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Medizinische MikrobiologieMedizinische MikrobiologiePharmazie KursPharmazie Kurs
K. ZimmermannFLI f. Medizin. Mikrobiologie
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Methoden zum Nachweis von MikroorganismenMethoden zum Nachweis von Mikroorganismen
• Mikroskopie– Lichtmikroskopie
• Nativpräparate• Färbungen
– Übersichtsfärbungen � Methylenblau– Differentialfärbungen � Gram
� Ziehl-Neelsen– Elektronenmikroskopie
• Kultur• Serologische Methoden• Molekularbiologische Methoden• Zellkultur• Tierversuch
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Mikroskopischer Nachweis von MikroorganismenMikroskopischer Nachweis von Mikroorganismen
Lichtmikroskopie- Nativpräparate: ungefärbt
- Übersichtsfärbungen (ein Farbstoff)� Darstellung von Strukturen
- Differentialfärbungen (Färbung/Gegenfärbung)� Zellwand: Gram-F., Ziehl-Neelsen-F.� Kapsel / Sporen / Geißeln
Elektronenmikroskopie
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Ablauf GramfAblauf Gramf äärbungrbung
1. Lufttrocknen u.Fixieren (Hitze, Ethanol)
2. Färben mit GentianaviolettGentianaviolett-Phenol-Ammoniumoxalatlösung
anschließend spülen (H2O)
3. Beizen (Lugolsche Lösung)Jod-Kaliumjodid-Lösung
anschließend spülen (H2O)
4. Entfärben mit 96%igem Alkoholanschließend spülen (H2O)
5. Gegenfärbung mit FuchsinFuchsin-Phenolrot-Lösung
anschließend spülen (H2O)
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Vermehrung von MikroorganismenVermehrung von Mikroorganismen((MikroorganismenkulturMikroorganismenkultur ))
Nährmedien / Kulturmedien:zur Kultivierung von Mikroorganismen dienende Substrate, die alle zum Wachstum erforderlichen Nährstoffe enthalten
- synthetische Medien ↔ komplexe Medien- feste Medien ↔ flüssige Medien- Universalmedien (Komplett-, Vollmedien) ↔ Spezialmedien
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beinhalten eine genau bestimmte Anzahl und Menge an Inhaltsstoffen, die chemisch gereinigt werden, u m Spuren von anderen Stoffen auszuschließen (z.B. Amies-Medium)
Synthetische Medien(def. Medien)
Nährboden (Nährbouillon mit zugesetzten Verfestigungsmitteln, z.B. Gelatine, Agar)
Feste Medien
Nährbouillon, Nährbrühe(z.B. Fleischwasser)
Flüssige Medien
Sonderform der definierten Medien, beinhalten nur die minimal nötigen Stoffe für das Wachstum der zu kultivierenden Mikroorganismen
Minimalmedien
bestehen aus Nährstoffen deren Inhalte nicht chemisch bestimmt sind, wie zum Beispiel Rindfleisch-Extrakt, Caseinhydrolysat, Hefeextrakt(z.B. Blutagar)
Komplexe Medien
CharakterisierungNährmedium
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
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Agar (Agar-Agar):
● gelierfähiges Polysaccharid, vorwiegend Polygalaktane. Gewinnung hauptsächlich inOstasien aus verschiedenen Meeres-Rotalgen (Gelidium, Gracilaria).
● Nähragar wird beim Erhitzen ab 95°C flüssig und erst arrt ab 45°C.
● Agar wird von Bakterien nicht abgebaut.
Vorteil gegenüber Nährbouillon :
auf festen (Agar-)Nährböden können Reinkulturenvon Bakterien isoliert werden.
Blutagar:
zu 100 ml verflüssigtem Nähragar(auf 50°C abgekühlt) 5-10 ml defibriniertes Blut geben, mischen und in Petrischalen ausgiessen.
Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
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Nährmedien zur Kultivierung von Mikroorganismen
Spezialmedien, die eine Unterscheidung verschiedener Mikroorganismen ermöglicht. Sie zeigen bestimmte Stoffwechselleistungen an(z.B. MacConkey-Agar)
Differentialmedien(Indikatormedien)
Spezialmedien, enthalten Hemmstoffe, die nur das Wachstum bestimmter Mikroorganismen zulassen(z.B. Tinsdale-Agar zur Anzucht von Korynebakterien)
Selektivmedien
Medien, die das Wachstum bestimmter Bakterien fördern(z.B Mannit-Kochsalz-Agar zur Anzucht von Staphylococcus aureus)
SpezialmedienElektivmedien
komplexe oder synthetische Nährmedien, auf der eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen wachsen(z.B. Blutagar)
Universalmedien(Komplettmedien )
CharakterisierungNährmedium
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NNäährbhrb öödenden
• GrundbestandteileAgar-Agar Seealgen, getrocknete Kolloidsubstanz
fester Nährboden = 1-2%
Peptone eiweißhaltiges Material, Fleisch, Casein,Sojabohnen, enzymat. Hydrolyse (Polypeptid, Dipeptid, Aminosäure)völlig löslich in H2O pH 5-7
Fleischextrakt mageres RindfleischHefeextrakt autolysierte Hefe (Vit. B-Komplex)
• Spezielle NährsubstrateSerum 10%Blut 5-10% Schaf defibriniertKochblut (hohe Ansprüche) 5-10 min 75-80°CMacConkey-Agar = Selektivnährboden (kein Blut)Eiernährboden ( Malachitgrün + Ei-emulsion)
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Differenzierung grampositiver KokkenDifferenzierung grampositiver Kokken
Katalase
StreptokokkenStreptokokken
positiv negativ
StaphylokokkenStaphylokokken
positiv negativ
Koagulase
St. St. aureusaureus KNSKNS
Hämolyse
αα ββ ((γγ))
VSVS((ßß)HS)HS
anhanhäämol.Strmol.Str..
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Das eisenporphyrinhaltige Enzym Katalase wird von
den meisten oxidasepositiven
aeroben und fakutativ anaeroben Spezies
- mit der wichtigsten Ausnahme STREPTOKOKKENSTREPTOKOKKEN -gebildet.
Es wandelt im Energiestoffwechsel gebildetes Wasserstoffperoxid in Wasser und molekularen Sauerstoff um.
KatalaseKatalase--ReaktionReaktion
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Freie Koagulase (extrazelluläres Enzym) bindet an Prothrombin und aktiviert die Entstehung von Fibrin aus Fibrinogen.
Clumping Faktor(zellwandgebundenes Protein) = Fibrinogenrezeptor
Differenzierung von Staphylococus aureusund Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS)
KoagulaseKoagulase--ReaktionReaktion
durch die Koagulase-Reaktion gebildetes Fibringerinnsel in einem Reagenzglas
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Latexpartikel sind mit Fibrinogen und IgG beladen � Fibrinausfällung durch Koagulase und Clumping factor
Protein A von Staph. aureus bindet an den Fc Teil von Immunglobulinen,welche dann nicht mehr an den Fc-Rezeptor von Phagozyten binden
Ausserdem sind die Latexpartikel mit spezifischen Antikörpern gegen die Kapsel-polysaccharide von Staph. aureus beladen.
Durch diese Mehrfachbeladung besteht die Möglichkeit, alle Stämme zu erfassen.
KoagulaseKoagulase--ReaktionReaktion
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• Nachweis von Cytochromen aus der Atmungskette, die Sauerstoff als terminalen Elektronenakzeptorim Energiestoffwechsel verwenden
• Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischen Sauerstoff in den Zellstoffwechsel, indem sie durch molekularen Sauerstoff oxydiert werden
OxidaseOxidase --ReaktionReaktion
• in der Zelle erfolgt die enzymatische Reduktion der Cytochrome
• künstliche Substrate (N,N-Dimethyl-1,4-diaminobenzol) bewirken die Reduktion des Cytochromoxidase-Systems (d.h. sie werden oxydiert)
• Substrate in Abhängigkeit vom Reduktions-/Oxidationszustand farblos bzw. gefärbt
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Gramnegative StGramnegative Stääbchen: bchen: BspBsp Enterobakterien: biochemische ReaktionenEnterobakterien: biochemische Reaktionen
KohlenhydratspaltungKohlenhydratspaltungAbbau von Kohlenhydraten (Glucose, Lactose, Rhamnose) � Säure (18 – 24 h)
Indikator: Bromthymolblau � Farbumschlag blaugrün (negativ) zu gelb/orange(positiv)
CitratCitrat --AbbauAbbauC-Quelle: Citrat, N-Quelle: Ammoniumsalz (Grundlage für Energie- + Baustoffwechsel)
� AlkalisierungIndikator: Bromthymolblau � Farbumschlag grün (negativ) zu blau (positiv)
HH22SS--BildungBildung- aus Eiweißkörpern bzw. S-haltigen Aminosäuren (insbes. Cystein)- aus S-haltigen, (an)organischen Zusätzen [(Thio-)Sulfaten, Sulfiten, Cystein]Indikator: Metallsalz (insbes. Ferrochlorid + Bleiacetat) � Sulfid (schwarzerNiederschlag)
UreaseUrease--NachweisNachweis/ / IndolIndol --BildungBildungIndikator: Phenolrot (durch Säurebildung aus Glucose-Abbau � gelb = negativ)
- Urease:Harnstoff � Ammoniak + CO2 positiv (rotviolett )- Indol: Eiweißabbau (Tryptophan) � Indol (Nachweis mit Kovacs Reagenz, roter Ring)- Beweglichkeit:Wachstum außerhalb des Impfstichs (wolkenartige Trübung) im Agar
OrnithinOrnithin --DekarboxylierungDekarboxylierungL-Ornithin (L-Lysin u.a) [pH niedrig] � Amine + CO2 (pH-Anstieg)Indikator: Bromkresolpurpur �Farbumschlag von farblos/gelblich (negativ) zu violett (positiv)
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Mikroflora im Menschen
10310810111011 – 1012Dickdarm
103105107107 – 108unterer Dünndarm
102103104104 – 105oberer Dünndarm
103104104104 – 105Magen
10210810121012 - 1013Zahnfleisch-tasche
10210810111010 - 1011
(Plaquesubstanz)Zahn-oberfläche
102107108108 – 109
(Speichel)Zungen-oberfläche
Sproßpilzeaerobe Bakterien
anaerobe Bakterien
Keimzahl(pro ml o. g)
Standort
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Mikroflora im Menschen
MycoplasmaEntamoeba gingivalisTrichomonas tenax
Str. sanguisStr. mitisS. epidermidisMicrococcus
Sulcusgingivalis
VeillonellaFusobacteriumLeptotrichiaPrev. oralisBact. corrodensPropionibacterium
PeptostreptococcusActinomycesNocardiaLactobacillus
NeisseriaHämophilusMycoplasmaProtozoa (Entamoeba gingivalisTrichomonas tenax)
Str. mutansStr. sanguis
Zahn-oberfläche
Str. sanguisStr. salivariusStr. mitis
Wangen-schleimhaut
VeillonellaPrev. melaninogenicaPrev. oralis
PeptococcusPeptostreptococcusPropionibacteriumActinomyces
NeisseriaVibrioHaemophilusEnterobacteriaceaeCandida u.a.
Str. salivariusStr. mitisStr. sanguisMicrococcus, StaphylococcusCorynebacterium
Zungen-oberfläche
gramnegativgrampositivgramnegativgrampositiv
AnaerobierAerobierStandort
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DesinfektionDesinfektion
heißt, einen Gegenstand in den Zustand versetzen, in dem er nicht mehr infizieren kann
Wirksamkeit abhängig von:• Temperatur• Einwirkungszeit• Konzentration und Art des Wirkstoffes• weitere Faktoren: inkorporierte MO (Ausscheidungen, Blut)schlecht o. nicht erreichbar
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DesinfektionsverfahrenDesinfektionsverfahren
thermische MethodenUV-Strahlen Filtration
PhysikalischPhysikalisch
Chemisch Chemisch
Heißwasser strömender Dampf Niederdruckdampf75 - 95°C 100°C 105°C, Unterdruck10 - 30 min 10 - 30 min 1 -15 min
Chemothermisch Chemothermisch
Alkohole / Aldehyde / Phenole und Derivate / Metalle / Halogene /Oberflächenaktive Substanzen / Oxidantien
Kombination von feuchter Hitze (60°C) und chemischen Desinfektionsmitteln bei thermolabilen Werkstoffen
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Wirksamkeit von DekontaminationsmaWirksamkeit von Dekontaminationsmaßßnahmennahmen
Reinigung: mechanische Entfernung Reduktion der Keimzahl (2-3 log-Stufen = 99 – 99,9 %)
Antiseptik : Inaktivierung von MO auf lebendem Gewebe
Desinfektion:Reduktion der Keimzahl (5 log-Stufen = 99,999 %)Inaktivierung krankheitserrregender MO
Entkeimungsfiltration:Abtrennung lebender und toter MO, nicht aller Viren
Sterilisation:Inaktivierung aller MO inklusive aller Sporen und VirenKeimzahlreduktion mind. 6 log-Stufen
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Sporenbildende BakterienSporenbildende Bakterien
grampositive Stäbchen
aerob: Bacillusanaerob: Clostridium
Bakteriensporen � stoffwechselinaktive Dauerformen� hohe Umweltresistenz
Artspezifische Sporenform und –lokalisationSporenbildung(Sporogenese) durch Nährstoff-Mangel
induziertSporenkeimung:Aktivierung, Keimung, Auswachsen
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Bacillus subtilis Bacillus cereus
Bacillus: aerobesporenbildende Stäbchen
Bedeutung:Toxinbildner (Lebensmittel, Bioterrorismus), Antibiotikaproduzent, Bioindikator (Phenylketonurienachweis, Sterilisatoren), Proteasebildner (Waschmittel)
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verschiedene Spezies verursachen Krankheiten durch die Produktion von potenten Protein-Ektotoxinen
Wichtige Humanpathogene Spezies:
A) Clostridium botulinum
B) Clostridium tetani
C) Clostridium perfringens
D) Clostridium difficile
Clostridium: anaerobe sporenbildende Stäbchen
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Auswertung Sporenbildner
anaerobaerob
subterminale ovale Spore (Tennisschläger)
++Clostridium botulinum
schlanke Stäbchen z.T. mit ovaler subterminaler Spore
Weißlich, flache Kolonien mit unregelmäßigem Rand(Geruch nach Stalldung)
++Clostridium difficile
große grampositive Stäbchen mit abgerundeten Enden
flach, matt glänzend, unregelmäßiger Rand, Doppelzonenhämolyse
++Clostridium perfringens
terminale runde Spore (Trommelschläger)
durchsichtig, flach, stumpfe Ober-fläche, unregelmäßiger Rand mit Ausläufern
++Clostridium tetani
ovale zentrale bis subterminale Spore
flache trockene Kolonien, unregelmäßiger Rand
++Bacillus subtilis
MikromorphologieMakromorphologie (Blutagar)WachstumSpezies
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Wichtige Erreger von Humanmykosen(Auswahl)
Cryptococcose /ZNSVogelkotCryptococcus
Primäre SystemmykosenPflanzen, Erdboden
Dimorphe Pilze(außereuropäische MykosenzB. Histoplasma
AspergilloseLunge und andere Organe
MucormykoseVerletzungsmykosen
ubiquitärSchimmelpilzeAspergillus spp.
Zygomyceten (Mucor u.a.)Dematiaceae
CandidoseHaut, Schleimhaut, andere Organe
Mensch, Tier, Nahrungsmittel
HefenCandida
DermatophytoseHaut, Haare, NägelMensch, Tier,
Erdboden
DermatophytenTrichophyton spp.Microsporum spp.Epidermophyton
Mykose/häufige LokalisationReservoirErreger
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DermatophytenDermatophyten
Keratinophile Pilze, Einteilung � ungeschlechtliche Fortpflanzungs-
Organe (Mikro-und Makrokonidien)
geophil Erde � Mensch, Kontamination� selten Infektion
zoophil Tier � Mensch, intensiver Fellkontakt
anthropophil Mensch � Mensch oder indirekt
Pathogenese: Sporen� Keratinozyten�Auskeimen zu Hyphen
fungistatische Lipide und Proteine können
Eindringen verhindern
Infektion � gesteigerte Desquamation(Schuppung)
� Hyperkeratose
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Tinea = Sammelbegriff für oberflächliche Dermatomykoseunabhängig von SpeziesT.pedis (Fuß)T.capitis (Kopf)T.inguinalis (in der Leistenbeuge)T.corporis (Körper)T.barbae (Bart)
Therapie: �lokale Applikation (Salben) Azoleausgedehnte Dermatosen (Haut, Nagel, Haare)
� systemische Therapie Griseofulvin, Itraconazol6 Monate (Finger)� 12 Monate (Fuß)
KlinikKlinik
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Labordiagnostik Labordiagnostik VirusVirus --assoziierterassoziierter ErkrankungenErkrankungen
direkter Virusnachweismit Virusvermehrung
ZellkulturBruteiVersuchstier
ohne VirusvermehrungMikroskopie (Einschluß-K.)ElektronenmikroskopieAntigenvirale Nukleinsäure
indirekter VirusnachweisImmunantwort des Wirtes
virus-spezifische Antikörper
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direkt indirekt
HA Hämagglutination x
HHT Hämagglutinationshemmung x
ELISA Enzymimmunoassay x x
IBL Immunoblot x
FAT Fluoreszenzantikörpertechnik x x
CPE zytopath.Effekt in der Zellkultur x
NAT Nukleinsäurenachweis x
RT-PCR, n-PCRReal-time PCR
Sequenzierung Nukleotid-alignment x
Methoden zum VirusnachweisMethoden zum Virusnachweis
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Polymerasekettenreaktion
Nukleinsäureextraktion aus Probe
Cave:RNA-Viren Reverse Transcription in c-DNA
Amplifikation DNA, Primer, dNTP,Taq-Polymerase
Denaturing der Ziel-DNA � EinzelsträngeTemperatursenkung � Anlagerung der Primer = Start der Neusynthese
Temperaturanstieg ���� Sythese-Stop���� erneute Denaturierung
����X-Zyklen (25 – 50 � Kettenreaktion)
Cave: Störfaktoren ���� Heparin, Proteinasen, Harnstoff, Phenol, Paraffin, Salze
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Detection der Amplifikate
a) Längenscreening im Gel
Ethidiumbromid
klassische PCR
b) Fluoreszenzsignale messen
markierte Oligonukleotide
Real-time PCR
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Amplifikation
Detektion
in einem Reaktionsgefäß
Basis: 5‘Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq -DNA-Polymerase
spezielle fluorogene Sonde = Oligonukleotidmarkiert mit Reporter -Farbstoff (5‘Ende)
Quencher -Farbstoff (3‘Ende)
Real-time PCR nach TaqMan TM Prinzip
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Virusisolierung
Versuchstier
embryoniertes Hühnerei
Zellkultur (monolayer)
a) primär (aus Organen angezüchtet, diploid)
b) diploid = Zell-Stamm (2.-50. Passage, begrenzte Lebensdauer)
c) Zell-Linie = permanent (unbegrenzte Passagenzahl,tri-, tetra-, polyploid, oft tumorbildend)
Zellbiologische VerfahrenZellbiologische Verfahren
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AntikAntik öörperrper --NachweiseNachweise
Neutralisationstest
Hämagglutinations-Hemmtest
Komplementbindungs-Reaktion
Immunfluoreszenztest
ELISA
Immunoblot
Quantitativ���� Serumtitration����Titer
����Einpunktverfahren(ELISA )
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Detektions-Antikörper(Enzym-markiert)
nachzuweisende Komponente aus Patientenmaterial(AK / Ag)
adsorbierter Nachweisparameter (Ag / AK)
Enzym
� setzt farbloses Substrat um
� es entsteht ein löslichesfarbiges Produkt
OD-Messung
ELISA ELISA (Enzyme (Enzyme linkedlinked immunoimmuno sorbentsorbent assayassay))
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Beurteilung von Antikörperbestimmung
Akute Infektion IgM Antikörper Nachweis in einer Probe
Cave: persistierende Virusinfektionen ���� bei Aktivierung erneut IgM -Bildung möglich
Intrauterine Infektion IgM im Serum des Embryo
ab 19.SSW selbständige IgM Bildung
keine Placentapassage
NT und HHT Antikörper anstieg 4-fach in zweiProben, Abstand 14 Tage
Differenzierung: akute Phase,
postakutePhase
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WesternWestern--BlotBlot = Immunoblot= Immunoblot
Auftrennung der Virusproteine����Molekulargewicht
Nitrozellulose
Patientenantikörper
enzymgekoppelter Anti-Human IgG Antikörper
farbloses Substrat
Umwandlung in unlöslichenfarbigen Niederschlag