menegatti 28 nov 08
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I MICROARRAY
E IL LORO UTILIZZO IN DIAGNOSTICA
Elisa MenegattiUniversità di Torino - Dipartimento di Medicina ed Oncologia Sperimentale
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I microarray
Linea ordinata di elementi microscopici su di una superficie piana su cui sono immobilizzati acidi nucleici, proteine, cellule o tessuti capaci di riconoscere e legare molecole specifiche.
DNA microarray
Proteinmicroarray
Cellmicroarray
Tissuemicroarray
DNA microarray
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DNA microarray (gene chip, DNA chip, o biochip) è costituito da una collezione sonde (DNA o oligonucleotidi) depositate in una posizione nota su un supporto a formare una microgriglia (da cui il nome microarray) che consente di identificarle in modo univoco.
Il supporto può essere di vetro, plastica o siliconico
100 - 1 million DNA probes in 1 cm2
Dimensioni degli spot da 15 a 350 micron
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Principio: appaiamento delle basicomplementari
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• espressione genica
• genotipizzazione
• valutazione di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti
• profilo di metilazione
• analisi di micro-RNA
Vengono utilizzati per:
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• 2007 = 6517• 2006 = 6236• 2005 = 4406• 2004 = 3509• 2003 = 2421• 2002 = 1557• 2001 = 834• 2000 = 294
294834
1557
2421
3509
4406
62366517
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
1998 2000 2002 2004 2006 2008
Anni
N° c
itazi
oni P
ubM
ed
Una metodologia promettente…
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Punti di forza• numero di informazioni disponibili con un’ unico esperimento• miniaturizzazione
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• Produzione dell’ array• Marcatura del campione• Ibridazione• Rilevazione del segnale (scan, imaging)• Analisi dei dati
Fasi analitiche
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1. PRODUZIONE DELL’ ARRAY
• Per deposizione (cDNA, oligonucleotidi)
• Fotolitografia (oligonucleotidi)
• Ink-jet technology (oligonucleotidi)
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SPOTTED MICROARRAY
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FOTOLITOGRAFIA
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InkJet technology
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Marcatura del campione
Ibridazione
Rilevazione del segnale (scan, imaging)
Analisi dei dati
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Analisi dell’ immagine
1. Identificazione degli spot (automatica, semiautomatica, manuale)
2. Segmentazione: separa gli spots dal background. Histogram
3. Valutazione dell’ intensità: media o mediana dei pixels rilevati nello spot
4. Correzione del background
Normalizzazione, software dedicati
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DIAGNOSTICA
• ANALISI DEI CNV (Copy Number Variants), •pazienti con ritardo mentale•pazienti con dismorfismi•Ricerca di delezioni, duplicazioni, riarrangiamenti
array CGH
• Analisi dei geni espressi
• RICERCA DI MUTAZIONI PUNTIFORMI
• GENOTIPIZZAZIONE (SNP array)• SEQUENZIAMENTO DIRETTO (su array)
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SingleNucleotidePolymorphism
array
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SNPs analizzabili con un unico assay:
da poche centinaia a 2,3 milioni (distanza minima
raggiungibile 1,5 kb)
Genome-wideassociation studies
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SEQUENZIAMENTO DIRETTO
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SEQUENZIAMENTO DIRETTOMETODO DI SANGER
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ARRAY CON MUTAZIONI CONOSCIUTE
ARRAY SEQUENZIAMENTO
Invest Ophthalmol Vis Sci 2005;46:3355
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