merjenje krvnih koncentracij tirozin kinaznih inhibitorjev ... j... · novosti -- merjenje...
TRANSCRIPT
Merjenje krvnih koncentracij tirozin kinaznih inhibitorjev s tekočinsko
kromatografijo s tandemsko masno spektrometrijo
Jurij Trontelj, Eva Kralj, Tadej Pajič, Simon Žakelj, Irena Preložnik Zupan, Peter Černelč, Janja Marc, Barbara
Ostanek, Helena Podgornik, Albin Kristl
Univerza
v Ljubljani
Fakulteta za farmacijo
Okviren načrt predstavitve
1. Pomen spremljanja koncentracij TKI
2. Princip metode LC-MS/MS
3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije
4. Novosti -- DBS
5. Zaključek
Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI ? 1/2
• Velika interindividualna variabilnost v farmakokinetiki imatiniba
Picard S et al. Blood 2007; 109:3496-3499.
• In – pomembno:
• Nekateri avtorji:
Dobra povezava med plazemskimi c. in učinkom
Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI? 2/2
Marin D et al. J Clin Oncol 2010; 28(14):2381-2388.
2. Komplianca oz. adherencaAdherenca ima izjemen vpliv na uspešnost zdravljenja, še posebej, če želimo doseči CMR – popolni molekularni odgovor
Adherenca imatiniba
Št
pac
ien
tov
Meseci
0-1
3500
3000
2500
2000
1500
0
1000
500
1-2 2-3 3-4 4-5 5-6 6-7 7-8 8-9 9-10 10-11 11-12 12-13 13+
2921
Tsang J et al. J Clin Oncol. 2006;24:330s. Abstract 6119.
Zakaj spremljati krvne koncentracije imatiniba in ostalih TKI?
(23%)
Ibrahim AR et al. Blood 2011;117(14):3733-3736.
(100%)
1) Izkazalo se je, da imajo pacienti s adherenco nižjo od 85% kar 18 krat večjoverjetnost, da izgubijo citogenetski odgovor (CCyR) (p=0,0002)
2) Slaba adherenca naj bi bila glavni razlog za izgubo citogenetskega
odgovora po 2 letih in za končni neuspeh terapije
Jabbour et al. Am J Hematol. Aug. 2012;87(7).
Kdaj oz. kako pogosto spremljati krvne koncentracije ?
3. Smernice- ne zapovedujejo rutinskih meritev krvnih konc.• Izmeriti plazemsko koncentracijo imatiniba:
– pri tistih pacientih, ki ne dosegajo optimalnega odgovora,• ne dosežejo CCyR (12 mes.), MMR (18 mes.)
– slabo prenašajo, – sum na interakcije (PK:inhibitorji, induktorji CYP3A4)– kjer se sumi na slabo komplianco
• Preveri se, ali je dosežena ciljna minimalna plazemska koncentracija (1002 ng/mL)
Eutos for CML: European Treatment and Outcome Study, Using blood level testing to optimize therapywww.eutos.org, dostopano Aprila 2012
Okviren načrt predstavitve
1. Pomen spremljanja koncentracij TKI
2. Princip metode LC-MS/MS
3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije
4. Novosti -- DBS
5. Zaključek
Zakaj potrebujemo za določevanje TKI tehnologijo(LC-MS/MS)?
1. zaradi potrebne velike občutljivosti:- koncentracije TKI v plazmi pacientov so relativno nizke, območje:
- 10 ng/mL – 2 µg/mL
Analit
2. zaradi potrebe po čim večji selektivnosti metode:- plazma vsebuje različne endogene ali eksogene snovi, ki
lahko motijo analizo
Princip metode LC-MS/MS
Priprava vzorcev Kromatografija Masna detekcija
Glavni princip delovanja tandemskega masnega detektorja
m/z = 494 = prekurzor = imatinib
394 = hčerinski ion
HPLCčrpalka
pripravljenvzorec
kolona
Površina pod kromatografskim vrhom je sorazmerna s koncentracijo prekurzorja v vzorcu
• Priprava vzorcev – metoda LLE (liquid-liquid extraction)
250µL
Titier et al. Ther Drug Monitor 2005; 27(5):634-40.
SRM:m/z 494����394
Princip metode LC-MS/MS
• Kromatografija in masna detekcija
kalibracijski vzorec na meji določitve (LLOQ):25 ng/mL
vzorec pacienta
imatinib
CGP 74588=N-desmetilmetabolit im.
IS
imatinib
IS
CGP 74588=N-desmetilmetabolit im.
Princip metode LC-MS/MS
• Validacija metode – po smernicah FDA, EMA– Točnost– Ponovljivost– Učinek matrice– Linearno območje– LOQ– stabilnost
Validacija metode – točnost, linearno območje
konc. ng/mL imatinib IS
imatinib/IS uteženo
Bias [%]Brez Izotopnooznač. IS
izrač. konc.ng/mL
Bias [%]z uporaboImatiniba-D8kot IS
0 62 54343 0,0011 32,39242 - 2,8717651 -25 561 53024 0,0106 54,394836 117,57934 26,71516 6,8606382
100 1986 53130 0,0374 117,2345 17,234499 94,417683 -5,5823165
200 4236 55870 0,0758 216,46151 8,2307526 191,52906 -4,2354697
500 11338 58101 0,1951 529,6481 5,9296199 492,96797 -1,406407
700 14510 52727 0,2752 669,5179 -4,3545863 695,18663 -0,6876239
1000 20991 53825 0,3900 955,31145 -4,4688548 985,17005 -1,4829947
2000 40251 51123 0,7873 1804,6665 -9,7666737 1989,0161 -0,5491939
3000 70654 58227 1,2134 3145,3728 4,8457589 3065,4087 2,1802914
5000 110427 55343 1,9953 4899,2818 -2,0143642 5040,6345 0,8126901
6000 123033 52315 2,3517 5455,1844 -9,08026 5941,0823 -0,9819615
slope 22,67657 0,000395843
intercept -672,32675 8,21649E-06
y = 0,0004x + 8E-06R² = 0,9998
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
2,5000
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
umeritvena krivulja imatinib/IS
optimalnoterapevtsko področje
Validacija metode – učinek matrice in ponovljivost
Različne plazmene vplivajo natočnostmetode
Okviren načrt predstavitve
1. Pomen spremljanja koncentracij TKI
2. Princip metode LC-MS/MS
3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije
4. Novosti -- DBS
5. Zaključek
Merjenje intracelularne koncentraciije imatiniba
Zakaj?Zato, ker je tirozinkinaza intracelularni encim. Imatinib torej deluje intracelularno.
mononuklearne celice ?ali granulociti ?ali oboje?
Potrebna separacija krvnih celic(Ficoll), Separacija z magneti
↓
Nato liza cca 3 mio celic
↓
tekočinska ekstrakcija,
↓
Dvojno koncentriranje � LCMS
V katerih celicah?
Kako?
Faktorji: aktivnost Pgp, hOCT1...
Metoda je že razvita in se uporabljaza meritve pri Projektu ARRS
Mer
jenj
e im
atin
iba
v ta
rčni
hce
licah
Rezultat: metoda, ki je sposobna z gotovostjo določiti do 6.2 pg imatiniba / 2000 celicKar je podoben uspeh, kot so ga dosegli v avstralski skupini, kjer pa so morali uporabiti radioaktivno označen imatinib.
Okviren načrt predstavitve
1. Pomen spremljanja koncentracij TKI
2. Princip metode LC-MS/MS
3. Novosti -- merjenje intracelularne koncentracije
4. Novosti -- DBS
5. Zaključek
DBS
(=Dried Blood Spots)
• Stara metoda več desetletij, predvsem v neonatalni in pediatrični diagnostiki (bilirubin, PKU),
• Ponoven vzpon (10-100 x ↑ občutljivosti LC-MSov v zadnjih 3 letih)• Manj invazivna metoda kot punkcija vene
Nekatere slabosti:-slabša občutljivost,-slabša ponovljivost,-spremenljiv hematokrit in
njegov vpliv,-odvisnost rezultata od velikosti lise,-porazdeljevanje uč. v Erc
Glavne prednosti:
+ malo vzorca 10-20 µL+ pacienti se lahko sami zbodejo+ lahko shranjevanje vzorcev+ lažji transport
Cilj: razviti metodo za kvantifikacijo imatiniba, nilotiniba, dasatiniba z DBS
vbodNanos na listič
Sušenje na zraku
Izre
z lis
e
Ekstrakcija z močnim topilom terOdstranjevanje motečih proteinov ter fosfolipidovLC-MS/MS
Zakaj?Kakšne so prednosti tovrstnega jemanja vzorcev?
- možnost odvzema v ambulantah zdr. domov,
- možnost odvzema celo na domu,
- pošiljanje vzorcev po pošti (ni treba hladiti)
Rezultat: metoda za simultano spremljanje treh TKI v vzorcih DBS
13C-D3-nilotinib
nilotinib
D8-imatinib
D8-dasatinib
imatinib
dasatinib
Primer vzroca na spodnji meji določitve (LLOQ)
Rezultat• Uspešno validirana metoda DBS• Točnost in ponovljivost:
imatinib dasatinib nilotinib
nominal concentration [µg/L] 300 800 2000 15 40 100 300 800 2000
intra day statistics (n=5)
mean concentration found [µg/L] 314,6 768,7 2001,2 13,1 42,3 99,1 309,4 831,3 2008,6
accuracy (%bias) 4,9 -3,9 0,1 -12,9 5,7 -0,9 3,1 3,9 0,4
precision (%CV) 3,1 4,4 5,6 2,8 4,9 7,1 6,9 5,3 6,8
inter day statistics (n=15)
mean concentration found [µg/L] 312,3 725,6 1994,3 13,0 41,4 99,6 323,5 782,5 1914,5
accuracy (%bias) 4,1 -9,3 -0,3 -13,2 3,4 -0,4 7,8 -2,2 -4,3
precision (%CV) 9,1 8,1 8,2 9,9 9,3 8,2 10,3 7,7 7,1
Rezultat• relativni matriks efekt – primerjava odzivov istih
koncentracij analitov v krvi več ljudi (DBS)primerjava različnih vzorcev krvi- imatinib
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0 500 1000 1500 2000 2500
vzorec A
vzorec B
vzorec C
vzorec D
vzorec E
primerjava različnih vzorcev krvi- dasatinib
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
0,4500
0,5000
0 20 40 60 80 100 120
vzorec A
vzorec B
vzorec C
vzorec D
vzorec E
primerjava različnih vzorcev krvi- nilotinib
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
5,0000
6,0000
7,0000
0 500 1000 1500 2000 2500
vzorec A
vzorec B
vzorec C
vzorec D
vzorec E
USPEH:RSD naklonov < 4 %
Uporaba imatiniba-D8nilotiniba-13C D3dasatiniba-D8
Rezultat – navzkrižna validacija
(N=15)
Spomladanski “Novi” izzivi• Razviti in validirati ter objaviti metodo z DBS
• Razviti metodo za merjenje intracelularne koncentracije nilotiniba, dasatiniba.
• Aplicirati metodo za spremljanje plazemskih koncentracij imatiniba tudi pri pacientih z GIST.
• Vpeljati analitiko za najnovejše TKI, ki so še v razvoju, npr. za bosutinib, ponatinib, bafetinib (učinkoviti tudi pri T315).
Zahvala
• Pomembni sodelujoči:
– Eva Kralj, mag farm. – za odlično delo v laboratoriju,– dr. Simon Žakelj, mag farm. – za pomoč pri razvoju metod,– dr. Tadej Pajič, univ.dipl. inž, spec. med. biokem. - za zbiranje
vzorcev,– vsi ostali, ki sodelujejo na projektu,– Novartis Slovenia, - za pomoč pri pridobitvi standardov,– ARRS za financiranje projekta,– ARRS za sofinanciranje nakupa LC-MS/MS-a.