methodenentwicklung für die trennung verschiedener

Universität Kassel

Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften

Fachgebiet Agrartechnik

Prof. Dr. sc. agr. Oliver Hensel

Methodenentwicklung für die Trennung verschiedener Proteinhydrolysate in Peptidfraktionen per Crossflow Diafiltration & sensorische Bewertung der Fraktionen

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Agrarwissenschaften (Dr. agr.)

Vorgelegt im Fachbereich Ökologische Agrarwissenschaften

der Universität Kassel

Von M. Sc. Markus Stefan Friedrich

aus Öhringen

Witzenhausen, 2019

Die vorliegende Arbeit wurde am 25.01.2019 vom Fachbereich für Ökologische

Agrarwissenschaften, Fachgebiet Agrartechnik der Universität Kassel als Dissertation zur

Erlangung des Grades eines Doktor der Agrarwissenschaften angenommen.

Tag der mündlichen Prüfung: 05.06.2019

Hauptberichter: Prof. Dr. Oliver Hensel

Mitberichter: Prof. Dr. Joachim J. Schmitt

Mündliche Prüfung: Prof. Dr. Oliver Hensel

Prof. Dr. Joachim J. Schmitt

Prof. Dr. Johannes Kahl

Prof. Dr. Elke Pawelzik

Vorwort

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Oliver Hensel für die wissenschaftliche Betreuung

der Arbeit, sowie Herrn Prof. Dr. Joachim J. Schmitt, der die Durchführung dieser Arbeit

ermöglichte.

Bei Frau Prof. Dr. Ingrid Seuß-Baum bedanke ich mich für die hilfreichen Diskussionen zur

Planung und Durchführung der Sensorik-Studie.

Weiter gilt mein Dank Herrn Ralf Schäfer für die organisatorische Unterstützung, sowie

moralischen Zuspruch. Zudem bedanke ich mich bei Frau Hannelore Borck und Herrn

Alexander Maxones für klärende Diskussionen bei der Einarbeitung in die SE-HPLC-Analytik.

Besonderer Dank gilt Herrn Daniel Koch, Herrn Dominik Hieß und Herrn Alexander Buchmüller

für hilfreiche wissenschaftliche Diskussionen, sowie Frau Giulia Kutzner und Frau Carine

Mollon für die Unterstützung bei der Vorbereitung der Sensorik-Termine.

Bei den Studienenden des Fachbereichs Lebensmitteltechnologie der Hochschule Fulda

bedanke ich mich für das rege Interesse und die zuverlässige Teilnahme als Panelisten im

Rahmen der Sensorik-Studie.

Abschließend bedanke ich mich bei meiner Familie, insbesondere meiner Frau Aziza

Schwenke, sowie meinen Eltern Wolfgang & Gerda Friedrich für die jahrelange Unterstützung,

motivierende Worte, Geduld und Zuversicht.

Ich widme diese Arbeit meiner verstorbenen Mutter,

Gerda Friedrich (25.02.1956 – † 21.01.2017)

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung, Zielsetzung & Hypothesenformulierung .............................. 1

1.1 Einleitung ..................................................................................................................... 1

1.2 Zielsetzung & Hypothesenformulierung ........................................................................ 2

2. Stand der Forschung ................................................................................ 5

2.1 Filtrations- und Fraktionierungstechnik ......................................................................... 5

2.1.1 Die Crossflow Filtrationstechnik ............................................................................. 6

2.1.2 Fouling und Konzentrationspolarisation ................................................................. 7

2.1.2.1 Die Konzentrationspolarisation.......................................................................... 7

2.1.2.2 Das Fouling ....................................................................................................... 9

2.1.3 Mathematische Charakterisierung von Filtrationsprozessen .................................10

2.1.3.1 Idealisierte Charakterisierung von Filtrationsprozessen - Das Hagen-Poiseulle-

Model ...............................................................................................................10

2.1.3.2 Charakterisierung der Konzentrationspolarisation – Das Gel-Polarisation-Modell

........................................................................................................................11

2.1.3.3 Charakterisierung druckgetriebener Filtrationsprozesse unter Berücksichtigung

prozessspezifischer Widerstände – Das Widerstands-Modell ..........................13

2.1.4 Einfluss von Prozess-Hydrodynamik und physikalisch-chemischen Eigenschaften

von Feed und Membran auf Fouling und Filtrationsprozess ..................................14

2.1.4.1 Fouling aufgrund der Prozess-Hydrodynamik ..................................................15

2.1.4.2 Fouling aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Feed und

Membran .........................................................................................................17

2.1.4.3 Weitere Verfahren zur Fouling-Kontrolle & Prozessoptimierung .......................23

2.1.5 Die Dialyse ...........................................................................................................26

2.2 Rohstoffcharakterisierung ............................................................................................28

2.2.1 Milchproteine ........................................................................................................28

2.2.1.1 Caseine ...........................................................................................................28

2.2.1.2 Molkenproteine ................................................................................................29

2.2.2 Algen & Algenproteine ..........................................................................................30

2.3 Hydrolyse von Proteinquellen ......................................................................................32

2.3.1 Die enzymatische Hydrolyse ................................................................................34

2.3.1.1 Hydrolyse von Algen & Algenproteinen ............................................................34

2.4 Analytik – Die Size-Exclusion HPLC (SE-HPLC) .........................................................35

2.5 Sensorik – Geschmackswahrnehmung & deren Modulation ........................................37

2.5.1 Geschmacksrezeptoren – Geschmackspapillen, -Knospen & -Sinneszellen .........38

II

2.5.2 Die fünf Grundgeschmacksarten & deren Wahrnehmung .....................................39

2.5.3 Zusammenhänge der Geschmackswahrnehmung & deren Modulation ................43

2.5.3.1 Zusammenhänge der Wahrnehmung von „süß“, „bitter“ und „umami“ ..............43

2.5.3.2 Modulation der Geschmackswahrnehmung .....................................................44

2.5.4 Geschmacksqualitäten von Peptiden ....................................................................47

3. Material & Methoden ............................................................................... 49

3.1 Rohstoffe .....................................................................................................................49

3.1.1 Molkenprotein-Isolat .............................................................................................49

3.1.2 Alge (Chlorella vulgaris) .......................................................................................50

3.2 Crossflow-Diafiltration .................................................................................................51

3.2.1 Die Methodenerstellung ........................................................................................51

3.2.1.1 Das Anlagensetup ............................................................................................51

3.2.1.2 Ablauf der Membrancharakterisierung – Bestimmung des „kritischen Drucks“ .52

3.2.2 Optimierung der Crossflow-Performance & der Trennschärfe ...............................54

3.2.2.1 Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke .............................................................54

3.2.2.2 Einfluss von Ultraschall ....................................................................................56

3.2.2.3 Eignung von regenerierten Cellulose Membranen für die Fraktionierung .........58

3.2.2.4 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed ..................59

3.3 Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris) ........................................................................60

3.3.1.1 Die Methodenerstellung ...................................................................................61

3.3.1.2 Methode zur Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris) ........................................63

3.3.2 Aufbereitung und Analytik der Hydrolysate ...........................................................63

3.4 Instrumentelle Analytik & Probenaufbereitung .............................................................63

3.4.1 Aufkonzentration der Peptidfraktionen ..................................................................63

3.4.2 Spektralphotometrische Proteingehaltbestimmung ...............................................64

3.4.2.1 Referenzmethodische Bestimmung des Proteingehalts der hydrolysierten Alge

(Chlorella vulgaris) ...........................................................................................65

3.4.3 Bestimmung des Hydrolysegrads der Proteinhydrolysate .....................................65

3.4.4 Analytik der Peptidfraktionen mittels SE-HPLC .....................................................67

3.4.4.1 Methodenerstellung .........................................................................................67

3.4.4.2 Methode zur SE-HPLC Analyse .......................................................................68

3.4.4.3 Probenvorbereitung .........................................................................................68

3.5 Sensorik ......................................................................................................................68

3.5.1 Schulung des Sensorikpanels ..............................................................................68

3.5.1.1 Prüfung auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014) ................70

3.5.1.2 Prüfung zur Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014) .....70

III

3.5.1.3 Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle (gemäß ISO 3972:2011) ..........70

3.5.1.4 Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes (gemäß DIN EN

ISO 8586:2014) ...............................................................................................71

3.5.1.5 Schulung zur Anwendung der Skale ................................................................72

3.5.2 Prüferauswahl ......................................................................................................72

3.5.3 Sensorik der Peptidfraktionen ...............................................................................73

3.6 Statistische Auswertung & Datenverarbeitung der Messergebnisse ............................74

3.6.1 Datenverarbeitung ................................................................................................74

3.6.1.1 Crossflow-Diafiltration ......................................................................................74

3.6.1.2 Ultraschall ........................................................................................................74

3.6.1.3 Eignung von RC-Membranen ...........................................................................76

3.6.1.4 Absolute Proteinmenge von Retentat (mRet) und Permeat (mPer) ......................76

3.6.2 Statistische Auswertung .......................................................................................76

3.6.2.1 Hydrolyse .........................................................................................................76

3.6.2.2 Crossflow-Filtration ..........................................................................................77

3.6.2.3 Ultraschall ........................................................................................................77

3.6.2.4 Dialyse .............................................................................................................78

3.6.2.5 Sensorik-Schulung ...........................................................................................78

3.6.2.6 Prüferauswahl ..................................................................................................78

3.6.2.7 Sensorik ...........................................................................................................78

4. Ergebnisse ............................................................................................... 79

4.1 Analytik .......................................................................................................................79

4.1.1 Size-Exclusion HPLC ...........................................................................................79

4.1.1.1 Tosoh TSKgel G 3000 SWXL (7,8 mm x 30 mm, 5 µm) .....................................80

4.1.1.2 PSS Suprema 1000 Â (8 mm x 300 mm, 10 µm) .............................................82

4.1.1.3 Agiltent Zorbax GF 250 (4,6 mm x 250 mm, 4 µm) ..........................................83

4.1.1.4 Übertragung der Methode auf eine Agilent 1100 Series HPLC.........................85

4.1.2 Spektralphotometrische Proteingehaltbestimmung ...............................................87

4.1.2.1 Molkenprotein-Isolat .........................................................................................87

4.1.2.2 Alge (Chlorella vulgaris) ...................................................................................88

4.2 Hydrolyse ....................................................................................................................89

4.2.1 Alge (Chlorella vulgaris) .......................................................................................89

4.2.1.1 Behandlung mit Rohament® PL ........................................................................93

4.2.1.2 Behandlung mit HCl, pH 3 ................................................................................97

4.2.1.3 Vergleich – Behandlung mit HCl, pH 3 vs. Behandlung mit Rohament® PL .... 100

4.3 Crossflow-Diafiltration & Fraktionierung ..................................................................... 101

IV

4.3.1 Membran- & Anlagen-Charakterisierung ............................................................. 101

4.3.1.1 Molkenprotein-Isolat ....................................................................................... 106

4.3.1.2 Alge (Chlorella vulgaris) ................................................................................. 106

4.3.2 Einfluss des pH-Werts & der Ionenstärke ........................................................... 107



4.3.3 Einfluss der Ultraschall-Anwendung ................................................................... 138

4.3.4 Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose ........................................ 142

4.3.5 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed ..................... 144

4.4 Sensorik .................................................................................................................... 153

4.4.1 Schulung des Sensorik-Panels ........................................................................... 153

4.4.1.1 Prüfung auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014) .............. 153

4.4.1.2 Prüfung zur Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014) ... 154

4.4.1.3 Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle (gemäß ISO 3972:2011) ........ 160

4.4.1.4 Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes (gemäß DIN EN

ISO 8586:2014) ............................................................................................. 166

4.4.1.5 Schulung zur Anwendung der Skale .............................................................. 169

4.4.2 Prüferauswahl .................................................................................................... 169

4.4.3 Sensorik der Peptidfraktionen ............................................................................. 176

5. Diskussion ............................................................................................. 179

5.1 Analytik ..................................................................................................................... 179

5.2 Hydrolyse .................................................................................................................. 179

5.2.1 Alge (Chlorella vulgaris) ..................................................................................... 179

5.2.1.1 Zusammenfassung der Diskussionspunkte .................................................... 181

5.2.1.2 Zusammenfassung & Darstellung der Ergebnisse.......................................... 181

5.3 Crossflow-Diafiltration & Fraktionierung ..................................................................... 182

5.3.1 Membran- & Anlagencharakterisierung ............................................................... 182

5.3.1.1 Molkenprotein-Isolat & Alge (Chlorella vulgaris) ............................................. 182

5.3.2 Einfluss des pH-Werts & der Ionenstärke ........................................................... 183





5.3.3 Einfluss der Ultraschall-Anwendung ................................................................... 203



V

5.3.4 Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose ........................................ 207



5.3.5 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed ..................... 209



5.3.6 Einfluss weiterer Faktoren .................................................................................. 212

5.4 Sensorik .................................................................................................................... 217

5.4.1 Schulung des Sensorik-Panels ........................................................................... 217



5.4.2 Prüferauswahl .................................................................................................... 223



5.4.3 Sensorik der Peptidfraktionen ............................................................................. 226



5.5 Evaluation der Ergebnisse ......................................................................................... 234

5.5.1 Evaluation der Ergebnisse in Bezug auf die formulierten Hypothesen ................ 234

5.5.2 Methodische Aspekte ......................................................................................... 237

5.5.2.1 Rohstoffe ....................................................................................................... 237

5.5.2.2 Crossflow-Diafiltration .................................................................................... 238

5.5.2.3 Hydrolyse der Alge Chlorella vulgaris ............................................................. 241

5.5.2.4 Instrumentelle Analytik & Probenaufbereitung ................................................ 241

5.5.2.5 Sensorik ......................................................................................................... 242

5.5.3 Ausblick .............................................................................................................. 245

6. Zusammenfassung ................................................................................ 246

Literaturverzeichnis ..................................................................................... 250

Anhang ......................................................................................................... 294

Crossflow-Fraktionierung - Versuchsdaten ....................................................................... 294

Dialyse - Versuchsdaten .................................................................................................. 318

Hydrolyse - Versuchsdaten .............................................................................................. 319

Sensorik - Versuchsdaten ................................................................................................ 320

Publikationsliste .......................................................................................... 336

VI

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Klassifizierung der Trennverfahren (Kofod Nielsen, 2004; modifiziert) .......... 5

Abbildung 2: Gegenüberstellung - Crossflow Filtration und Dead-End Filtration (Bhave,

1997) ............................................................................................................ 6

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Konzentrationsprofils an der

Membranoberfläche (Hiersig, 1995) ............................................................. 8

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Konzentrationspolarisation (Chen et al., 1997;

modifiziert) .................................................................................................... 8

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Foulingmechanismen (Wang & Tarabara,

2008; modifiziert) .......................................................................................... 9

Abbildung 6: Sherwood-Zahl zur Charakterisierung des Stoffübergangs ..........................13

Abbildung 7: Einfluss einer Deckschichtausbildung auf den Flux JF,t in Abhängigkeit des

Transmembrandrucks ∆pTMP für Reinstwasser und ein beladenes Medium

(Irmler, 2001; modifiziert) .............................................................................15

Abbildung 8: Kritische Flux Bereich (Brans et al., 2004) ...................................................16

Abbildung 9: "harte/starke" und "weiche/schwache" Form des kritischen Flux JCF (Bacchin

et al., 2006) .................................................................................................17

Abbildung 10: Flux/Feed-Konzentration Abhängigkeit (links: Harker et al., 2013; modifiziert;

rechts: Cheryan, 1998; modifiziert) ..............................................................19

Abbildung 11: Einfluss der Feed-Konzentration CF auf den Permeatflux JF,t (links: She et al.,

2009; rechts: Tarleton & Wakeman, 1994) ..................................................19

Abbildung 12: Einfluss der Partikelgröße auf die foulinginduzierte Abnahme des Permeatflux

JF,t für niedrige (links) und hohe (rechts) Strömungsgeschwindigkeiten

(Tarleton & Wakeman, 1993) .......................................................................20

Abbildung 13: pH-Abhängigkeit des ζ-Potentials einer Polysulfon-Membran (Melin &

Rautenbach, 2007; modifiziert) ....................................................................22

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Porengrößenverteilung einer Membran

(Mulder, 1996) .............................................................................................23

Abbildung 15: BSA-Konzentration und Reinheit von Immunglobulin G (IgG) in Abhängigkeit

der Diavolumina-Anzahl Nd (Venkiteshwaran et al., 2008; modifiziert) .........24

Abbildung 16: Permeatflux JF,t in Abhängigkeit der Ultraschallfrequenz fUS einer 0,5 %igen

(w/w) Milchlösung (Kobayashi et al., 2003) ..................................................25

Abbildung 17: Abhängigkeit des Permeatflux von der Konzentration CF des Feed für die

Crossflow-Filtration von Molke mit und ohne die Verwendung von US

(Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al., 2005; modifiziert) .................25

Abbildung 18: Druckabhängige Änderung des Permeatflux bei der Crossflow-Mikrofiltration

von Bäcker-Hefe (Matsumoto et al., 1996) ..................................................26

VII

Abbildung 19: Schematische Darstellung des Dialyseprozess (Ballew, Martinez, Markee, &

Eddleman, 2002; modifiziert) .......................................................................27

Abbildung 20: Schematische Darstellung von Chlorella (links: Linne von Berg, Hoef-Emden,

& Melkonian, 2012, modifiziert) und transmissionselektronenmikroskopische

Aufnahme von Chlorella vulgaris (rechts: Yamamoto, Kurihara, & Kawano,

2005, modifiziert) .........................................................................................31

Abbildung 21: Zusammensetzung verschiedener Algen (Becker, 2007) .............................31

Abbildung 22: Aminosäurenprofil von Chlorella vulgaris (Safi et al., 2014; modifiziert;

basierend auf a Safi et al. 2012; b Faheed & Fattah, 2008 & Shaaban, 2001; c

Naik, Goud, Rout, & Dalai, 2010) ................................................................32

Abbildung 23: Hydrolyse einer Peptidbindung (Pasupuleti, Holmes & Demain, 2010;

basierend auf: Adler-Nissen, 1986) .............................................................33

Abbildung 24: Hydrolysegrad in Abhängigkeit der Zeit für die Hydrolyse von Chlorella mit

Subtilisin (Tchorbanov & Bozhkova, 1988; modifiziert) ................................35

Abbildung 25: Bestimmung von Totzeit t0/-Volumen V0 und Retentionszeit tr/-Volumen Vr

(Siouffi, 2000) ..............................................................................................36

Abbildung 26: Arbeitsweise einer Size-Exclusion Chromatography (Kremer & Bannwarth,

2014; modifiziert) .........................................................................................37

Abbildung 27: Geschmackrezeptoren - Geschmackspapillen, -Knospen und -Sinneszellen

(Becker-Carus & Wendt, 2017; modifiziert) ..................................................38

Abbildung 28: Bevorzugte Lokalisation der Geschmacksqualitäten auf der Zunge (Hatt,

2011; modifiziert) .........................................................................................40

Abbildung 29: Zusammenfassung der Geschmackstransduktion (Silverthorn, 2009;

modifiziert) ...................................................................................................40

Abbildung 30: Signaltransduktion in Geschmackszellen (Hatt, 2006; modifiziert) ...............41

Abbildung 31: Mechanismus der "süß"-, "bitter"- und "umami"-Wahrnehmung (Feher, 2017;

modifiziert) ...................................................................................................43

Abbildung 32: Schematische Darstellung des „Crosstalk“ zwischen "umami"- und "bitter"-

Rezeptoren (Temussi, 2009; modifiziert; basierend auf: Tomchik et al., 2007)

....................................................................................................................44

Abbildung 33: Schematische Darstellung möglicher Wirkmechanismen von Natrium-

Kationen während der „bitter“-Transduktion (Keast et al., 2001) ..................46

Abbildung 34: Schematischer Aufbau der Crossflow-Anlage ..............................................51

Abbildung 35: Schematischer Ablauf der Diafiltration .........................................................55

Abbildung 36: Schematischer Aufbau der Crossflow-Anlage mit Ultraschalleinheit ............57

Abbildung 37: Schematischer Aufbau der Crossflow- Anlage (RC-Membran) ....................59

Abbildung 38: Schematische Übersicht der Dialyseversuche .............................................60

VIII

Abbildung 39: Schematische Übersicht der Hydrolyseversuche .........................................62

Abbildung 40: Ablaufplan der Sensorik-Schulung...............................................................69

Abbildung 41: 7-Punkt Skale zur Bewertung der Prüfproben ..............................................72

Abbildung 42: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des

BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL –

Puffer: 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer +0,05 % NaN3, pH 6,7, quantitative

Darstellung ..................................................................................................80


BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL

– Puffer: 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,1 mol/l Na2SO4 + 0,05 % NaN3,

pH 6,7, quantitative Darstellung ...................................................................81


BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL

– Puffer: 0,2 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,2 mol/l Na2SO4 + 0,05 % NaN3,

pH 7, quantitative Darstellung ......................................................................81


BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: PSS Suprema 1000 Â – Puffer:

0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer +0,05 % NaN3, pH 6,9, quantitative

Darstellung ..................................................................................................82




Darstellung ..................................................................................................83




Darstellung ..................................................................................................83


BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Agilent Zorbax GF 250 – Puffer:

0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3, pH 6,9, quantitative

Darstellung ..................................................................................................84




Darstellung ..................................................................................................84



IX


Darstellung ..................................................................................................85




Darstellung ..................................................................................................86

Abbildung 52: Kalibrationsfunktion für die photometrische Bestimmung des Proteingehlts von

hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat bei 280 nm ..........................................87

Abbildung 53: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von

hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) bei 280 nm ......................................88

Abbildung 54: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit Pronase

(0,25 % (112,5 PU); 45 min), qualitative Darstellung ...................................90


(0,50 % (225 PU); 45 min), qualitative Darstellung ......................................90

Abbildung 56: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit

Pancreatin (0,25 % (20 USP); 10 min), qualitative Darstellung ....................92


(0,25 % (112,5 PU); 10 min), qualitative Darstellung ...................................92

Abbildung 58: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der

Dauer der Vorbehandlung mit Rohament® PL .............................................93

Abbildung 59: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris mit a)

Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: Rohament® PL, 18 h) und

b) Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: Rohament® PL, 18 h),

qualitative Darstellung .................................................................................95









Abbildung 62: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der

Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3 .....................................................97


Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 18 h) und b)

X

Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 18 h), qualitative

Darstellung ..................................................................................................99

Abbildung 64: Molekülgrößenverteilung - Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris mit a)

Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 48 h) und b)

Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 48 h), qualitative

Darstellung ..................................................................................................99

Abbildung 65: Gelelektrophorese der Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

.................................................................................................................. 102

Abbildung 66: Molekülgrößenverteilung - SE-HPLC-Chromatogramme von fraktioniertem,

hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Feed-Konzentration 3 % (bezogen auf

den Proteingehalt) a) Fraktion > 50 kDa b) Fraktion < 50 kDa – 30 kDa,

quantitative Darstellung ............................................................................. 104

Abbildung 67: Molekülgrößenverteilung - SE-HPLC-Chromatogramme von fraktioniertem,

hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Feed-Konzentration 1,5 % (bezogen auf

den Proteingehalt) a) Fraktion > 100 kDa b) Fraktion < 100 kDa, qualitative

Darstellung ................................................................................................ 105

Abbildung 68: Membrancharakterisierung 100 kDa – hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat106

Abbildung 69: Membrancharakterisierung 100 kDa – hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris)

.................................................................................................................. 107

Abbildung 70: Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von

pH-Wert und Ionenstärke .......................................................................... 109

Abbildung 71: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke .......... 110

Abbildung 72: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke .......... 111

Abbildung 73: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Nullprobe für die

Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat, pH 4, a) ohne NaCl

b) mit NaCl, qualitative Darstellung ............................................................ 114










XI




Abbildung 78: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentat- und

Permeatfraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der

Ionenstärke, pH 6, a) Retentat ohne NaCl b) Permeat ohne NaCl c) Retentat

mit NaCl d) Permeat mit NaCl, qualitative Darstellung ............................... 118













Abbildung 82: Permeatflux von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von

pH-Wert und Ionenstärke .......................................................................... 123

Abbildung 83: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysierter Alge

(Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke ............ 124

Abbildung 84: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysierter Alge

(Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke ............ 124


Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, a) ohne NaCl











XII


Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris), pH 11, a) ohne

NaCl b) mit NaCl, qualitative Darstellung ................................................... 131


Permeatfraktion von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit

der Ionenstärke, pH 3, a) Retentat ohne NaCl b) Permeat ohne NaCl c)

Retentat mit NaCl d) Permeat mit NaCl, qualitative Darstellung ................ 133

















Abbildung 95: Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit einer

Ultraschall-Anwendung .............................................................................. 139

Abbildung 96: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung ........... 139

Abbildung 97: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat n in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung ........ 139



Anwendung von Ultraschall, pH 7, a) Retentat & Permeat ohne US, Wdh. 1 b)

Retentat & Permeat mit US, Wdh. 1 c) Retentat & Permeat ohne US, Wdh. 5

d) Retentat & Permeat mit US, Wdh. 5, qualitative Darstellung ................. 141


Permeatfraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat unter Verwendung

XIII

einer RC-Membran, pH 9, a) Retentat, b) Permeat, qualitative Darstellung

.................................................................................................................. 142

Abbildung 100: Ausflockung einer Dialyseprobe (pH 9, 48 h) ............................................. 146

Abbildung 101: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der

Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach

Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 3, 1 %, 24 h, b) pH 5, 1 %, 24 h,

c) pH 6, 1 %, 24 h, d) pH 7,5, 1 %, 24 h, qualitative Darstellung ................ 147



Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 9, 1 %, 24 h, b) pH 11, 1 %, 24

h, qualitative Darstellung ........................................................................... 148







Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts a) pH 9, 2 %, 48 h, b) pH 11, 2 %, 48








Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 3, 1 %, 24 h, b) pH 5, 1 %, 24 h,

c) pH 6, 1 %, 24 h, d) pH 7,5, 1 %, 24 h, quantitative Darstellung ............. 150




h, quantitative Darstellung ......................................................................... 151







XIV

Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts a) pH 9, 2 %, 48 h, b) pH 11, 2 %, 48






Abbildung 111: Grafische Darstellung der a) Prüfersensibilität, b) Reiz- und

Erkennungsschwelle „süß“ ........................................................................ 161


Erkennungsschwelle „sauer“ ..................................................................... 162

Abbildung 113: Grafische Darstellung der a)Prüfersensibilität, b) Reiz- und

Erkennungsschwelle „salzig“ ..................................................................... 163


Erkennungsschwelle „bitter“ ...................................................................... 164


Erkennungsschwelle „umami“ .................................................................... 165

Abbildung 116: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierten Molkenprotein-Isolats

(Retentat > 100 kDa, pH 9; Permeat < 100 kDa, pH 9) .............................. 178

Abbildung 117: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)


XV

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Zusammensetzung und Eigenschaften der Milchproteinfraktionen (Ternes,

2008; Topel, 2004; modifiziert) ....................................................................28

Tabelle 2: Zusammensetzung des Molkenprotein-Isolats "Thermax 690" (Glanbia

Nutritionals Ltd., 2012) ................................................................................49

Tabelle 3: Aminosäure-Profil des Molkenprotein-Isolats „Thermax 690“ (Glanbia

Nutritionals Ltd., 2012) ................................................................................50

Tabelle 4: Zusammensetzung des Algen-Pulvers „Chlorella vulgaris Powder“ (Allma,

2014) ...........................................................................................................50

Tabelle 5: Charakterisierte UF- und NF-Membranen des Herstellers Microdyn Nadir

GmbH (Wiesbaden, GER) ...........................................................................52

Tabelle 6: 100 kDa UF-Membranen (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden, GER) ..........53

Tabelle 7: Übersicht – Nutschenfilter ...........................................................................53

Tabelle 8: Übersicht - pH-Werte je Proteinquelle .........................................................54

Tabelle 9: Pumpenfördermengen und daraus resultierenden

Strömungsgeschwindigkeiten ......................................................................55

Tabelle 10: Übersicht - Parameter der Crossflowfraktionierung .....................................56

Tabelle 11: Herstellerangaben zu den Enzymen Corolase, Pronase und Pancreatin .....61

Tabelle 12: Herstellerangaben zu Rohament® PL ..........................................................62

Tabelle 13: Konzentrationsstufen CF der Kalibrationslösungen ......................................64

Tabelle 14: SEC-Säulen und zugehöriger Anlagenfluss .................................................67

Tabelle 15: Laufmittel zur SE-HPLC Methodenerstellung ..............................................68

Tabelle 16: Rohstoffe zur Herstellung der Schulungsstandards .....................................69

Tabelle 17: Probenkonzentrationen für die Prüfung auf Geschmacksblindheit ...............70

Tabelle 18: Probenkonzentrationen zur Wahrnehmung eines Reizes ............................70

Tabelle 19: Probenkonzentrationen C zur Ermittlung der Reiz-/Erkennungsschwelle.....71

Tabelle 20: Probenkonzentrationen C zur Prüfung zur Unterscheidung von

Intensitätsstufen eines Reizes .....................................................................71

Tabelle 21: Probenkonzentrationen C und Skalenwerte zur Schulung zur Anwendung der

Skale ...........................................................................................................72

Tabelle 22: Probenkonzentrationen C für die sensorische Bewertung der Peptidfraktionen

....................................................................................................................73

Tabelle 23: Zusammensetzung des BioRad Gel-Filtration Standards # 151-1901 (BioRad

Laboratories, Inc., n.d.) ................................................................................79

Tabelle 24: Retentionszeiten tr und prozentuale Standardabweichung (SD) der

Komponenten des BioRad Gel-Filtration Standards ....................................86

XVI

Tabelle 26: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der

Dauer der Vorbehandlung mit Rohament® PL .............................................94


Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3 .....................................................98


Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3 und Rohament® PL .................... 100

Tabelle 28: Laufzeit tFm & Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in

Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke .............................................. 108

Tabelle 29: Absolute Proteingehalte von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Retentat

und Permeat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke ..................... 110

Tabelle 30: Wiederfindungsrate und Anteile der Retentat- und Permeat-Fraktion bei der

Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat ............................ 112

Tabelle 31: Laufzeit tFm & Permeatflux JFm von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in

Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke .............................................. 122

Tabelle 32: Absolute Proteingehalte von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in

Retentat und Permeat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke ....... 123


Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ........................ 126

Tabelle 34: Bestimmtheitsmaß R2 und pH-Mittelwert, -Minima und -Maxima der

Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ........................ 127

Tabelle 35: Laufzeit tFm, Permeatflux JFm und absolute Proteingehalte der Retentat- und

Permeat-Fraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der

Anwendung von Ultraschall ....................................................................... 138


Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der

Anwendung von Ultraschall ....................................................................... 140

Tabelle 37: Laufzeit tFm, Permeatflux JFm und absolute Proteingehalte der Retentat- und

Permeat-Fraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat ....................... 143

Tabelle 38: Absoluter Proteingehalt der Dialyseproben (Retentat) von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat vor (mvD) und nach (mnD) der Dialyse in Abhängigkeit von

pH-Wert, Konzentration und Dialysedauer ................................................. 144

Tabelle 39: Ergebnisse des Tests auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO

8586:2014) ................................................................................................ 154

Tabelle 40: Ergebnisse des Test zur Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes (gemäß

DIN EN ISO 8586:2014) ............................................................................ 155


DIN EN ISO 8586:2014) - Fortsetzung ...................................................... 156

XVII





Tabelle 44: Gruppenauswertung des Test zur Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes

(gemäß DIN EN ISO 8586:2014) ............................................................... 159

Tabelle 45: Anteil der Prüferpersonen die eine Geschmacksausprägung erkennen –

Verlauf der Schulung - Tag 1 – Tag 3 ........................................................ 159

Tabelle 46: Reiz- und Erkennungsschwelle "süß" ........................................................ 161

Tabelle 47: Reiz- und Erkennungsschwelle "sauer" ..................................................... 162

Tabelle 48: Reiz- und Erkennungsschwelle "salzig" ..................................................... 163

Tabelle 49: Reiz- und Erkennungsschwelle "bitter" ...................................................... 164

Tabelle 50: Reiz- und Erkennungsschwelle "umami" ................................................... 165

Tabelle 51: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Friedman-Test ................................ 166

Tabelle 52: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Wilcoxon-Test................................. 167

Tabelle 53: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Mittlerer Rang ................................. 168

Tabelle 54: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer – Deskriptive Teststatistik der

Rangordnungstests ................................................................................... 168

Tabelle 55: Skalenbewertungen der Prüfer - Deskriptive Statistik der Skalenschulung 169

Tabelle 56: Prüferauswahl - Friedman-Test zur Überprüfung der Diskriminierungsfähigkeit

.................................................................................................................. 171

Tabelle 57: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „süß“

.................................................................................................................. 172

Tabelle 58: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „salzig“

.................................................................................................................. 172

Tabelle 59: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „sauer“

.................................................................................................................. 173

Tabelle 60: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „bitter“

.................................................................................................................. 174

Tabelle 61: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „umami“

.................................................................................................................. 174

Tabelle 62: Prüferauswahl - Panelhomogenität "süß" .................................................. 175

Tabelle 63: Prüferauswahl - Panelhomogenität "sauer" ............................................... 175

Tabelle 64: Prüferauswahl - Panelhomogenität "salzig" ............................................... 175

Tabelle 65: Prüferauswahl - Panelhomogenität "bitter" ................................................ 176

Tabelle 66: Prüferauswahl - Panelhomogenität "umami" .............................................. 176

XVIII

Tabelle 67: Sensorische Bewertung – Fraktionen hydrolysierten Molkenprotein-Isolats


Tabelle 68: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)


Tabelle 70: Konzentrationen der Erkennungsschwelle verschiedener Geschmacksstoffe

(Schiffman et al., 19901; Paulus & Reisch, 19802; Pfaffmann et al., 19713) 219

XIX

Formelverzeichnis

Formel 1: Hagen-Poiseulle Gleichung – Flux durch Membran, ideal ...........................10

Formel 2: Transmembrandruck, ideal ..........................................................................11

Formel 3: Massenbilanz der Konzentrationspolarisation ..............................................11

Formel 4: Permeatflux JP,t bei Konzentrationspolarisation nach dem Gel-Polarisations-

Modell .........................................................................................................12

Formel 5: Stoffüberhangskoeffizient k .........................................................................12

Formel 6: Filtrationswiderstand RT ...............................................................................14

Formel 7: Darcy-Gleichung - Flux durch Membran in Abhängigkeit fluxreduzierender

Parameter ...................................................................................................14

Formel 8: Widerstand durch Fouling ............................................................................14

Formel 9: Degree of Hydrolysis ...................................................................................33

Formel 10: Berechnung von h .......................................................................................67

Formel 11: Rechnerische Angleichung der Prozesslaufzeit in Abhängigkeit des

Permeatvolumen und des Initialflux der Membran mit destilliertem Wasser .74

Formel 12: Rechnerische Angleichung des Permeatvolumens der performanteren

Vivaflow-Einheit ...........................................................................................75

Formel 13: Rechnerische Angleichung des Permeatvolumens der weniger performanten

Vivaflow-Einheit ...........................................................................................75

Formel 14: Rechnerische Angleichung der Prozesszeit in Abhängigkeit des

Permeatvolumens .......................................................................................75

Formel 15: Rechnerische Ermittlung der absoluten Proteinmengen ..............................76

Formel 16: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von

hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat ............................................................88

Formel 17: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von

hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ........................................................88

XX

Abkürzungen

AS Aminosäure

ANOVA Analysis of Variance

AOAC Association of Analytical Communities

BSA Bovine-Serum-Albumin

CA Cellulose Acetat

CFF Crossflow Filtration

CDF Continuous Diafiltration/Kontinuierliche Diafiltration

DDF Discontinuous Diafiltration/Diskontinuierliche Diafiltration

DH Degree of Hydrolysis/Hydrolysegrad

DIN Deutsches Institut für Normung

EH-W extensively hydrolysed whey/extensiv hydrolysiertes

Molkenprotein

EPS extrazellulärer polymerer Substanzen

EOM extracellular organic matter/extrazelluläre organische

Substanzen

EU Europäischen Union

ES Erkennungsschwelle

GPC Gel Permeation Chromatography

H2O Wasser

HCl Salzsäure

HMW high molecular weight/hochmolekular

HIC Hydrophobic-Interaction Chromatography

IBM International Business Machines Corporation

IEP Isoelektrischer Punkt

IgG Immunglobulin G

IUB International Union of Biochemistry

XXI

KCl Kaliumchlorid

kDa Kilo-Dalton

kHz Kilo-Hertz

LMW low molecular weight/niedermolekular

MF Mikrofiltration

MgCl2 Magnesiumchlorid

MSG Monosodium L-Glutamat

MMW middle molecular weight/mittelmolekular

MWCO Molecular Weight Cut-Off

NaCl Natriumchlorid

NaOH Natriumhydroxyd

NaN3 Natriumazid

Na2SO4 Natriumsulfat

n. d. nicht datiert

NF Nanofiltration

NP-HPLC Normal Phase High Pressure Liquid Chromatography

NSF National Sanitation Foundation

OPA O-phthaldialdehyd

PES Polyethersulfon

PH-W partially hydrolysed whey/teilhydrolysiertes Molkenprotein

PS Polysulfon

PSS Polymer Standards Service

RC Regenerierte Celluose

RPS released polysaccharide/freie Polysaccharide

RS Reizschwelle

RP-HPLC Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography

XXII

S Schwefel

SD Standardabweichung

SE-HPLC Size Exclusion High Pressure Liquid Chromatography

TFF Tangentialfluss Filtration

TNBS Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid

TOC total organic carbon/Gesamter organischer Kohlenstoff

UF Ultrafiltration

US Ultraschall

VD Verdünnungsfaktor

WFR Wiederfindungsrate

WPC Whey Protein Concentrate/Molkenprotein-Konzentrat

WPH Whey Protein Hydrolysate/Molkenprotein-Hydrolysat

WPI Whey Protein Isolate/Molkenprotein-Isolat

XXIII

Formelzeichen

a Konstante (Charakterisierung der Strömungskanalgeometrie)

α‘ Exponent (Abhängig von Strömungsform)

β‘ Exponent (Abhängig von Strömungsform)

C Konzentration eines Stoffes

CF Konzentration des Feeds

CS Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Mediums

CS-Ret spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Retentats

CS-Per spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Permeats

CS-vD Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Feeds vor

Dialyse

CS-nD Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Retentats

nach Dialyse

CM Konzentration an der Membranoberfläche

δ Dicke der Grenzschicht

D Diffusions-Koeffizient

dH Hydraulischer Durchmesser

ε Porosität der Membranoberfläche

fUS Frequenz des Ultraschalls

h Anzahl hydrolysierter Peptidbindungen

htot Gesamtzahl der Peptidbindungen pro Protein-Äquivalent

JF,t Permeatflux zum Messzeitpunkt t

JFm/ JFmOUS Mittlerer/durchschnittlicher Permeatflux (ohne den Einfluss von

Ultraschall)

JFmUS Mittlerer/durchschnittlicher Permeatflux unter Einfluss von

Ultraschall

JCF Critical Flux/Kritischer (Permeat-)Flux

JD Rückdiffusion von der Membran

XXIV

JK Konvektion zur Membran

JLF Limitierender Permeatflux

JV-W-max Permeatflux von dest. Wasser der performanter Vivaflow-

Einheit

JV-W-min Permeatflux von dest. Wasser der weniger performanten

Vivaflow-Einheit

JV-W-Initial Initialflux von dest. Wasser einer Vivaflow-Einheit

JV-W-W Permeatflux von dest. Wasser einer Vivaflow-Einheit vor Start

eines Wiederholungsversuchs

JV-Wvor-OUS Permeatflux von dest. Wasser einer neuen Membran (die ohne

die Verwendung von Ultraschall betrieben wird)

JV-Wvor-US Permeatflux von dest. Wasser einer neuen Membran (die unter

Verwendung von Ultraschall betrieben wird)

JWnach Permeatflux von dest. Wasser einer gereinigten Membran

JWvor Permeatflux von dest. Wasser einer neuen Membran

k Stoffübergangskoeffizient

mPer absolute Proteinmenge im Permeat

mRet absolute Proteinmenge im Retentat

mvD absolute Proteinmenge vor Dialyse

mnD absolute Proteinmenge im Retentat nach Dialyse

Mr Molmasse

η Dynamische Viskosität

pCP Critical Pressure/Kritischer Druck

pA Ausgangsdruck

pE Eingangsdruck

pF Filtratseitiger Druck

pTMP/∆pTMP Transmembrandruck

pTMP(ideal)/∆pTMP(ideal) Transmembrandruck, ideal

XXV

r Mittlerer Porenradius

RAD Widerstand durch Adsorption

Re Reynolds-Zahl

RF Widerstand durch Fouling

RiF Widerstand durch irreversibles Fouling

RKP Widerstand durch Konzentrationspolarisation

RM Membranwiderstand

RrF Widerstand durch reversibles Fouling

RT Kombinierter Filtrationswiderstand

Sc Schmidt-Zahl

Sh Sherwood-Zahl

∑ Summe

t Prozesslaufzeit

TCF Temperatur des Feeds

TOH Temperaturoptimum des Enzyms der Hydrolyse

tDL Dauer der Dialyse

tE Dauer der Enzymeinwirkung

tEV Dauer der enzymatischen Vorbehandlung

tF Unkorrigierte Prozesslaufzeit des Versuchs

tFm Mittlere/durchschnittliche korrigierte Prozesslaufzeit

tF-korrigiert Korrigierte Prozesslaufzeit des Versuchs

tVF Unkorrigierte Prozesszeit einer Vivaflow-Einheit nach

Performanceanpassung

tVF-korrigiert Korrigierte Prozesszeit einer Vivaflow-Einheit nach

Performanceanpassung

tr Retentionszeit

TSV Dauer der sauren Vorbehandlung (HCl, pH 3)

XXVI

TWH Temperatur des Wasserbads zur Temperierung des

Rotationsverdampfers

TWK Temperatur des Wasserbads zur Kondensation des verdampften

Wassers

ʋ Strömungsgeschwindigkeit

ϑ Kinematische Viskosität

VDia Diavolumen

VPer Volumen des Permeats

VPer,t Volumen des Permeats zum Messzeitpunkt t

VPer-ist Permeat-Volumen des Versuchs

VPer-max Maximale Permeatmenge einer Versuchsreihe

Vr Retentionsvolumen

VRet Volumen des Retentats

VV-Per-korrigert korrigiertes Permeatvolumen

VV-Per-korrigert,t korrigiertes Permeatvolumen zum Messzeitpunkt t

WFRRet Wiederfindungsrate im Retentat

WFRPer Wiederfindungsrate im Permeat

xA Abstand zur Membran

xM Porenlänge/Membrandicke

yExtinktion Spektralphotometrisch ermittelte Extinktion

yEx-vD Extinktion des Feeds vor Dialyse

.yEx-nD Extinktion des Retentats nach Dialyse

yEx-Ret Spektralphotometrisch ermittelte Extinktion des Retentats

yEx-Per Spektralphotometrisch ermittelte Extinktion des Permeats

γM Scherrate an der Membranoberfläche

XXVII

Kurzfassung

Bestimmte Peptidverbindungen besitzen Geschmacksqualitäten, welche sie für einen Einsatz

in Lebensmitteln qualifizieren. Neben einer chemischen Synthese bestimmter Verbindungen

können Peptide auch durch Hydrolyse intakter Proteine gewonnen werden. Zur Trennung und

Aufreinigung stellt die Crossflow-Filtrationstechnik eine skalierbare Alternative zu

chromatographischen Trennverfahren dar.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Crossflow-Diafiltrationsverfahren unter Verwendung

hydrophilisierter Polysulfon-Membranen (MWCO: 100 kDa) entwickelt, um hydrolysierte

Protein-Feeds aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat, sowie hydrolysierter Alge Chlorella

vulgaris zu fraktionieren. Zur Optimierung des Fraktionierungsprozesses wurde der Einfluss

von pH-Wert und Ionenstärke (Anpassung durch Zugabe von 150 mM NaCl) auf Permeatflux,

Wiederfindungsrate, Transmission und die mittels SE-HPLC ermittelten molekulare

Zusammensetzung der Fraktionen beider Proteinquellen bestimmt. Ausgewählte Retentat-

und Permeatfraktionen wurden mittels eines im Zuge der Studie geschulten Sensorik-Panels

hinsichtlich der fünf Grundgeschmacksarten „süß“, „sauer“, „salzig“, „bitter“ und „umami“,

sowie ihrer Eignung als „bitter“-Blocker bewertet. Darüber hinaus wurde die Eignung von

Ultraschall (35 kHz) und die Verwendung alternativer Membranmaterialien zur Verbesserung

des Fraktionierungsprozesses, sowie die Eignung der Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle

(< 2 kDa) aus dem vorfiltrierten Feed, überprüft.

Bei der Fraktionierung hydrolysierten Molkenprotein-Isolats wirkte sich der pH-Wert nicht

signifikant auf Permeatflux, Wiederfindungsrate und Transmission aus. Die Erhöhung der

Ionenstärke durch Zugabe von 150 mM NaCl resultierte in einem für die pH-Stufen pH 7, pH

8, pH 9 signifikant erhöhten Permeatflux. Die Wiederfindungsrate wurde in diesem Zuge für

die pH-Stufen pH 8, pH 9 jedoch signifikant verringert. Die chromatographisch ermittelte

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen offenbarte einen weitestgehend pH-unabhängigen

Rückhalt von Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat, bei gleichzeitig hohem Rückhalt von Strukturen

≤ 1,35 kDa, sowie geringe Anteile an Verbindungen ≥ 20 kDa im Permeat. Die Erhöhung der

Ionenstärke wirkte sich positiv auf den Anteil an Verbindungen ≥ 20 kDa im Permeat aus.

Bei der Fraktionierung hydrolysierter Alge Chlorella vulgaris wirkte sich der pH-Wert nicht

signifikant auf Permeatflux und Wiederfindungsrate aus. Die Erhöhung der Ionenstärke führte

für die pH-Stufen pH 7 und pH 11 zu signifikant geringerem Permeatflux. Unabhängig vom pH-

Wert wurden in Retentat und Permeat hauptsächlich Strukturen ≤ 1,35 kDa festgestellt. Die

Erhöhung der Ionenstärke führte für die pH-Stufen pH 3, pH 6 und, in geringem Umfang, pH 8

zu erhöhten Anteilen an Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat.

XXVIII

Bei der sensorischen Bewertung der Fraktionen aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

wurde im Retentat ein sehr schwacher „süß“-, im Permeat ein schwacher „salzig“-Geschmack

identifiziert. Die Retentatfraktion hydrolysierter Alge Chlorella vulgaris wurden als schwach

„salzig“-, sowie sehr schwach „umami“ schmeckend, die Permeatfraktion als schwach „salzig“,

sowie sehr schwach „sauer“ und „umami“ beschrieben. Die „bitter“-Ausprägung des Koffein-

Standard (0,22 g/l) konnte durch Zugabe von Permeat (1g/l) signifikant reduziert werden.

Der Einsatz von Ultraschall (35 kHz), sowie alternativen Membranmaterialien erwies sich im

Rahmen dieser Studie als nicht für die Optimierung des Fraktionierungsprozess geeignet. Der

Anteil an Molekülen < 2 kDa konnten für Feed-Konzentration zwischen 1 % (w/v) und 4 % (w/v)

durch Dialyse verringert werden.

XXIX

Abstract

Certain peptide compounds have taste qualities which qualify them for the use in foods. In

addition to chemical synthesis of certain compounds, peptides can also be obtained by

hydrolysis of intact proteins. For separation and purification purposes, the crossflow filtration

technology represents a scalable alternative to chromatographic separation processes.

In this work, a crossflow diafiltration process, using hydrophilized polysulfone membranes

(MWCO: 100 kDa) was developed to fractionate hydrolysed protein feeds from hydrolyzed

whey protein isolate, as well as hydrolyzed alga chlorella vulgaris. The influence of pH and

ionic strength (adaptation by addition of 150 mM NaCl) on permeate flux, recovery,

transmission and molecular composition (determined by SE-HPLC) of the fractions of both

protein sources was determined to optimize the fractionation process. Selected retentate and

permeate fractions were evaluated with regard to the five basic tastes "sweet", "sour", "salty",

"bitter" and "umami" and their qualification as "bitter"-blocker, using a trained sensory panel.

In addition, the qualification of ultrasound (35 kHz) and the use of alternate membrane

materials to improve the fractionation process, as well as the qualification of dialysis for the

separation of small molecules (< 2 kDa) from the prefiltered feed was checked.

For hydrolyzed whey protein isolate fractionation, pH did not significantly affect permeate flux,

recovery and transmission. The increase of the ionic strength by addition of 150 mM NaCl

resulted in a significantly increased permeat flux for pH 7, pH 8 and pH 9. However, the

recovery rate was significantly reduced for pH 8 and pH 9. The chromatographically

determined molecular size distribution of the fractions revealed a largely pH-independent

retention of structures ≥ 20 kDa in the retentate, with simultaneously high retention of

structures ≤ 1.35 kDa and low proportion of compounds ≥ 20 kDa in the permeate. The

increase in the ionic strength had a positive effect on the proportion of compounds ≥ 20 kDa

in the permeate.

For hydrolyzed algae chlorella vulgaris fractionation, pH did not significantly affect permeate

flux and recovery. The increase of the the ionic strength led to significantly lower permeate flux

for pH 7 and pH 11. Regardless of the pH, mainly structures ≤ 1.35 kDa were found in the

retentate and permeate. The increase of the ionic strength led to increased proportions of

structures ≥ 20 kDa in the retentate for pH 3, pH 6 and, to a lesser extent, pH 8.

In the sensory evaluation of the fractions of hydrolysed whey protein isolate a very weak

"sweet" taste was noted in the retentate and a weak "salty" taste was identified in the permeate.

The retentate fraction of hydrolyzed algae chlorella vulgaris were described as weak "salty",

as well as very weak "umami", the permeate fraction was described as slightly "salty", as well

XXX

as very weak "sour" and "umami". The "bitter" expression of the caffeine standard (0.22 g/l)

could be significantly reduced by adding permeate (1 g/l).

The use of ultrasound (35 kHz), as well as alternate membrane materials, did not prove

suitable for optimizing the fractionation process in this study. The proportion of molecules

< 2 kDa could be reduced for feed concentration between 1 % (w/v) and 4 % (w/v) by dialysis.

Einleitung, Zielsetzung & Hypothesenformulierung

1

1. Einleitung, Zielsetzung & Hypothesenformulierung

1.1 Einleitung

Der Ersatz von Lebensmittelinhaltsstoffen wie Zucker oder Salz durch Stoffe mit

vergleichbaren Eigenschaften hat eine lange Tradition. Die bekanntesten Beispiele hierfür sind

die Zuckerersatzstoffe Saccharin und Aspartam, die 1878 bzw. 1965 entdeckt wurden, oder

das in der Europäischen Union (EU) im Jahre 2011 zugelassene Stevia (Buddrus, 2011;

Verordnung (EU) Nr. 1131/2011, 2011; Pilz, 2010). Ersatzstoffe verfügen, gestützt durch

ausgeklügelte Marketingstrategien, über ein großes Absatzpotential im Lebensmittelsektor

und rücken so immer weiter in den Mittelpunkt der Forschung (Pförtsch & Müller, 2006).

Gerade große Unternehmen sichern potentielle Stoffe gerne frühzeitig durch Patente ab

(Kienle, 2010).

Peptidverbindungen gewannen hierbei schon früh an Bedeutung, wie sich z. B. anhand von

Aspartam belegen lässt (Ternes, 2008; Pförtsch & Müller, 2006). Aber auch bisher kommerziell

nicht genutzte Verbindungen wie Brazzein sind bereits seit einiger Zeit Gegenstand der

Forschung (Temussi, 2002; Assadi-Porter, Aceti, Cheng, & Markley, 2000; Ming & Hellekant,

1994). Neben Süßstoffen und Bitterkomponenten lassen sich aus Peptiden und

Peptidverbindungen auch „umami“ und „sauer“ schmeckende Stoffe realisieren (Temussi,

2012; Kirimura, Shimizu, Kimizuka, Ninomiya, & Katsuya, 1969).

Der Einfluss der Peptidstruktur auf die Geschmacksqualitäten von Peptiden ist sehr komplex.

Bereits Kirimura et al. (1969) führten die verschiedenen Geschmacksausprägungen auf

unterschiedliche chemische Strukturen zurück. „sauer“ schmeckende Peptide sind

beispielsweise reich an Säureresten, bittere Peptide verfügen hingegen über einen hohen

Gehalt an hydrophoben Resten. Der Verlust der Peptid-Sekundärstruktur erhöht den

Bittergeschmack zusätzlich (Ternes, 2008). Mazur et al. (1969) belegten für den Süßstoff

Aspartam einen Einfluss der Peptidkonformation auf die Geschmacksqualität. Nur die L-

Konformation des Stoffes (L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester) verfügt über eine stark

süßende Wirkung. Alle weiteren chiralen Isomere schmecken bitter (Mazur et al., 1969).

Ähnliches scheint auch für andere, sowohl nieder- als auch hochmolekulare Verbindungen zu

gelten (Ternes, 2008). Solms et al. (1965) untersuchten 18 Aminosäuren auf, mit der

Konformation verknüpfte, Änderungen des Geschmacks und dokumentierte z.B. für L-Leucin

einen bitteren Geschmack, wohingegen D-Leucin süß schmeckt. Des Weiteren konnte bei

vorwiegend geschmacklosen Aminosäuren wie dem L-Arginin in der D-Form ein leicht süßer

Geschmack festgestellt werden (Solms et al., 1965).


2

Neben Aspartam existieren auch noch weitere Aminoverbindungen mit hoher Süßkraft.

Darunter fallen Thaumatin, Monellin, Brazzein, Pentadin, Curculin und Mabinlin. Für die

Industrie sind hiervon insbesondere Thaumatin (hohe Thermostabilität), Brazzein

(kostengünstige Herstellung) und Curculin (Umwandlung von „sauer“ in „süß“) interessant

(Ternes, 2008).

Die Erzeugung und Erforschung von Proteinen deren Peptidfraktionen besondere

Geschmacksqualitäten aufweisen ist einer Vielzahl von Faktoren unterworfen, sodass neue

Stoffe oftmals nur zufällig entdeckt werden (Ley, 2008; Mazur et al., 1969). Neben der zumeist

aufwendigen, chemischen Synthese von Peptiden besteht die Möglichkeit verschiedenste

Peptide durch die Hydrolyse von intakten Proteinen zu erzeugen. Dabei entsteht ein Vielzahl

verschiedener Peptide unterschiedlicher chemischer Struktur (Wong & Whitesides, 1994; Jung

& Beck-Sickinger, 1992; Bodanszky, 1984). Die Fraktionierung dieser Peptide kann, in

Labormaßstab, beispielsweise mittels Gel-Permeation Chromatography (GPC) in Verbindung

mit Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography (RP-HPLC) erfolgen

(Schlichtherle-Cerny & Amadò, 2002). Im Hinblick auf eine großtechnische Anreicherung

stellen Membrantrennverfahren eine vielversprechende Alternative zu den technisch

aufwendigen Chromatographieverfahren dar.

Membrantrennverfahren finden bereits seit vielen Jahren in der Lebensmittelindustrie

Verwendung. Besonders im Bereich der Gewinnung von Molkenprotein-Konzentraten und der

Aufreinigung von Molke gibt es zahlreiche Veröffentlichungen, welche die Fortschritte

dokumentieren (Saxena, Tripathi, Kumar, & Shahi, 2009; Zydney, 1998). Für die

Fraktionierung intakter Proteine sind eine Vielzahl von Einflussfaktoren verifiziert. Durch

gezielte Steuerung von pH, Feed-Konzentration, Ionenstärke oder die Verwendung von

Ultraschall lassen sich Flux und Ausbeute verbessern, sowie unerwünschtes Fouling

reduzieren (Almécija, Ibáñez, Guadix, & Guadix, 2007; de la Casa, Guadix, Ibáñez, & Guadix,

2007; Huisman, Prádanos, & Hernández, 2000; Balakrishnan & Agarwal, 1996; Chai,

Kobayashi, & Fujii, 1998).

1.2 Zielsetzung & Hypothesenformulierung

Ziel des Forschungsvorhabens ist die Entwicklung einer Methode zur Fraktionierung von

hydrolysierten Proteinquellen. Hintergrund des Vorhabens ist die Überprüfung der Nutzung

eines Membrantrennverfahrens für die Gewinnung funktioneller Fraktionen aus

Proteinhydrolysaten. Zur Methodenerstellung werden Molkenprotein-Isolat-Hydrolysate

verwendet. Diese verfügen über eine standardisierte, von produzierenden Unternehmen

analytisch kontrollierte Zusammensetzung, sind kommerziell erhältlich, preiswert in der

Anschaffung und werden darüber hinaus von einer Vielzahl von Herstellern angeboten.


3

Die bereits hydrolysierten Molkenprotein-Isolate werden unter Verwendung einer Kombination

von Crossflow-Filtrationstechnik und Diafiltration aufgetrennt. Anschließend erfolgt ein

Nachweis des Trennerfolges mittels Size Exclusion High Pressure Liquid Chromatography

(SE-HPLC). Die Trennung basiert hierbei nicht auf der Polarität oder Affinität des

Probenmaterials zur Säule, sondern auf einer Auftrennung der Peptidproben anhand deren

Molekül-Größenverteilung im Probenmedium (Meyer, 1988).

Nach erfolgter Etablierung einer Methode zur Fraktionierung von hydrolysierten

Molkenprotein-Isolaten mittels Crossflow Diafiltration erfolgt die Übertragung der Methode für

die Nutzung der Alge Chlorella vulgaris als Proteinquelle. In diesem Zuge ist die Entwicklung

von geeigneten Hydrolyseverfahren für die Alge Chlorella vulgaris erforderlich.

Die gewonnenen Fraktionen werden abschließend durch ein zu schulendes Panel sensorisch

auf ihre Geschmacksqualitäten überprüft. Besonderes Augenmerk liegt hierbei auf einer den

Bittergeschmack hemmenden Eigenschaft bestimmter Peptidfraktionen.

Im Rahmen der Studie sollen folgende Hypothesen überprüft werden:

Hypothese 1: Proteinhydrolysate lassen sich durch Filtration in Fraktionen auftrennen.

Experimenteller Ansatz: Per Crossflow Diafiltration sollen Peptidfraktionen erzeugt werden.

Die Filtration ist hinsichtlich ihrer Performance durch Herausarbeiten der optimalen

Betriebsbedingungen zu optimieren.

Hypothese 2: Durch Hydrolyse kann aus der Alge Chlorella vulgaris ein für die

Fraktionierung nutzbares Feed gewonnen werden.

Experimenteller Ansatz: Ziel des Hydrolyseprozesses ist die Erzeugung eines Hydrolysats mit

breiter Molekülgrößenverteilung durch Ermittlung der für diesen Zweck optimierten

Hydrolysebedingungen.

Hypothese 3: Die anhand von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat gewonnenen

Kenntnisse hinsichtlich der Fraktionierung lassen sich auf weitere Proteinquellen

übertragen.

Experimenteller Ansatz: Die Erkenntnisse aus der Molkenprotein-Isolat-Fraktionierung werden

auf die Proteinquelle Alge (Chlorella vulgaris) übertragen. Anpassungen werden, falls

notwendig, vorgenommen.


4

Hypothese 4: Einzelne Peptid-Fraktionen verfügen über unterschiedliche

Geschmacksqualitäten.

Experimenteller Ansatz: Die Peptidfraktionen werden durch ein zu schulendes Sensorik-Panel

auf ihre Geschmacksqualitäten überprüft. Die Schulung erfolgt in Übereistimmung mit den

gängigen ISO-Normen.

Hypothese 5: Eine Peptidfraktion besitzt die Eigenschaft eines Bittergeschmack-

Blockers.

Experimenteller Ansatz: Ein Bitterstandard wird mit einer Probe Bitterstandard + Peptidfraktion

hinsichtlich des Geschmackseindrucks „bitter“ durch ein geschultes Sensorik-Panel

verglichen. Stellt das Panel einen signifikant (p < 0,05) geringeren Bittergeschmack fest,

verfügt die Peptidfraktion über die Funktion eines Bittergeschmack-Blockers.

Hypothese 6: Die Peptidfraktionen lassen sich mit der erarbeiteten Methode in

produktionstauglichem Maßstab herstellen.

Experimenteller Ansatz: Die erarbeitete Methode wird anhand der Ergebnisse hinsichtlich ihrer

Skalierbarkeit bewertet.

Stand der Forschung

5

2. Stand der Forschung

2.1 Filtrations- und Fraktionierungstechnik

Grundlegend lassen sich Separationsverfahren anhand ihrer Trenneigenschaften einteilen. Je

nach Trennbereich erfolgt die Klassifizierung anhand der Porengröße der Membran bzw. dem

Molecular Weight Cut-Off (MWCO) (Dosmar & Pinto, 2007; Kofod Nielsen, 2004; Bhave,

1997). Der MWCO ist definiert als die kleinste Molekülmasse einer Struktur, welche durch die

verwendete Membran zu 90 – 95 % (je nach Membran und Hersteller) zurückgehalten wird

(Melin & Rautenbach, 2007). Eine übersichtliche Klassifizierung der Trennverfahren ist in

Abbildung 1 dargestellt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde aufgrund der

Molekülgrößenverteilung der Hydrolysate im Ultra- (UF) bzw. Nanofiltrationsbereich (NF)

gearbeitet.

Abbildung 1: Klassifizierung der Trennverfahren (Kofod Nielsen, 2004; modifiziert)

Membrantrennverfahren im Mikro- (MF), Ultra- und Nanofiltrationsbereich haben sich im Life

Science Bereich als Trennprozess zur Produktaufreinigung und Rückgewinnung etabliert

(Schuchmann & Schuchmann, 2005). Besonderes Augenmerk der Forschung gilt der

Stand der Forschung

6

Verbesserung der Selektivität membranbasierter Trennprozesse (Saxena et al., 2009; van

Reis & Zydney, 2001). Basierend auf den Forschungserfolgen der vergangenen Jahre steigen

die an Membrantrennverfahren gestellten Anforderungen. Neben der Aufkonzentration

bestimmter Proteine spielen Fraktionierungsprozesse komplexer werdender Feed-Medien,

wie beispielsweise Proteinhydrolysaten, zunehmend eine tragende Rolle (Butylina, Luque, &

Nyström, 2006; Wijers, Pouliot, Gauthier, Pouliot, & Nadeau, 1998).

Als unverzichtbarer Baustein des Fortschritts in der Filtrationstechnik kristallisierte sich die

Crossflow Filtration heraus, die gegenüber der Dead-End Filtration eine Vielzahl an Vorteilen

hinsichtlich Effektivität und Effizienz bietet (Melin & Rautenbach, 2007; Kofod Nielsen, 2004;

Irmler, 2001).

2.1.1 Die Crossflow Filtrationstechnik

Bei der Crossflow Filtration (CFF), stellenweise auch Tangentialfluss Filtration (TFF) genannt,

handelt es sich um ein druckgetriebenes Membrantrennverfahren (Bhave, 1997; Aimar,

Meireles, Bacchin, & Sanchez, 1994). Im Gegensatz zur Dead-End Filtration, dargestellt in

Abbildung 2, wird der Feed-Strom tangential zur Membran geführt (Dosmar & Pinto, 2007;

Bhave, 1997).

Abbildung 2: Gegenüberstellung - Crossflow Filtration und Dead-End Filtration (Bhave, 1997)

Es erfolgt eine Auftrennung des Feed-Stroms in zwei Fraktionen; Permeat und Retentat. Als

Permeat bezeichnet man den Anteil des ursprünglichen Feeds, der die Membran passiert

(siehe Abbildung 2). Der über der Membran verbleibende Anteil wird als Retentat bezeichnet

(Melin & Rautenbach, 2007; Cheremisinoff, 1998; Bhave, 1997).

Stand der Forschung

7

Die tangentiale Betriebsweise bietet den Vorteil, dass Partikel auf der Membranoberfläche

durch strömungsbedingte Scherkräfte abgetragen werden können. Unter idealisierten

Bedingungen ist die Filtration folglich nicht weiter von Kompressibilität und Größe der Partikel

anhängig, sondern lediglich von der tangentialen Fließgeschwindigkeit (Aimar et al., 1994).

In der Praxis lässt sich die Vermeidung einer Deckschichtbildung durch Fouling und

Konzentrationspolarisation jedoch nicht realisieren (Melin & Rautenbach, 2007; Aimar et al.,

1994).

2.1.2 Fouling und Konzentrationspolarisation

Die Ausbildung einer Deckschicht auf Membranoberflächen stellt für die Filtrationstechnik ein

ernstzunehmendes Problem dar, da es unter anderem zu Veränderungen der

Membranselektivität und Abnahme des Flüssigkeitstransports durch Membran, auch Fluss

oder Flux genannt, kommen kann (Kofod Nielsen, 2004; Hiersig, 1995; Ousman & Bennasar,

1995). Für membranbasierte Trennaufgaben führen deckschichtinduzierte Veränderungen der

Leistungsfähigkeit zu erhöhten Produktionskosten und geringem Durchsatz (Choi, Zhang,

Dionysiou, Oerther, & Sorial, 2005; Ousman & Bennasar, 1995). Trotz intensiver Forschungen

sind die komplexen Vorgänge der Deckschichtbildung nicht vollständig charakterisiert (Hiersig,

1995).

Grundsätzlich unterteilt man die Deckschichtbildung in den reversiblen Prozess der

Konzentrationspolarisation und den irreversiblen Prozess des Fouling (Chen, Fane, Madaeni,

& Wenten, 1997; Balakrishnan & Agarwal, 1996; Hiersig, 1995). Der Übergang zwischen

beiden Phänomenen ist, trotz abgegrenzter Definitionen, schwer zu bestimmen, sodass einige

Autoren neben dem reversiblen Prozess der Konzentrationspolarisation auch von reversiblen

und irreversiblem Fouling sprechen (Choi et al., 2005; Cheryan, 1998; Chen et al., 1997).

2.1.2.1 Die Konzentrationspolarisation

Unter dem Begriff „Konzentrationspolarisation“ versteht man die Aufkonzentration

zurückgehaltener Moleküle des Feeds auf der Retentatseite der Membran. Es kommt zur

Ausbildung eines Konzentrationsgradienten zwischen Membranoberfläche und Feed. Hierbei

ist die Konzentration gelöster Stoff, wie in Abbildung 3 dargestellt, nahe der Membran am

höchsten (Foley, 2013; Hiersig, 1995; Zydney & Colton, 1986).

Stand der Forschung

8

Abbildung 3: Schematische Darstellung des Konzentrationsprofils an der Membranoberfläche (Hiersig, 1995)

Mit steigendem Transmembranflux steigt, abhängig von der Feed-Konzentration, die

Konzentration gelöster Stoffe an der Membranoberfläche. Die dadurch entstehende

bewegliche Grenzschicht wächst bis zum Erreichen eines stationären Zustands und führt zu

einer Abnahme des Flux und zu einer Verschlechterung des Trennprozesses (Shirazi, Lin, &

Chen, 2010; Toledo, 2004; Hiersig, 1995; Ousman & Bennasar, 1995). Im stationären Zustand

wird von einem Gleichgewicht zwischen einer Konvektion zur Membran mit anschließender

Permeation und einer Rückdiffusion ins Feed ausgegangen (Foley, 2013; Zydney & Colton,

1986). Durch hohe Strömungsgeschwindigkeiten an der Membranoberfläche lässt sich, in

Verbindung mit optimiertem Transmembranflux, eine Verringerung der beweglichen

Grenzschichtdicke durch Scherkräfte erreichen (Toledo, 2004; Chen et al., 1997).

Legende: 𝐷 ×∆𝐶

∆𝑦 = Rückdiffusion, 𝐽 × 𝐶 × (1 − Φ) = Transmission, 𝐽 = Flux, 𝐶 = Feed-Konzentration, 𝛿fl = Dicke

„beweglicher Filterkuchen“, 𝛿st = Dicke „unbeweglicher Filterkuchen“

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Konzentrationspolarisation (Chen et al., 1997; modifiziert)

Stand der Forschung

9

Wird das Gleichgewicht zwischen Konvektion zur Membran, Rückdiffusion und

scherkraftbedingtem Abtransport von Molekülen an der Membranoberfläche, dargestellt in

Abbildung 4, verschoben, kommt es zu einer Zunahme der beweglichen Grenzschichtdicke,

deren Verdichtung und, gegebenenfalls, zur Ausbildung einer unbeweglichen Ablagerung auf

der Membran (Toledo, 2004; Chen et al., 1997; Hiersig, 1995). Durch

Konzentrationspolarisation induzierte Veränderungen des Filtrationsprozesses, treten in der

Regel sehr schnell auf, oftmals in weniger als einer Minute nach Filtrationsbeginn (Chudacek

& Fane, 1984). Zur mathematischen Charakterisierung der Konzentrationspolarisation

existieren mehrere Modelle, von denen das „Gel-Polarisation Modell“ in Kapitel 2.1.3.2

vorgestellt wird.

2.1.2.2 Das Fouling

Ablagerungen von gelösten Bestandteilen auf Membranoberflächen oder in den Poren der

Membran bezeichnet man als Fouling (Toledo, 2004; Aimar et al., 1994). Dabei unterschiedet

man nach Wang & Tarabara (2008) und Bowen, Calvo, & Hernández (1995) zwischen den in

Abbildung 5 dargestellten Mechanismen des

„Complete Blocking“, der vollständigen Blockierung von Membranporen durch geloste

Stoffe ohne Partikelüberlagerung,

„Standard Blocking“, der Ablagerung von Partikeln in den Membranporen, welche zu

einer Abnahme des Porendurchmessers proportional zur Partikelgröße des

angelagerten Moleküls führt,

„Intermediate Blocking“, der vollständigen Blockierung einzelner Membranporen

(vergleichbar mit „Complete Blocking“) in Verbindung mit Verblockungseffekten, die

durch eine Auf- und Aneinanderlagerung von Partikeln entsteht und der

„Cake Filtration“, der Ausbildung einer dichten Partikelschicht auf der

Membranoberfläche.

Legende: a) „Complete Blocking“, b) „Standard Blocking“, c) „Intermediate Blocking“, d) „Cake Filtration“

Abbildung 5: Schematische Darstellung der Foulingmechanismen (Wang & Tarabara, 2008; modifiziert)

Stand der Forschung

10

Es ist davon auszugehen, dass die Abnahme des Flux während eines Filtrationsprozesses

nicht nur auf einen Foulingmechanismus zurückzuführen ist, sondern auf einem

Zusammenspiel der verschiedenen Mechanismen beruht. Dabei kommt es zu Beginn zu einer

Verblockung der kleinsten Poren und im Verlauf zu einer Ablagerung von Partikeln in größeren

Poren. Es wird davon ausgegangen, dass sogar Partikel, die ein oder zwei Größenordnungen

unter der Porenweite der Membran liegen, durch Adsorption an den Porenwänden signifikant

zum Foulingprozess beitragen. Weiter kommt es zu Ab- und Überlagerung von Partikeln auf

der Membranoberfläche, die schlussendlich in der Ausbildung eines Filterkuchens resultieren

(Güell & Davis, 1996; Bowen et al., 1995). Diese Prozesse laufen, aufgrund der mehr oder

weniger unregelmäßigen Verteilung der Porengröße, die von Hersteller zu Hersteller variieren

kann, überlagert ab (Balakrishnan & Agarwal, 1996; Bowen et al., 1995). Vereinfacht

unterscheidet man zwischen internem Fouling, darunter fallen „Complete Blocking“ und

„Standard Blocking“ und externem Fouling durch „Intermediate Blocking“ und „Cake Filtration“

(Shirazi et al., 2010; Tracey & Davis, 1994).

Zum besseren Verständnis der Einflüsse von Konzentrationspolarisation und Fouling auf den

Crossflow Prozess wird dieser nachfolgend mathematisch näher charakterisiert (Kapitel 2.1.3).

Im Anschluss wird der Einfluss der Prozess-Hydrodynamik und der physikalisch-chemischen

Eigenschaften von Membran und Feed auf die Deckschichtbildung dargestellt (Kapitel 2.1.4).

2.1.3 Mathematische Charakterisierung von Filtrationsprozessen

2.1.3.1 Idealisierte Charakterisierung von Filtrationsprozessen - Das Hagen-Poiseulle-Model

Der Transport einer Flüssigkeit durch eine Membran, lässt sich für einen idealisierten Fall, in

der Abwesenheit einer gelösten Substanz, mit der Hagen-Poiseulle Gleichung beschreiben

(Dosmar & Pinto, 2007):

𝐽𝐹,𝑡 =휀 × 𝑟4 × ∆𝑝𝑇𝑀𝑃(𝑖𝑑𝑒𝑎𝑙)

8 × 𝜂 × ∆𝑥𝑀

Formel 1: Hagen-Poiseulle Gleichung – Flux durch Membran, ideal

JF,t = Flux durch die Membran zum Zeitpunkt t

ε = Porosität der Membranoberfläche

r = Mittlerer Porenradius

∆pTMP(ideal) = Transmembrandruck, ideal

η = dynamische Viskosität der Flüssigkeit

xM = Länge der Pore/Dicke der Membran

Stand der Forschung

11

Der Transmembrandruck ∆pTMP(ideal) ist dabei definiert als (Irmler, 2001):

∆𝑝𝑇𝑀𝑃(𝑖𝑑𝑒𝑎𝑙) = 𝑝𝐸 + 𝑝𝐴

2 × 𝑝𝐹

Formel 2: Transmembrandruck, ideal

∆pTMP(ideal) = Transmembrandruck, ideal

pE = Eingangsdruck

pA = Ausgangsdruck

pF = filtratseitiger Druck

Im Idealfall, bei gleichbleibender Viskosität η der Flüssigkeit, ist der Flux durch die Membran

JF,t folglich proportional zum Transmembrandruck ∆pTMP(ideal) (Dosmar & Pinto, 2007; Irmler,

2001).

Unter realen Bedingungen manifestiert sich bei zunehmendem Transmembrandruck eine

Abweichung von der linearen Zunahme des Flux. Diese ist auf die Konzentrationspolarisation

und Fouling auf der Membranoberfläche zurückzuführen (Irmler, 2001; Cheryan, 1990).

2.1.3.2 Charakterisierung der Konzentrationspolarisation – Das Gel-Polarisation-Modell

Die Grundlage für die Charakterisierung der Konzentrationspolarisation ist die Massenbilanz

für den Transport von suspendierten Stoffen an der Grenzschicht der Flüssigkeit zur

Membranoberfläche (Shirazi et al., 2010; Toledo, 2004). Im stationären Zustand wird davon

ausgegangen, dass ein Gleichgewicht zwischen Konvektion zur Membran JK und

Rückdiffusion JD in das Feed stattfindet (Foley, 2013; Shirazi et al., 2010; Zydney & Colton,

1986):

𝐽𝐹,𝑡 × 𝐶𝐹 = − 𝐷 ×∆𝐶

∆𝑥𝐴

Formel 3: Massenbilanz der Konzentrationspolarisation

JF,t * CF = Konvektion JK zur Membran mit Konzentration CF des Feeds

D * ∆C/∆x = Rückdiffusion JD von der Membran

D = Diffusion-Koeffizient

xA = Abstand zur Membran

Stand der Forschung

12

Integriert man Formel 3 über die Dicke δ der Grenzschicht ergibt sich für den Permeatflux

durch die Membran (Toledo, 2004; Zydney & Colton, 1986):

𝐽𝐹,𝑡 = 𝐷

𝛿× 𝑙𝑛 (

𝐶𝑀

𝐶𝐹) = 𝑘 × 𝑙𝑛 (

𝐶𝑀

𝐶𝐹)

Formel 4: Permeatflux JP,t bei Konzentrationspolarisation nach dem Gel-Polarisations-Modell



δ = Dicke der Grenzschicht

CM = Konzentration an der Membranoberfläche

CF = Konzentration im Feed

k = Stoffübergangskoeffizient

Der Stoffübergangskoeffizient k ist dabei nährungsweise, in Analogie zum Wärmeübergang

an undurchlässigen Oberflächen, definiert als (Shirazi et al., 2010; Toledo, 2004; Zydney &

Colton, 1986):

𝑘 = 0,538 × (𝐷2 × 𝛾𝑀

𝑥𝑀)

13

Formel 5: Stoffüberhangskoeffizient k


γM = Scherrate an der Membranoberfläche

xM = Porenlänge

Für höhere Membranflüsse ist eine Anpassung des Stoffübergangskoeffizienten k notwendig.

Abhängig von der Geometrie der Poren und der Strömungsform existieren hierfür in der

Literatur verschiedene Modelle, die prozessspezifisch angepasst werden müssen (Melin &

Rautenbach, 2007). Soll der Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit bei der Bestimmung des

Stoffübergangskoeffizienten miteinbezogen werden, eignet sich dafür die Verwendung der

Sherwood-Zahl. Hierbei wird deutlich, dass eine Steigerung des Permeatflusses in

Abhängigkeit der Re Zahl, sprich idealerweise im turbulenten Bereich, erreicht werden kann

(Shirazi et al., 2010; Melin & Rautenbach, 2007; Toledo, 2004; Matthiasson & Sivik, 1980):

Stand der Forschung

13

𝑆ℎ = 𝑘 × 𝑑ℎ

𝐷= 𝑎 × (

𝑑ℎ × 𝑉

𝜗)

𝑎′

× (𝜗

𝐷)

𝛽′

= 𝑎 × 𝑅𝑒𝛼′ × 𝑆𝑐𝛽′

Abbildung 6: Sherwood-Zahl zur Charakterisierung des Stoffübergangs

Sh = Sherwood Zahl

Re = Reynolds Zahl

Sc = Schmidt Zahl


k = Stoffübergangskoeffizient

dh = hydraulischer Durchmesser

a = Konstante (Charakterisierung der Strömungskanalgeometrie)

V = Strömungsgeschwindigkeit

ϑ = kinematische Viskosität

α‘ = Exponent (Abhängig von Strömungsform)

β‘ = Exponent (Abhängig von Strömungsform)

Grundlage für die Gültigkeit des Gel-Polarisation Modells ist die Annahme eines konstanten

Widerstands der Grenzschicht und der Membran. Des Weiteren wird die Konzentration an der

Membranoberfläche CM als unveränderliche Größe vorausgesetzt (Shirazi et al., 2010). Dies

entspricht allerdings nicht den Realbedingungen, da die Konzentration CM sowohl von der

Konzentration CF des Feeds, als auch der Strömungsgeschwindigkeit abhängig ist (Mulder,

1996). Auch das Diffusionsvermögen von Makromolekülen ist konzentrationsabhängig,

wodurch die Annahme eines konstanten Stoffübergangskoeffizienten k zu Ungenauigkeiten

führt (Shirazi et al., 2010).

2.1.3.3 Charakterisierung druckgetriebener Filtrationsprozesse unter Berücksichtigung

prozessspezifischer Widerstände – Das Widerstands-Modell

Für die Charakterisierung druckgetriebener Filtrationsverfahren hat sich die Verwendung des

Widerstandsmodells etabliert, da Flux-Transmembrandruck abhängige Fouling-Phänomene

mit dem Diffusionsmodell der Gel-Polarisation nicht dargestellt werden können (Melin &

Rautenbach, 2007; Choi et al., 2005; Sablani, Goosen, Al-Belushi, & Wilf, 2001). Hierbei wird

angenommen, dass die Ausbildung einer Deckschicht in einem zusätzlichen, in Reihe zum

Membranwiderstand geschalteten Widerstand, resultiert (Shirazi et al., 2010; Melin &

Rautenbach, 2007; Choi et al., 2005; Mulder, 1996). Der kombinierten Filtrationswiderstand

RT ergibt sich aus der Summe der Einzelwiderstände, bestehend aus dem

Membranwiderstand RM, dem Widerstand durch Fouling RF, dem Widerstand durch

Konzentrationspolarisation RKP und dem Widerstand durch Adsorption RAD (Choi et al., 2005):

Stand der Forschung

14

𝑅𝑇 = 𝑅𝑀 + 𝑅𝐹 + 𝑅𝐾𝑃 + 𝑅𝐴𝐷

Formel 6: Filtrationswiderstand RT

RT = kombinierter Filtrationswiderstand

RM = Membranwiderstand

RF = Widerstand durch Fouling

RKP = Widerstand durch Konzentrationspolarisation

RAD = Widerstand durch Adsorption

Für den Flux JF,t ergibt sich unter Berücksichtigung der Widerstände (Choi et al., 2005; Choo

& Lee, 1996; Ousman & Bennasar, 1995):

𝐽𝐹,𝑡 = ∆𝑝𝑇𝑀𝑃

𝜂 × (𝑅𝑀 + 𝑅𝐹 + 𝑅𝐾𝑃 + 𝑅𝐴𝐷)

Formel 7: Darcy-Gleichung - Flux durch Membran in Abhängigkeit fluxreduzierender Parameter


∆pTMP = Transmembrandruck

η = dynamische Viskosität des Permeat

RM = Membranwiderstand


RKP = Widerstand durch Konzentrationspolarisation

RAD = Widerstand durch Adsorption

Der durch Fouling erzeugte Widerstand RF kann wiederum in reversibles und irreversibles

Fouling unterteilt werden (Choi et al., 2005):

𝑅𝐹 = 𝑅𝑟𝐹 + 𝑅𝑖𝐹

Formel 8: Widerstand durch Fouling


RrF = Widerstand durch reversibles Fouling

RiF = Widerstand durch irreversibles Fouling

2.1.4 Einfluss von Prozess-Hydrodynamik und physikalisch-chemischen

Eigenschaften von Feed und Membran auf Fouling und Filtrationsprozess

Das Auftreten von Fouling in Membranfiltrationsprozessen ist durch eine Vielzahl von Faktoren

beinflussbar. Grundlegend kann man zwischen Fouling aufgrund der Hydrodynamik des

Prozesses und Fouling hervorgerufen durch die physikalisch-chemischer Eigenschaften von

Membran und Feed unterscheiden (Huisman et al., 2000).

Stand der Forschung

15

2.1.4.1 Fouling aufgrund der Prozess-Hydrodynamik

Transmembrandruck ∆pTMP/Permeatflux JF,t/JFm:

Für Reinstmedien steigt der Permeatflux JFm, in Übereinstimmung mit den theoretischen

Annahmen, proportional zum Transmembrandruck ∆pTMP. Bei beladenen Medien zeigt sich,

abhängig von Feed-Konzentration und Strömungsgeschwindigkeit, eine Abweichung vom

linearen Zusammenhang des Permeatflux JF,t bei steigendem Transmembrandruck ∆pTMP,

dargestellt in Abbildung 7 (Kofod Nielsen, 2004; Irmler, 2001; Lojkine, Field, & Howell, 1992).

Abbildung 7: Einfluss einer Deckschichtausbildung auf den Flux JF,t in Abhängigkeit des Transmembrandrucks ∆pTMP für Reinstwasser und ein beladenes Medium (Irmler, 2001; modifiziert)

Die Abnahme des Permeatflux JFm ist hierbei im Anfangsstadium auf die Ausbildung einer

Konzentrationspolarisation an der Membranoberfläche, und im weiteren Verlauf durch die

Ausbildung einer irreversiblen Foulingschicht auf der Membran zurückzuführen (Taddei,

Daufin, Aimar, & Sanchez, 1989). Die Ausbildung von Fouling kann, gemäß der „Critical-Flux“-

Theorie von Howell (1995) und Field, Wu, Howell, & Gupta (1995), durch nicht-überschreiten

eines kritischen Flux JCF verhindert werden. Als kritischen Flux JCF bezeichnet man den

Permeatflux JF, bei dessen Überschreiten es zur einer Abweichung vom linearen

Transmembrandruck-Flux Zusammenhang bzw. zur Ausbildung einer wahrnehmbaren

Fouling-Schicht kommt (Bacchin, Aimar, & Field, 2006; Field et al., 1995; Howell, 1995). Eine

weitere Möglichkeit der Prozessführung ist die Verwendung eines konstanten

Transmembrandrucks ∆pTMP. Unterhalb eines kritischen Drucks pCP entspricht der kritische

Flux JCF weitestgehend dem limitierend Flux JLF. Unter limitierendem Flux JLF versteht man den

Flux, für den eine Steigerung des Transmembrandrucks ∆pTMP nicht länger in einem Anstieg

des Permeatflux resultiert (Vyas, Bennett, & Marshall, 2000; Defrance & Jaffrin, 1999).

Betrachtet man die in Abbildung 8 dargestellte Transmembrandruck-Flux-Abhängigkeit näher,

Transmembrandruck ∆pTMP [bar]

Flu

x J

F,t [

l/m

2h]

Stand der Forschung

16

ist eine Einteilung in drei Bereiche möglich (Brans, Schroën, van der Sman, & Boom, 2004;

Field et al., 1995).

Abbildung 8: Kritische Flux Bereiche (Brans et al., 2004, modifiziert)

Bereich I ist gekennzeichnet durch einen linearen Anstieg des Transmembrandruck/Flux-

Verhältnisses bis zum Erreichen des kritischen Flux JCF/kritischen Druck pCP (Brans et al.,

2004). Eine weitere Unterteilung in eine „harte/starken“ und „weiche/schwachen“ Form,

dargestellt in Abbildung 9, ist möglich. Bei der „harten/starken“ Form steigt das Flux-Druck-

Verhältnis analog zum Reinstwasserflux bis JCF bzw. pCP erreicht wird. Bei der

„weichen/schwachen“ Form wird ebenfalls von einem linearen Anstieg bis zum Erreichen von

JCF bzw. pCP ausgegangen, jedoch weicht das Flux/Druck-Verhältnis aufgrund einer

unverzüglich auftretenden, fouling-/konzentrationspolarisation-induzierten Fluxminderung

bereits zu Beginn vom Reinstwasserflux ab (Bacchin et al., 2006; Brans et al., 2004; Field et

al., 1995).

In Bereich II ist der limitierende Flux erreicht. Durch die konzentrationspolarisation-induzierte

Ausbildung einer stationären Grenzschicht kommt es zur Stagnation des Permeatflux und

somit zu einem Übergang vom druckabhängigen Bereich in den deckschichtabhängigen

Bereich des Filtrationsprozesses. Bei weiterem Anstieg des Transmembrandrucks ∆pTMP,

charakterisiert als Bereich III, bildet sich Fouling auf der Membranoberfläche, welches zur

einer drastischen Reduzierung des Permeatflux und der Selektivität der Membran, unter

anderem durch eine druckabhängige Kompression des Filterkuchens, führt (Brans et al., 2004;

Field et al., 1995). Entscheidend für eine Crossflow Filtration ist das Operieren unterhalb des

deckschichtkontrollierten Bereichs durch Bestimmung des kritischen Flux JCF oder kritischen

Druck pCP der Anlagenkonzeption.

Stand der Forschung

17

Abbildung 9: "harte/starke" und "weiche/schwache" Form des kritischen Flux JCF (Bacchin et al., 2006)

Strömungsgeschwindigkeit ʋ:

Ein weiterer Parameter zur Kontrolle des Fouling-Prozesses und der

Konzentrationspolarisation ist die Strömungsgeschwindigkeit ʋ des Crossflow-Prozesses

(Melin & Rautenbach, 2007; Atra, Vatai, Bekassy-Molnar, & Balint, 2005; Punidadas & Rizvi,

1998). Abhängig von der Strömungsgeschwindigkeit ʋ kommt es zur Ausbildung von

Scherkräften auf der Membranoberfläche, durch die ein Abtragen der Deckschicht möglich ist.

Der Permeatflux ist umso höher, je höher die Scherkräfte sind, da die Rückdiffusion von

Partikelen in das Feed verbessert wird (Melin & Rautenbach, 2007; Wang & Song, 1999).

Insbesondere der Rücktransport größerer Partikel kann, bei gesteigerter

Strömungsgeschwindigkeit ʋ in Verbindung mit dem Transmembrandruck ∆pTMP, allerdings zu

einer Verminderung der Deckschichtporosität führen, wodurch der Deckschichtwiderstand

ansteigt (Fane, Beatson, & Li, 2000; Lojkine et al., 1992). Darüber hinaus ist bei hohen

Strömungsgeschwindigkeiten eine Denaturierung der Proteine möglich, wie Meireles, Aimar,

& Sanchez (1991) für Bovin-Serum-Albumin (BSA) zeigten.

2.1.4.2 Fouling aufgrund der physikalisch-chemischen Eigenschaften von Feed und

Membran

pH-Wert & Ionenstärke:

Der Einfluss des pH-Wertes auf den Fouling-Prozess ist seit langem intensiver Gegenstand

der Forschung (Wang & Tang, 2011; She, Tang, Wang, & Zhang, 2009; Almécija et al., 2007;

Persson, Jönsson, & Zacchi, 2003; Chan & Chen, 2001; Huisman et al., 2000; Herrero,

Prádanos, Calvo, Tejerina, & Hernández, 1997; Fane, Fell, & Suki, 1983). Kernaussage vieler

Studien ist, dass starkes Fouling in Verbindung mit niedrigem Permeatflux grundsätzlich in der

Stand der Forschung

18

Nähe des isoelektrischen Punkts (IEP) auftritt (Wang & Tang, 2011; She et al., 2009; Huisman

et al., 2000; McDonogh, Bauser, Stroh, & Chmiel, 1990; Fane et al., 1983). Sowohl über- als

auch unterhalb des IEP ist eine vergleichsweise reduzierte Auswirkung von Fouling auf den

Permeatflux JF zu beobachten (Wang & Tang, 2011; She et al., 2009; Palecek, Mochizuki, &

Zydney, 1993). Grund für verstärktes Membranfouling im Bereich des IEP sind vor allem

Veränderungen des Ladungszustandes von Proteinen und Peptiden. Diese führen durch

verstärkte hydrophobe Interaktion zur Adsorption von Molekülen auf der Membran (Ricq,

Narçon, Reggiani, & Pagetti, 1999; Martin-Orue, Bouhallab, & Garem, 1998; Nyström,

Pihlajamäki, & Ehsani, 1994). Des Weiteren kann es durch die am IEP reduzierte

elektrostatische Abstoßung zur aggregationsbedingtem Fouling kommen (Wang & Tang,

2011; She et al., 2009; Kelly & Zydney, 1995). Der pH-Wert beeinflusst, in Verbindung mit der

Partikelgrößenverteilung, auch die Struktur der Fouling-Schicht (Huisman et al., 2000; Vyas et

al., 2000). Huisman et al. (2000) charakterisierten anhand von rasterkraftmikroskopischen

Aufnahmen die Struktur von BSA-Foulingschichten. Eine besonders dichte, unregelmäßige

Foulingschicht manifestierte sich am IEP, wohingegen niedrige pH-Werte zur Ausbildung einer

lockeren Deckschicht führten. In Verbindung mit dem pH-Wert spielt die Ionenstärke des

Feeds eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Strukturbildung der Deckschicht. Eine

allgemeingültige Aussage ist hinsichtlich widersprüchlicher Forschungsergebnisse jedoch

nicht uneingeschränkt möglich. In vielen Fällen wird von einer Zunahme des Fouling-Effekts

bei steigender Ionenstärke berichtet (Teng, Lin, Wu, & Juang, 2006; Tarabara, Koyuncu, &

Wiesner, 2004; Palecek & Zydney, 1994; Heinemann, Howell, & Bryan, 1988; Fane et al.,

1983). Vereinzelt berichten Autoren auch von gegenteiligen Effekten (Salgın, 2007; She et al.,

2009; Chan & Chen, 2001). Aussagen bezüglich des Einflusses der Ionenstärke müssen

folglich einer ganzheitlichen Betrachtung, in Verbindung mit weiteren Prozessparametern,

unterzogen werden. Zudem spielt die Zusammensetzung des Feeds, die Art der Membran und

das Trennziel eine wichtige Rolle. Bei der Filtration von BSA resultierten erhöhte Ionenstärken

in Verbindung mit einem pH-Wert in der Nähe des IEP beispielsweise in einer verbesserten

Transmission der BSA-Moleküle (de la Casa et al., 2007; Persson et al., 2003). Für komplexere

Feed-Medien hat sich zur Verbesserung der Membran-Selektivität eine pH-Führung am IEP

der niedermolekularen Feed-Bestandteile und möglichst weit entfernt vom IEP der

höhermolekularen Bestandteile bewährt (Zydney, 1998; Saksena & Zydney, 1994; Nakatsuka

& Michaels, 1992). Hierbei wird der Einfluss der Ionenstärke auf die elektrochemische

Doppelschicht eines geladenen Proteins ausgenutzt. Mit steigender Ionenstärke nimmt deren

Dicke ab, was in einer Reduktion des hydrodynamischen Volumens des Moleküls resultiert.

Bei genauer Kenntnis des Feeds lässt sich das hydrodynamische Volumen bestimmter

Proteine folglich durch Anpassung der Ionenstärke steuern (Teng et al., 2006; Zydney, 1998).

Stand der Forschung

19

Feed-Konzentration:

Eine höhere Feed-Konzentration CF resultiert, abhängig von der Strömungsgeschwindigkeit ʋ,

wie in Abbildung 10 dargestellt, in einem niedrigeren Permeatflux (Harker, Backhurst, &

Richardson, 2013; Wakeman & Tarleton, 2005; Cheryan, 1998).

Abbildung 10: Flux/Feed-Konzentration Abhängigkeit (links: Harker et al., 2013; modifiziert; rechts: Cheryan, 1998; modifiziert)

Stellt man den Permeatflux für verschiedenen Feed-Konzentrationen CF in Abhängigkeit der

Zeit dar (Abbildung 11), ähnelt sich der stationäre Flux in vielen Fällen. Abhängig von den

Eigenschaften und der Zusammensetzung des Feeds kann sich der stationäre Flux aber auch

deutlich unterscheiden (She et al., 2009; Wakeman & Tarleton, 2005; Tarleton & Wakeman,

1994).

Abbildung 11: Einfluss der Feed-Konzentration CF auf den Permeatflux JF,t (links: She et al., 2009; rechts: Tarleton & Wakeman, 1994)

Stand der Forschung

20

Die Zeit bis zum Erreichen des stationären Zustands ist dabei abhängig von der Partikelgröße

der Moleküle im Feed. Besonders bei kleinen Partikeln stellt sich schnell ein stationärer Flux

ein (Wakeman & Tarleton, 2005; Tarleton & Wakeman, 1994).

Partikelgröße & -Verteilung:

Größe, Form und Verteilung der Partikel eines Feeds beeinflussen die Eigenschaften der

Fouling-Schicht bei der Crossflow Filtration. Eine Zunahme der Partikelgröße resultiert dabei,

dargestellt in Abbildung 12, in einer Zunahme des Permeatflux (Park, Lee, Lee, & Hong, 2008;

Vyas et al., 2000; Tarleton & Wakeman, 1993).

Abbildung 12: Einfluss der Partikelgröße auf die foulinginduzierte Abnahme des Permeatflux JF,t für niedrige (links) und hohe (rechts) Strömungsgeschwindigkeiten (Tarleton & Wakeman, 1993)

Dies lässt sich durch die Art der ausgebildeten Deckschicht erklären. Kleine Partikel führen

verstärkt zu internem Fouling, sodass ein strömungsbedingter Rücktransport der Partikel und

somit ein Abtragen der Deckschicht nicht möglich ist. Die Dicke der darüber ausgebildeten

externen Fouling-Schicht entspricht in den meisten Fällen der größerer Partikel, kann diese

aber auch überschreiten. Eine Erhöhung der Strömungsgeschwindigkeit oder des

Transmembrandruck kann, abhängig von der Strömungsform, in der Ausbildung dichterer

Deckschichten mit geringerer Durchlässigkeit und höherem Filterkuchenwiderstand führen

(Park et al., 2008; Lawler & Kweon, 2004; Vyas et al., 2000; Tarleton & Wakeman, 1993). Laut

Tarleton & Wakeman (1993) wird die Ausbildung der Fouling-Schicht auch bei

unterschiedlicher Partikelgrößenverteilung hauptsächlich von kleinen Partikeln bestimmt.

Dabei spielt auch die Form der Partikel eine Rolle. Je geringer die Kugelhaftigkeit von Partikeln

ist, desto höher ist die Durchlässigkeit der Foulingschicht, sofern es sich nicht um

plättchenförmige Partikel handelt (Foust, Wenzel, Clump, Maus, & Andersen, 2008; Dullien,

1992).

Stand der Forschung

21

Temperatur:

Gezielte Steuerung der Prozesstemperatur TCF kann zu einem erhöhten Permeatflux führen.

Der Einfluss erhöhter Temperatur TCF auf Membranfouling bedarf aufgrund widersprüchlicher

Studienergebnisse jedoch einer differenzierten Betrachtung. Atra et al., (2005) (1),

Samuelsson, Dejmek, Trägårdh, & Paulsson (1997) (2), Vetier, Bennasar, & de la Fuente

(1988) (3) sowie Hwang, Chang, & Chen (1996) (4) berichten bei der Mikrofiltration von Milch

(Rohmilch (1) und entrahmte Milch (2)), Molke (3) und für ein Modellsystem mit Polystyrene

Latex Partikeln (4) von verbesserten Permeatflüssen zwischen 40 °C (Polystyrene Latex

Partikel) und 55 °C (Rohmilch). Vetier et al. (1988) führen dies auf eine Verringerung der

Deckschichtdicke aufgrund gesteigerter Viskosität des Feeds zurück. Mo, Tay, & Ng (2008)

und van Boxtel, Otten & van der Linden (1991) stellten bei Umkehrosmoseprozessen von BSA

und im Rahmen der Käseherstellung anfallender Molke eine Abnahme des Permeatflux bei

steigenden Temperaturen fest. Mo et al. (2008) erklären dies anhand struktureller

Veränderungen der BSA-Moleküle bei steigender Temperatur, die zu Verminderung der

elektrostatischen Abstoßung zwischen Molekülen und Membran führen. Protein-Membran und

Protein-Protein Interaktionen resultieren in Folge pH-abhängig in Deckschichtbildung und

Aggregation von BSA-Molekülen. Eine temperaturabhängige Verringerung der Viskosität führt

also nicht zwangsweise zur Vermeidung von Fouling. Temperatur-, pH- und Ionenstärke-

bedingte Veränderungen der Proteinstruktur- und Ladung müssen bei der Auswahl der

Prozesstemperatur miteinbezogen werden.

Membranen:

Morphologie und hydrophobe/hydrophile Eigenschaften beeinflussen neben den

Trenneigenschaften einer Membran auch deren Neigung zu Fouling (Melin & Rautenbach,

2007). Hydrophobe Membranen wird allgemein eine gesteigerte Fouling-Anfälligkeit

zugeschrieben. Abhängig vom Grad der Hydrophobizität von Membran und Molekül kommt es

zur Ausbildung von hydrophoben Wechselwirkungen oder Anlagerungseffekten aufgrund von

van-der-Walls-Kräften die, besonders in der Startphase eines Filtrationsprozesses, in der

verstärkten Ausbildung von Konzentrationspolarisation und Fouling resultieren. Hydrophobe

Membranen neigen darüber hinaus zur Ausbildung von Filterkuchen mit höherem Widerstand,

was in erhöhtem Rückhalt gelöster Substanzen resultiert (Maximous, Nakhla, & Wan, 2009;

Melin & Rautenbach, 2007; Kofod Nielsen, 2004; Huisman et al., 2000; Matthiasson, 1983).

Einige Studien wiedersprechen mittlerweile der lange geltenden Annahme und führen die

unterschiedlichen Erkenntnisse auf mit der Hydrophobizität verknüpfte Änderungen der

Membranmorphologie zurück, die eine Deutung des Hydrophobizität/Fouling

Zusammenhangs erschweren (Choo & Lee, 2000; Nomura, Fujii, & Suzuki, 1997). Entgegen

der Hydrophobizität stehen elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Membran und Feed.

Stand der Forschung

22

Abbildung 13: pH-Abhängigkeit des ζ-Potentials einer Polysulfon-Membran (Melin & Rautenbach, 2007; modifiziert)

Die Oberflächenspannung einer Membran wird dabei anhand des ζ-Potentials beschrieben.

Das ζ-Potential einer Membran ist, aufgrund von Ionisationsvorgängen, abhängig vom pH-

Wert des Feeds, dargestellt in Abbildung 13. Ein steigender Absolutwert des ζ-Potentials steht

in Verbindung mit einer Abnahme der Hydrophobizität der Membran (Melin & Rautenbach,

2007; Huisman et al., 2000). Die Abnahme des Permeatflux ist abhängig von der Porosität der

Membran. Eine steigende Porosität führt dabei, bis zum Erreichen eines Grenzwertes, zu

einem höheren Permeatflux durch Reduktion des Fouling. Dies lässt sich unter anderem auf

die Entstehung einer lockereren Deckschicht mit steigender Porosität der Membran

zurückführen. Wird eine Grenzporosität überschritten, fallen Fouling-Effekte, durch effektivere

Verblockung der Poren, dafür umso schwerwiegender aus. In Verbindung mit der

Porengrößenverteilung beeinflusst die Porosität der Membran die Art des auftretenden

Foulingphänomens (internes Fouling/externes Fouling) (Melin & Rautenbach, 2007; Kofod

Nielsen, 2004; Choo & Lee, 2000; Ho & Zydney, 1999; Riedl, Girard, & Lencki, 1998). Wichtig

für das Verständnis von Membrantrennprozessen ist darüber hinaus die Tatsache, dass der

MWCO einer Membran (z. B. 100 kDa) nicht bedeutet, dass die Porengeometrie aller Poren

identisch ist. Der MWCO definiert vielmehr die kleinste Molekülmasse einer Struktur, welche

durch die verwendete Membran zu 90 – 95 % zurückgehalten wird (Melin & Rautenbach,

2007). Die Membranporung genügt also einer bestimmten Porengrößenverteilung, dargestellt

in Abbildung 14, die einen annährend vollständigen Rückhalt von Molekülen ermöglicht, die

oberhalb der nominalen Trenngrenze liegen (Mulder, 1996).

Stand der Forschung

23

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Porengrößenverteilung einer Membran (Mulder, 1996)

2.1.4.3 Weitere Verfahren zur Fouling-Kontrolle & Prozessoptimierung

Diafiltration:

Unter dem Begriff Diafiltration versteht man die kontinuierliche (Continuous Diafiltration; CDF)

oder diskontinuierliche (Discontinuous Diafiltration; DDF) Zugabe von Lösungsmittel im

Rahmen eines Filtrationsprozesses (Wakeman & Tarleton, 2005; Irmler, 2001). Als ein

Diavolumen (VDia) wird dabei die Menge an Lösungsmittel definiert, die der Menge des Feeds

zu Prozessbeginn entspricht. Bei der diskontinuierlichen Diafiltration erfolgt eine schrittweise

Verdünnung des Feeds zu bestimmten Prozesszeiten. Nach Zugabe eines oder mehrerer

Diavolumina wird das Feed solange verarbeitet, bis ein festgelegtes Minimalvolumen des

Feeds erreicht ist. Je nach Trennziel kann zu diesem Zeitpunkt die Zugabe weiterer

Diavolumina erfolgen. Bei kontinuierlicher Fahrweise wird das Lösungsmittel in Abhängigkeit

des Permeatflux über die Laufzeit des Prozesses zugeführt (Wakeman & Tarleton, 2005).

Das Verfahren der Diafiltration eignet sich in der Crossflow-Filtration zur Verbesserung der

Trennschärfe bei der Trennung von hoch- und niedermolekularen Substanzen (Irmler, 2001).

Unter Verwendung des Diafiltrationsverfahren lässt sich, wie in Abbildung 15 dargestellt,

abhängig von der Häufigkeit der Zugabe eines Diavolumens, eine erhöhte Reinheit der

Retentatfraktion bei verbesserter Auswaschung permeabler, niedermolekularer Bestandteile

erreichen (Baldasso, Barros, & Tessaro, 2011; Venkiteshwaran, Heider, Teysseyre, & Belfort,

2008; Wakeman & Tarleton, 2005; van Eijndhoven, Saksena, & Zydney, 1995). Dies liegt in

einer Verhinderung des Viskositätsanstiegs des Feeds durch Aufkonzentration von Feed-

Partikeln im Retentat (Irmler, 2001).

Stand der Forschung

24

Abbildung 15: BSA-Konzentration und Reinheit von Immunglobulin G (IgG) in Abhängigkeit der Diavolumina-Anzahl Nd (Venkiteshwaran et al., 2008; modifiziert)

Ultraschall:

Die Verwendung von Ultraschall (US) hat sich bei der Optimierung von Filtrationsprozessen,

besonders bei Crossflow-Systemen, als vielversprechend erwiesen. Mehrere Studien

berichten von deutlichen Steigerungen des Permeatflux unter Ultraschalleinfluss

(Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, & Stevens, 2005; Kobayashi, Chai, & Fujii, 1999; Chai

et al., 1998; Wakeman & Tarleton, 1991). Die fluxsteigernde Wirkung des Ultraschalls wird

dabei auf eine Reduktion von Konzentrationspolarisation und eine Abschwächung von Fouling

durch Aufbrechen der Deckschicht zurückgeführt (Kobayashi et al., 1999; Lamminen, Walker,

& Weavers, 2004; Muthukumaran et al., 2004). Dies kann, gemäß Muthukumaran, Kentish,

Ashokkumar, & Stevens (2005), anhand von vier ultraschall-induzierten Effekten erklärt

werden:

Verminderung der Filterkuchendichte und Reduktion von internem Fouling durch

Agglomeration von feinen Partikeln

Verbesserung der Suspensionsfähigkeit und Auswaschung von Partikeln durch

mechanische Schwingungsenergie

Abtragen von Partikeln durch das Einwirken akustischer Gleichströmung

Durch Kavitation verursachte Reinigung der Membranoberfläche

Die Steigerung des Permeatflux JF,t ist, wie in Abbildung 16 dargestellt, unter anderem

abhängig von der verwendeten Frequenz fUS. Niedrigere US-Frequenzen (28 – 50 kHz)

erwiesen sich als effektiv (Kyllönen, Pirkonen, & Nyström, 2005; Muthukumaran, Kentish,

Ashokkumar, et al., 2005; Lamminen et al., 2004; Kobayashi et al., 2003).

Stand der Forschung

25

Abbildung 16: Permeatflux JF,t in Abhängigkeit der Ultraschallfrequenz fUS einer 0,5 %igen (w/w) Milchlösung (Kobayashi et al., 2003)

Die Wirksamkeit der US-Anwendung kann dabei nicht losgelöst von weiteren

Prozessparametern betrachtet werden. US-Anwendung bei Filtrationsprozessen erlaubt

höhere Feed-Konzentrationen ohne Abnahme des Permeatflux. Bei Annäherung an eine

Grenzkonzentration, dargestellt in Abbildung 17, nimmt der positive Effekt des US jedoch ab

(Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al., 2005; Wakeman & Tarleton, 1991).

Abbildung 17: Abhängigkeit des Permeatflux von der Konzentration CF des Feed für die Crossflow-Filtration von Molke mit und ohne die Verwendung von US (Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al., 2005; modifiziert)

Stand der Forschung

26

Hierbei spielt auch die Viskosität und Partikelgrößenzusammensetzung des Feed eine Rolle.

Besonders bei kleinen Partikeln wird von erhöhter Partikelbewegung ausgegangen, die einer

Deckschichtausbildung entgegenwirkt oder durch Agglomeration von feinen Partikeln in einer

Verminderung des Deckschichtwiderstands resultiert (Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar,

et al., 2005; Wakeman & Tarleton, 1991). Steigt die Viskosität und die Oberflächenspannung

des Feeds jedoch an, wird besonders das Auftreten kavitations-basierender Effekte durch

erschwerte Ausbildung der Kavitation reduziert (Wakeman & Tarleton, 1991; Mason & Lorimer,

1988). Auch bei Ansteigen des Transmembrandrucks ∆pTMP, dargestellt in Abbildung 18,

verringert sich der fluxsteigernde Effekt des US, abhängig von den Membraneigenschaften,

teilweise deutlich. Die Drucksteigerung führt zu einer Verdichtung des Filterkuchens und somit

zu erhöhtem Wiederstand. Darüber hinaus kommt es bei steigendem Druck zu

Unregelmäßigkeiten im US-Feld, die dafür sorgen, dass US-induzierte Effekte nicht mehr

gleichmäßig auf der kompletten Membranfläche wirken (Kyllönen et al., 2005; Matsumoto,

Miwa, Nakao, & Kimura, 1996).

Abbildung 18: Druckabhängige Änderung des Permeatflux bei der Crossflow-Mikrofiltration von Bäcker-Hefe (Matsumoto et al., 1996)

2.1.5 Die Dialyse

Die Trennung im Dialyse-Prozess erfolgt, im Gegensatz zu druckgetriebenen Ultra- und

Nanofiltrationsverfahren, durch einen Konzentrationsgradienten zwischen zwei

membrangetrennten Phasen (Baynes & Dominiczak, 2014; de Castro, Capote, & Ávila, 2008).

In der Praxis werden Dialyse-Prozesse, neben medizinischen Anwendungen, zur Abtrennung

niedermolekularen Substanzen wie beispielsweise Salzen eingesetzt (Baynes & Dominiczak,

2014; Luo, Wu, Xu, & Wu, 2011; Pingoud & Urbanke, 1997). Des Weiteren ist eine Nutzung

zur Aufkonzentration von Makromolekülen möglich (Dennison, 2003). Eine Dialyse lässt sich

Stand der Forschung

27

im Labormaßstab, dargestellt in Abbildung 19, mit einfachen Mitteln durchführen (Ballew,

Martinez, Markee, & Eddleman, 2002).

Abbildung 19: Schematische Darstellung des Dialyseprozess (Ballew, Martinez, Markee, & Eddleman, 2002; modifiziert)

Abhängig vom MWCO passieren kleine Partikel die semipermeable Membran im Bestreben

eines Konzentrationsausgleichs zwischen Probe und Puffer, während große Moleküle

zurückgehalten werden (Baynes & Dominiczak, 2014). Durch mehrfachen Austausch des

Puffers kann die Konzentration kleiner Partikel deutlich abgesenkt werden (Koolman & Röhm,

2003). Zur Verbesserung des Diffusionsvorgangs ist ein Rühren des Puffers, sowie ein

möglichst großes Membranoberflächen-Probenvolumen-Verhältnis, von Vorteil (Dennison,

2003). Eine erhöhte Diffusionsrate lässt sich bei erhöhten Temperaturen und niedrigen

Viskositäten erreichen (Ballew et al., 2002). Unter Berücksichtigung der Proteinstabilität

werden Dialyseprozess aber bevorzugt bei niedrigen Temperaturen oder bei Raumtemperatur

durchgeführt (Dennison, 2003; Ballew et al., 2002). Die Performance der Dialyse ist darüber

hinaus, vergleichbar mit druckgetriebenen Trennverfahren, abhängig von den Feed-

Charakteristika, Membraneigenschaften und Konzentrationspolarisations-Effekten (Dennison,

2003; Ballew et al., 2002). Besondere Wichtigkeit obliegt dabei Membrancharakteristika wie

Dicke und Oberflächeneigenschaften (Porosität, Dimensionierung) der Membran (de Castro

et al., 2008).

Stand der Forschung

28

2.2 Rohstoffcharakterisierung

2.2.1 Milchproteine

Die Proteine der Milch sind seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschungen (Hartmann

& Meisel, 2007; Meisel, 1997). Der Schwerpunkt liegt hierbei, neben der Erforschung

bioaktiver Substanzen, auf dem funktionellen Potential der Milchproteine für die

Lebensmittelindustrie (Foegeding, Davis, Doucet, & McGuffey, 2002; Meisel, 1997). Der

Gesamtproteingehalt der Milch beträgt 2,8 – 3,6 %. Der Großteil davon, etwa 98 %, entfällt auf

die beiden Proteingruppen Casein und Molkenprotein. Die restlichen 2 % verteilen sich auf

Hüllproteine und Enzyme (Töpel, 2004). Tabelle 1 gibt einen Überblick über die prozentuale

Zusammensetzung der beiden Proteinfraktionen, sowie weiteren Eigenschaften.

Tabelle 1: Zusammensetzung und Eigenschaften der Milchproteinfraktionen (Ternes, 2008; Topel, 2004; modifiziert)

Protein

%-Anteil

der

Fraktion

%-Anteil in

der

Fraktion

Anzahl der

Aminosäuren

Mr

(kDa) IEP

Casein: 80

αS1-Caseine 35 199 23,6 4,9

αS2-Caseine 10 207 25,3 5,3

β-Caseine 30 209 24,0 5,2

χ-Caseine 12 169 19,0 5,4

Sonstige 13

Molkenproteine: 20

β-Lactoglobulin 55 162 18,0 5,1

α-Lactoglobulin 25 123 14,2 4,2

Immunoglobuline 8 - > 145,0 5,5 – 8,3

Rinderserumalbumin 7 582 66,3 5,0

Lactoferrin 5 700 82,0 8,0

Transferrin - -

Legende: Mr, Molmasse. IEP, Isoelektrischer Punkt.

2.2.1.1 Caseine

Die Proteinfraktion der Caseine bildet mit einem Anteil von ca. 80 % die quantitative

Hauptkomponente der Milchproteine (Töpel, 2004). Im Gegensatz zu den Molkenproteinen

verfügen sie nicht über eine globuläre Struktur und können, begründet durch ihren hohen

Prolingehalt, nur bedingt Sekundärstrukturen ausbilden (Töpel, 2004; Graham, Malcolm, &

McKenzie, 1984; Slattery, 1976; Herskovits, 1966).

Stand der Forschung

29

Caseine sind, abhängig vom pH-Wert des Umgebungsmilieus, sehr hitzetolerant und bleiben

bis zu einer Temperatur von 120 – 140 °C stabil (Anema & Klostermeyer, 1997; Ternes, 2008;

Töpel, 2004). Durch Zusatz von Natriumchlorid (NaCl), Natriumcitrat (C6H5Na3O7) oder

Natriumphosphat (Na3PO4) und den damit verbundenen pH-Wert-Veränderungen kann

beispielsweise die Caseinstabilität bei 95 °C für Erhitzungsdauern von bis zu 30 min erhöht

werden (Le Ray et al., 1998). Bei einem pH von 4,6 fallen Caseine aus und bilden, unter

Labeinwirkung und in Gegenwart von Calcium-Ionen (Ca2+), ein Gel (Ternes, 2008; Töpel,

2004). Caseine liegen in nativem Zustand überwiegend in Form von Caseinmicellen vor. Als

Caseinmicellen bezeichnet man einen Komplex aus Caseinmolekülen der Caseinfraktionen

αS1, αS2, β und κ sowie Wasser (Töpel, 2004). Den Aufbau der Caseinmicellen betreffend

existieren verschiedene Modelle, von denen das Casein-Submicellen-Modell am weitesten

verbreitet ist (Holt, de Kruif, Tuinier, & Timmins, 2003; Horne, 1998; Ternes, 2008; Töpel,

2004). Die Eigenschaften der Caseine werden lebensmitteltechnologisch besonders bei der

Herstellung von Käse- und Sauermilchprodukten wie Joghurt oder Kefir ausgenutzt. Durch

Säurefällung, Behandlung unter Hochdruck oder das Einwirken von proteolytischen Enzymen

kommt es zur Koagulation der Caseinmicellen und, abhängig von Umgebungsmilieu und

mechanischen Einflüssen, zur Gelbildung (Ternes, 2008; Töpel, 2004).

2.2.1.2 Molkenproteine

Molkenproteine galten lange Zeit als unerwünschtes Nebenprodukt der Käseherstellung. Ihre

Bedeutung als bioaktive Substanz und ihr technologischer Nutzen wurden erst

verhältnismäßig spät, durch Einführung neuer gesetzlicher Regulationen zur Entsorgung und

technologischen Fortschritt offenkundig und Gegenstand intensiver Forschung. Zuvor lag der

Fokus verstärkt auf der Erforschung und Nutzung der Caseinfraktion (Smithers, 2008; Töpel,

2004). Molkenproteine bilden mit 20 % den quantitativ kleineren Anteil am

Gesamtproteingehalt der Milchproteine (Töpel, 2004). Der größte Anteil wird von β-

Lactoglobulin (55 %) und α-Lactoglubulin (25 %) abgedeckt (Ternes, 2008). Abhängig von der

Wahl der Literaturquelle existieren geringfügig abweichende Konzentrationsangaben. Im

Gegensatz zu den Caseinen liegen Molkenproteine in nativer Form als globuläre Strukturen

vor und sind somit vergleichsweise hitzeempfindlicher. Ihre Denaturierungstemperatur liegt, je

nach Beschaffenheit (z.B. pH-Wert, Vorhandensein von Ca2+-Ionen) des

Umgebungsmediums, zwischen 60 °C und 72 °C (Ternes, 2008; Töpel, 2004).

Spricht man von Molkenproteinen, ist eine Unterscheidung zwischen

Molkenproteinkonzentrat, -Isolat oder -Hydrolysat notwendig (DeMan, 1999). Die Unterteilung

in Konzentrat, Isolat und Hydrolysat erfolgt aufgrund unterschiedlicher Herstellungsprozesse.

Molkenproteinkonzentrate (WPC – Whey Protein Concentrate) werden unter Verwendung

mehrstufiger Ultrafiltrationsanlagen gewonnen (DeMan, 1999; Mehrens, 2004). Hohe

Stand der Forschung

30

Proteingehalte von bis zu 80 % erreicht man durch Auswaschen niedermolekulare

Bestandteile mittels Diafiltration. Molkenproteinisolate (WPI – Whey Protein Isolate) können

einen Proteingehalt von über 90 % aufweisen (Mehrens, 2004). Hierzu wird zusätzlich zur

Ultrafiltration eine Mikrofiltration vorgeschaltet oder eine Kombination aus Mikrofiltration und

anschließender Aufarbeitung durch Ionenaustauscher verwendet (DeMan, 1999; Mehrens,

2004). Bedingt durch die feinere Filtration werden Fettbestandteile, Mikroorganismen und

große Proteinaggregate abgetrennt (Mehrens, 2004). Die Herstellung von

Molkenproteinhydrolysaten (WPH – Whey Protein Hydrolysate) findet bevorzugt unter

Verwendung von Proteasen statt (DeMan, 1999). Das Ergebnis der Hydrolyse ist abhängig

von der Spezifität der verwendeten Enzyme und deren Einwirkzeit. Nach erfolgter Hydrolyse

wird die erhaltene Lösung filtriert und getrocknet (DeMan, 1999; Lahl & Braun, 1994).

Abhängig vom Hydrolysegrad werden hydrolysierte Molkenproteine in „partially hydrolysed

whey proteins“ (PH-W) und „extensively hydrolysed whey proteins“ (EH-W) eingeteilt (Schütte

& Paschke, 2009).

2.2.2 Algen & Algenproteine

Mit dem Begriff „Alge“ klassifiziert man eine Vielzahl überwiegend im Wasser lebender

Organismen (Rogers, 2011; Hoek, Mann, & Jahns, 1995). Die Systematik der Algen ist

aufgrund laufender Forschung ständiger Veränderung unterworfen und umfasst

quellenabhängig Pro- und Eukaryoten (Rogers, 2011; Hoek et al., 1995; Harlin & Darley,

1988). Eine Einteilung in einzellige Mikroalgen und komplexere Makroalgen erleichtert eine

Übersicht. Basierend auf ihrer Pigmentierung werden Makroalgen in Braun- (Phaeophyceae),

Rot- (Rhodophyceae) und Grünalgen (Chlorophyceae) eingeteilt. Mikroalgen sind in

Diatomeen (Bacillariophyta), Dinoflagellaten (Dinophyceae) und prokaryotische Blaualgen

(Cyanbateria) unterteilt (Rogers, 2011; Garson, 1989). Mikroalgen rückten in den letzten

Jahren besonders als Lieferant für Biomasse zur Kraftstoffproduktion in den Fokus der

Forschung (Demirbas & Demirbas, 2010; Mata, Martins, & Caetano, 2010). Mit der

Entdeckung aus Algenprotein gewonnener, bioaktiver Peptide stieg das Interesse an Makro-

und Mikroalgen auch abseits der Kraftstoffproduktion (Samarakoon & Jeon, 2012; Harnedy &

FitzGerald, 2011). Ein hoher Proteinanteil macht Mikroalgen auch als Lebensmittel interessant

(Mata et al., 2010; Becker, 2007; Bewicke & Potter, 1984).

Neben Dunaliella und Spirulina gilt Chlorella als Mikroalgen-Gattung mit großem Potential als

Lebensmittelzusatz (Mata et al., 2010; Bewicke & Potter, 1984). Die den Grünalgen

zugehörige, kugelförmig bis elliptische Chlorella vulgaris, dargestellt in Abbildung 20, verfügt

über eine Zellwand mit hoher Stabilität (Renneberg & Berkling, 2012). Die Zellwand der

meisten Pflanzen besteht zu 15 – 30 % aus Cellulose, zu ca. 30 % aus Pektin, sowie zu 20 –

Stand der Forschung

31

25 % aus Hemicellulose (Chen, 2014). Cellulose, Pektin und Hemicellulose sind auch in

Mikroalge maßgebende Bestandteile der Zellwand (Bastos, 2018; Domozych, 2016).

a) ganze Zelle; b) hochauflösende Vergrößerung der Zellwand

Abbildung 20: Schematische Darstellung von Chlorella (links: Linne von Berg, Hoef-Emden, & Melkonian, 2012, modifiziert) und transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Chlorella vulgaris (rechts: Yamamoto, Kurihara, & Kawano, 2005, modifiziert)

Die durchschnittliche Dicke einer Chlorella vulgaris Zellwand liegt bei 17 – 20 nm (Yamamoto

et al., 2005). Der Proteingehalt von Chlorella, wird, je nach Art und Quelle, mit 51 – 58 %

angegeben (Safi, Zebib, Merah, Pontalier, & Vaca-Garcia, 2014; Morris, Almarales, Carrillo, &

Bermúdez, 2008; Becker, 2007). Eine von Übersicht der Zusammensetzung verschiedener

Algen ist beispielhaft in Abbildung 21 dargestellt (Becker, 2007).

Abbildung 21: Zusammensetzung verschiedener Algen (Becker, 2007)

Hydrolysate von Chlorella können aufgrund ihres hohen Anteils an Glutaminsäure, dargestellt

in Abbildung 22, einen fleischig-herzhaften (umami) Geschmack aufweisen (Yamaguchi, 1997;

Tchorbanov, Bozhkova, Dilov, & Litchev, 1986). Die Aminosäuren-Zusammensetzung von

Chlorella vulgaris kann, je nach Analysemethode, Umrechnungsfaktor und Quelle jedoch

schwanken (Safi et al., 2014).

Zellwand

Zellkern

Chloroplast

Stand der Forschung

32

Abbildung 22: Aminosäurenprofil von Chlorella vulgaris (Safi et al., 2014; modifiziert; basierend auf a Safi et al. 2012; b Faheed & Fattah, 2008 & Shaaban, 2001; c Naik, Goud, Rout, & Dalai, 2010)

Die technologischen Eigenschaften von Chlorella im Lebensmittelbereich sind trotz großem

Potential bis jetzt wenig erforscht (Ursu et al., 2014). Ursu et al. (2014) charakterisierten die

aus Chlorella vulgaris gewonnenen Proteine mit Hilfe einer Natriumdodecylsulfat-

Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE). Abhängig von pH-Wert während der Zell-Lysis

identifizierten sie Proteine im Bereich von 25 – 60 kDa mit Schwerpunkt bei 30 kDa (pH 7)

bzw. 60 kDa (pH 12). Der IEP lag für einen Großteil der Proteine im Bereich 4,0 – 5,5, sowie

6,0 – 8,0. Morris et al. (2008) stellten bei der Gel-Filtration von Chlorella vulgaris sechs

Proteinfraktionen im Bereich von 12 – 120 kDa fest. Die aus Chlorella vulgaris gewonnen

Proteine verfügen über eine Emulgierfähigkeit und emulsionsstabilisierende Eigenschaften,

die mit kommerziellen Produkten wie Natrium-Caseinat vergleichbar sind (Ursu et al., 2014).

2.3 Hydrolyse von Proteinquellen

In der Lebensmittelverarbeitung werden Proteine aufgrund ihrer funktionellen Eigenschaften

geschätzt. Ihre stabilisierenden, texturbildenden und wasserbindenden Eigenschaften können

in Produktionsabläufen jedoch durch thermische-mechanische Beanspruchung, Änderungen

des pH-Werts oder der Ionenstärke beeinträchtigt oder aufgehoben werden (Zayas, 1997). Die

Hydrolyse von Proteinen bietet eine gangbare Möglichkeit die Funktionalität des

Ursprungsproteins bei verbesserter Stabilität beizubehalten oder sogar zu steigern (Nielsen,

1997).

Unter dem Begriff Hydrolyse versteht man die Spaltung einer Peptid-Bindung durch eine

Reaktion mit Wasser (H2O), dargestellt in Abbildung 23 (Tavano, 2013; Watson et al., 2010).

Stand der Forschung

33

Das Produkt dieses Prozesses wird als Hydrolysat bezeichnet (Pasupuleti, Holmes & Demain,

2010).

Abbildung 23: Hydrolyse einer Peptidbindung (Pasupuleti, Holmes & Demain, 2010; basierend auf: Adler-Nissen, 1986)

Wichtiger Kontrollparameter bei der Herstellung von Proteinhydrolysaten ist der Hydrolysegrad

(DH - Degree of Hydrolysis). Der DH, in Formel 9 dargestellt, erlaubt eine Aussage über die

prozentuale Anzahl gespaltener Peptidbindungen im Medium.

𝐷𝐻 = ℎ

ℎ𝑡𝑜𝑡 × 100 %

Formel 9: Degree of Hydrolysis

h = Anzahl hydrolysierter Peptidbindungen

htot = Gesamtzahl der Peptidbindungen pro Protein-Äquivalent

htot, die Gesamtzahl der Peptidbindungen pro Protein-Äquivalent ist hierbei abhängig von der

Aminosäurenzusammensetzung des ursprünglichen Proteins (Nielsen, Petersen, &

Dambmann, 2001).

Für die Bestimmung des DH gibt es eine Vielzahl an Methoden von denen die pH-stat, O-

phthaldialdehyd- (OPA) und Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid (TNBS) Methode am weitesten

verbreitet sind (Spellman, McEvoy, O’Cuinn, & FitzGerald, 2003; Nielsen et al., 2001; Church,

Porter, Catignani, & Swaisgood, 1985; Adler-Nissen, 1979; Fields, 1971; Jacobsen, Léonis,

Linderstrøm-Lang, & Ottesen, 1957). Die Ermittlung des DH basiert für OPA- und TNBS-

Methode auf einer Reaktion zwischen spezifischen Aminosäuren und einer Reagenz (O-

Phthaldialdehyd bzw. Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid). Hierbei entsteht ein Komplex der

spektralphotometrisch bei 340 nm detektiert werden kann (Nielsen et al., 2001; Adler-Nissen,

1979). Die pH-stat-Technik nutzt die Freisetzung von Protonen bei einer Hydrolyse im

neutralen oder alkalischen Bereich, die zu einem Absinken des pH-Wert führt. Durch Titration

einer Base wird der pH-Wert konstant gehalten. Die Bestimmung des DH erfolgt rechnerisch

unter Verwendung der zum Konstanthalten des pH-Wertes benötigten Menge an Base (Adler-

Nissen, 1986).

Stand der Forschung

34

Die Hydrolyse von Proteinen kann chemisch, im sauren oder alkalischen Bereich, oder

enzymatisch erfolgen (Tavano, 2013; Pasupuleti, Holmes & Demain, 2010).

2.3.1 Die enzymatische Hydrolyse

In der Lebensmittelverarbeitung werden aufgrund erhöhter Spezifität und Wirtschaftlichkeit,

sowie einer reduzierter Menge an Nebenprodukten, bevorzugt enzymatische Verfahren

eingesetzt (van Oort, 2009). Die grundlegende Charakterisierung von Enzymen erfolgt anhand

der katalysierten Reaktion. Die von der International Union of Biochemistry (IUB) initialisierte

Nomenklatur umfasst sechs Enzymgruppen (van Oort, 2009). Zur Hydrolyse von Proteinen

werden Proteasen aus der Gruppe der Hydrolyasen (EC 3) verwendet (Tavano, 2013; van

Oort, 2009; Clemente, 2000). Proteolytische Enzyme lassen sich anhand ihrer Wirkweise

weiter in Endo-und Exopeptidasen unterteilen (Tavano, 2013; Clemente, 2000).

Exopeptidasen trennen Aminosäuren systematisch am Anfang oder Ende einer Sequenz ab,

wohingegen Endopeptidasen verschieden große Peptidfragmente erzeugen (Clemente,

2000). Die Aktivität der Enzyme ist dabei abhängig von Umgebungsbedingungen. Temperatur,

pH, Substrat- und Enzymkonzentration müssen prozess- und produktspezifisch angepasst

werden (van Oort, 2009).

2.3.1.1 Hydrolyse von Algen & Algenproteinen

Aufgrund ihres hohen Proteingehalts sowie antioxidativer, antibakterieller und antiviraler

Eigenschaften besitzen Mikroalgen Potential für Anwendungen in der Lebensmittel- und

Pharmawirtschaft (Plaza, Cifuentes, & Ibáñez, 2008; Suzuki et al., 2004). Um funktionelle

Komponenten von Mikroalgen zu nutzen, ist das Aufbrechen der oftmals stabilen Zellwände

notwendig (Morris et al., 2008). Dies ist beispielsweise durch das Einwirken von Druck,

organischen Lösungsmitteln oder enzymatisch möglich (Tchorbanov & Bozhkova, 1988). Der

Erfolg der nachfolgenden Hydrolyse des Algenproteins ist abhängig vom verwendeten Enzym

und der Enzymkonzentration. Während eine Hydrolyse mit Pepsin nur zu niedrigen

Hydrolysegraden führt, erwiesen sich Subtilisin, Papin, Pronase und Pancreatin als geeignete

Wahl zur Hydrolyse von Proteinen aus Mikroalgen der Gattung Chlorella und Scenedesmus

(Morris et al., 2008; Tchorbanov & Bozhkova, 1988; Tchorbanov et al., 1986; Barashkov,

Trubachev, & Gitel’zon, 1979). Bei der Hydrolyse von Chlorella mit Pancreatin bzw. Subtilisin

erreichten Morris et al. (2008) und Tchorbanov & Bozhkova (1988) eine DH von 20 – 22 %,

dargestellt in Abbildung 24.

Stand der Forschung

35

Abbildung 24: Hydrolysegrad in Abhängigkeit der Zeit für die Hydrolyse von Chlorella mit Subtilisin (Tchorbanov & Bozhkova, 1988; modifiziert)

Eine vierstündige Hydrolyse von Chlorella vulgaris mit Pancreatin führt zum Abbau aller

Peptide > 28 KDa. Die entstehenden Hauptpeptidfraktionen liegen zwischen 2 – 5 kDa (Morris

et al., 2008).

2.4 Analytik – Die Size-Exclusion HPLC (SE-HPLC)

Die High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) hat sich, bedingt durch den technischen

Fortschritt der vergangenen Jahrzehnte, zur leistungsfähigsten Methode der Flüssigkeits-

Chromatografie entwickelt (Gritter, Bobbitt, & Schwarting, 1987). Die Trennung einer Probe

basiert dabei, vereinfacht dargestellt, auf einer Interaktion des durch eine mobile Phase

(Puffer, Lösungsmittel, Eluent) transportierten Probenmaterials mit einer stationären Phase

(Trennsäule). Abhängig von der Beschaffenheit der Trennsäule wird zwischen adsorptiven und

nicht-adsorptiven Wechselwirkungen unterschieden (Bradley & Desai, 2000). Trennverfahren

wie Normal-Phase (NP)-, Reversed-Phase (RP)- und Hydrophobic-Interaction

Chromatography (HIC) basieren auf adsorptiven Interaktionen, wohingegen bei der Trennung

in SE-HPLC-Prozessen die unterschiedlichen Molekülgrößen einzelner Probenbestandteile

ausschlaggeben sind (Kremer & Bannwarth, 2014; Meyer, 1988). Nicht-adsorptive

Trennprozesse werden in der Regel isokratisch, sprich ohne Veränderung der

Zusammensetzung des Eluenten durchgeführt, während bei adsorptiven Prozessen häufig

Gradienten zum Einsatz kommen. Unter einer Gradientenfahrweise versteht man die

schrittweise Veränderung der Zusammensetzung des Eluenten während des Trennprozesses.

Dies resultiert in einer Veränderung der Interaktion zwischen Probenmolekül und stationärer

Phase, sowie Probemolekül und mobiler Phase und beeinflusst somit dessen

Elutionszeitpunkt (Bradley & Desai, 2000; Amersham Pharmacia Biotech, 1999; Pharmacia

LBK Biotechnology, 1991; Meyer, 1988).

Stand der Forschung

36

Die Zeit die zwischen Aufbringen einer Substanz und der Detektion des Peakmaximums

vergeht, bezeichnet man als Retentionszeit tr, dargestellt in Abbildung 25. Mit der

Retentionszeit tr korrespondiert das Retentionsvolumen Vr, definiert als das Eluenten-

Volumen, das von Aufbringen bis Detektion des Peakmaximums benötigt wird (Siouffi, 2000;

Galensa, Bahadir, Engelhardt, & Böhm, 1995).

Abbildung 25: Bestimmung von Totzeit t0/-Volumen V0 und Retentionszeit tr/-Volumen Vr (Siouffi, 2000)

Als Totzeit t0 bezeichnet man die Zeitspanne, die eine Substanz, die keine Wechselwirkung

mit der stationären Phase erfährt, von Injektion bis Peakmaximum des ersten Peaks benötigt

(Kromidas, 2008; Galensa et al., 1995). Das Totvolumen V0 ist das durch Kapillaren, Fittings

und weitere Bauteile des HPLC-Systems verursachte Volumen zwischen Injektor und

Detektor, ausgenommen der Trennsäule (Kromidas, 2008). Mit Kenntnis von tr und t0 lässt sich

die Nettoretentionszeit ts als Differenz beider Größen bestimmen (Kromidas & Kuss, 2008).

Die SE-HPLC gilt als leistungsfähiges Verfahren zur Größencharakterisierung einer

Probensubstanz und findet dadurch begründet, unter anderem, Anwendung in der Protein-

und Peptid-Charakterisierung (Hong, Koza, & Bouvier, 2012). Als stationäre Phase werden

Trennsäulen mit einer Füllung aus chemisch modifizierten, porösen Silica-Partikeln verwendet

(Hong et al., 2012; Tayyab, Qamar, & Islam, 1991). Beim SE-HPLC Verfahren lassen sich

anhand der Retentionszeiten einzelner Proben-Moleküle Rückschlüsse auf deren

Molekülgröße ziehen. Dazu ist eine Kalibrierung der jeweiligen Säule mit einer bekannten

Stand der Forschung

37

Standardsubstanzen notwendig (Kostanski, Keller, & Hamielec, 2004; Tayyab et al., 1991;

Meyer, 1988). Große Moleküle passieren die Säule dabei am schnellsten, dargestellt in

Abbildung 26, da sie nicht in die Porenstruktur des Silica-Gels eindringen, wohingegen kleine

Teilchen eine längere Wegstrecke durch die Poren zurücklegen und später eluieren (Hong et

al., 2012; Tayyab et al., 1991).

Abbildung 26: Arbeitsweise einer Size-Exclusion Chromatography (Kremer & Bannwarth, 2014; modifiziert)

Die Trennung erfolgt dabei, im Idealfall, lediglich anhand des hydrodynamischen Radius der

Moleküle (Tieke, 2014; Yau & Kirkland, 1981). In der Praxis lassen sich Wechselwirkungen

zwischen Probe und stationärer Phase jedoch nicht vollkommen ausschließen, sodass es zu

Adsorption oder Degradation von Molekülen kommen kann (Hong et al., 2012; O’Callaghan,

Donnelly, Slattery, & Mulvihill, 1995; Kopaciewicz & Regnier, 1982; Yau & Kirkland, 1981).

Diese Effekte gilt es experimentell im Rahmen der Methodenerstellung, beispielsweise durch

die Anpassung von Ionenstärke und pH-Wert des Puffers, zu reduzieren (Arakawa, Ejima, Li,

& Philo, 2010; Golovchenko, Kataeva, & Akimenko, 1992; Kopaciewicz & Regnier, 1982).

2.5 Sensorik – Geschmackswahrnehmung & deren Modulation

Der Geschmack eines Stoffes gibt Auskunft über dessen Genusstauglichkeit (Frings & Müller,

2013). Ein Geschmackseindruck wird auf der Zunge, aber auch im Gaumen und Rachenraum

durch Geschmacksrezeptoren wahrgenommen. Die objektive Einordnung des

Geschmackseindrucks erfolgt durch Interpretation der Reize im Gehirn (Rehner & Daniel,

2010).

Um geschmacksmodulatorische Eigenschaften von Peptidverbindungen verstehen und

bewerten zu können, sind nachfolgend grundlegende Begrifflichkeiten und Abläufe der

Stand der Forschung

38

Wahrnehmung gustatorischer Reize dargestellt. Darüber hinaus werden mögliche

Mechanismen zur Modulation der Geschmackswahrnehmung erläutert.

2.5.1 Geschmacksrezeptoren – Geschmackspapillen, -Knospen & -

Sinneszellen

Die Geschmackswahrnehmung erfolgt durch Geschmackssinneszellen, dargestellt in

Abbildung 27 (c). Diese sind, in Gruppen von 40 - 60, in Geschmacksknospen gebündelt (c),

die wiederum in Zungenpapillen lokalisiert sind (b) (Becker-Carus & Wendt, 2017; Rehner &

Daniel, 2010). Auch Teile der Mundhöhle tragen zur Geschmackswahrnehmung bei.

Vereinzelte Geschmacksknospen befinden sich am weichen Gaumen, der hinteren

Rachenwand, sowie dem Kehldeckel (Rehner & Daniel, 2010).

Abbildung 27: Geschmackrezeptoren - Geschmackspapillen, -Knospen und -Sinneszellen (Becker-Carus & Wendt, 2017; modifiziert)

Die Zungenpapillen werden unter anderem in Abhängigkeit von Form, Größe, Anzahl, sowie

der Anzahl der Geschmacksknospen charakterisiert (Rehner & Daniel, 2010; Büsing &

Heinzeller, 2001). Im Bereich des Zungenrund liegen 7 – 12 unverhornte Wallpapillen (Papillae

vallatae), die jeweils bis zu 200 Geschmacksknospen enthalten (Rehner & Daniel, 2010; Hatt,

Stand der Forschung

39

2006; Büsing & Heinzeller, 2001). Am hinteren Zungenrand sitzen 15 – 30 Blätterpapillen

(Papillae foliatae), die über bis zu 50 Geschmacksknospen verfügen. Über die ganze Zunge

verteilt sind darüber hinaus 150 – 400 unverhornte Pilzpapillen (Papillae fungiformes)

vorzufinden, die jeweils nur 3 – 4 Geschmacksknospen enthalten (Hatt, 2006). Die verhornten

Fadenpapillen (Papillae filiformes) dienen der Tastempfindung (Schulz, Hundeiker, & Kreusch,

2016; Hatt, 2006). Insgesamt verfügt der Mensch über ca. 2000 – 4000 Geschmacksknospen

(Schmidt, Lang, & Heckmann, 2007; Hatt, 2006; Birbaumer & Schmidt, 1991).

Der Aufbau einer Geschmacksknospe ist in Abbildung 27 (c) dargestellt. Gelangen

wasserlösliche Reizstoffe, beispielweise aus der Nahrung, in den Pore/Porus genannten,

flüssigkeitsgefüllten Raum einer Geschmacksknospe, diffundieren diese in Richtung der

fingerförmigen Membranfortsätze (Mikrovilli) der Geschmackssinneszellen (Hatt, 2006;

Birbaumer & Schmidt, 1991). Von dort aus wird der Geschmacksreiz durch afferente

Nervenfasern ins Gehirn weitergeleitet (Birbaumer & Schmidt, 1991). Dort findet die

hedonische Bewertung des Geschmackseindrucks statt (Frings & Müller, 2013).

Überschneidungen von Sinneseindrücken während des Verzehrs können die individuelle

Einordung des Reizes beeinflussen (Rehner & Daniel, 2010). Darüber hinaus kann sich die

Wahrnehmung eines Geschmacksreizes von Person zu Person, beispielsweise aufgrund

unterschiedlicher Anzahl an Geschmacksknospen, unterscheiden (Oehlenschläger &

Schneider-Häder, 2012).

2.5.2 Die fünf Grundgeschmacksarten & deren Wahrnehmung

Klassischerweise wird zwischen den vier Grundgeschmacksarten „süß“, „sauer“, „salzig“ und

„bitter“ unterschieden (Becker-Carus & Wendt, 2017; Rehner & Daniel, 2010; Bujas, Szabo,

Ajdukovć, & Mayer, 1989). Darüber hinaus ist mittlerweile auch „umami“ als fünfte

Grundgeschmacksart anerkannt (Rehner & Daniel, 2010; Birbaumer & Schmidt, 1991). Neben

den Grundgeschmacksarten existieren die Nebengeschmacksqualitäten alkalisch (seifig) und

metallisch (Birbaumer & Schmidt, 1991).

Die Wahrnehmung der einzelnen Grundgeschmackseindrücke ist, mit geringfügigen

Unterschieden (max. 10 %), über die gesamte Zungenfläche moglich. „bitter“ wird jedoch

vorwiegend im hinteren Bereich der Zunge wahrgenommen (Becker-Carus & Wendt, 2017;

Hatt, 2006). Darüber hinaus gilt die Zungenmitte als geschmacksunempfindlich (Becker-Carus

& Wendt, 2017). Die bevorzugte Lokalisation der Geschmacksqualitäten auf der Zunge ist in

Abbildung 28 dargestellt.

Stand der Forschung

40

Abbildung 28: Bevorzugte Lokalisation der Geschmacksqualitäten auf der Zunge (Hatt, 2011; modifiziert)

Grundlegend gehen einer Geschmackswahrnehmung zwei Prozesse voraus; Eine lokale

Depolarisation/Hyperpolarisation der Zellmembran der Geschmackssinneszellen, sowie die

darauf folgende neuronale Codierung des Reizes (Rehner & Daniel, 2010).

Die (Signal-) Transduktion, sprich, die Umsetzung eines chemischen (Geschmacks-) Reizes

in eine elektrische Antwort der Sinneszelle, die in der Depolarisation/Hyperpolarisation

resultiert, erfolgt dabei für „bitter“ und „süß“ rezeptorvermittelt, während „sauer“- und „salzig“-

Empfindungen durch eine direkte Interaktion des ionisierten Geschmacksstoffes mit

Ionenkanälen zustande kommen (Rehner & Daniel, 2010; Hatt, 2006).

Auf die Reizverarbeitung folgt die Reizweiterleitung. Das zuvor erzeugte Sensorpotential der

Geschmackssinneszelle resultiert in einer Transmitterfreisetzung. Diese führt wiederum zu

einer Erregung der afferenten Nervenfasern und der Weiterleitung des Reizes in Form eines

Aktionspotentials (Birbaumer & Schmidt, 1991). Abbildung 29 und Abbildung 30 zeigen die

zugrundeliegenden Vorgänge.

Abbildung 29: Zusammenfassung der Geschmackstransduktion (Silverthorn, 2009; modifiziert)

Stand der Forschung

41

Abbildung 30: Signaltransduktion in Geschmackszellen (Hatt, 2006; modifiziert)

Eine „sauer“-Wahrnehmung wird durch Wasserstoffionen (H+-Ionen) dissoziierter Säuren

ausgelöst. Die Intensität des Geschmacks nimmt dabei mit steigender H+-Ionen-Konzentration

zu, sodass stark/vollständig dissoziierte Säuren, mit wenigen Ausnahmen, eine stärkere

Geschmacksempfindung auslösen (Hatt, 2006). In der Zellmembran der

Geschmacksinneszellen sind zwei Kanalproteine für die “sauer“-Wahrnehmung zuständig;

Amiloridsensitive Natriumionen-Kanäle (Na+-Ionen Kanäle), sowie hyperpolarisationsaktivierte

Kationenkanäle (Hatt, 2011). Die Kanalproteine sind im Ruhezustand Kalium-Ionen (K+-Ionen)

und in geringem Maße auch für Na+-Ionen permeabel (Hatt, 2006). In Anwesenheit von H+-

Ionen wird der Ausstrom von K+-Ionen blockiert. Dies resultiert in der Ausbildung eines

positiven Membranpotentials, sowie in Folge, der Depolarisation der Zelle (Hatt, 2011). Durch

die Zelldepolarisation öffnen sich Calcium-Kanäle (Ca2+-Kanäle), wodurch ein Calcium-Signal

erzeugt wird, das letztendlich zur Transmitterfreisetzung führt (Silverthorn, 2009).

Für milde Säuren, wie Apfel-, Essig- oder Milchsäure wird ein anderer Mechanismus vermutet.

Hierbei wird davon ausgegangen, dass die wenig dissoziierten Säuren die Zellmembran der

Geschmackssinneszellen passieren und erst im Zellinneren weiter dissoziieren und in Folge

die Depolarisation der Zelle auslösen (Frings & Müller, 2013).

„salzig“ schmeckende Stoffe dissoziieren im Mundraum in Kationen und Anionen. Beide

Moleküle tragen zur Geschmackswahrnehmung bei (Hatt, 2006). Die in der Zellmembran der

Stand der Forschung

42

Geschmackssinneszelle verankerten Ionenkanäle sind unspezifisch für Kationen permeabel.

Eine Erhöhung der Kationen außerhalb der Zelle führt zu einem Kationeneinstrom und in Folge

zur Depolarisation (Frings & Müller, 2013; Hatt, 2006). Vergleichbar mit „sauer“ führt diese

Depolarisation zur Öffnung von Ca2+-Kanälen und gipfelt in der Transmitterfreisetzung

(Silverthorn, 2009). Amiloridsensitive Na+-Kanäle können durch Amilorid blockiert werden

(Hatt, 2006).

Die „bitter“-Wahrnehmung ist wesentlich komplexer als es im Falle von „sauer“- oder „salzig“-

Reizen der Fall ist. Aufgrund der Vielfältigkeit von Bitterstoffen verfügt der Mensch über ca. 25

verschiedene Bitterrezeptoren (Frings & Müller, 2013). Bindet ein Bitterstoff an einen Rezeptor

wird eine mehrstufige Signalkaskade ausgelöst. Hierbei sind verschiedene G-Protein-

gekoppelte Mechanismen bekannt, die sich „second messenger“ Botenstoffen bedienen. Eine

Möglichkeit ist der Abbau von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) durch

Phosphodiesterase (PDE) zu nicht-cyclischen 5‘-AMP. Der Abfall der cAMP-Konzentration

führt in Folge zur Öffnung der Ca2+-Kanäle und somit zu einer Depolarisation der Zelle (Rehner

& Daniel, 2010; Aidley, 1998).

Die Zelldepolarisation ist ebenfalls durch eine Phospholipase C (PLC) vermittelte Abspaltung

des „second messenger“ Botenstoffs Inositoltrisphosphat (IP3) aus der Plasmamembran

möglich (Frings & Müller, 2013; Aidley, 1998). Gelangt IP3 zu den intrazellulären Ca2+-

Speichern, werden Ca2+-Ionen freigesetzt. Die Erhöhung des zellinternen Ca2+-Spiegels führt

zur Öffnung von Ionenkanälen. Der daraus resultierende Einstrom von Na+-Ionen führt

letztendlich zur Depolarisation der Zelle und zur Transmitterfreisetzung (Feher, 2017; Boron &

Boulpaep, 2016; Frings & Müller, 2013).

Die „süß“-Wahrnehmung erfolgt ebenfalls G-Protein-vermittelt. Durch natürliche oder

synthetische Zucker ausgelöste Reize werden dabei in Form unterschiedlicher

Signalkaskaden verarbeitet (Rehner & Daniel, 2010; Birbaumer & Schmidt, 1991). Bindet ein

natürlicher Zucker an einen Rezeptor, wird Adenosintriphosphat (ATP) durch das Enzym

Adenylat-Cyclase (AC) in den „second messenger“ cAMP umgewandelt. cAMP aktiviert

darauffolgend die Proteinkinase C. Diese überträgt ihren Phosphat-Rest auf K+-Kanalproteine

und führt dadurch zu einer Blockade des K+-Ionenstroms aus der Zelle. Die Folge ist die

Depolarisation der Zelle (Rehner & Daniel, 2010; Birbaumer & Schmidt, 1991).

Im Falle von synthetischem Zucker wird anstelle der AC eine PLC aktiviert. Die PLC-Aktivität

führt zur Ausbildung der Botenstoffe IP3 und Diacylglycerol (DAG). DAG regt die Proteinkinase

C wiederum zur Übertragung des Phosphat-Rests auf K+-Kanalproteine an und führt, analog

des vorausgehend beschriebenen Prozesses, zur Depolarisation der Zelle (Rehner & Daniel,

2010). Darüber hinaus wird durch IP3 eine Erhöhung des zellinternen Ca2+-Spiegels, mit darauf

folgender Öffnung von Ionenkanälen, getriggert. Dieser Vorgang trägt zur Depolarisation bei

Stand der Forschung

43

(Birbaumer & Schmidt, 1991). Die Zelldepolarisation führt zur Freisetzung von

Neurotransmittern (Feher, 2017; Silverthorn, 2009).

Die „umami“-Wahrnehmung wird aufgrund strukturell ähnlicher Rezeptoren mit der „süß“- und

„bitter“-Wahrnehmung in Verbindung gebracht (Boron & Boulpaep, 2016; Gekle et al., 2010;

Temussi, 2009; Zhang et al., 2003). Binden Aminosäuren wie L-Glutamat oder Peptide an

einen G-Protein gekoppelten Rezeptor, werden „second messenger“ Botenstoffe erzeugt, die

vergleichbar der Signalkaskade der „süß“- und „bitter“-Wahrnehmung, zur Depolarisation der

Zelle und in Folge zu einer Freisetzung der Neurotransmitter führen (Feher, 2017; Boron &

Boulpaep, 2016; Aidley, 1998). Aufbau und Signalkaskaden in einer „umami“-, „bitter“- und

„süß“-Geschmackssinneszelle sind in Abbildung 31 gegenübergestellt.

Abbildung 31: Mechanismus der "süß"-, "bitter"- und "umami"-Wahrnehmung (Feher, 2017; modifiziert)

2.5.3 Zusammenhänge der Geschmackswahrnehmung & deren Modulation

2.5.3.1 Zusammenhänge der Wahrnehmung von „süß“, „bitter“ und „umami“

Aufgrund strukturell ähnlicher Rezeptoren werden „umami“-, „süß“- und „bitter“-Wahrnehmung

in Verbindung gebracht (Boron & Boulpaep, 2016; Gekle et al., 2010; Temussi, 2009; Zhang

et al., 2003). Zhang et al. (2003) wiesen nach, dass bei der Transduktion von „umami“-, „süß“-

und „bitter“-Reizen gemeinsame Signalmoleküle (PLC, sowie der Ionen-Kanal TPRM5)

beteiligt sind, obwohl bei der Wahrnehmung von „süß“ und „umami“ (T1R-Familie) bzw. „bitter“

(T2R-Familie) unabhängige Rezeptorfamilien zu Tragen kommen. Temussi (2009) stellte die

Hypothese auf, dass darüber hinaus eine weitaus komplexere Beziehung zwischen „süß“- und

„umami“-Rezeptoren besteht. Der Autor geht davon aus, dass der bittere Geschmack chiraler

Stand der Forschung

44

Isomere süßer Moleküle von „umami“-Rezeptoren wahrgenommen werden kann, somit folglich

kein separater Rezeptor für die „bitter“-Wahrnehmung chiraler „süß“-Isomere existiert.

Temussi (2009) stützt seine Hypothese auf die Studienergebnisse von Tomchik, Berg, Kim,

Chaudhari, & Roper (2007). Die Autoren arbeiten heraus, dass die meisten präsynaptischen

Zellen (83 %) Signale von zwei oder mehreren Geschmackssinneszellen empfangen. Eine

durch chirale „süß“-Isomere ausgeloste „bitter“-Empfindung kann folglich per „Crosstalk“,

dargestellt in Abbildung 32, auch von „umami“-Rezeptoren erfasst und weitergegeben werden

(Temussi, 2009).

Abbildung 32: Schematische Darstellung des „Crosstalk“ zwischen "umami"- und "bitter"-Rezeptoren (Temussi, 2009; modifiziert; basierend auf: Tomchik et al., 2007)

Weitere Autoren berichteten von nicht-rezeptorspezifischen Geschmackswahrnehmung.

Sowohl Caicedo, Kim, & Roper (2002) als auch Gilbertson, Boughter, Zhang, & Smith (2001)

arbeiten heraus, dass 38 – 73 % der Geschmackssinneszellen auf mehr als eine

Geschmacksausprägung reagieren. Ein einheitliches Meinungsbild hinsichtlich dieser These

existiert jedoch nicht (Scott, 2004). Zhang et al. (2003) wiederlegten die Ergebnisse der zuvor

genannten Autoren in „in vivo“ Knockout-Versuchen mit modifizierten Mäusezellen durch

selektive Modulation der PLC-Funktionalität. Auch Zhao et al. (2003) wiesen durch gezielte

Modulation des T1R2-Rezeptors nach, dass ein bestimmter Rezeptortyp dezidierte

Verhaltensweisen auslöst und die weitergeleitete Geschmacksempfindung abhängig von der

Art des Rezeptors ist.

2.5.3.2 Modulation der Geschmackswahrnehmung

Lebensmittel können bedingt durch Herstellungsprozesse oder das Zusammenwirken von

Inhaltsstoffen unerwünschte Off-Flavours, darunter fallen beispielsweise „bitter“ und

„adstringierend“, aufweisen. Um eine breite Akzeptanz des Produktes zu erreichen, ist in vielen

Stand der Forschung

45

Fällen eine Maskierung des Geschmackseindrucks oder eine Modulation der

Geschmackswahrnehmung erforderlich (Nadathur & Carolan, 2016; Dürrschmid, 2009). Um

unerwünschte oder Fehlgeschmäcker zu reduzieren, existieren verschiedene Methoden

(Nadathur & Carolan, 2016; Dürrschmid, 2009; Ley, 2008). Darunter fallen nach Ley (2008) …

die Entfernung schlecht schmeckender Komponenten,

die Ausbildung physischer Barrieren (Verkapselung, Coating),

der Einsatz von Radikalfängern oder komplexbildenden Stoffen,

die Verwendung stark süßer, salziger, saurer oder fruchtiger Geschmacksstoffe,

kongruenter und maskierender Aromen,

sowie Modulationen auf molekularer Ebene.

Auf molekularer Ebene sind, gemäß Ley (2008), mehrere Möglichkeiten zur Unterdrückung

der „bitter“-Transduktion denkbar. Darunter fallen …

das Einwirken von Molekülen die eine Komplexbildung bewirken, Bitterstoffe zersetzen

oder deren Transport zum Rezeptor einschränken,

als Gegenspieler der T2R-Rezeptor Bindungsstellen wirken, sowie

Moleküle die die T2R-Rezeptorbindungsstellen verändern,

Moleküle die weitere Proteine der Transduktionskette modulieren,

Moleküle die die Funktion des TRPM5-Ionenkanals oder die

Ausschüttung, Bindung und Wiederaufnahme von Neurotransmittern beeinflussen.

In den folgenden Abschnitten wird entsprechend der Zielsetzung der Studie die Modulation

der Bitterwahrnehmung näher beleuchtet. Hierbei wird schwerpunktmäßig auf eine Modulation

auf molekularer Ebene eingegangen.

Für die „bitter“-Wahrnehmung sind Rezeptoren der T2R-Familie verantwortlich (Mueller et al.,

2005). Ein gangbarer Weg zur Reduktion des „bitter“-Geschmacks auf molekularer Ebene

stellt die Hemmung der Bindung von Bitterstoffen mit den relevanten T2R-Rezeptoren dar

(Nadathur & Carolan, 2016). Slack et al. (2010) identifizierten GIV3727 (4-(2,2,3-

trimethylcyclopentyl)-Buttersäure) als Gegenspieler bestimmter Bitterrezeptoren,

insbesondere des hTAS2R31-Rezeptors. Den Autoren gelang es sowohl in „in vitro“

Versuchen, als auch in humansensorischen Panels, die bittere Geschmackskomponente von

Acesulfam-K und Saccharin in wässrigen Lösungen signifikant zu reduzieren. Neben GIV3727

scheint auch Probenecid (4-(Dipropylsulfamoyl)benzoesäure) mit bestimmten T2R-

Rezeptoren zu interagieren. Greene et al. (2011) berichten, neben einer Unterbindung des

Rezeptorsignals „in vitro“, von einer signifikanten Reduktion der Bitterwahrnehmung einer 10

mM Salicin-Lösung nach Benetzen der Mundraumes mit einer 10 mM Probenecid-Lösung. Die

Stand der Forschung

46

Autoren führen dies auf eine Interaktion von Probenecid mit dem hTAS2R16-Rezeptor zurück

und gehen dabei von einem allosterischen Mechanismus aus.

Keast, Breslin, & Beauchamp (2001) verwendeten Natriumsalze und den „bitter“-Geschmack

von verschiedenen Modellösungen zu reduzieren. Die Reduktion der Geschmackintensität ist

dabei abhängig von der Bittersubstanz. Während sich Natriumsalze zur Reduktion der „bitter“-

Wahrnehmung von Kaliumchlorid, Harnstoff und Amilorid eignen, konnte die von Koffein und

Chinin-Hydrochlorid-Dihydrat ausgelöste Geschmacksempfindung nur geringfügig reduziert

werden. Im Gegensatz zu GIV3727 kann der Wirkmechanismus der Natriumsalze nicht alleinig

auf das Gegenspieler-Prinzip zurückgeführt werden.

Abbildung 33: Schematische Darstellung möglicher Wirkmechanismen von Natrium-Kationen während der „bitter“-Transduktion (Keast et al., 2001)

Keast et al. (2001) postulieren verschiedene Wirkmechanismen, dargestellt in Abbildung 33.

Ein möglicher Mechanismus ist die Ausbildung eines ladungsbedingten Abschirmungseffekts

im Bereich des Rezeptors (1). Dieser vermindert potentiell die Rezeptor-Interaktion der „bitter“-

Substanz. Darüber hinaus ist eine Modulation der am Transduktionsprozess beteiligten Ionen-

Kanäle verstellbar (2). Weiter ist eine durch Na+-Ionen ausgelöste Stabilisierung der

Zellmembran denkbar, die Bitterstoffen den Zugang zu in der Membran eingebetteten

Rezeptorproteinen erschwert (3). Auch eine Interaktion der Na+-Ionen mit „second-

messenger“-Botenstoffen kann zu einer Modulation der Geschmackswahrnehmung führen (4)

(Keast et al., 2001).

Bryant et al. (2007) gelang es, die Aktivität des am Transduktionsprozess beteiligten Ionen-

Kanals TRPM5 in HEK293 Zellsystemen auf 40 % zu reduzieren. Die Autoren verwendeten

Stand der Forschung

47

dafür geringe Konzentrationen von Hydrazin-Derivaten. Die Ausprägung der Wirkung von

Hydrazin-Derivaten wurde von Bryant et al. (2007) nicht dokumentiert. Somit ist nicht bekannt,

ob die Substanz zur selektiven Abschwächung eines Geschmacksreizes in der Lage ist, oder

die Geschmackswahrnehmung generell einschränkt (Ley, 2008).

Nicht bei allen Substanzen mit geschmacksmodulatorischen Eigenschaften sind die

Wirkmechanismen geklärt. Zhang, Xia, & Peterson (2014) identifizierten „bitter“-blockenden

Eigenschaften bei einem Maillard-Reaktionsprodukt des flavan-3-ol−spiro-C-Glycosids ohne

dessen Einfluss auf die Geschmackstransduktion zu betrachten. Hofmann et al. (2007)

unterbanden den „bitter“-Geschmack einer wässrigen L-Phenlyalanin-Lösung durch den

Zusatz verschiedener Pyridinium Betaine (Glypyridaine, β-Alapyridaine, Gabapyridaine).

Pyridinium Betaine wirken nicht nur als „bitter“-Blocker sondern verstärken auch den „süß“-,

„salzig“- und „umami“-Geschmack (Hofmann et al., 2007). Neodiosmin vermindert ebenfalls

die „bitter“-Wahrnehmung, wie Guadagni, Horowitz, Gentili, & Maier (1979) bei der

humansensorischen Bewertung von Koffein- und Chinin-Sulfat-Lösungen feststellten. Die

Verwendung von Neodiosmin wird jedoch unter anderem durch eine begrenzte Erhältlichkeit

eingeschränkt (Ley, 2008). Weitere Verbindungen, die ein quantitative Veränderung der

Bitterwahrnehmung bewirken, sind Adenosin-5‘-Monophosphat und Chlorhexidin

(Dürrschmid, 2009).

Generell ist die Modulation des „bitter“-Geschmacks aufgrund der Vielzahl der am

Transduktionsprozess beteiligten T2R-Rezeptoren eine Herausforderung. Bis heute gibt es

kein allumfassende Lösung, sodass zur Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung zumeist

Kombinationen aus Verkapselung, dem Zusatz von kongruenten und maskierenden Aromen

oder weiteren Methoden Anwendung finden (Ley, 2008).

2.5.4 Geschmacksqualitäten von Peptiden

Peptidverbindungen gewannen als Ersatz für Lebensmittelinhaltsstoffe bereits früh an

Bedeutung, wie sich anhand des Beispiels Aspartam (als Zuckerersatz) belegen lässt (Ternes,

2008; Pförtsch & Müller, 2006). Die zufällige Entdeckung von Aspartam bildete die Grundlage

für weitere Forschungen hinsichtlich potentieller Geschmackseigenschaften von

Peptidverbindungen. In Anlehnung an die Struktur von Aspartam synthetisierten Polinelli et al.

(1992) und Toniolo et al. (1993) Süßstoffe mit vergleichbarer oder höherer Süßkraft und

gesteigerter Stabilität. In den vergangenen Jahren rückten weitere Verbindungen mit hoher

Süßkraft wie Thaumatin, Monellin, Brazzein, Pentadin, Curculin und Mabinlin in den Fokus der

Forschung (Ternes, 2008). Das aus 54 Aminosäuren bestehende Brazzein trug, wie auch

Monellin und Thaumatin dazu bei, die Annahme zu wiederlegen, dass Verbindungen mit einer

molaren Masse > 2,5 kDa generell nicht über Geschmackseigenschaften verfügen (Ming &

Hellekant, 1994).

Stand der Forschung

48

Neben Süßstoffen lassen sich durch Peptidverbindungen auch „umami“ schmeckende

Komponenten realisieren. Tamura et al. (1989), Ohyama, Ishibashi, Tamura, Nishizaki, & Okai

(1988), sowie Fujimaki, Arai, Yamashita, Kato, & Noguchi (1973) berichteten von

mehrgliedrigen Aminosäureverbindungen, die einen „umami“-Geschmackseindruck auslösen.

Die Existenz „umami“-schmeckender Peptidstrukturen wird jedoch angezweifelt. Bei der

sensorischen Bewertung einer Auswahl von 16 Di- und Tri-Peptiden der zuvor genannten

Autoren, konnten van den Oord & van Wassenaar (1997) bei keiner der untersuchten

Komponenten eine Geschmacksqualität ermitteln, die Monosodium L-Glutamat (MSG) gleicht.

Die Autoren führen dies, unter anderem, auf unzureichende Reinheit der in den

Referenzstudien verwendeten Peptidproben zurück.

Peptide mit einem hohen Gehalt an hydrophoben Resten werden als „bitter“ wahrgenommen

(Matoba & Hata, 1972; Kirimura et al., 1969). Ney (1971) erarbeitete, basierend auf den

Erkenntnissen von Tanford (1962), den Q-Wert zur Vorhersage der Bitterkeit von

Peptidverbindungen. Dieser erlaubt die Bestimmung der mittleren Hydrophobität eines

Peptides. Der Autor postulierte, dass Verbindungen mit Q > 1400 „bitter“ und Verbindungen

mit Q < 1300 nicht „bitter“ schmecken. Guigoz & Solms (1976) bestätigten diese These bei der

Auswertung von diversen Studienergebnissen zu 61 natürlichen und 145 synthetisch

gewonnenen Peptiden, identifizierten allerdings 3 Verbindungen mit Q < 1300 die ebenfalls

einen „bitter“-Geschmack aufwiesen. Darüber hinaus ist der Q-Wert nicht für

Peptidverbindungen geeignet deren Struktur Glycin-Reste aufweist (Guigoz & Solms, 1976).

Cho, Unklesbay, Hsieh, & Clarke (2004) stellten bei der Untersuchung von aus Soja-

Hydrolysat gewonnenen Peptidverbindungen ebenfalls keinen Zusammenhang zwischen Q-

Wert und „bitter“-Geschmack fest.

Die strukturellen Eingeschalten, sowie die Konformität einer Peptidstruktur, ist grundsätzlich

maßgeblich entscheidend für deren Geschmackseigenschaften (Temussi, 2011).

Säurerestreiche Peptide losen beispielweise eine „sauer“-Empfindung aus (Kirimura et al.,

1969). Hydrochloride einiger Peptidverbindungen werden mitunter als „salzig“ empfunden

(Belitz, Grosch, & Schieberle, 2008). Darüber hinaus führt die L- und D-Konformität einer

Struktur zu unterschiedlichen Geschmacksempfindungen, wie Solms et al. (1965) für 18

Aminosäuren herausarbeiteten. Auch der bekannte Süßstoff Aspartam verfügt nur in seiner L-

Konformität über eine süßende Wirkung. Alle weiteren chiralen Isomere schmecken „bitter“

(Mazur et al., 1969). Die Komplexität und Vielzahl der Einflussfaktoren führt jedoch dazu, dass

geschmacksaktive Peptide häufig nur durch Zufall entdeckt werden (Ley, 2008; Mazur et al.,

1969).

Material & Methoden

49

3. Material & Methoden

Im Fokus der Versuchsreihe standen die Entwicklung einer Methode zur Fraktionierung von

Proteinhydrolysaten mittels Crossflow Diafiltration, sowie die sensorische Charakterisierung

von aus Proteinhydrolysaten gewonnenen Peptidfraktionen. Die Methodenerstellung erfolgte

unter Verwendung von kommerziell erhältlichem, hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Kapitel

3.2.1). Nach Etablierung der Modellmethode wurden rohstoffspezifische Anpassungen (Feed-

pH, Ionenstärke) experimentell ermittelt (Kapitel 3.2.2). Für hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

wurde darüber hinaus der Einfluss einer Fraktionierung unter Anwendung von Ultraschall,

sowie die Verwendung alternativer Membranen, untersucht (Kapitel 3.2.2.2 und Kapitel

3.2.2.3). Um die Möglichkeit der Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem vorfiltrierten

Feed (Nullprobe) zu untersuchen, wurden Dialyseversuche durchgeführt (Kapitel 3.2.2.4).

Für die Fraktionierung der Alge Chlorella vulgaris war die Entwicklung eines geeigneten

Hydrolyseverfahrens notwendig (Kapitel 3.3). Die Proteingehalte der verwendeten Hydrolysate

wurden spektralphotometrisch (280 nm) ermittelt (Kapitel 3.4.2). Die Bestimmung des

Hydrolysegrads basiert auf der OPA-Methode von Nielsen, Petersen, & Dambmann (2001)

(Kapitel 3.4.3). Die Analyse der Peptidgrößenverteilung der Fraktionen erfolgte mittel SE-

HPLC unter Zuhilfenahme eines Standards (Kapitel 3.4.4)

3.1 Rohstoffe

3.1.1 Molkenprotein-Isolat

Im Rahmen dieser Studie wurde das hydrolysierte Molkenprotein-Isolat „Thermax 690“ (Lot.

02923210) (Glanbia Nutritionals Ltd., IRL), gewonnen aus Süßmolke, verwendet. Der

Hydrolysegrad des Pulvers liegt bei 8 – 12 %. Der Proteingehalt „dry basis“ ist mit 90 %, der

pH-Wert mit 7,2 – 7,8 angegeben (Glanbia Nutritionals Ltd., 2012). In Tabelle 2 sind weitere

Analysedaten des Molkenprotein-Isolats aufgeführt. In Tabelle 3 ist das Aminosäure-Profil

dargestellt.

Tabelle 2: Zusammensetzung des Molkenprotein-Isolats "Thermax 690" (Glanbia Nutritionals Ltd., 2012)

Bezeichnung Gehalt (%)

Proteingehalt „dry basis“ > 90

Feuchte < 5

Fett < 1

Mineralstoffe < 7

Lactose < 1,5

Material & Methoden

50

Tabelle 3: Aminosäure-Profil des Molkenprotein-Isolats „Thermax 690“ (Glanbia Nutritionals Ltd., 2012)


Asparaginsäure 10,7

Threonin 6,6

Serin 4,3

Glutaminsäure 16,7

Glycin 1,6

Alanin 4,4

Valin 4,9

Isoleucin 6,3

Leucin 9,6

Tyrosin 2,8

Phenylalanin 2,7

Histidin 1,6

Lysin 9,8

Arginin 1,9

Prolin 5,7

Cystein 2,4

Methionin 1,9

Tryptophan 2,0

3.1.2 Alge (Chlorella vulgaris)

Neben dem hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat „Thermax 690“ (Glanbia Nutritionals Ltd., IRL)

fand die Alge „Chlorella vulgaris Powder“ (Lot. 201410215) (Allma, Lissabon, PRT) bei den

nachfolgend dargestellten Untersuchungen Anwendung. Der Proteingehalt des

sprühgetrockneten Algenpulvers liegt bei 52 % (Allma, 2014). Weitere Analysedaten sind in

Tabelle 4 dargestellt.

Tabelle 4: Zusammensetzung des Algen-Pulvers „Chlorella vulgaris Powder“ (Allma, 2014)


Proteingehalt 52,0

Feuchte 6,0

Fett 9,6

Asche 6,8

Kohlenhydrate 12,0

Ballaststoffe 13,6

Material & Methoden

51

3.2 Crossflow-Diafiltration

3.2.1 Die Methodenerstellung

Zur Fraktionierung der hydrolysierten Proteinquellen (Molkenprotein-Isolat, Alge (Chlorella

vulgaris)) wurde ein Crossflow-Anlagensetup konzipiert und entsprechend der Zielsetzung

dieser Studie optimiert. Die hierzu durchgeführten Versuche sind nachfolgend dargestellt.

3.2.1.1 Das Anlagensetup

45 °C

CrossflowAnlage

Feed/Retenat

pTMP (bar)

Wasserbad (beheizt)

TCF (°C)

Waage

Permeat

Datenlogger

pH

Abbildung 34: Schematischer Aufbau der Crossflow-Anlage

Das zur Fraktionierung verwendete Anlagesetup (Abbildung 34) bestand aus einer Polyacryl-

Crossflow Einheit (OPTISEP CL, Schleicher & Schuell BioScience GmbH, Dassel, GER) mit

integriertem Druckmesser, geeignet für die Verwendung von Flat-Sheet Membranen. Die

Regulierung des Transmembrandrucks pTMP erfolgte über ein Ventil an der Ausflussseite der

Crossflow Einheit. Für die Förderung der Feed-Lösung wurde eine Schlauchpumpe (CD 1500,

Heraeus Instruments, Hanau, GER) samt geeigneter Schläuche (Pharmed BPT, Ø 9,5 mm,

NSF 51, R-Biopharm AG, Darmstadt, GER) verwendet. Die Temperierung des Feeds erfolgte

mit Hilfe eines Wasserbads (Ecoline RE 206, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-

Königshofen, GER). Der pH-Wert des Retentats wurde mittels eines pH-Meters (FE 20,

Mettler-Toledo AG, Schwerzenbach, AUT) gemessen. Zur Kontrolle der Temperatur wurde ein

Thermometer (Testo 110, Testo AG, Lenkirch, GER) herangezogen. Die Permeatmenge

wurde gravimetrisch bestimmt (TP 3002, Denver Instruments, Bohemia, USA) und durch einen

Material & Methoden

52

Datenlogger (YDP03-0CE, Sartorius AG, Göttingen, GER) dokumentiert (nur für die Filtration

der Alge Chlorella vulgaris).

3.2.1.2 Ablauf der Membrancharakterisierung – Bestimmung des „kritischen Drucks“

Entscheidend für optimale Selektivität bei hohem Flux ist das Operieren unterhalb eines

deckschichtkontrollierten Bereichs (Pearce, 2007). Da jeder Membrantyp über verschiedene

prozessspezifische Eigenschaften verfügt, wurde der kritische Druck pCP der verwendeten

Membranen im Rahmen der Methodenerstellung ermittelt.

Vor Beginn der Messungen wurde der Permeatflux JWvor von deionisiertem, auf 45 ± 0,2 °C

temperiertem Wasser bei steigendem Druck bestimmt. Dazu erfolgte zur Erzeugung eines

stationären Zustandes ein 15 minütiges Rundführen des Feeds. Im Anschluss wurde nach

weiteren 5 Minuten Laufzeit Permeat über einen Zeitraum von 5 Minuten per Messzylinder

aufgefangen und der Mittelwert JWvor für den jeweiligen pTMP bestimmt.

Zur Charakterisierung der Membranen wurde der Permeatflux JF,t des Feeds bei steigendem

Transmembrandruck pTMP dokumentiert. pTMP wurde, in Intervallen von ∆pTMP = 0,2 bar,

schrittweise von 0 bar bis max. 3 bar (je nach Membran) angehoben. Nach jeder Druckstufe

erfolgte eine Reinigung der Membran und eine Überprüfung des Reinigungserfolgs durch

Vergleich des Wasserflux JWvor mit dem nach der Reinigung bestimmten Flux JWnach. Der

kritische Druck pCP wurde durch Auftragen des Permeatflux JF über ∆pTMP grafisch bestimmt.

Tabelle 5: Charakterisierte UF- und NF-Membranen des Herstellers Microdyn Nadir GmbH (Wiesbaden, GER)

Bezeichnung Trenngrenze (kDa) Material Trennbereich

UH 050 P 50 Polyethersulfon UF






NP 010 1 Polyethersulfon NF

NP 030 0,5 Polyethersulfon NF

Die initiale Charakterisierung verschiedener Membranen (Trenngrenze 0,5 kDa – 50 kDa;

siehe Tabelle 5) des Herstellers Microdyn Nadir GmbH (Wiesbaden, GER) wurde mittels des

gleichen Anlagensetups unter Verwendung hydrolysierten Molkenprotein-Isolats (Thermax

690, Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) bei einer Feed-Konzentration 3 % (w/v) (bezogen auf den

Proteingehalt), pH 8 durchgeführt. Das Permeat der ersten Fraktionierung (Trenngrenze: 50

kDa, Fraktion < 50 kDa) diente dabei als Feed für den jeweils folgenden Trennprozess.

Material & Methoden

53

Die Charakterisierung der in dieser Studie verwendeten 100 kDa Membran (Microdyn Nadir

GmbH, Wiesbaden, GER) (Tabelle 6) erfolgte, abgesehen von der Feed-Konzentration (0,15

% (w/v)), analog der beschriebenen Vorgehensweise (siehe Kapitel 4.3.1).

Tabelle 6: 100 kDa UF-Membranen (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden, GER)

Bezeichnung Trenngrenze (kDa) Material Trennbereich

US 100 P 100 Polysulfon

(hydrophiliert) UF

Die Prozessparameter des Feeds (Temperatur TCF, pH, CF) wurden gemäß der Prämisse der

Vermeidung/Reduzierung von Fouling, Konzentrationspolarisation sowie Bakterienwachstum

basierend auf Erkenntnissen von Pelegrine & Gomes (2012), Nigam, Bansal, & Chen (2008),

Butylina et al. (2006) und Britten, Giroux, & Gaudin (1994) gewählt. Als Rohstoff für das Feed

wurde ein hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd., IRL)

verwendet. Für optimale Löslichkeit des hydrolysierten Molkenprotein-Isolats (Thermax 690,

Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) in 500 ml deionisiertem Wasser, bei gleichzeitig minimiertem

Bakterienwachstum über die Prozesszeit, wurde das Feed (0,15 % (w/v) (bezogen auf den

Proteingehalt)) auf 45 ± 0,2 °C temperiert und mittels Natriumhydroxyd (NaOH) auf pH 8 ±

0,01 eingestellt.

Tabelle 7: Übersicht – Nutschenfilter

Bezeichnung Trenngrenze (µm) Hersteller Material

Polypropylen/Polyethylen

Tiefenfilter 10

Pall Corporation (Port

Washington, USA)

Polypropylen/

Polyethylen

GLA 5000 PVC 5 Pall Corporation (Port

Washington, USA) Polyvinylchlorid

Typ A/E Glass-Fiber

Filter 1

Pall Corporation (Port

Washington, USA)

Borsilikat

Glasfaser

Supor 800 PES 0,80 Pall Corporation (Port

Washington, USA) Polyethersulfon

Cellulose Nitrate Filter 0,45 Sartorius AG

(Göttingen, GER) Cellulose Nitrat

Cellulose Nitrate Filter 0,20 Sartorius AG

(Göttingen, GER) Cellulose Nitrat

Um große Moleküle abzutrennen wurde das Feed vor Prozessbeginn via Nutsche (Sartorius

AG, Göttingen, GER) aufgereinigt. Die verwendeten Filter sind in Tabelle 7 aufgeführt. Das

vorfiltrierte Feed wird als Nullprobe bezeichnet.

Material & Methoden

54

3.2.2 Optimierung der Crossflow-Performance & der Trennschärfe

3.2.2.1 Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke

Da die Trennschärfe eines membranbasierten Trennverfahrens hauptsächlich auf gezielter

Auswahl von Feed-pH-Wert und Ionenstärke basiert (Huisman et al., 2000; Zydney, 1998),

wurden für jede Proteinquelle eine umfassende pH-Versuchsreihe durchgeführt. Die Auswahl

der pH-Stufen, dargestellt in Tabelle 8, orientierte sich, sofern vorhanden, an aktueller

Fachliteratur (Wang et al., 2006; Almécija et al., 2007). Neben der pH-Reihe wurde der Einfluss

einer 150 mM Natriumchlorid (NaCl) Zugabe überprüft (Zydney, 1998).

Die Untersuchungen erfolgten neben hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Thermax 690,

Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) für die hydrolysierte Alge Chlorella vulgaris (Allma, Lissabon,

PRT).

Tabelle 8: Übersicht - pH-Werte je Proteinquelle

pH/Proteinquelle Molkenprotein-Isolat Alge (Chlorella vulgaris)

3 X

4 X

6 X X

7 X X

8 X X

9 X

11 X

Zur Fraktionierung wurde eine hydrophilierte Polysulfon-Membran mit einer Trenngrenze von

100 kDa (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden, GER) (Tabelle 6) verwendet. Für die Alge

(Chlorella vulgaris) war zuvor die Entwicklung eines geeigneten Hydrolyseverfahrens

notwendig (Kapitel 3.3). Die Auswahl der Trenngrenze orientierte sich an der per SE-HPLC

ermittelten Peptidgrößenverteilung des Feeds.

Um einem starken Konzentrationsanstieg im Retentat vorzubeugen, wurde das Verfahren der

diskontinuierlichen Diafiltration, vergleichbar Baldasso, Barros, & Tessaro (2011), eingesetzt.

Abbildung 35 zeigt schematisch den Ablauf der Lösungsmittelzugabe. Dem Feed wurde zu

Beginn des Prozesses ein Diavolumen VDia deionisiertes Wasser zugeführt. Sobald eine dem

Diavolumen VDia entsprechende Permeatmenge VPer aufgefangen wurde, erfolgte die Zugabe

des nächsten Diavoluminas. Der pH-Wert des Feeds wurde nach Zugabe eines Diavoluminas

VDia auf den vor Zugabe ermittelten Wert eingestellt. Eine Fraktionierung endete, sobald vier

Volumenanteile (4 x VDia) Permeat erzeugt wurden.

Material & Methoden

55

Feed H2O H2O H2O H2O

Filtration

Permeat Permeat Permeat Permeat

Retentat

+ + +

Abbildung 35: Schematischer Ablauf der Diafiltration

Die Feed-Konzentration wurde, basierend auf den Erkenntnissen der Pilot-Versuche (siehe

Kapitel 4.3.1), auf 0,15 % (w/v) festgelegt. Für optimale Löslichkeit des hydrolysierten

Molkenprotein-Isolats, bzw. der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris) in 500 ml deionisiertem

Wasser, wurde das Feed auf 45 ± 0,2 °C temperiert. Der jeweilige pH-Wert des Versuchs

(siehe Tabelle 8) wurde mittels Natriumhydroxyd (NaOH) bzw. Salzsäure (HCl) eingestellt.

Neben der pH-Reihe wurde der Einfluss einer 150 mM NaCl-Zugabe überprüft. Hierzu wurden

dieselben pH-Stufen verwendet.

Um große Moleküle abzutrennen, wurde das Feed vor Prozessbeginn via Nutsche (Sartorius

AG, Göttingen, GER) aufgereinigt. Die verwendeten Filter sind in Tabelle 7 aufgeführt. Das

vorfiltrierte Feed wird als „Nullprobe“ bezeichnet.

Die im Rahmen dieser Studie verwendete Schlauchpumpe (CD 1500, Heraeus Instruments,

Hanau, GER) verfügt über eine variable Einstellung der Fördermenge Q. In Tabelle 9 sind die

mit verschiedenen Fördermengen korrelierenden Strömungsgeschwindigkeiten ʋ dargestellt.

Tabelle 9: Pumpenfördermengen und daraus resultierenden Strömungsgeschwindigkeiten

Fördermenge Q (ml/min) Strömungsgeschwindigkeit ʋ (m/s)

1000 0,24

2000 0,47

4000 0,94

6000 1,41

8000 1,88

Material & Methoden

56

Während der Pilot-Versuche wurde der Einfluss der Strömungsgeschwindigkeit ʋ auf die

Performance der Anlagen-Konzeption überprüft. Bei Strömungsgeschwindigkeiten ʋ zwischen

0,24 – 0,47 m/s (Fördermenge: 1000 ml/min – 2000 ml/min) konnten während des Anfahrens

des Systems entstandene Luftblasen nicht vollständig aus der Filtrationseinheit transportiert

werden. Das Forderverhalten erschien „ungleichmäßig“, sowie „schubartig“. Ein Anheben der

Strömungsgeschwindigkeit ʋ über 0,94 m/s (Fördermenge: 4000 ml/min) war im Rahmen

dieser Studie für die gegebene Anlagenkonzeption ebenfalls nicht über längere Zeiträume

möglich. In Abhängigkeit vom Transmembrandruck ΔpTMP führten höhere

Strömungsgeschwindigkeiten ʋ zu mechanisch bedingtem, unrundem Pumpenlauf und

darüber hinaus zum Aufblähen und schlussendlich Platzen der Schläuche. Schläuche mit

höherer Wandstärke/Stabilität konnten auf der verwendeten Schlauchpumpe nicht verwendet

werden, da Rotor und Stator aufgrund der geringeren Elastizität nicht zur Kompression des

Schlauchmaterials imstande waren und somit der notwendige Ansaugunterdruck nicht erzeugt

werden konnte.

Die für die Versuche in dieser Studie angewendeten Parameter pTMP und Fördermenge Q der

Pumpe sind in Tabelle 10 dargestellt.

Tabelle 10: Übersicht - Parameter der Crossflowfraktionierung

Proteinquelle Trenn-

grenze (kDa)

Transmembrandruck

pTMP (bar)

Pumpenfördermenge Q

(ml/min)

Molkenprotein-

Isolat 100 0,5 4000

Alge (Chlorella

vulgaris) 100 0,5 4000

Während des Fraktionierungsprozess wurden die Prozesszeit tF, die Permeat- und

Retentatmengen VPer bzw. VRet, sowie der pH-Verlauf (nur für die hydrolysierte Alge (Chlorella

vulgaris)) (Messintervall: Minute 1 – 10, minütlich; Minute 10 – Ende, alle 5 Minuten) während

des Prozesses dokumentiert. Nach Abschluss des Fraktionierungsprozesses erfolgte die

Bestimmung des Proteingehalts CS-Ret/Per (Kapitel 3.4.2), die Aufkonzentration der Fraktionen

(Kapitel 3.4.1), sowie die Probenvorbereitung für die SE-HPLC Analyse (Kapitel 3.4.4.3).

Alle Messungen erfolgten in Dreifachbestimmung.

3.2.2.2 Einfluss von Ultraschall

Für intakte Molkenproteine resultiert eine Fraktionierung unter Ultraschallanwendung (50 kHz)

in einer signifikanten Steigerung des Permeatflux und somit in einer Verminderung der

Prozesszeit durch Beeinflussung der Deckschichtstabilität (Muthukumaran, Kentish, Stevens,

Material & Methoden

57

Ashokkumar, & Mawson, 2007; Muthukumaran, Kentish, Lalchandani, et al., 2005;

Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al., 2005). Der Einfluss von Ultraschall auf die

Trennschärfe der Fraktionierung wurde bis dato wenig beachtet.

In dieser Studie sollte der Einfluss von Ultraschall auf den Prozessparameter Permeatflux JFm,

sowie auf die Trennschärfe der Fraktionierung für hydrolysierte Molkenprotein-Isolate

untersucht werden. Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 36 dargestellt. Abweichend zu den

Hauptversuchen wurden für diese Versuchsreihe zwei mit Polyethersulfon (PES) Membranen

ausgestattete Crossflow-Filtrationskammern (Vivaflow 50, Sartorius AG, Göttingen, GER) mit

einer Trenngrenze von 100 kDa verwendet. Filtrationskammer 1 wurde in einem beheizbaren

Wasserbad (RM6 S, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-Königshofen, GER)

platziert und auf 48 ± 0,2 °C temperiert. Filtrationskammer 2 wurde in ein Ultraschallwasserbad

mit einer Frequenz von 35 kHz (Super RKS 10 H, Bandelin Sonorex, Berlin, GER) eingebracht.

Die Temperierung auf 48 ± 0,2 °C erfolgte in diesem Fall durch den Erwärmungseffekt des

Ultraschalls. Die Temperatur der Wasserbäder wurde mit Hilfe von Thermometern (Testo 110,

Testo AG, Lenkirch, GER) überprüft.

48 °C

Feed/Retenat

Wasserbad (beheizt)

Waage

PermeatSartorius Crossflow Kammer

Sartorius Crossflow Kammer

Ultraschall-Wasserbad (beheizt)

Feed/Retenat

48 °CWaage

Permeat

pH pH

Abbildung 36: Schematischer Aufbau der Crossflow-Anlage mit Ultraschalleinheit

Je 100 ml eines 0,30 %igen (w/v), vorfiltrierten Feeds (Tabelle 7) aus hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) wurden mit je zwei

Diavolumina VDia deionisiertem Wasser verdünnt und auf pH 7 eingestellt. Die Zugabe von

insgesamt zwei weiteren Diavolumina VDia erfolgte, sobald jeweils eine dem Diavolumen

entsprechende Menge Permeat VPer aufgefangen wurde. Der pH-Wert des Feeds wurde nach

Zugabe eines Diavoluminas VDia auf den vor Zugabe ermittelten Wert eingestellt. Die

Material & Methoden

58

Permeatmengen VPerUS und VPerOUS wurden gravimetrisch (LSP 3102, VWR International

GmbH, Darmstadt, GER) in einem Intervall von zwei Minuten bestimmt. Der pH-Wert des

Feeds wurde alle 5 Minuten unter Verwendung eines pH-Meters (FE 20, Mettler- Toledo AG,

Schwerzenbach, AUT) gemessen. Das Versuchssetup wurde simultan mit einer

Schlauchpumpe (Minipuls 2, Gilson Inc., Middelton, USA) bei 25 min-1 betrieben. Vor

Versuchsstart wurden beide Filtrationskammern für 15 min mit deionisiertem Wasser gespült.

Im Anschluss wurde nach weiteren 5 Minuten Laufzeit Permeat über einen Zeitraum von 5

Minuten per Messzylinder aufgefangen und der Flux JV-Wvor-US bzw. JV-Wvor-OUS beider

Filtrationskammern bestimmt. Eine Fraktionierung endete sobald vier Volumenanteile (4 x VDia)

Permeat erzeugt wurden.

Nach Abschluss des Fraktionierungsprozesses erfolgte die Bestimmung des Proteingehalts

CS-Ret/Per (Kapitel 3.4.2), die Aufkonzentration der Fraktionen (Kapitel 3.4.1), sowie

anschließend die Probenvorbereitung für die SE-HPLC Analyse (Kapitel 3.4.4.3).

Die Filtrationskammern wurden nach jedem Versuchsdurchgang einer Reinigung unterzogen.

Hierzu wurden die Kammern jeweils 15 min mit deionisiertem Wasser, 30 min mit 0,075 %

NaOH-Lösung und abschließend abermals 15 min mit deionisiertem Wasser gespült. Der

Permeatflux JV-Wvor-US bzw. JV-Wvor-OUS der Kammern wurde vor jedem Versuchsstart überprüft.

Alle Messungen erfolgten in Sechsfachbestimmung.

3.2.2.3 Eignung von regenerierten Cellulose Membranen für die Fraktionierung

Neben synthetischen Polyethersulfon Membranen finden auch Filtermedien aus regenerierter

Cellulose (RC) Anwendung in der Proteinaufreinigung (Walter et al., 2012). In einem

Pilotversuch wurde, unter Verwendung der zuvor ermittelten optimalen Bedingungen für das

Feed, ermittelt, ob die Nutzung von RC-Membranen in einer Verbesserung der Trennleistung

resultiert.

Der Versuchsaufbau ist in Abbildung 37 dargestellt. Abweichend zu den Hauptversuchen

wurde für diese Versuchsreihe eine mit Membranen aus regenerierter Cellulose ausgestattete

Crossflow-Filtrationskammer (Vivaflow 50, Sartorius AG, Göttingen, GER) mit einer

Trenngrenze von 100 kDa genutzt. Als Feed wurden 100 ml einer vorfiltrierten (Tabelle 7),

0,15 %igen (w/v) Molkenprotein-Isolat-Lösung, pH 9 (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd.,

IRL) verwendet. Das Feed wurde mit Hilfe eines beheizbaren Wasserbads (RM6 S, Lauda Dr.

R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-Königshofen, GER) auf 45 ± 0,2 °C temperiert.

Material & Methoden

59

Wasserbad (beheizt)

45 °C

45 °C

Feed/Retenat

Wasserbad (beheizt)

Sartorius Crossflow Kammer

Waage

Permeat

pH

Abbildung 37: Schematischer Aufbau der Crossflow- Anlage (RC-Membran)

Zugabe der Diavolumina, Dokumentation und Aufnahme der Messwerte, Betriebsparameter

und Art der Geräte, sowie Reinigungs- und Aufarbeitungsprocedere, wurden von den

Versuchen zum Einfluss von Ultraschall (Kapitel 3.2.2.2) übernommen.


3.2.2.4 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed

Die Trennleistung von membranbasierten Trennverfahren kann durch die Ausbildung von

Konzentrationspolarisation, Membran-Protein-Interaktionen und damit in Verbindung

stehendem Fouling beeinträchtigt werden (Huisman et al., 2000; Aimar et al., 1994; Marshall,

Munro, & Trägårdh, 1993). Durch Bildung eines Filterkuchens auf der Membranoberfläche

oder durch Adsorption in den Poren der Membran wird die nominale Trenngrenze

herabgesetzt, sodass auch niedermolekulare Partikel zurückgehalten werden können (Wang

& Tarabara, 2008; Marshall et al., 1993).

Im Rahmen des Versuchs wurde überprüft, ob niedermolekulare Bestandteile (< 2 kDa) aus

einem zur Fraktionierung vorgesehenen, vorfiltrierten Feed per Dialyse abgetrennt werden

können. Hintergrund des Versuchs war die Überprüfung der Eignung der Dialyse zur

Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus der zur Fraktionierung vorgesehenen Nullprobe.

Als Feed wurde eine Molkenprotein-Isolat-Lösung (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd.,

IRL) (1 % (w/v), 2 % (w/v), 4 % (w/v); bezogen auf den Proteingehalt) verwendet.

Material & Methoden

60

Hochmolekulare Bestandteile wurden per Vorfiltration des Feeds abgetrennt (Tabelle 7).

Neben der Feed-Konzentration wurde der Einfluss von Initial-pH-Wert (3, 5, 6, 7,5, 9, 11) und

Dialysezeit (24 h, 48 h) auf die Trennschärfe ermittelt. Unter Initial-pH wird der pH-Wert der

Dialyseprobe verstanden, der zu Beginn des Dialyseprozess, sowie bei Wechsel der

Dialyselösung eingestellt wurde. Als Dialyselösung wurde destilliertes Wasser verwendet. Die

Dialyselosung „destilliertes Wasser“ wurde mit dem Hintergrund gewählt, das Feed frei von

den zur Herstellung von Dialysepuffern üblichen Salzen, Aminen und ähnlichen Zusätzen mit

Pufferwirkung zu halten, die eine Aufreinigung des Retentats vor einem nachfolgenden

Fraktionierungsprozess notwendig machen würden. Ein Wechsel der Dialyselösung, sowie die

Justierung des pH-Werts der Dialyseprobe auf den Initial-pH, erfolgten jeweils nach 2, 4 und

6 h (24 h Versuch) sowie nach 2, 4, 6, 24, 26 und 28 h (48 h Versuch). Eine schematische

Übersicht der Versuche ist in Abbildung 38 dargestellt.

Molkenprotein-Isolat

4 % (w/v)2 % (w/v)1 % (w/v)

pH 6 pH 7,5 pH 9 pH 11pH 5pH 3 pH 9 pH11 pH 9 pH 11

24 h 48 h

pH 9 pH 11

4 % (w/v)

24 h 24 h

Abbildung 38: Schematische Übersicht der Dialyseversuche

23 ml Feed wurden in einen nach Herstellerangaben vorbereiteten Dialyseschlauch mit einer

nominalen Trenngrenze von 2 kDa (Spectra/Por 6, Ø 24 mm, Spectrum Labs Inc., Rancho

Dominguez, CA) eingebracht. Der verschlossene Dialyseschlauch wurde in 2,3 l Dialyselösung

überführt und unter Rühren (IKAMAG RCT Basic, IKA Labortechnik GmbH & Co. KG, Staufen,

GER) bei Raumtemperatur dialysiert. Nach Abschluss der Dialyse wurde der Proteingehalt

CS-Ret des Retentats photometrisch (Kapitel 3.4.2) erfasst. Die Analyse der

Peptidgrößenverteilung wurde mittels SE-HPLC (Kapitel 3.4.4) durchgeführt.


3.3 Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris)

Für die Alge (Chlorella vulgaris) war die Entwicklung eines eigenes Hydrolyseverfahrens

notwendig. Ziel war die Erzeugung eines Feeds mit einer möglichst breiten

Material & Methoden

61

Molekülgrößenverteilung unter Verwendung von in der Lebensmittelindustrie genutzten

Enzymen.

Im Rahmen der Hydrolyseversuche für die Alge Chlorella vulgaris wurden die Enzyme

Corolase 2 TS (AB Enzymes GmbH, Darmstadt, GER), Pronase - Streptomyces griseus

(Merck KGaA, Darmstadt, GER) sowie Pancreatin - Porcine pancreas (Sigma Aldrich GmbH,

Steinheim, GER) auf ihre Eignung für die Hydrolyse überprüft. Von den Herstellern

angegebene Temperatur- und pH-Optima der Enzyme sind in Tabelle 11 dargestellt.

Tabelle 11: Herstellerangaben zu den Enzymen Corolase, Pronase und Pancreatin

Enzym pH-Optimum Temp.-Optimum TOH (°C) Enzymaktivität

Corolase 2 TS 6,5 65 1100 UHb/g

Pronase 7,5 40 45000 PU/g

Pancreatin 7,5 40 8000 USP/g

3.3.1.1 Die Methodenerstellung

Je 200 ml destilliertes Wasser wurden mit Hilfe eines beheizbaren Magnetrührers (IKAMAG

RCT Basic, IKA Labortechnik GmbH & Co. KG, Staufen, GER) auf das Temperatur-Optimum

TOH erwärmt. Anschließend wurden 2,5 % (w/v) Alge (Chlorella vulgaris Powder, Allma,

Lissabon, PRT) (bezogen auf den Proteingehalt) im temperierten Wasser suspendiert und der

pH-Wert auf 7 (Corolase) bzw. 8 (Pancreatin/Pronase) eingestellt.

Der Hydrolyseprozess startete mit Zugabe des jeweiligen Enzyms in den in Abbildung 39

dargestellten Konzentrationen.

Je Enzym (Corolase, Pronase, Pancreatin) erfolgte zuerst eine Hydrolyse der Algen für 45 min

unter Verwendung von 0,125 % Pronase (56,25 PU), 0,25 % Pronase (112,5 PU), sowie 0,5

% Pronase (225 PU), 0,125 % Pancreatin (10 USP), 0,25 % Pancreatin (20 USP), sowie 0,5

% Pancreatin (40 USP) und 0,1 % Corolase (2,75 UHb), 1,5 % Corolase (41,25 UHb), sowie 3,0

% Corolase (82,5 UHb).

Darüber hinaus wurden für die Enzym Pronase und Pancreatin Versuche mit einer

Vorbehandlung im sauren Bereich durchgeführt. Hierzu wurde die Algensuspension (2,5 %

(w/v), bezogen auf den Proteingehalt) mit HCl auf pH 3 eingestellt und für 18 h, sowie 48 h im

Wasserbad (Ecoline RE 206, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-Königshofen,

GER) bei 45 ± 0,2 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Anhebung des pH auf pH 8 ± 0,04.

Das inkubierte Feed wurde darauf folgend für 45 min bei Optimal-Temperatur unter

Verwendung von 0,25 % Pronase (112,5 PU) bzw. 0,25 % Pancreatin (20 USP) hydrolysiert.

Material & Methoden

62

Pancreatin Pronase

0,25 %0,125 % /

Hydrolyse: 45 min0,5 % /



Hydrolyse: 45 min0,25 %

Vorinkubation: 0,02 %

Rohament PL

Vorinkubation:HCl, pH 3

18 h 48 h

72 h

48 h18 h

Hydrolyse: 45 min

Hydrolyse:135 min

Vorinkubation: 0,02 %

Rohament PL

Vorinkubation:HCl, pH 3

18 h 48 h

72 h

48 h18 h

0,25 %

Hydrolyse: 45 min Hydrolyse: 45 min Hydrolyse: 45 min Hydrolyse: 45 min

Hydrolyse: 45 min

Hydrolyse:135 min

Corolase

1,5 % / Hydrolyse: 45 min

0,1 % / Hydrolyse: 45 min

3 % /Hydrolyse: 45min

Legende: Einfachversuch

Abbildung 39: Schematische Übersicht der Hydrolyseversuche

Zusätzlich zur Vorbehandlung im sauren Bereich wurde der Einfluss eines proteolytischen

Enzymes (Pektinase, Rohament® PL, AB Enzymes GmbH, Darmstadt, GER) untersucht. Das

vom Hersteller angegebene Temperatur- und pH-Optima der Pektinase ist in Tabelle 12

dargestellt.

Tabelle 12: Herstellerangaben zu Rohament® PL

Enzym pH-Optimum Temp.-Optimum TOH (°C) Enzymaktivität

Rohament® PL 4 - 5 - 28000 PGU/mg

Der auf pH 4,5 ± 0,05 eingestellten Algensuspension (2,5 % (w/v), bezogen auf den

Proteingehalt) wurden 0,02 % Rohament® PL (14000 PGU) zugegeben. Im Anschluss erfolgte

eine Inkubation für 18 h, 48 h, sowie 72 h bei 45 ± 0,2 °C im Wasserbad (Ecoline RE 206,

Material & Methoden

63

Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-Königshofen, GER). Rohament® PL wurde durch

eine fünfminütige Erhitzung auf 100 °C inaktiviert. Nach der proteolytischen Vorbehandlung

wurde der pH-Wert auf 8 ± 0,05 eingestellt und die Algensuspension für 45 min unter

Verwendung von 0,25 % Pronase (112,5 PU) bzw. 0,25 % Pancreatin (20 USP) hydrolysiert.

Der Hydrolyseprozess endete jeweils mit einer Inaktivierung der Enzyme durch eine

zehnminütige Erhitzung auf 100 °C.

pH-Wert und Temperatur wurden jede Minute (Minute 1 – 5) bzw. in einem Fünf-Minuten-

Intervall (Minute 5 – Ende) dokumentiert. Bei einem Abfall des pH-Wertes unter 6,2 (Corolase)

bzw. 7,2 (Pronase/Pancreatin) erfolgte eine Anhebung auf 6,5 (Corolase) bzw. 7,5 (Pronase/

Pancreatin).

Sofern nicht anders gekennzeichnet, erfolgten alle Messungen in Dreifachbestimmung.

3.3.1.2 Methode zur Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris)

Zur Herstellung des Hydrolysats für die Crossflow Diafiltration wurden, basierend auf den

Ergebnissen der Methodenerstellung, 500 ml einer 2,5 %igen (w/v) Algensuspension

(Chlorella vulgaris Powder, Allma, Lissabon, PRT) (bezogen auf den Proteingehalt) mit HCl

auf pH 3 eingestellt und 48 h im Wasserbad bei 45 ± 0,2 °C inkubiert. Anschließend erfolgte

die Anhebung des pHs auf 8 ± 0,06 und die Temperierung des Feeds auf TOH 40 ± 1 °C. Der

Hydrolyseprozess wurde durch Zugabe von 0,25 % Pronase (112,5 PU) (bezogen auf den

Proteingehalt) gestartet und nach 45 min durch eine Inaktivierung der Enzyme bei 100 °C

beendet.

3.3.2 Aufbereitung und Analytik der Hydrolysate

Im Anschluss an die Hydrolyse wurde das Medium für 30 min bei 3000 min-1 zentrifugiert

(Megafuge 1.0 R, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA). Der Hydrolysegrad des

Überstandes wurde mittels OPA-Methode (Kapitel 3.4.3), die

Molekülgrößenzusammensetzung mittels SE-HPLC (Kapitel 3.4.4) ermittelt. Bis zur

Verwendung wurde das Hydrolysat bei -18 °C gelagert.

3.4 Instrumentelle Analytik & Probenaufbereitung

3.4.1 Aufkonzentration der Peptidfraktionen

Die während des Fraktionierungsprozesses gewonnen Retentate und Permeate wurden für

die weitere Verwendung mit Hilfe eines Rotationsverdampfers-Setups, bestehend aus einem

Rotationsverdampfer mit Wasserbad, temperiert auf TWH 75 ± 5 °C (Rotavapor R-124 + B-

490, Büchi Labortechnik GmbH, Essen, GER), einer Vakuumpumpe (MZ2C, Vaccumbrand

GmbH, Wertheim, GER) zu Erzeugung des Unterdrucks (pU 0,3 ± 0,02 bar), sowie einem

Wasserbad (TWK 8 ± 2 °C) zur Kondensation des Wasserdampfs (Ecoline RE 212, Lauda Dr.

Material & Methoden

64

R. Wobser GmbH & Co.KG, Lauda-Köngishofen, GER) auf ein Volumen von ca. 100 ml

aufkonzentriert und im Anschluss bei -18 °C gelagert.

3.4.2 Spektralphotometrische Proteingehaltbestimmung

Gemäß des Lambert-Beer-Gesetzes besteht bei konstanter Schichtdicke des durchstrahlten

Mediums ein proportionaler Zusammenhang zwischen der Extinktion eines

monochromatischen Lichtstrahls und der molaren Konzentration einer gelösten Substanz, die

eine Bestimmung der molaren Konzentration bei Vorhandensein einer Kalibrationsfunktion

erlaubt (Gressner & Arndt, 2007). Die Bestimmung des Proteingehalts der Fraktionen erfolgte

spektralphotometrisch bei einer Wellenlänge von 280 nm (Aitken & Learmonth, 2009).

Zur Erstellung der Kalibrationsfunktionen wurden Stammlösungen (3 g/l Molkenprotein-Isolat

(bezogen auf den Proteingehalt); 1,6 g/l Alge (Chlorella vulgaris) (bezogen auf den

Proteingehalt)) aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat und hydrolysierter Alge (Chlorella

vulgaris) hergestellt und in Anlehnung an Whitaker & Granum (1980) mit 20 mM Natrium-

Phosphat Puffer schrittweise verdünnt, um verschiedene Konzentrationsstufen CF abzubilden.

Für die hydrolysierte Alge Chlorella vulgaris war zuvor eine referenzmethodische Bestimmung

des Proteingehalts notwendig (siehe Kapitel 3.4.2.1). Die verwendeten Konzentrationsstufen

sind in Tabelle 13 dargestellt.

Tabelle 13: Konzentrationsstufen CF der Kalibrationslösungen

Probe Molkenprotein-Isolat (g/l) Alge (Chlorella vulgaris) (g/l)

1 0,00 0,00

2 0,30 0,20

3 0,60 0,40

4 0,90 0,60

5 1,20 0,80

6 1,50 1,00

7 1,80 1,20

8 2,10 1,40

9 2,40 1,60

10 2,70

11 3,00

Die Konzentration der Molkenprotein-Isolat-Stammlösung wurde unter Berücksichtigung des

Proteingehalts des verwendeten Rohstoffs (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd., IRL)

ermittelt und ist somit als absolut zu betrachten. Der Proteingehalt der hydrolysierten Alge

(Chlorella vulgaris) wurde referenzmethodisch per Kjeldahl-Stickstoffbestimmung ermittelten

(Kapitel 3.4.2.1).

Material & Methoden

65

Das Puffermedium wurde für hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat in Anlehnung an Britten et al.

(1994) auf pH 8 und für die hydrolysierte Alge Chlorella vulgaris in Anlehnung an Hadjoudja,

Deluchat, & Baudu (2010) auf pH 6,5 eingestellt. Die Messungen erfolgten mit Hilfe eines

Spektralphotometers (Ultraspec III, Pharmacia LKB Biochrom Ltd., Cambridge, UK). Durch

Korrelieren der gemessenen Extinktionen mit den Konzentrationen der Kalibrationslösungen

konnten Kalibrationsfunktionen ermittelt werden.


3.4.2.1 Referenzmethodische Bestimmung des Proteingehalts der hydrolysierten Alge

(Chlorella vulgaris)

Zur Erstellung der Spektralphotometerkalibrationen ist Kenntnis bezüglich der Proteingehalte

der verwendeten Kalibrationsstandards notwendig. Der Proteingehalte organischer Stoffe

kann per Kjeldahl-Stickstoffbestimmung ermittelt werden (Nielsen, 2010; Kjeldahl, 1883).

Die Bestimmung des Proteingehalts der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris) wurde extern

an das Labor KWALIS Qualitätsforschung (Fulda GmbH, Fulda, GER) vergeben.


3.4.3 Bestimmung des Hydrolysegrads der Proteinhydrolysate

Die Bestimmung des Hydrolysegrads der Algenhydrolysate (Chlorella vulgaris) erfolgte gemäß

der OPA-Methode von Nielsen, Petersen, & Dambmann (2001).

Die OPA-Methode ist eine analytische Schnellmethode zur Bestimmung des Hydrolysegrads,

die auf der Reaktion primärer Aminogruppen mit o- Phthaldialdehyd beruht (Nielsen et al.,

2001). Die Herstellung der benötigten Reagenzien, sowie die Durchführung der Bestimmung,

sind nachfolgend beschrieben.

Die OPA-Reagenz, sowie ein Serinstandard, wurden vor jeder Anwendung frisch hergestellt.

OPA-Reagenz:

Zur Herstellung der OPA-Reagenz wurden 7,62 g di-Natriumtetraborat Decahydrat (di-

Natriumtetraborat Decahydrat 99,0 - 103,0 % AnalaR NORMAPUR®, VWR International

GmbH, Darmstadt, GER) und 200 mg Natriumdodecylsulfat (SDS) (Natriumdodecylsulfat ≥

98,0 %, VWR International GmbH, Darmstadt, GER) in 150 ml destilliertem Wasser vollständig

gelöst. 160 mg o-Phthaldialdehyd (Phthaldialdehyd ≥ 97 %, Sigma Aldrich GmbH, Steinheim,

GER) wurden in 4 ml Ethanol gelöst und in die bestehende Lösung überführt. Abschließend

wurden der Lösung 176 mg Dithiothreitol (Dithiothreitol ≥ 98 %, Alfa Aesar GmbH & Co. KG,

Karlsruhe, GER) zugefügt und die Lösung mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt.

Material & Methoden

66

Serin-Standard:

Die Herstellung des Serinstandards erfolgte durch Zugabe von 50 mg Serin (L(+)-Serin, Merck

KGaA, Darmstadt, GER) zu 500 ml destilliertem Wasser.

Die Bestimmung des Hydrolysegrads mittels OPA-Methode erfolgte rechnerisch unter

Verwendung spektralphotometrischer Extinktions-Messwerte von Blindproben, Serinstandard,

sowie der eigentlichen Probe.

Für die Messungen wurden Blindprobe, Serinstandard, sowie die eigentliche Probe gemäß

nachfolgendem Schema in Küvetten (Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, GER) pipettiert.

Blindprobe:

3 ml OPA-Reagenz + 400 µl destilliertes Wasser

Serinstandard:

3 ml OPA-Reagenz + 400 µl Serinstandard

Probe:

3 ml OPA-Reagenz + 400 µl Probe

Verdünnung hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris): 1:20

Nach dem Pipettieren beider Komponenten erfolgte ein sofortiges Mischen für 10 sec. Nach 2

min Standzeit wurden die Proben bei 340 nm spektralphotometrisch analysiert (Ultraspec III,

Pharmacia LKB Biochrom Ltd., Cambridge, UK). Die gemessene Extinktion dient als

Berechnungsgrundlage für die Bestimmung des Hydrolysegrads.

Die Extinktion von Blindprobe und Serinstandard wurde je Hydrolysatprobe vierfach, die

Extinktion der zu untersuchenden Probe dreifach bestimmt.

Der Hydrolysegrad wurde gemäß Formel 9 (Seite 33) ermittelt. Hierzu ist vorab die

Berechnung von h (Anzahl hydrolysierter Peptidbindungen), sowie die Kenntnis von htot

(Gesamtzahl der Peptidbindungen pro Protein-Äquivalent) notwendig.

h wurde mit Hilfe der ermittelten mittleren Extinktionen von Blindprobe, Serinstandard, sowie

der zu untersuchenden Probe gemäß Formel 10, berechnet (Nielsen et al., 2001). Die

rohstoffspezifischen Konstanten α (1,00), β (0,40), sowie htot (8,3) entsprechend den

Referenzwerten von Nielsen et al. (2001), sowie Adler-Nissen (1986).

Material & Methoden

67

ℎ =((𝑦𝐸𝑥.−𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 − 𝑦𝐸𝑥.−𝐵𝑙𝑖𝑛𝑑/𝑦𝐸𝑥.−𝑆𝑒𝑟𝑖𝑛 − 𝑦𝐸𝑥.−𝐵𝑙𝑖𝑛𝑑 ∗ 0,9516 ∗ 0,1 ∗ 100/𝑋 ∗ 𝑃) − 𝛽)

𝛼

Formel 10: Berechnung von h

h = Anzahl hydrolysierter Peptidbindungen

α = Konstante (1,00)

β = Konstante (0,40)

yEx.-Probe = mittlere Extinktion der Probe

yEx.-Blind = mittlere Extinktion der Blindprobe

yEx.-Serin = mittlere Extinktion des Serinstandard

X = Einwaage der Probe

P = Proteingehalt der Probe

3.4.4 Analytik der Peptidfraktionen mittels SE-HPLC

Die Analyse der Peptidgrößenverteilung erfolgte mittels SE-HPLC (Meyer, 1988). Die

Chromatogramme der Fraktionen wurden zur Größenbestimmung der enthaltenen

Molekülstrukturen mit einem Gelfiltrations-Standard verglichen.

3.4.4.1 Methodenerstellung

Um die Performance der SE-HPLC hinsichtlich Auflösung und Analysegeschwindigkeit zu

optimieren, wurden verschiedene Kombinationen aus Säule und Laufmittel unter Verwendung

eines Gelfiltrationsstandards (Gel Filtration Standard Catalog # 151-1901, BioRad

Laboratories Inc., Hercules, USA) auf einer HPLC Anlage (880-PU und UV-2077 Plus, Jasco

Labor- und Datentechnik GmbH, Gross-Umstadt, GER) überprüft. Später erfolgte aufgrund

eines Anlagenwechsels (Agilent 1100 Series, Vacuum Degasser, Binary Pump, UV/VIS-

Detector, Manual Injector, Agilent Technologies Corporation, Santa Clara, USA) die

Übertragung der Methode. Die verwendeten Säulen samt Säulenparameter und

Flussgeschwindigkeit sind in Tabelle 14, die Laufmittel in Tabelle 15 dargestellt. Die Auswahl

der überprüften Laufmittel erfolgte aufgrund von Herstellerangaben und Literatur (Webb,

Naeem, & Schmidt, 2002; Uversky & Ptitsyn, 1994; Singh, Donovan, & MacRitchie, 1990).

Tabelle 14: SEC-Säulen und zugehöriger Anlagenfluss

Säule Säulenparameter Fluss (ml/min)

Agilent Zorbax GF 250 4,6 mm x 250 mm, 4 µm 0,500

PSS Suprema 1000 Â 8 mm x 300 mm, 10 µm 1,000

Tosoh TSKgel G 3000 SWXL 7,8 mm x 30 mm, 5 µm 1,000

Material & Methoden

68

Tabelle 15: Laufmittel zur SE-HPLC Methodenerstellung

Laufmittel Molarität (mol/l) pH-Wert

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3 0,05 6,9

Natriumphosphatpuffer + 0,05 M Na2SO4 + 0,05 % NaN3 0,05 6,9

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3 0,10 6,7 / 7,0

Natriumphosphatpuffer + 0,10 M Na2SO4 + 0,05 % NaN3 0,10 6,7 / 7,0

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3 0,20 6,7 / 7,0

Natriumphosphatpuffer + 0,20 M Na2SO4 + 0,05 % NaN3 0,20 6,7 / 7,0

3.4.4.2 Methode zur SE-HPLC Analyse

Zur Analyse der Peptidfraktionen wurde, basierend auf den Ergebnissen der

Methodenerstellung, ein 0,2 M Natriumphosphatpuffer (+ 0,05 M Natriumazid (NaN3)), pH 7 in

Kombination mit einer Agilent Zorbax GF 250 (4,6 mm x 250 mm, 4 µm) (Agilent Technologies

Corporation, Santa Clara, USA) betrieben bei einem Fluss von 0,500 ml/min gewählt. Die

Aufzeichnung der Chromatogramme erfolgte im UV/VIS-Bereich bei einer Wellenlänge von

280 nm. Es wurde jeweils 100 µl Probe aufgegeben.

3.4.4.3 Probenvorbereitung

Feed, Retentat und Permeat wurden mit deionisiertem Wasser auf einen Proteingehalt von 1

mg/ml verdünnt und mittels Spritzenfilter (0,2 µm, Chromafil Xtra PES 20/25, Macherey-Nagel

GmbH & Co. KG, Düren, GER) filtriert.

3.5 Sensorik

Die Produkte des Fraktionierungsprozesses wurden sensorisch auf ihre

Geschmacksqualitäten geprüft. Hierzu erfolgte eine Prüferschulung auf die fünf

Grundgeschmacksarten „süß“, „sauer“, „salzig“, „bitter“ und „umami“.

3.5.1 Schulung des Sensorikpanels

24 Teilnehmer (8 männlich, 16 weiblich) im Alter von 19 – 29 (MW: 22,75 ± 2,44) Jahren

wurden für die Sensorikschulung ausgewählt. Die Teilnehmer wurden gebeten einen

Fragenbogen auszufüllen um Informationen über Alter, Rauchgewohnheiten, Allergien und

Sensorikerfahrung zu erhalten. Die Studie wurde von der Ethik-Kommission der Hochschule

Fulda genehmigt.

Die Schulung erfolgte an sieben einstündigen, in wöchentlichem Rhythmus stattfindenden

Terminen (siehe Abbildung 40), in Anlehnung an die DIN EN ISO 8586:2014 und die ISO

3972:2011 unter Verwendung von Standards der fünf Grundgeschmacksarten. Die Teilnehmer

wurden in zwei Gruppe à 12 Teilnehmern aufgeteilt. Die Schulung der Gruppen erfolgte an

aufeinanderfolgenden Tagen. Eine Übersicht der verwendeten Rohstoffe ist in Tabelle 16

Material & Methoden

69

dargestellt. Alle Proben wurden mit dreistelligen Zahlencodes codiert. Jeder Prüfer erhielt eine

identische Anordnung der Proben. Zur Neutralisation wurde entionisiertes Wasser verwendet.

Schulung und sensorische Bewertung fanden im klimatisierten (T = 23,1 ± 1 °C) Technikum

der Hochschule Fulda statt.

Sensorik-Schulung

Prüfung auf Geschmacks-

blindheit

Prüfung zur Wahrnehmung

eines Reizes

Ermittlung der Reiz- und

Erkennungs-schwelle

Wdhlg. 1

Wdhlg. 1

Whdlg. 2

Wdhlg. 2

Wdhlg. 3

Wdhlg. 3

Schulung zur Anwendung

der Skale

Prüfung zur Unterscheidung von Intensitäts-

stufen

Wdhlg. 1

Wdhlg. 2

Wdhlg. 3

Wdhlg. 1

Wdhlg. 2

Wdhlg. 3

Termin 1

Termin 2

Termin 3

Termin 4

Termin 5

Termin 6

Termin 7

Abbildung 40: Ablaufplan der Sensorik-Schulung

Tabelle 16: Rohstoffe zur Herstellung der Schulungsstandards

Grundgeschmack Rohstoff Bezugsquelle

süß Saccharose, reinst Merck KGaA, Darmstadt,

GER

sauer Citronensäure Monohydrat,

reinst Bernd Kraft GmbH,

Düssburg, GER

salzig Natriumchlorid, reinst Bernd Kraft GmbH,

Düssburg, GER

bitter Koffein (wasserfrei), reinst AppliChem GmbH, Darmstadt, GER

umami Natrium-L(+)-glutamat

Monohydrat Sigma Aldrich Corporation,

St. Louis, USA gemäß DIN EN ISO 8586:2014

Material & Methoden

70

3.5.1.1 Prüfung auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Zu Beginn des Tests wurde den Teilnehmern die Möglichkeit gegeben sich gemäß ISO

6658:2005 mit den verschiedenen Grundgeschmacksarten vertraut zu machen. Hierzu wurde

je eine überschwellige Probe pro Grundgeschmackart gereicht. Im Anschluss wurden die

Teilnehmer gebeten die Grundgeschmacksart von zehn Proben (3x „süß“, 1x „sauer“, 1x

„salzig“, 3x „bitter“, 2x „umami“) zu erkennen. Die verwendeten Konzentrationen der Proben

sind in Tabelle 17 dargestellt.

Die Prüfung erfolgte in Einfachbestimmung.

Tabelle 17: Probenkonzentrationen für die Prüfung auf Geschmacksblindheit

Grundgeschmack Rohstoff Konzentration C (g/l)

süß Saccharose, reinst 10,0


reinst 0,3

salzig Natriumchlorid, reinst 2,0 bitter Koffein (wasserfrei), reinst 0,3


Monohydrat 0,6

gemäß DIN EN ISO 8586:2014

3.5.1.2 Prüfung zur Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Um zu überprüfen, ob die Prüfpersonen den Geschmacksreiz einer überschwelligen Probe

feststellen können, wurde ein Dreieckstest nach DIN EN ISO 4120:2007 durchgeführt. Den

Prüfern wurde für jede Grundgeschmacksart ein Dreieck zur Bewertung gereicht. Die

abweichende Probe sollte ermittelt und die Art der Abweichung angegeben werden. Die

Reihung und Zusammenstellung (AAB, ABA, ABB, BAB, BBA) wurde je Dreieck variiert. Die

verwendeten Konzentrationen der Proben sind in Tabelle 18 dargestellt.

Die Prüfung erfolgte in Dreifachbestimmung.

Tabelle 18: Probenkonzentrationen zur Wahrnehmung eines Reizes

Grundgeschmack Rohstoff Konzentration C (g/l)

süß Saccharose, reinst 7,2


reinst 0,2

salzig Natriumchlorid, reinst 1,4 bitter Koffein (wasserfrei), reinst 0,2


Monohydrat 0,3

in Anlehnung an DIN EN ISO 8586:2014

3.5.1.3 Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle (gemäß ISO 3972:2011)

Um die Reiz- und Erkennungsschwellen der Prüferpersonen zu ermitteln wurde eine einfache

beschreibende Prüfung nach DIN 10964:2014 durchgeführt. Den Prüfern wurden je

Material & Methoden

71

Grundgeschmacksart acht Lösungen einer Geschmacksart, in steigender Konzentration,

gereicht. Als Blindproben dienten zwei Wasserproben. Die Prüfer wurden gebeten anzugeben,

bei welcher Probe ein Geschmackseindruck (Reizschwelle) wahrgenommen, der

Probengeschmack erkannt (Erkennungsschwelle) oder eine Konzentrationsunterschied

(Unterschiedsschwelle) festgestellt wurde. Die verwendeten Konzentrationen der Proben sind

in Tabelle 19 dargestellt.


Tabelle 19: Probenkonzentrationen C zur Ermittlung der Reiz-/Erkennungsschwelle

Verdünnung/Grundgeschmack süß (g/l) sauer

(g/l)

salzig

(g/l)

bitter

(g/l)

umami

(g/l)

D1 12,00 0,60 2,00 0,27 1,00

D2 7,20 0,48 1,40 0,22 0,70

D3 4,32 0,38 0,98 0,17 0,49

D4 2,59 0,31 0,69 0,14 0,34

D5 1,56 0,25 0,48 0,11 0,24

D6 0,94 0,20 0,34 0,09 0,17

D7 0,55 0,16 0,24 0,07 0,12

D8 0,34 0,13 0,16 0,05 0,08

gemäß ISO 3972:2011

3.5.1.4 Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes (gemäß DIN EN ISO

8586:2014)

Um festzustellen ob die Prüfer Proben mit unterschiedlichen Ausprägungen eines Reizes

unterscheiden können, wurde eine Rangordnungsprüfung gemäß DIN ISO 8587:2010

durchgeführt. Je Grundgeschmacksart erhielten die Prüfer vier Proben die nach steigender

Intensität geordnet werden sollten. Die verwendeten Konzentrationen der Proben sind in

Tabelle 20 dargestellt.

Tabelle 20: Probenkonzentrationen C zur Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes

Verdünnung/Grundgeschmack süß (g/l) sauer

(g/l)

salzig

(g/l)

bitter

(g/l)

umami

(g/l)

D1 12,00 0,60 2,00 0,27 1,00

D3 4,32 0,38 0,98 0,17 0,49

D5 1,56 0,25 0,48 0,11 0,24

D7 0,55 0,16 0,24 0,07 0,12

In Anlehnung an ISO 3972:2011 und DIN EN ISO 8586:2014

Material & Methoden

72


3.5.1.5 Schulung zur Anwendung der Skale

Um die Geschmackswahrnehmungen zu quantifizieren wurden die Prüfer auf die Nutzung

einer ordinalen 7-Punkt Skale (siehe Abbildung 41) zur Intensitätsmessung trainiert. Die

Schulung erfolgte in Anlehnung an das Kapitel „Ausbildung eines deskriptiven Panels -

Schulungsphase: Training von Intensitätsmessungen“ von Rummel (2002).

schwach mittel stark

Nicht

wahrnehmbar

Sehr

schwach Schwach

Schwach bis

mittel Mittel

Mittel bis

Stark Stark Sehr stark

0 1 2 3 4 5 6 7

Abbildung 41: 7-Punkt Skale zur Bewertung der Prüfproben

Die Prüfer erhielten je Grundgeschmacksart drei Proben unterschiedlicher Konzentration.

Zuerst wurden die Prüfer gebeten die Proben hinsichtlich ihrer Intensität den Kategorien

„schwach“, „mittel“ und „stark“ zuzuordnen. Im nächsten Schritt sollten die Prüfer auf einer 7-

Punkt Skale angeben, wie ausgeprägt sie den jeweiligen Geschmackseindruck empfunden

haben. Die Ergebnisse wurden zusammengefasst und der Gruppe am Ende eines Termins

vorgestellt. Darüber hinaus wurden den Prüfern die Skalenwerte mitgeteilt, die von der

Versuchsleitung für die einzelnen Proben vergeben wurde. Die verwendeten Konzentrationen,

sowie die korrespondierenden Skalenwerte der Proben, sind in Tabelle 21 dargestellt.

Die Schulung erfolgte in Dreifachbestimmung.

Tabelle 21: Probenkonzentrationen C und Skalenwerte zur Schulung zur Anwendung der Skale

Grundgeschmack/Intensität

(Skalenwert) schwach (2) mittel (4) stark (6)

süß 4,32 g/l 7,20 g/l 12,00 g/l

sauer 0,20 g/l 0,38 g/l 0,60 g/l

salzig 0,48 g/l 0,98 g/l 1,40 g/l

bitter 0,07 g/l 0,14 g/l 0,27 g/l

umami 0,12 g/l 0,34 g/l 0,70 g/l

In Anlehnung an ISO 3972:2011

3.5.2 Prüferauswahl

Die Bewertung und Auswahl der Prüfpersonen erfolgte in Anlehnung an die DIN EN ISO

8586:2014. Aufgrund des ordinalen Skalenniveaus wurden verteilungsunabhängige,

nichtparametrische Testverfahren zur Auswertung herangezogen.

Material & Methoden

73

Basierend auf den Ergebnissen der Schulung zur Anwendung der Skale (Kapitel 3.5.1.5)

wurde die Diskriminierungsfähigkeit je Prüfperson für jeden Grundgeschmack mittels

Friedman-Tests überprüft. Prüfer mit nicht signifikanter Diskriminierungsfähigkeit wurden für

den betreffenden Grundgeschmack aus dem jeweiligen Panel ausgeschlossen. Im Anschluss

erfolgte ein Vergleich der Punktevergabe jeder Einzelperson in Bezug auf den

Gruppenmittelwert mit dem reduzierten Panel. Eine Abweichung > 0,6 Punkten je

Konzentrationsstufe oder mehr als eine Abweichung > 0,5 Punkten führten zum Ausschluss

der betroffenen Prüferperson.

Die Homogenität des jeweiligen resultierenden Panels wurde je Grundgeschmack mittels

Kruskal-Wallis H Tests überprüft. Bei unzureichender Homogenität der Merkmalsausprägung

(niedrige, mittlere, hohe Intensität) eines Grundgeschmacks erfolgte eine Überprüfung der

Panelzusammenstellung unter Verwendung von Mann-Whitney U Tests. Signifikante

Unterschiede zwischen den Prüfpersonen resultierten im Ausschluss der Prüfperson mit vom

Rangmittel abweichender Rangsumme.

Die Ermittlung der Teststatistiken basierten auf einem Signifikanzniveau von α = 0,05.

3.5.3 Sensorik der Peptidfraktionen

Im Rahmen der sensorischen Beurteilung der Fraktionen wurden je Proteinquelle vier Proben

zur Bewertung herangezogen. Neben der jeweiligen Permeat- und Retentatfraktion wurde ein

Bitterstandard und eine Mischung aus Bitterstandard und Permeat gereicht um zu überprüfen,

ob die Geschmacksausprägung „bitter“ durch Zusatz einer Permeatfraktion reduziert werden

kann. Die verwendeten Konzentrationen sind in Tabelle 22 dargestellt.

Tabelle 22: Probenkonzentrationen C für die sensorische Bewertung der Peptidfraktionen

Probe Probengrundstoff Konzentration C (g/l)

Retentat Molkenprotein-Isolat 1,0

Permeat Molkenprotein-Isolat 1,0

Bitterstandard Koffein 0,22

Bitterstandard + Permeat Koffein / Molkenprotein-Isolat 0,22 / 1,0

Retentat Alge (Chlorella vulgaris) 1,0

Permeat Alge (Chlorella vulgaris) 1,0

Bitterstandard Koffein 0,22

Bitterstandard + Permeat Koffein / Alge (Chlorella

vulgaris) 0,22 / 1,0

Material & Methoden

74

Die Prüfer wurden gebeten die Proben hinsichtlich der Grundgeschmacksarten „süß“, „sauer“,

„salzig“, „bitter“ und „umami“ auf einer 7-Punkt-Skale zu bewerten. Art und Probengrundstoff

der Probe wurden den Prüfern nicht mitgeteilt.

Die untersuchten Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat wurden bei pH 9 die

Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) bei pH 6 gewonnen. Auf eine Untersuchung

der korrespondierenden Proben, die unter Zusatz von NaCl gewonnen wurden, wurde

aufgrund des starken „salzig“ Geschmacks verzichtet.


3.6 Statistische Auswertung & Datenverarbeitung der Messergebnisse

3.6.1 Datenverarbeitung

3.6.1.1 Crossflow-Diafiltration

Zur statistischen Bewertung der Ergebnisse war zuvor eine rechnerische Angleichung der

Daten erforderlich um Unterschiede aufgrund von Schwankungen der Permeatmengen und

des Initialflux der Membranen mit destilliertem Wasser auszugleichen. Diese erfolgte durch

Normierung der Permeatmenge und der Verwendung eines gemittelten Initialflux.

𝑡𝐹−𝑘𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑒𝑟𝑡 =𝑉𝑃𝑒𝑟−𝑚𝑎𝑥

𝑉𝑃𝑒𝑟−𝑖𝑠𝑡×

∑ 𝐽𝑖𝑛𝑖=1𝑛

𝐽𝑊𝑣𝑜𝑟 × 𝑡𝐹

Formel 11: Rechnerische Angleichung der Prozesslaufzeit in Abhängigkeit des Permeatvolumen und des Initialflux der Membran mit destilliertem Wasser

tF-korrigiert = korrigierte Prozesslaufzeit

tF = unkorrigierte Prozesslaufzeit des Versuchs

VPer-max = maximale Permeatmenge einer Versuchsreihe

VPer-ist = Permeatmenge des Versuchs

JWvor = Permeatflux der Membran für destilliertes Wasser des Versuchs

∑ Ji/n = Mittelwert des Permeatflux für destilliertes Wasser

n = Anzahl der Versuche

3.6.1.2 Ultraschall

Anders als bei der Crossflow-Diafiltration der Hauptversuche, wurden die Vivaflow-Einheiten

für die Wiederholungsversuche nach einem Reinigungsprozess wiederverwendet. Um die

geringfügigen, anhand des Flux mit destilliertem Wasser ermittelten Unterschiede zwischen

ursprünglicher Performance der Vivaflow-Einheit und der Ist-Performance des jeweiligen

Wiederholungsversuchs, sowie Unterschiede der Initial-Performance beider Vivaflow-

Einheiten auszugleichen, erfolgte eine rechnerische Angleichung. Die draus resultierenden,

veränderten Probenvolumina VV-Per-korrigiert,t wurden anhand Formel 12 (für die performanter

Material & Methoden

75

Vivaflow-Einheit) und Formel 13 (für die weniger performante Vivaflow-Einheit) berechnet. Ein

Versuch wurde bei dem Erreichen einer Permeatmenge VV-Per-korrigiert von ca. 400 ml als

beendet erklärt. Die korrespondierende korrigierte Zeit tVF wurde als Prozesszeit nach

Performance-Anpassung angenommen.

𝑉𝑉−𝑃𝑒𝑟−𝑘𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑒𝑟𝑡,𝑡 = 𝑉𝑃𝑒𝑟,𝑡 × 𝐽𝑉−𝑊−𝐼𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙

𝐽𝑉−𝑊−𝑊

Formel 12: Rechnerische Angleichung des Permeatvolumens der performanteren Vivaflow-Einheit

VPer,t = Permeatvolumen zum Messzeitpunkt t

VV-Per-korrigiert,t = korrigiertes Permeatvolumen zum Messzeitpunkt t

JV-W-Initial = Initialflux einer Vivaflow-Einheit mit destilliertem Wasser

JV-W-W = Permeatflux einer Vivaflow-Einheit mit destilliertem Wasser vor Start eines Wiederholungsversuchs

𝑉𝑉−𝑃𝑒𝑟−𝑘𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑒𝑟𝑡,𝑡 = 𝑉𝑃𝑒𝑟,𝑡 × 𝐽𝑉−𝑊−𝐼𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙

𝐽𝑉−𝑊−𝑊 ×

𝐽𝑉−𝑊−𝑚𝑎𝑥

𝐽𝑉−𝑊−𝑚𝑖𝑛

Formel 13: Rechnerische Angleichung des Permeatvolumens der weniger performanten Vivaflow-Einheit

VPer,t = Permeatvolumen zum Messzeitpunkt t

VV-Per-korrigiert,t = korrigiertes Permeatvolumen zum Messzeitpunkt t

JV-W-max = Permeatflux von destilliertem Wasser der performanter Vivaflow-Einheit

JV-W-min = Permeatflux von destilliertem Wasser der weniger performanten Vivaflow-Einheit

JV-W-Initial = Initialflux einer Vivaflow-Einheit mit destilliertem Wasser

JV-W-W = Permeatflux einer Vivaflow-Einheit mit destilliertem Wasser vor Start eines Wiederholungsversuchs

JV-W-max entspricht dabei dem Initialflux der Vivaflow-Einheit die für die Filtration mit Ultraschall,

JV-W-min dem Initialflux der Vivaflow-Einheit die für die Filtration ohne Ultraschall verwendet

wurde.

Aufgrund von Schwankungen der Permeatmenge erfolgte eine rechnerische Angleichung der

Prozesslaufzeit.

𝑡𝑉𝐹−𝑘𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑒𝑟𝑡 =𝑉𝑃𝑒𝑟−𝑚𝑎𝑥

𝑉𝑃𝑒𝑟−𝑖𝑠𝑡× 𝑡𝑉𝐹

Formel 14: Rechnerische Angleichung der Prozesszeit in Abhängigkeit des Permeatvolumens

tVF-korrigiert = korrigierte Prozesslaufzeit einer Vivaflow-Einheit

tVF = unkorrigierte Prozesslaufzeit einer Vivaflow-Einheit nach Performanceanpassung

VPer-max = maximale Permeatmenge einer Versuchsreihe

VPer-ist = Permeatmenge des Versuchs

Material & Methoden

76

3.6.1.3 Eignung von RC-Membranen

Die Versuche zur Eignung der RC-Membranen für die Fraktionierung wurden, analog zu den

Ultraschall-Versuchen, unter Verwendung einer Vivaflow-Kammer durchgeführt. Die

rechnerische Korrektur der Messdaten erfolgte gemäß Formel 12 und Formel 14.

3.6.1.4 Absolute Proteinmenge von Retentat (mRet) und Permeat (mPer)

Die Bestimmung der absoluten Proteinmengen in Retentat mRet und Permeat mPer erfolgte

rechnerisch durch die Multiplikation des spektralphotometrisch ermittelten Proteingehalts von

Retentat/Permeat CS-Ret/Per mit dem Retentat-/Permeatvolumen VRet/VPer, dargestellt in Formel

15.

𝑚𝑅𝑒𝑡/𝑃𝑒𝑟 = 𝐶𝑆−𝑅𝑒𝑡/𝑃𝑒𝑟 × 𝑉𝑅𝑒𝑡/𝑃𝑒𝑟

Formel 15: Rechnerische Ermittlung der absoluten Proteinmengen

mRet/Per = Absolute Proteinmenge im Retentat/Permeat

CS-Ret/Per = spektralphotometrisch ermittelte Konzentration von Retentat/Permeat

VRet/Per = Volumen des Retentats/Permeats

3.6.2 Statistische Auswertung

Zur statistischen Auswertung der Daten wurden IBM SPSS Statistics 20 (International

Business Machines Corporation (IBM), Armonk, USA) verwendet.

3.6.2.1 Hydrolyse

Zur Bestimmung des Einflusses von gewähltem Enzym und Vorbehandlung (unabhängige

Variable) der Hydrolysate auf den Hydrolysegrad der Proben (abhängige Variable) wurden die

unabhängigen Stichproben mittels einfaktorieller univariater Varianzanalyse (ANOVA)

ausgewertet. Überschritt der F-Wert des Tests den kritischen F-Wert, Fkritisch, wurde anstelle

der Nullhypothese H0 (die Gruppenmittelwerte sind identisch) die Alternativhypothese H1 (die

Gruppenmittelwerte sind nicht identisch) akzeptiert (Janssen & Laatz, 2007). Im Falle einer

signifikanten ANOVA erfolgten Post-hoc Tests zur Identifizierung signifikant unterschiedlicher

Vergleichspaare.

Voraussetzung für die Verwendung der ANOVA sind mindestens intervallskallierte Daten,

Unabhängigkeit der Stichproben, Normalverteilung der Kriteriumsvariablen sowie

Varianzhomogenität der Gruppe (Eckstein, 2016; Janssen & Laatz, 2007).

Die Normalverteilung der Variablen wurde mittels Shapiro-Wilk Test überprüft, da dieser bei

Stichprobenumfängen n < 50 über eine gute Teststärke verfügt (Janssen & Laatz, 2007). Die

Varianzhomogenität der Gruppe wurde mittels Levene-Test bestimmt.

Material & Methoden

77

Basierend auf den Verteilungseigenschaften der Stichproben erfolgte der Post-hoc

Mehrfachvergleich für die hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris) unter Verwendung des

Bonferroni-Tests.

Die Ermittlung des F-Werts und des kritischen F-Werts basierte auf einem Signifikanzniveau

von α = 0,05 (Rudolf & Kuhlisch, 2008).

3.6.2.2 Crossflow-Filtration

Zur Bestimmung des Einflusses des pH-Werts (unabhängige Variable) auf die Prozesszeit t

der Filtration, dem korrelierenden Flux JF, sowie der absoluten Proteinmenge in

Permeat/Retentat und der Wiederfindungsrate (abhängige Variable), wurden für die beiden

Versuchsgruppen (NaCl-Zusatz, kein NaCl-Zusatz) jeweils einfaktorielle univariate

Varianzanalysen durchgeführt.

Analog zu Kapitel 3.6.2.1 erfolgte eine Überprüfung der Hypothesen der Normalverteilung und

Varianzhomogenität. Basierend auf den Verteilungseigenschaften der Stichproben wurde der

Post-hoc Mehrfachvergleich unter Verwendung des Tukey-HSD-Tests, sowie in Einzelfällen

des Games-Howell-Tests durchgeführt.

Der Einfluss der Änderung der Ionenstärke durch Zugabe von NaCl (unabhängige Variable)

auf die Prozesszeit t der Filtration, dem korrelierenden Flux JF, sowie der absoluten

Proteinmenge in Permeat/Retentat und der Wiederfindungsrate (abhängige Variable) wurde

für jede pH-Stufe und Variable mittels T-Test für unabhängige Stichproben bestimmt. Es

erfolgte eine Überprüfung der Hypothesen der Normalverteilung und Varianzhomogenität. Die

Nichterfüllung einer der beiden Hypothesen resultierte in der Verwendung des

verteilungsunabhängigen, nichtparametrischen Mann-Whitney U Tests (Eckstein, 2016).



3.6.2.3 Ultraschall

Zur Bestimmung des Einflusses des Ultraschalls (unabhängige Variable) auf die Prozesszeit t

der Filtration, dem korrelierenden Flux JF, sowie der absoluten Proteinmenge in

Permeat/Retentat (abhängige Variablen) wurden jeweils T-Tests für unabhängige Stichproben

durchgeführt. Es erfolgte eine Überprüfung der Hypothesen der Normalverteilung und

Varianzhomogenität. Die Nichterfüllung einer der beiden Hypothesen resultierte in der

Verwendung des verteilungsunabhängigen, nichtparametrischen Mann-Whitney U Tests.


Material & Methoden

78

3.6.2.4 Dialyse

Zur Bestimmung des Einflusses des pH-Werts (unabhängige Variable) auf den Proteingehalt

der Proben vor und nach der Dialyse (abhängige Variablen) wurden je Konzentration und

Prozessdauer einfaktorielle univariate Varianzanalysen oder, im Falle von zwei

Vergleichspaaren, T-Tests für unabhängige Stichproben durchgeführt.

Analog zu Kapitel 3.6.2.1 erfolgte eine Überprüfung der Hypothesen der Normalverteilung und

Varianzhomogenität. Basierend auf den Verteilungseigenschaften der Stichproben wurde der

Post-hoc Mehrfachvergleich unter Verwendung des Tukey-HSD-Tests durchgeführt.

Der Einfluss unterschiedlicher Prozesszeiten (unabhängige Variable) auf den Proteingehalt

der Proben vor und nach der Dialyse (abhängige Variablen) wurde je pH-Stufe mittels T-Test

für unabhängige Stichproben bestimmt. Zur Bestimmung des Einflusses der Dialyse

(unabhängige Variable) auf den Proteingehalt der Proben (abhängige Variable) wurden je

Konzentration, Prozessdauer und pH-Stufe T-Tests für abhängige Stichproben durchgeführt.

Es erfolgte eine Überprüfung der Hypothesen der Normalverteilung und Varianzhomogenität.



3.6.2.5 Sensorik-Schulung

Zur Bestimmung der Diskriminierungsfähigkeit zwischen Proben unterschiedlicher

Konzentrationen erfolgte eine Auswertung der Daten der „Prüfung zur Unterscheidung von

Intensitätsstufen eines Reizes“ mittels Friedman-Test. Im Falle signifikanter Ergebnisse

wurden Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtests zur Ermittlung signifikanter Paardifferenzen

durchgeführt (Quadt, Schönberger, & Schwarz, 2009; Lawless & Heymann, 1999).


3.6.2.6 Prüferauswahl

Die für die Prüferauswahl angewendeten statistischen Verfahren wurden bereits vorab in

Kapitel 3.5.2 (Seite 72) dargestellt.


3.6.2.7 Sensorik

Zur Bestimmung des Einfluss der Zugabe der Permeatfraktion zum gereichten Bitter-Standard

(unabhängige Variable) auf die Bitterwahrnehmung (abhängige Variable) der Probe, wurden

je Proteinquelle verteilungsunabhängige, nichtparametrische Mann-Whitney U Tests

durchgeführt.


Ergebnisse

79

4. Ergebnisse

4.1 Analytik

4.1.1 Size-Exclusion HPLC

Beim SE-HPLC Verfahren lassen sich anhand der Retentionszeiten einzelner Proben-

Moleküle Rückschlüsse auf deren Molekülgröße ziehen. Zur Bestimmung der

Molekülgrößenverteilung einer Analyseprobe ist eine Kalibrierung der verwendeten Säule mit

bekannten Standardsubstanzen notwendig (Kostanski et al., 2004; Tayyab et al., 1991; Meyer,

1988). Da sich die Trenneigenschaften einer HPLC-Säule unter anderem in Abhängigkeit der

Säulenparameter (Länge, Durchmesser, Partikelgröße) und der Pufferzusammensetzung

unterscheiden, wurden verschiedene SE-HPLC-Säulen und Puffer auf ihre Eignung untersucht

(Kromidas, 2012; Kromidas 2006). Die Auswahl der Säule wurde unter Verwendung einer

Jasco 880-PU HPLC, sowie eines Jasco UV-2077 Plus UV/VIS-Detektors (Jasco Labor- und

Datentechnik GmbH, Gross-Umstadt, GER) durchgeführt. Der dazu verwendete Standard

besteht aus fünf Komponenten unterschiedlicher Molekülmaße, dargestellt in Tabelle 23.

Aufgrund eines Anlagenwechsels erfolgte die Übertragung der Methode auf eine Agilent 1100

Series Anlage (Vacuum Degasser, Binary Pump, UV/VIS-Detector, Manual Injector) (Agilent

Technologies Corporation, Santa Clara, USA).

Tabelle 23: Zusammensetzung des BioRad Gel-Filtration Standards # 151-1901 (BioRad Laboratories, Inc., n.d.)

Komponente Molare Maße (kDa)

(1) Thyroglobulin (Bovine) 670

(2) γ-Globulin (Bovine) 158

(3) Ovalbumin (Chicken) 44

(4) Myoglobin (Horse) 17

(5) Vitamin B12 1,35

Nachfolgend sind die Chromatogramme (jeweils links dargestellt, (a)) der SE-HPLC Analysen

des BioRad Gel-Filtration Standards dargestellt. Die Peak-Beschriftung (1 – 5) weist den

Peaks der Chromatogramme eine der in Tabelle 23 aufgeführten Komponenten zu. Zwischen

molarer Masse der Komponenten (1 – 5) und der korrelierenden Retentionszeit tr (x-Achse)

kann grafisch ein Zusammenhang dargestellt werden (jeweils rechts dargestellt, (b)). Je

linearer dieser Zusammenhang (bewertet anhand des Bestimmtheitsmaßes R2 der Trendlinie),

desto geeigneter ist die Kombination aus Säule und Laufmittel für die SE-HPLC-Analyse.

Neben der Linearität spielt die Trennschärfe eine wesentliche Rolle bei der Bewertung der

Chromatogramme. Wünschenswert ist hierbei eine möglichst vollständige Trennung der

einzelnen Komponenten (Peaks).

Ergebnisse

80

Aufgrund der schlecht lesbaren Achsenbeschriftung der Ausgangsgrafiken wurde diese zur

besseren Lesbarkeit nachgearbeitet. Jeder | auf der x-Achse entspricht einer Retentionszeit

∆tr von 5 min. Auf der y-Achse wird zur Wahrung der Übersicht nur der Maximalwert des

Detektorsignals angegeben (Einheit: µV).

4.1.1.1 Tosoh TSKgel G 3000 SWXL (7,8 mm x 30 mm, 5 µm)

Die TSKgel G 3000 SWXL von Tosoh reagiert sehr empfindlich auf Änderungen der

Pufferzusammensetzung. Besonders bei niedriger Molarität des Puffers, Abweichungen vom

idealen pH Wert 6,7, sowie dem Verzicht des Zusatzes von Na2SO4, kann es zu Unruhen

(Auftrennung der Peaks in mehrere „Unter-Peaks“) im Chromatogramm. Diese treten,

beispielhaft dargestellt in Abbildung 42 (a), besonders zwischen Thyroglobulin (1) und γ-

Globulin (2), aber auch rechts von Vitamin B12 (5) auf. Zudem laufen die Peaks (2) und (3),

sowie (4) und (5) ineinander, was für eine mangelnde Auftrennung der Komponenten spricht.

Das beispielhaft dargestellte Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,934 des 0,05 mol/l

Natriumphosphatpuffer +0,05 % NaN3, pH 6,9 ist zwar zufriedenstellend, Abbildung 42 (b)

offenbart allerdings unerwünschte Abweichungen vom linearen Verlauf der Kalibriergeraden.

Legende: 1, Thyroglobulin (670 kDa). 2, γ-Globulin (158 kDa). 3, Ovalbumin (44 kDa). 4, Myoglobin (17 kDa).

5, Vitamin B12 (1,35 kDa)

Abbildung 42: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL – Puffer: 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer +0,05 % NaN3, pH 6,7, quantitative Darstellung

Eine verlässliche Trennung der Komponenten des Standards wurde bei einer Molarität von 0,1

mol/l, pH 6,7 unter Zusatz von 0,1 mol/l Na2SO4 erreicht (Abbildung 43). Die Verwendung von

0,1 mol/l Na2SO4, sowie die erhöhte Molarität des Puffers resultiert im Vergleich zu Puffern

niedriger Molaritäten in einer differenzierteren Auftrennung der Komponenten, wenn auch γ-

Globulin (2) und Ovalbumin (3) nicht separiert dargestellt werden können. Das am Beispiel

des 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffers mit 0,1 mol/l Na2SO4, pH 6,7 dargestellte

Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,957 ist abermals zufriedenstellend, Abbildung 43 (b) offenbart

R² = 0,9340

2

4

6

8

10

12

14

16

1 10 100 1000

t r (m

in)

Mol. Maße (kDa)

0 5 10 15 20

1

3

4

5

2

a) b)

tr (min)

µV 1*105

Ergebnisse

81

aber ebenfalls geringfügige Abweichungen vom linearen Verlauf der Kalibriergeraden. Der

verwendete Laufpuffer entspricht den Empfehlungen des Herstellers (Tosoh Bioscience, 2010)



Abbildung 43: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL – Puffer: 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,1 mol/l Na2SO4 + 0,05 % NaN3, pH 6,7, quantitative Darstellung

Eine weitere Steigerung der Molarität des Puffers auf 0,2 mol/l führte sowohl mit als auch ohne

den Zusatz von 0,2 mol/l Na2SO4 zu breiteren, wenig differenzierten Peaks. Das

Bestimmtheitsmaß R2 ist für den 0,2 mol/l Puffer mit 0,2 mol/l Na2SO4, pH 7 mit 0,995 zwar

hoch (Abbildung 44 b), dies ist jedoch in einer mangelnde Schärfe der Trennung, sowie dem

pH-anhängigen Verlust (pH 6,7/pH 7,0) der Differenzierung von γ-Globulin (2) und Ovalbumin

(3) begründet (Abbildung 44 a) und somit nicht erwünscht.



Abbildung 44: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Tosoh TSKgel G 3000 SWXL – Puffer: 0,2 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,2 mol/l Na2SO4 + 0,05 % NaN3, pH 7, quantitative Darstellung

Die Analysedauer beträgt bei einem Anlagenfluss von 1,0 ml/min 20 min.

R² = 0,9570

2

4

6

8

10

12

14

16

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

R² = 0,9950

2

4

6

8

10

12

14

16

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

1

2

3

4 5

1 3

4

5

0 5 10 15

1,5*105 µV

tr (min)

a) b)

µV

0 5 10 15

1,5*105

a) b)

tr (min)

Ergebnisse

82

4.1.1.2 PSS Suprema 1000 Â (8 mm x 300 mm, 10 µm)

Die Säule Suprema 1000 Â von PSS reagiert weniger empfindlich auf Änderungen der

Pufferzusammensetzung. Der Zusatz von Na2SO4 (0,05 mol/l – 0,2 mol/l) oder die Variation

des pH-Werts (6,7 – 7,0) resultierten in keiner sichtbaren Veränderung der

chromatographischen Trennung. Die Molarität des Puffers (0,05 mol/l – 0,2 mol/l) wirkte sich

allerdings entscheidend auf die Trenneigenschaften der Säule aus und wird aus diesem Grund

nachfolgend betrachtet.

Eine differenzierte Auftrennung des Standards wurde, abweichend von den Angaben des

Herstellers, für eine Molarität von 0,05 mol/l bei einem pH-Wert von 6,9 erreicht (Abbildung

45 a) (PSS Polymer Standards Service GmbH, n.d.). Das Bestimmtheitsmaß R2 = 0,992 spricht

für die Eignung des Puffers zur chromatographischen Analyse des BioRad Gel-Filtration

Standards. Im Vergleich zu der vorangehend dargestellten Tosoh TSKgel G 3000 SWXL

erscheint die Auftrennung aufgrund enger zusammenliegender Peaks (1 – 3), sowie

mangelnder Wiederfindung von Myoglobin (4) jedoch weniger geeignet.



Abbildung 45: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: PSS Suprema 1000 Â – Puffer: 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer +0,05 % NaN3, pH 6,9, quantitative Darstellung

Eine Steigerung der Molarität auf 0,1 mol/l führte darüber hinaus, beispielhaft dargestellt für

pH 7, zum Verlust des Myoglobin-Peaks (4), sowie zu geringerer Differenzierbarkeit von γ-

Globulin (2) und Ovalbumin (3) (Abbildung 46 a). Das Bestimmtheitsmaß R2 sinkt auf 0,984

ab.

R² = 0,9920

2

4

6

8

10

12

14

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)1

2 & 3

4

5

0 5 10 15 20 tr (min)

µV

4,0*105

a) b)

Ergebnisse

83




Eine Steigerung der Molarität des Puffers auf 0,2 mol/l resultierte im vollständigen Verlust der

Differenzierbarkeit von γ-Globulin (2) und Ovalbumin (3), sowie dem bereits vom 0,1 mol/l

Puffer bekannten Verlust des Myoglobin-Peaks (4) (Abbildung 47 a). Das Bestimmtheitsmaß

R2 sinkt auf 0,971. Die mangelnde Auflösung der Trennung spricht gegen eine Eignung des

Puffers für den Zweck der Trennung des BioRad Gel-Filtration Standards.





4.1.1.3 Agiltent Zorbax GF 250 (4,6 mm x 250 mm, 4 µm)

Die Säule Zorbax GF 250 von Agilent liefert, weitestgehend unabhängig von pH-Wert, Na2SO4-

Zusatz und Molarität des Puffers, die performanteste Trennung der untersuchten Säulen.

Lediglich bei niedriger Molarität des Puffers (0,05 mol/l), pH 6,9 konnten Ovalbumin (3) und

R² = 0,9840

2

4

6

8

10

12

14

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

R² = 0,9710

2

4

6

8

10

12

14

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

1

2 & 3

5

1

3

5

0 5 10 15 tr (min)

µV

4,0*105

0 5 10 15 tr (min)

µV

5,0*105

a) b)

a) b)

Ergebnisse

84

Myoglobin (4) nicht differenziert werden (Abbildung 48 a). Das Bestimmtheitsmaß R2 = 0,971

ist jedoch als zufriedenstellend zu bewerten.



Abbildung 48: Chromatogramm (a) und Kalibriergerade (b) der SE-HPLC-Analyse des BioRad Gel-Filtration Standards mittels Säule: Agilent Zorbax GF 250 – Puffer: 0,05 mol/l Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3, pH 6,9, quantitative Darstellung

Bei Molaritäten < 0,2 mol/l ist zudem ein unerwünschtes Tailing des Thyroglobulin-Peaks (1)

erkennbar (Abbildung 48 a, Abbildung 49 a). Ab einer Molarität des Puffers von 0,1 mol/l erfolgt

eine Differenzierung des Ovalbumin- (3) und Myoglobin-Peaks (4). Das Bestimmtheitsmaß R2

ist, beispielhaft dargestellt in Abbildung 49 b, mit 0,955 abermals als zufriedenstellend zu

bewerten.




In Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Herstellers erwies sich ein 0,2 mol/l

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3, pH 7,0 als optimales Puffermedium (Abbildung 50 a)

R² = 0,9710

1

2

3

4

5

6

7

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

R² = 0,9550

1

2

3

4

5

6

7

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

1 2 4

5

1 2 3 & 4 5

a) b)

a) b)

0 5 10

0 5 10

µV

µV

8,0*105

8,0*105

tr (min)

tr (min)

Ergebnisse

85

(Agilent Technologies, n.d.). Das Bestimmtheitsmaß R2 genügt mit 0,967 den Anforderungen

an die Auftrennung des BioRad Gel-Filtration Standards.





Basierend auf den Ergebnissen der Auftrennung des BioRad Gel-Filtration Standards wurde

die Kombination aus der Säule Agilent Zorbax GF 250, sowie einem 0,2 mol/l

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3, pH 7,0 als SE-HPLC Methode für die Analysen im

Rahmen dieser Studie ausgewählt. Die gewählte Kombination gewährleistet eine differenzierte

Auftrennung des BioRad Gel-Filtration-Standard bei kurzer Analysezeit (10 min) und

zufriedenstellender Linearität (R2 = 0,967) der Kalibriergerade.

Die Tosoh TSKgel G 3000 SWXL Säule wurde trotz guten Trennergebnissen aufgrund der

erhöhten Analysezeit (20 min), sowie der Notwendigkeit des Zusatz von Na2SO4 nicht in

Betracht gezogen. Gleiches gilt für die PSS Suprema 1000 Â Säule, deren mangelnde

Auflösung gegen eine Verwendung im Versuchssetup spricht.

4.1.1.4 Übertragung der Methode auf eine Agilent 1100 Series HPLC

Aufgrund eines Anlagenwechsels erfolgte die Übertragung der Methode auf eine Agilent 1100

Series Anlage (Vaccum Degasser, Binary Pump, UV/VIS-Detector, Manual Injector) (Agilent

Technologies Corporation, Santa Clara, USA). Abbildung 51 a zeigt die Auftrennung des

Standards bei gleichen Untersuchungsparametern (Anlagenflux: 0,5 ml/min, Puffer: 0,2 mol/l

Natriumphosphatpuffer + 0,05 % NaN3, pH 7,0). Die Auftrennung des Standards erwies sich

in Zehnfachwiederholung als zuverlässig und wiederholbar (R2 = 0,996), wenn auch der

Myoglobin (4) Peak (ermittelt anhand des Vergleichs der Retentionszeit tR) unter Verwendung

der Agilent 1100 Series HPLC nicht ausreichend differenziert werden konnte. Die

R² = 0,9670

1

2

3

4

5

6

7

1 10 100 1000

t r(m

in)

Mol. Maße (kDa)

1 2 3 & 4 5

a) b)

0 5

µV 6,0*105

tr (min)

Ergebnisse

86

Standardabweichung der Retentionszeiten, dargestellt in Tabelle 24, liegt zwischen 0,51 %

(Thyroglobulin (1)) und 1,74 % (Vitamin B12 (5)).




Tabelle 24: Retentionszeiten tr und prozentuale Standardabweichung (SD) der Komponenten des BioRad Gel-Filtration Standards

Komponente Molare Maße (kDa) tr MW (min) SD (%)

(1) Thyroglobulin (Bovine) 670 3,712 ± 0,019 0,51

(2) γ-Globulin (Bovine) 158 4,312 ± 0,071 1,65

(3) Ovalbumin (Chicken) 44 4,856 ± 0,062 1,28

(4) Myoglobin (Horse) 17 - -

(5) Vitamin B12 1,35 6,138 ± 0,107 1,74

R² = 0,9960

1

2

3

4

5

6

7

1 10 100 1000

t R (m

in)

Molare Maße (kDa)

1

2

3

5 (4)

0 5 10

a) b)

mA

U

350

tr (min)

Ergebnisse

87

4.1.2 Spektralphotometrische Proteingehaltbestimmung

Gemäß des Lambert-Beer-Gesetzes besteht bei konstanter Schichtdicke des durchstrahlten

Mediums ein proportionaler Zusammenhang zwischen der Extinktion eines

monochromatischen Lichtstrahls und der molaren Konzentration einer gelösten Substanz, die

eine Bestimmung der molaren Konzentration bei Vorhandensein einer Kalibrationsfunktion

erlaubt (Gressner & Arndt, 2007). Die im Rahmen dieser Studie ermittelten

Kalibrationsfunktionen sind nachfolgend dargestellt.

4.1.2.1 Molkenprotein-Isolat

Abbildung 52: Kalibrationsfunktion für die photometrische Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat bei 280 nm

Abbildung 52 zeigt die in Dreifachbestimmung ermittelte Kalibrationsfunktion für das

verwendete Molkenprotein-Isolat. Die Konzentration der Stammlösung wurde unter

Berücksichtigung des Proteingehalts des verwendeten Rohstoffs (Thermax 690, Glanbia

Nutritionals Ltd., IRL) eingestellt und ist somit als absolut zu betrachten. Durch Auflösung der

ermittelten Geradengleichung nach Cs (x) ist bei bekannter Extinktion eine Aussage über den

Proteingehalt der untersuchten Probe möglich. Das Bestimmtheitsmaß R2 der

Kalibrationsfunktion liegt bei 0,999. Dies spricht für die Eignung der spektralphotometrischen

Analyse zur Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysierten Molkenprotein-Isolat-

Lösungen.

y = 0,7552xR² = 0,999

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Exti

nkt

ion

bei

28

0 n

m

Konzentration CF (g/l)

Ergebnisse

88

𝐶𝑆 = 𝑦𝐸𝑥𝑡𝑖𝑛𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛

0,7552

Formel 16: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

CS = spektralphotometrisch bestimmter Proteingehalt

yExtinktion = spektralphotometrisch ermittelte Extinktion

4.1.2.2 Alge (Chlorella vulgaris)

Abbildung 53: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) bei 280 nm

Abbildung 53 zeigt die in Dreifachbestimmung ermittelte Kalibrationsfunktion zur Bestimmung

des Proteingehalts der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris). Der Proteingehalt der

Stammlösung wurde extern per Kjeldahl-Stickstoffbestimmung ermittelt (von: KWALIS

Qualitätsforschung Fulda GmbH, Fulda, GER). Das Bestimmtheitsmaß R2 der

Kalibrationsfunktion liegt bei 0,999. Dies spricht für die Eignung der spektralphotometrischen

Analyse zur Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris).

𝐶𝑆 = 𝑦𝐸𝑥𝑡𝑖𝑛𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛

1,692

Formel 17: Kalibrationsfunktion zur photometrischen Bestimmung des Proteingehalts von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

CS = spektralphotometrisch bestimmter Proteingehalt

yExtinktion = spektralphotometrisch ermittelte Extinktion

y = 1,692xR² = 0,999

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6

Exti

nkt

ion

bei

28

0 n

m

Konzentration CF (g/l)

Ergebnisse

89

4.2 Hydrolyse

Nachfolgend sind die Ergebnisse der Versuchsreihe zum Einfluss von Enzym und Art der

Vorbehandlung (enzymatisch, unter Verwendung einer Pektinase; „sauer“, unter Verwendung

von HCl, pH 3) auf Hydrolysegrad und Molekülgrößenverteilung von Algenhydrolysaten

gewonnen aus der Alge Chlorella vulgaris dargestellt. Die Beurteilung der Eignung des

Hydrolysevorgangs zur Erzeugung eines geeigneten Feeds für den Fraktionierungsprozess

basiert nicht alleinig auf dem erreichten Hydrolysegrad. Vielmehr spielt die

Molekülgrößenverteilung des Feeds eine entscheidende Rolle. Ziel der Versuche war die

Erzeugung eines Hydrolysats mit möglichst breiter Molekülgrößenverteilung. Der Hintergrund

dieser Zielsetzung ist im Studienziel begründet. Zur Erzeugung unterschiedlicher

Peptidfraktionen eignet sich eine breite Größenverteilung, da potentiell mehr funktionelle

Fraktionen gewonnen werden können.


Mikroalgen, wie die im Rahmen dieser Studie verwendete Chlorella vulgaris, verfügen über

stabile, vorwiegend Cellulose-, Hemicellulose- und Pektin-basierte Zellwände (Bastos, 2018;

Domozych, 2016). Die Stabilität der Zellwand kann eine Digestion der Algenproteine

erschweren (Renneberg & Berkling, 2012; Morris et al., 2008; Tchorbanov et al., 1986).

Die im Rahmen dieser Studie durchgeführten Pilotversuche (Versuchsschema: siehe

Abbildung 39, Seite 62) ohne enzymatische oder saure Vorbehandlung der Algenzellwände

resultierten, unabhängig von den verwendeten Enzymen (Pancreatin, Pronase, Corolase) und

deren Konzentration (Pancreatin 0,125 % (10 USP), 0,25 % (20 USP), 0,5 % (40 USP);

Pronase 0,125 % (56,25 PU), 0,25 % (112,5 PU), 0,5 % (225 PU); Corolase 0,1 % (2,75 UHb),

1,5 % (41,25 UHb), 3,0 % (82,5 UHb)), sowie der Prozessdauer (45 min, 135 min), in einem

Hydrolysat das von Verbindungen im Größenbereich 1,35 kDa dominiert wurde. Dies geht aus

den Chromatogrammen der Hydrolysate, exemplarisch dargestellt in Abbildung 54 und

Abbildung 55, hervor.

Das Vorhandensein derart kleiner, niedermolekularer Verbindungen deutet, für sich

genommen, auf eine zu weit fortgeschrittene Hydrolyse hin. Bezieht man jedoch die Menge

des bei der Zentrifugation gewonnenen Sediments mit in die Betrachtung ein (> 50 % der

Einwaage), wird klar, dass vermutlich nur ein Bruchteil des Algenproteins für das jeweilige zur

Hydrolyse verwendete Enzym zur Verfügung stand, während ein Großteil der Algenzellen nicht

aufgeschlossen werden konnte. Der verbleibende, der Hydrolyse zugängliche Proteinanteil

wurde vermutlich, bedingt durch die Veränderung des Verhältnis Protein-zu-Enzym zu

niedermolekularen Verbindungen hydrolysiert.

Ergebnisse

90

Abbildung 54: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min), qualitative Darstellung

Abbildung 55: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit Pronase (0,50 % (225 PU); 45 min), qualitative Darstellung

Pronase 0,25 %

(112,5 PU), 45 min

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Pronase 0,50 %

(225 PU), 45 min

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:

x-Achse: Retentionszeit tr (min)

y-Achse: nominale Extinktion (mAU)

blau: BioRad Gel-Filtration Standard

rot: hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris)

qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

91

Diese Annahme wurde durch zwei je 10 minütige Hydrolysen mit Pancreatin (0,25 % (20 USP))

und Pronase (0,25 % (112,5 PU)) verifiziert.

In beiden Fällen resultierte die Hydrolyse in einem von niedermolekularen Strukturen (< 1,35

kDa) dominierten Hydrolysat, sowie hohem Sediment-Anteil (> 75 % der Einwaage),

dargestellt in Abbildung 56 und Abbildung 57. Der geringfügig erhöhte (in den Abbildungen

markierte) Anteil an Verbindungen > 1,35 kDa ist vermutlich auf einen unwesentlich geringeren

Hydrolysegrad der Algenproteine, bedingt durch die sehr kurze Reaktionszeit, zurückzuführen.

Zur Verbesserung des Hydrolyse-Prozesses wurde die Alge einer enzymatischen

Vorbehandlung (Pektinase, Rohament® PL) bzw. einer sauren Vorbehandlung (HCl, pH 3)

unterzogen um die Zellwände aufzubrechen und das Protein für die enzymatische Hydrolyse

zugänglich zu machen. Für den anschließenden Hydrolyseprozess wurde jeweils eine

Enzymkonzentration von 0,25 % Pronase (112,5 PU) bzw. 0,25 % Pancreatin (20 USP)

verwendet.

Ergebnisse

92

Abbildung 56: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit Pancreatin (0,25 % (20 USP); 10 min), qualitative Darstellung

Abbildung 57: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris mit Pronase (0,25 % (112,5 PU); 10 min), qualitative Darstellung

Pancreatin 0,25 %

(20 USP), 10 min

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

qu

alit

ativ

Legende:





Pronase 0,25 %

(112,5 PU), 10 min

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

qu

alit

ativ

Legende:





Ergebnisse

93

4.2.1.1 Behandlung mit Rohament® PL

Wie bereits zu Beginn des Kapitels beschrieben, verfügen Mikroalgen über stabile, vorwiegend

Cellulose-, Hemicellulose- und Pektin-basierte Zellwände (Bastos, 2018; Domozych, 2016).

Vergleichbar der nachfolgend dargestellten Behandlung der Algensuspension mit HCl, pH 3

(Kapitel 4.2.1.2, Seite 97) wurde überprüft, ob die Verwendung der Pektinase Rohamant® PL

zu einem Aufschluss der Algenzellwand führt und somit die Zugänglichkeit der Algenproteine

für die Enzyme Pancreatin und Pronase erhöht.

In Abbildung 58 und Tabelle 25 sind die Hydrolysegrade des Algenhydrolysats gewonnen aus

Chlorella vulgaris in Abhängigkeit des Enzyms, sowie der Dauer der Vorbehandlung tEV

dargestellt.

Abbildung 58: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der Dauer der Vorbehandlung mit Rohament® PL

Sowohl für Pancreatin als auch für Pronase unterschieden sich die einer enzymatischen

Vorbehandlung mit der Pektinase Rohament® PL unterzogenen Hydrolysate nicht signifikant

in Abhängigkeit der Dauer der Vorbehandlung (18 h, 48 h, 72 h) (p > 0,05) (Abbildung 58). Für

Pronase und Pancreatin wurden jeweils ähnliche Hydrolysegrade ermittelt (Pancreatin,

Rohament® PL, 18 h: 15,32 ± 1,19, Pronase, Rohament® PL, 18 h: 14,63 ± 2,73; Pancreatin,

Rohament® PL, 48 h: 20,14 ± 1,56, Pronase, Rohament® PL, 48 h: 21,39 ± 1,77; Pancreatin,

Rohament® PL, 72 h: 19,81 ± 0,10, Pronase, Rohament® PL, 72 h: 19,01 ± 2,99).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Hyd

roly

segr

ad D

H (

%)

Ergebnisse

94

Verglichen mit der 48-stündigen Behandlung mit Rohament® PL, sinkt der Hydrolysegrad der

72-stündigen Behandlung für beide Enzyme geringfügig ab (Tabelle 25).

Tabelle 25: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der Dauer der Vorbehandlung mit Rohament® PL

Enzym n

Enzym-

wirkdauer

tE (min)

Vorbehandlung

Dauer der

Vorbehandlung tEV

(h)

Hydrolysegrad

DH (%)

Pancreatin 3 45 Rohament® PL 18 15,32 ± 1,19 a

Pancreatin 3 45 Rohament® PL 48 20,14 ± 1,56 a

Pancreatin 2* 45 Rohament® PL 72 19,81 ± 0,10 a

Pronase 3 45 Rohament® PL 18 14,63 ± 2,73 a

Pronase 3 45 Rohament® PL 48 21,39 ± 1,77 a

Pronase 2* 45 Rohament® PL 72 19,01 ± 2,99 a

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b unterschieden sich signifikant (p < 0,05). * Ausschluss eines Messwerts aufgrund fehlerhafter Temperaturführung während des Vorbehandlungsprozesses.

Die einer enzymatische Behandlung mit der Pektinase Rohamant® PL unterzogenen

Hydrolysate verfügen über eine relativ schmale Molekülgrößenverteilungen (Abbildung 59 –

Abbildung 61). Sowohl für Pancreatin als auch für Pronase resultiert die enzymatische

Vorbehandlung unabhängig von der Dauer (18 h, 48 h, 72 h) in einem verschwindend kleinen

Anteil von Molekülen im Bereich von 158 kDa – 10 kDa. Strukturen mit einer Molekülgröße <

1,35 kDa sind stark repräsentiert. Mit zunehmender Dauer der Pektinase-Behandlung (48 h,

72 h) sind in den Chromatogrammen zudem (in Abbildung 60 & Abbildung 61 markierte)

Moleküle erkennbar, die weitaus kleiner als < 1,35 kDa sind (tr = 9,5 min – 12 min) (Abbildung

60, Abbildung 61). Unter Berücksichtigung der Hydrolysegrade (Pancreatin, Rohament® PL,

48 h: 20,14 ± 1,56, Pronase, Rohament® PL, 48 h: 21,39 ± 1,77; Pancreatin, Rohament® PL,

72 h: 19,81 ± 0,10, Pronase, Rohament® PL, 72 h: 19,01 ± 2,99) kann davon ausgegangen

werden, dass es sich hierbei um eine Anreicherung, bzw. einen erhöhten Anteil kleinster

Peptide oder Peptidbruchstücke handelt, deren Entstehung durch einen weiter

fortgeschrittenen Hydrolyseprozess begünstigt wurde.

Ergebnisse

95

Abbildung 59: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris mit a) Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: Rohament® PL, 18 h) und b) Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: Rohament® PL, 18 h), qualitative Darstellung


a) Pancreatin 0,25 %, (20 USP),45 min, Rohament® PL 18 h

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


b) Pronase 0,25 %, (112,5 PU),45 min, Rohament® PL 18 h


Legende:





Legende:





Legende:





Legende:





qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

Ergebnisse

96


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa



Legende:





Legende:





qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

Ergebnisse

97

4.2.1.2 Behandlung mit HCl, pH 3

Um die Zugänglichkeit der Algenproteine für die Enzyme Pronase und Pancreatin zu

verbessern, wurde eine Behandlung mit HCl, pH 3 für 18 h, sowie 48 h durchgeführt. Hiermit

sollte überprüft werden, ob die Behandlung, vergleichbar mit einer sauren, besonders beim

Umsatz von Biomasse zur Glucose-Gewinnung Anwendung findenden Hydrolyse, zu

effektivem Aufschluss der Algenzellwand führt.

In Abbildung 62 und Tabelle 26 sind die Hydrolysegrade des Algenhydrolysats in Abhängigkeit

des Enzyms, sowie der Dauer der Vorbehandlung tEV dargestellt.

Abbildung 62: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3

Sowohl für Pancreatin als auch für Pronase zeigt sich bei einer Vorbehandlung mit HCl, pH 3

ein geringfügig erhöhter, aber nicht signifikant unterschiedlicher, Hydrolysegrad (p > 0,05) in

Abhängigkeit der Dauer (Pancreatin, HCl, pH 3, 18 h: 10,29 ± 0,97, Pancreatin, HCl, pH 3, 48

h: 12,76 ± 1,21; Pronase, HCl, pH 3, 18 h: 17,04 ± 2,83, Pronase, HCl, pH 3, 48 h: 18,16 ±

2,59). Die Verwendung von Pronase führt im Vergleich zu Pancreatin zu signifikant höheren

Hydrolysegraden (Pancreatin, HCl, pH 3, 18 h: 10,29 ± 0,97, Pronase, HCl, pH 3, 18 h: 17,04

± 2,83; Pancreatin, HCl, pH 3, 48 h: 12,76 ± 1,21, Pronase, HCl, pH 3, 48 h: 18,16 ± 2,59) (p

< 0,05). Bei der Hydrolyse der Algenproteine nach einer Behandlung mit HCl, pH 3 blieben

nach der Zentrifugation des Hydrolysats nur geringe Menge Sediment zurück (Massen nicht

gravimetrisch ermittelt).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

Hyd

roly

segr

ad D

H (

%)

Ergebnisse

98

Tabelle 26: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3

Enzym n

Enzym-

wirkdauer

tE (min)

Vorbehandlung

Dauer der

Vorbehandlung tSV

(h)

Hydrolysegrad

DH (%)

Pancreatin 3 45 HCl, pH 3 18 10,29 ± 0,97 a

Pancreatin 3 45 HCl, pH 3 48 12,76 ± 1,21 a, b

Pronase 3 45 HCl, pH 3 18 17,04 ± 2,83 b, c

Pronase 3 45 HCl, pH 3 48 18,16 ± 2,59 c

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Die Erhöhung des Hydrolysegrads bei einer Behandlung mit HCl, pH 3 ist für beiden Enzyme

(Pancreatin, Pronase) auch chromatographisch erkennbar. Während bei einer 18-stündigen

Vorbehandlung lediglich eine geringer Anteil von Molekülen im Bereich von 44 – 10 kDa

erzeugt werden können (Abbildung 63 a, b), lassen sich beim 48-stündigen Prozess Moleküle

im Bereich von 158 kDa – 10 kDa nachweisen (Abbildung 64 a, b). Besonders bei 48-stündiger

Vorbehandlung resultiert die Verwendung von Pronase in einem vergleichsweise hohen Anteil

an Molekülverbindungen > 44 kDa (Abbildung 64 b).

Eine Zunahme des Anteils von Verbindungen dieser Größenordnungen erscheint, unter

Berücksichtigung des steigenden Hydrolysegrads, ungewöhnlich. Da nicht-native, denaturierte

oder teilgefaltete Proteine gemäß Roberts (2007), unter anderem bedingt durch frei

zugängliche hydrophobe Gruppen, jedoch anfällig für die Ausbildung von irreversiblen Protein-

Aggregaten sind, wird von einer verstärkten Aggregatbildung bei steigender Dauer der

Vorbehandlung ausgegangen.

Unabhängig vom verwendeten Enzym und der Dauer der Behandlung mit HCl, pH 3 sind

Strukturen mit einer Molekülgröße < 1,35 kDa stark repräsentiert.

Ergebnisse

99

Abbildung 63: Molekülgrößenverteilung – Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris mit a) Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 18 h) und b) Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 18 h), qualitative Darstellung

Abbildung 64: Molekülgrößenverteilung - Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris mit a) Pancreatin (0,25 % (20 USP); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 48 h) und b) Pronase (0,25 % (112,5 PU); 45 min; Behandlung: HCl, pH 3, 48 h), qualitative Darstellung

a) Pancreatin 0,25 %, (20 USP), 45 min, HCl, pH 3, 18 h

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Pronase 0,25 %, (112,5 PU), 45 min, HCl, pH 3, 18 h

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

a) Pancreatin 0,25 %, (20 USP), 45 min, HCl, pH 3, 48 h

b) Pronase 0,25 %, (112,5 PU), 45 min, HCl, pH 3, 48 h

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

Legende:





Legende:





Legende:





Ergebnisse

100

4.2.1.3 Vergleich – Behandlung mit HCl, pH 3 vs. Behandlung mit Rohament® PL

In Tabelle 27 sind die Hydrolysegrade des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms,

sowie der Dauer tEV bzw. tSV und Art (HCl, pH 3; Rohament® PL) der Vorbehandlung

dargestellt.

Die Behandlung der Algen (Chlorella vulgaris) für 18 h und 48 h mit der Pektinase Rohament®

PL führte, verglichen mit einer Behandlung durch HCl, pH 3 (18 h, 48 h), zu nicht signifikant

erhöhten Hydrolysegraden (p > 0,05). Die Hydrolysegrade der sauren Vorbehandlung (HCl,

pH 3) lagen dabei durchweg unter den Hydrolysegraden der mit der Pektinase Rohament® PL

behandelten Alge (Chlorella vulgaris) (ausgenommen: Pronase, HCl, pH 3, 18 h vs. Pronase,

Rohament® PL, 18 h).

Tabelle 27: Hydrolysegrad des Algen-Hydrolysats in Abhängigkeit des Enzyms und der Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3 und Rohament® PL

Enzym n

Enzym-

wirkdauer

tE (min)

Vorbehandlung

Dauer der

Vorbehandlung

tEV/tSV (h)

Hydrolysegrad

DH (%)

Pancreatin 3 45 HCl, pH 3 18 10,29 ± 0,97 a

Pancreatin 3 45 HCl, pH 3 48 12,76 ± 1,21 a, d

Pancreatin 3 45 Rohament® PL 18 15,32 ± 1,19 a, c

Pancreatin 3 45 Rohament® PL 48 20,14 ± 1,56 b, c

Pancreatin 2* 45 Rohament® PL 72 19,81 ± 0,10 b, c

Pronase 3 45 HCl, pH 3 18 17,04 ± 2,83 b, c, d

Pronase 3 45 HCl, pH 3 48 18,16 ± 2,59 b, c

Pronase 3 45 Rohament® PL 18 14,63 ± 2,73 a, c

Pronase 3 45 Rohament® PL 48 21,39 ± 1,77 b, c

Pronase 2* 45 Rohament® PL 72 19,01 ± 2,99 b, c

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c, d unterschieden sich signifikant (p < 0,05). * Ausschluss eines Messwerts aufgrund fehlerhafter Temperaturführung während des Vorbehandlungsprozesses.

Die vorab dargestellte, verstärke Ausbildung von Peptiden < 1,35 kDa, sowie der geringe Anteil

an Peptiden im Bereich zwischen 158 – 10 kDa sprechen gegen die Anwendung der

Behandlung mit Rohament® PL, sodass im Rahmen dieser Studie, unter Berücksichtigung der

Zielsetzung „Erzeugung eines Hydrolysats mit moglichst breiter Molekülgroßenverteilung“,

eine Behandlung mit HCl, pH 3 für 48 h in Kombination mit einer anschließend durchgeführten

Hydrolyse durch Pronase 0,25 % (112,5 PU), 45 min Anwendung fand.

Ergebnisse

101

4.3 Crossflow-Diafiltration & Fraktionierung

Nachfolgend sind die Ergebnisse der Membrancharakterisierung, sowie die Versuchsreihe

zum Einfluss des pH-Werts und der Ionenstärke auf den Crossflow-Parameter Permeatflux

JF,t dargestellt. Darüber hinaus werden die Auswirkungen der Crossflow-Fraktionierung

anhand der SE-HPLC Daten, sowie der absoluten Proteingehalte von Retentat mRet- und

Permeat-Fraktion mPer beschrieben. In weiteren Schritten wird dargelegt, wie sich die

Verwendung von Ultraschall, sowie alternativer Membranmaterialien auf die Fraktionierung

auswirkt. Abschließend wird das Verfahren der Dialyse und dessen Einfluss auf die

Molekülgrößenverteilung des vorfiltrierten Feeds beleuchtet.

4.3.1 Membran- & Anlagen-Charakterisierung

Entscheidend für eine Crossflow Filtration ist das Operieren unterhalb des

deckschichtkontrollierten Bereichs. Im Rahmen dieser Studie wurde dazu der kritische Druck

pCP der Anlagenkonzeption für hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat und hydrolysierte Alge

(Chlorella vulgaris) ermittelt. Hierfür wurde der Permeatflux JF,t in Abhängigkeit des

Transmembrandrucks pTMP für die Filtration mit Wasser und Feed bestimmt. Die Ergebnisse

der Versuche sind in Kapitel 4.3.1.1 und 4.3.1.2 (Abbildung 68 – Abbildung 69) dargestellt.

Den Charakterisierungs-Versuchen vorausgehen, erfolgte die Festlegung des MWCO der

verwendeten Membran, basierend auf den Ergebnissen der Pilot-Versuche, sowie der

Molekülgrößenverteilung der Hydrolysate von Molkenprotein-Isolat und der Alge Chlorella

vulgaris.

Die im Rahmen der Pilot-Versuche anhand des hydrolysierten Molkenprotein-Isolats „Thermax

690“ (Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) bei einer Feed-Konzentration von 3 % (bezogen auf den

Proteingehalt), pH 8 auf derselben Anlagenkonzeption unter identischen Bedingungen mittels

einer Membran mit 50 kDa MWCO (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden, GER) gewonnenen

Ergebnisse offenbarten, gelelektrophoretisch ermittelt (Abbildung 65), massive

Verschiebungen der Membrantrenngrenze, sowie einen umfassenden Rückhalt großer (> 220

kDa) aber auch kleiner (< 14 kDa) Moleküle über der Membran (im Retentat). In der Fraktion

< 50 kDa – 30 kDa konnten, basierend auf einer Bewertung der Farbintensität, nur geringe

Molekülmengen im Bereich > 14 kDa festgestellt werden. Der Anteil an Strukturen < 14 kDa

war gelelektrophoretisch nicht darstellbar. Zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung wurde

diese Feststellung auf eine mangelnde Färbung der Peptide im betroffenen Größenbereich

durch „Coomassie Brilliant Blau G 250“ zurückgeführt, da spektralphotometrisch ca. 6 – 7 %

des Gesamtproteingehalts aller Fraktionen in der betroffenen Fraktion festgestellt werden

konnten.

Ergebnisse

102

Legende: 1) Größenmarker, 2) „Thermax 690“, 3) > 50 kDa, 4) 50 kDa – 30 kDa, 5) 30 kDa – 20 kDa

6) 20 kDa – 10 kDa, 7) 10 kDa – 5 kDa, 8) 5 kDa – 4 kDa, 9) 4 kDa – 1 kDa, 10) Größenmarker

Abbildung 65: Gelelektrophorese der Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

In einer nachgestellten SE-HPLC-Analyse der Fraktionen konnten in der Fraktion < 50 kDa –

30 kDa jedoch lediglich wenige Moleküle im Bereich < 17 kDa und kleiner nachgewiesen

werden. Der Großteil der Moleküle lag im Bereich < 1,35 kDa und kleiner (Abbildung 66 b).

Betrachtet man die Molekülgrößenverteilung der Fraktion > 50 kDa, liegt der Schluss nahe,

dass Moleküle im Bereich < 50 kDa - > 1,35 kDa die Membran nicht passieren konnten und

somit eine Verschiebung der Trenngrenze hin zu einem geringeren MWCO stattgefunden hat

(Abbildung 66 a).

Um die Problematik zu umgehen, wurde die Feed-Konzentration auf 1,5 % (bezogen auf den

Proteingehalt) herabgesetzt. Weiterhin wurde der MWCO der Membran auf 100 kDa

angehoben um einer Permeatfraktion mit zu schmaler Molekülgrößenverteilung vorzubeugen,

da in diesem Falle eine weitere Fraktionierung des Permeats aufgrund der beschriebenen

Problematik der Trenngrenzenverschiebung als nicht sinnvoll anzusehen ist.

Die unter den genannten Bedingungen durchgeführte Fraktionierung offenbarte ebenfalls eine

starke Verschiebung der Trenngrenze hin zu einem geringeren MWCO (Abbildung 67 a, b).

Trotzdem konnten durch die Reduktion der Feed-Konzentration ein geringer (in der Abbildung

markierte) Anteil von Molekülen im Bereich zwischen 17 kDa – 44 kDa festgestellt werden

(Abbildung 67 b).

Erst die, basierend auf umfangreichen Literaturrecherchen, zusammengefasst dargestellt in

Kapitel 2.1.4, vorgenommene Absenkung der Feed-Konzentration des hydrolysierten

Molkenprotein-Isolat-Feeds auf 0,15 % (bezogen auf den Proteingehalt) in Verbindung mit der

220 kDa (Myosin)

116 kDa (ß-Galactosidase)

66 kDa (Albumin)

55,6 kDa (Glutamat-Dehydrogenase)

29 kDa (α-Carboanhydrasen)

14 kDa (Lysozym)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Ergebnisse

103

Verwendung einer Membran mit einer Trenngrenze von 100 kDa führte zu einer breiteren

Molekülgrößenverteilung im Permeat (siehe Kapitel 4.3.2, Abbildung 78 - Abbildung 81).

Aufgrund einer vergleichbaren Molekülgrößenverteilung der hydrolysierten Alge (Chlorella

vulgaris) (siehe Abbildung 64 b) wurden Feed-Konzentration und MWCO der Membran für die

Fraktionierung des hydrolysierten Algen-Feeds (Chlorella vulgaris) übernommen.

Ergebnisse

104

Anmerkung: Die Zuweisung der Molekülgrößen erfolgte unter Verwendung der entsprechenden Retentionszeiten tr des BioRad Gel-Filtration-Standards. Aufgrund der schlecht

lesbaren Achsenbeschriftung der Ausgangsgrafiken wurde diese zur besseren Lesbarkeit nachgearbeitet. Jeder | auf der x-Achse entspricht einer Retentionszeit ∆tr von 5 min. Auf

der y-Achse wird zur Wahrung der Übersicht nur der Maximalwert des Detektorsignals angegeben (Einheit: µV).

Legende: 1, Thyroglobulin (670 kDa). 2, γ-Globulin (158 kDa). 3, Ovalbumin (44 kDa). 4, Myoglobin (17 kDa). 5, Vitamin B12 (1,35 kDa).

Abbildung 66: Molekülgrößenverteilung - SE-HPLC-Chromatogramme von fraktioniertem, hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Feed-Konzentration

3 % (bezogen auf den Proteingehalt) a) Fraktion > 50 kDa b) Fraktion < 50 kDa – 30 kDa, quantitative Darstellung

0 5 10 0 5 10 tr (min) tr (min)

µV µV 2*104

3*105

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

a) b)

Ergebnisse

105

Abbildung 67: Molekülgrößenverteilung - SE-HPLC-Chromatogramme von fraktioniertem, hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Feed-Konzentration 1,5 % (bezogen auf den Proteingehalt) a) Fraktion > 100 kDa b) Fraktion < 100 kDa, qualitative Darstellung

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:



rot: BioRad Gel-Filtration Standard

blau: hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

qu

alit

ativ

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:



rot: BioRad Gel-Filtration Standard

blau: hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

qu

alit

ativ

a) b)

Ergebnisse

106


Zur Fraktionierung des hydrolysierten Molkenprotein-Isolats wurde, basierend auf der

Molekülgrößenverteilung des Feeds, sowie der vorausgehen dargestellten Erkenntnisse

(Kapitel 4.3.1), eine Membran mit einer Trenngrenze von 100 kDa (Microdyn Nadir GmbH,

Wiesbaden, GER) gewählt.

Abbildung 68: Membrancharakterisierung 100 kDa – hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

Zur Charakterisierung der Membran wurde der Permeatflux JF,t des Feeds bei steigendem

Transmembrandruck pTMP dokumentiert. Hierzu wurde pTMP, in Intervallen von ∆pTMP = 0,2 bar,

schrittweise von 0 bar bis max. 2 bar angehoben. Ab einem Transmembrandruck pTMP von 0,6

bar weicht der Flux JF,t des Feeds vom linearen Verlauf des Wasserflux JWvor ab. Der kritische

Druck pCP der Filtration von Molkenprotein-Isolat wurde auf 0,5 bar festgelegt.


Zur Fraktionierung der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris) wurde, basierend auf der

Molekülgrößenverteilung des Feeds, sowie der vorausgehend dargestellten Erkenntnisse

(Kapitel 4.3.1), eine Membran mit einer Trenngrenze von 100 kDa (Microdyn Nadir GmbH,

Wiesbaden, GER) gewählt.

R² = 0,955

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

Flu

x J F

,t(m

l/m

in)

Druck pTMP (bar)

Flux Wasser MW (ml/min) Flux Medium MW (ml/min)

Ergebnisse

107

Abbildung 69: Membrancharakterisierung 100 kDa – hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris)

Zur Charakterisierung der Membran wurde der Permeatflux JF,t des Feeds bei steigendem

Transmembrandruck pTMP, vergleichbar der vorab dargestellten Charakterisierung der

Membran für hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat, dokumentiert. Hierzu wurde pTMP, in

Intervallen von ∆pTMP = 0,2 bar, schrittweise von 0 bar bis max. 2 bar angehoben. Vergleichbar

mit der Filtration von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat weicht der Flux des Feeds JF,t ab

einem Transmembrandruck pTMP von 0,6 bar von linearen Verlauf des Wasserflux JWvor ab. Der

kritische Druck pCP der Filtration von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) wurde

dementsprechend auf 0,5 bar eingestellt.

4.3.2 Einfluss des pH-Werts & der Ionenstärke

Der Einfluss des pH-Wertes auf den Fouling-Prozess ist seit langem intensiver Gegenstand

der Forschung. Kernaussage vieler Studien ist, dass starkes Fouling in Verbindung mit

niedrigem Permeatflux bei nicht hydrolysierten Feeds grundsätzlich in der Nähe des IEP auftritt

und, dass sowohl über- als auch unterhalb des IEP eine vergleichsweise reduzierte

Auswirkung von Fouling auf dem Permeatflux JF zu beobachten ist (Wang & Tang, 2011; She

et al., 2009; Huisman et al., 2000; McDonogh et al., 1990; Palecek et al., 1993; Fane et al.,

1983).

In Verbindung mit dem pH-Wert spielt die Ionenstärke des Feeds eine wichtige Rolle bei der

Entstehung und Strukturbildung der Deckschicht. Eine allgemeingültige Aussage bezüglich

des Effekts der Ionenstärke auf den Fouling-Prozess ist, hinsichtlich widersprüchlicher

Forschungsergebnisse, unter anderem von She et al. (2009), Salgın (2007), Teng et al. (2006),

Tarabara et al. (2004), Chan & Chen (2001), Kwon et al. (2000), Palecek & Zydney (1994),

Heinemann et al. (1988) & Fane et al. (1983), aber nicht uneingeschränkt möglich.

R² = 0,997

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

Flu

x J F

,t (m

l/m

in)

Druck pTMP (bar)

Flux Wasser MW (ml/min) Flux Medium MW (ml/min)

Ergebnisse

108

Für Molkenprotein-Isolat- und Algen-Hydrolysate der Alge Chlorella vulgaris gibt es

diesbezüglich keine Erkenntnisse.


Der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf den Permeatflux JFm des Feeds, den absoluten

Proteingehalt der gewonnen Fraktionen, die Wiederfindungsrate, sowie die

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen, wurde für das Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat

anhand von fünf pH-Werten (4, 6, 7, 8, 9) überprüft. Darüber hinaus fand je pH-Stufe eine

Anpassung der Ionenstärke durch die Zugabe von 150 mM NaCl statt. Zur Fraktionierung

wurde eine PS-Membran mit einem MWCO von 100 kDa (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden,

GER) verwendet.

Aufgrund einer nicht standardisierbar durchführbaren Vorfiltration (Dauer, Verlust Feed-

Volumen, Molekülgrößenverteilung des Feeds), sowie Ausflockung in Retentat und Permeat

wurde die Versuchsreihe für pH 4 abgebrochen. Die Ergebnisse des Einfachversuchs sind zur

Vervollständigung der Daten aufgeführt, werden aber nicht diskutiert.

Permeatflux JFm:

In Tabelle 28 und Abbildung 70 sind die Ergebnisse der Untersuchung des Permeatflux JFm

der Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und

Ionenstärke des Feeds dargestellt.

Tabelle 28: Laufzeit tFm & Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

pH n

Ohne NaCl-Zugabe Mit NaCl-Zugabe

Laufzeit tFm MW

(min)

Flux JFm MW

(ml/min)

Laufzeit tFm MW

(min)

Flux JFm MW

(ml/min)

4* 1 48,26 37,61 82,56 21,98

6 3 73,06 ± 16,16 a, 1 25,62 ± 5,27 a, 1 61,79 ± 13,85 a, 1 30,27 ± 6,01 a, 1

7 3 74,33 ± 15,16 a, 1 25,16 ± 5,48 a, 1 49,80 ± 5,99 a, c, 1 36,78 ± 4,14 a, 2

8 3 90,81 ± 3,74 a, 1 20,01 ± 0,84 a, 1 49,12 ± 5,25 a, c, 2 37,23 ± 3,91 a, 2

9 3 64,68 ± 16,95 a, 1 29,44 ± 8,19 a, 1 37,07 ± 2,41 b, c, 2 49,11 ± 3,23 b, 2

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05). * Einfachversuch; in statistischer Auswertung nicht berücksichtigt.

Der pH-Wert wirkte sich bei der Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat ohne

NaCl-Zusatz nicht signifikant (p > 0,05) auf den Permeatflux JFm der Crossflow-Diafiltration

aus. pH 4 nicht mit einbezogen, konnte für pH 9 die beste Performance erzielt (29,44 ± 8,19

ml/min) werden. Eine Fraktionierung bei pH 6 (25,62 ± 5,27 ml/min) und pH 7 (25,16 ± 5,48

Ergebnisse

109

ml/min) liefert weitestgehend identische Ergebnisse. Eine Fraktionierung bei pH 8 führt zum

geringsten Permeatflux JFm (20,01 ± 0,84 ml/min) bei gleichzeitig sehr guter Wiederholbarkeit,

beurteilt anhand der geringen Standardabweichung.

Abbildung 70: Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

Bei einer Fraktionierung unter Zusatz von 150 mM NaCl konnte für pH 9 abermals die beste

Performance JFm erreicht werden (49,11 ± 3,23 ml/min), die sich signifikant (p < 0,05) von den

weiteren pH-Stufen (6, 7, 8) unterschied. Des Weiteren ist anhand der Daten ein Ansteigen

des Permeatflux JFm mit zunehmendem pH-Wert erkennbar.

Für die pH-Stufen 7 (36,78 ± 4,14 ml/min), 8 (37,23 ± 3,91 ml/min) und 9 (49,11 ± 3,23 ml/min)

konnten durch das Erhöhen der Ionenstärke signifikant (p < 0,05) erhöhte Permeatflüsse JFm

bei gleichzeitig geringeren Standardabweichungen im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne

150 mM NaCl erreicht werden (pH 7: 25,16 ± 5,48 ml/min; pH 8: 20,01 ± 0,84 ml/min; pH 9:

29,44 ± 8,19 ml/min). Für pH 6 führte der Zusatz von 150 mM NaCl nicht zu signifikant

erhöhtem Permeatflux JFm (pH 6: 25,62 ± 5,27 vs. pH 6:, NaCl: 30,27 ± 6,01).

Proteingehalt von Retentat mRet & Permeat mPer:

In Tabelle 29, sowie Abbildung 71 und Abbildung 72 sind die absoluten Proteingehalt der

Retentat (mRet)- und Permeatfraktionen (mPer) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

dargestellt.

37,61

25,62

25,16

20,01

29,48

21,98

30,27

36,78

37,23

49,11

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

4

6

7

8

9

Permeatflux JFm (ml/min)

pH

-Wer

t

Flux (ml/min) - mit NaCl Flux (ml/min) - ohne NaCl

Ergebnisse

110

Tabelle 29: Absolute Proteingehalte von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Retentat und Permeat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

pH n Ohne NaCl-Zugabe Mit NaCl-Zugabe

mRet (g) mPer (g) mRet (g) mPer (g)

4* 1 0,348 0,395 0,271 0,461

6 3 0,300 ± 0,056 a, c, 1 0,373 ± 0,050 a, 1 0,209 ± 0,031 a, 1 0,354 ± 0,014 a, 1

7 3 0,209 ± 0,060 a, 1 0,367 ± 0,047 a, 1 0,136 ± 0,037 a, 1 0,426 ± 0,039 a, 1

8 3 0,354 ± 0,067 b, c, 1 0,358 ± 0,026 a, 1 0,194 ± 0,019 a, 2 0,419 ± 0,037 a, 1

9 3 0,286 ± 0,012 a, c, 1 0,398 ± 0,024 a, 1 0,163 ± 0,049 a, 2 0,419 ± 0,045 a, 1

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05). * Einfachversuch; in statistischer Auswertung nicht berücksichtigt.

Der pH-Wert wirkte sich bei der Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat ohne

NaCl-Zusatz in nur einem Fall (vergleiche: pH 7 vs. pH 8) signifikant (p < 0,05) auf den

Proteingehalt mRet der Retentat-Fraktionen aus. Der höchste Proteingehalt mRet wurde hierbei

für pH 8 (0,354 ± 0,067 g), der niedrigste für pH 7 (0,209 ± 0,060 g) festgestellt. Der

Proteingehalt der pH-Stufe 6 und 9 lag zwischen 0,286 ± 0,012 g (pH 9) und 0,300 ± 0,056 g

(pH 6).

Die Permeat-Fraktionen unterschieden sich hinsichtlich ihres Proteingehalts mPer nicht

signifikant (p > 0,05) und lagen im Bereich zwischen 0,373 ± 0,050 g (pH 6) und 0,398 ± 0,024

g (pH 9).

Abbildung 71: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

0,348

0,300

0,209

0,354

0,286

0,271

0,209

0,136

0,194

0,163

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450

4

6

7

8

9

Proteingehalt Retentat (g)

pH

-Wer

t

Proteinmenge (g) Retentat - mit NaCl Proteinmenge (g) Retentat - ohne NaCl

Ergebnisse

111

Eine Fraktionierung unter Zusatz von 150 mM NaCl resultierte weder für Retentat- noch für

Permeatfraktion in signifikant unterschiedlichen Proteingehalten mRet/mPer (p > 0,05). Der

höchste Retentat-Proteingehalt wurde bei pH 6 (0,209 ± 0,031 g), der niedrigste bei pH 7

(0,136 ± 0,037 g) festgestellt. Generell lagen die Proteingehalte des Retentats bei einer

Fraktionierung unter Zusatz von 150 mM NaCl unter denen der Fraktionierung ohne Zusatz

von 150 mM NaCl. Für pH 8 (0,194 ± 0,019 g) und pH 9 (0,163 ± 0,049 g) konnten durch die

Erhöhung der Ionenstärke im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne 150 mM NaCl (pH 8:

0,354 ± 0,067 g; pH 9: 0,286 ± 0,012 g) signifikant geringere Proteingehalte mRet (p < 0,05) im

Retentat festgestellt werden.

Der Proteingehalt mPer der zugehörigen Permeatfraktionen (pH 8: 0,419 ± 0,037 g; pH 9: 0,419

± 0,045 g) lag über dem der ohne NaCl-Zusatz erzeugten Fraktionen (pH 8: 0,358 ± 0,026 g;

pH 9: 0,398 ± 0,024 g), unterschied sich aber nicht signifikant (p > 0,05). Mit Ausnahme von

pH 6 wurden im Permeat des unter 150 mM NaCl-Zusatz fraktionierten Feed höhere

Proteingehalte festgestellt als in den Permeatfraktionen des ohne NaCl aufgetrennten Feeds.

Abbildung 72: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

Wiederfindungsrate:

Die Wiederfindungsrate, dargestellt in Tabelle 30, lag bei der Fraktionierung von

Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat ohne NaCl-Zusatz zwischen 76, 91 ± 5,53 % (pH 7) und 94,85

± 4,63 % (pH 8) (pH 4 nicht miteinbezogen). Der pH-Wert beeinflusste die WFR nicht

signifikant (p> 0,05). Ein Großteil der Molekülverbindungen (47,67 ± 3,43 % (pH 8) - 53,02 ±

3,22 % (pH 9) passierte die Membran. Bei pH 7 ist der Anteil an Protein in der Retentatfraktion

am geringsten (27,92 ± 8,03 %). Dies resultierte jedoch nicht in einem erhöhten Proteinanteil

im Permeat. Darüber hinaus wurde bei pH 7 (76,91 ± 5,53 %) die geringste WFR festgestellt.

0,395

0,373

0,367

0,358

0,398

0,461

0,355

0,426

0,419

0,420

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250 0,300 0,350 0,400 0,450 0,500

4

6

7

8

9

Proteingehalt Permeat (g)

pH

-Wer

t

Proteinmenge (g) Permeat - mit NaCl Proteinmenge (g) Permeat - ohne NaCl

Ergebnisse

112

Die höchste WFR, sowie der höchste Proteinanteil im Retentat wurde bei pH 8 (WFR: 94,85 ±

4,63 %; WFRRET: 47,18 ± 8,94 %), der höchste Proteinanteil im Permeat bei pH 9 (53,02 ±

3,22 %) festgestellt.

Tabelle 30: Wiederfindungsrate und Anteile der Retentat- und Permeat-Fraktion bei der Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat


WFR (%) WFRRet (%) WFRPer (%) WFR (%) WFRRet (%) WFRPer (%)

4* 1 99,10 46,41 52,69 97,70 36,17 61,53

6 3 89,64 ±

11,46 a, 1

39,96 ±

7,52 a, 1

49,68 ±

6,67 a, 1

75,14 ±

4,90 a, 1

27,87 ±

4,22 a, 1

47,27 ±

1,79 a, 1

7 3 76,91 ±

5,53 a, 1

27,92 ±

8,03 a, 1

48,99 ±

6,31 a, 1

74,88 ±

3,39 a, 1

18,10 ±

4,92 a, 1

56,78 ±

5,23 a, 1

8 3 94,85 ±

4,63 a, 1

47,18 ±

8,94 a, 1

47,67 ±

3,43 a, 1

81,74 ±

4,36 a, 2

25,91 ±

2,62 a, 2

55,83 ±

4,97 a, 1

9 3 91,10 ±

4,63 a, 1

38,07 ±

1,56 a, 1

53,02 ±

3,22 a, 1

77,67 ±

4,82 a, 2

21,72 ±

6,60 a, 2

55,95 ±

5,97 a, 1

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05). * Einfachversuch; in statistischer Auswertung nicht berücksichtigt.

Die Wiederfindungsrate bei der Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat unter

NaCl-Zusatz lag, pH-abhängig, zwischen 74,88 ± 3,39 % (pH 7) und 81,74 ± 4,36 % (pH 8).

Der Großteil der Proteine findet sich auch in diesem Fall in der Permeatfraktion (47,27 ± 1,79

% (pH 6) - 56,78 ± 5,23 % (pH7)). Die höchste WFR wurde bei pH 8 (81,74 ± 4,36 %;

WFRRET: 47,18 ± 8,94 %), der höchste Proteinanteil im Retentat bei pH 6 (27,87 ± 4,22 %)

und der höchste Proteinanteil im Permeat bei pH 7 (56,78 ± 5,23 %) festgestellt.

Die Erhöhung der Ionenstärke resultierte in einer geringeren WFR im Vergleich zur

Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz. Die pH-Stufen 8 (WFR (ohne NaCl): 94,85 ± 4,63 %, WFR

(mit NaCl): 81,74 ± 4,36 %) und 9 (WFR (ohne NaCl): 91,10 ± 4,63 %, WFR (mit NaCl): 77,67

± 4,82 %) unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Die geringere WFR lässt sich auf signifikant

geringere Proteinanteile (p < 0,05) in der Retentat-Fraktion zurückführen.

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen:

Zur Beurteilung der Güte der Fraktionierung wurden SE-HPLC Analysen der Retentat- und

Permeatproben durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind nachfolgend qualitativ

dargestellt.

Abbildung 73 - Abbildung 77 zeigen die Chromatogramme einer nicht-fraktionierten

Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat-Probe (Nullprobe) nach der Vorfiltration. Die

Ergebnisse

113

Molekülgrößenverteilung der Nullproben wiesen keine deutlichen erkennbaren pH- und

ionenstärke-abhängigen Unterschiede auf und verfügten über eine breite

Molekülgrößenverteilung.

Lediglich bei pH 4, ohne NaCl wurde ein Großteil der Moleküle > 17 kDa bereits im Rahmen

der Vorfiltration abgetrennt (Abbildung 73 a). Wie bereits vorab dargestellt, wurde die

Fraktionierung bei pH 4 aufgrund der nicht standardisierbar durchführbaren Vorfiltration

(Dauer, Verlust Feed-Volumen, Molekülgrößenverteilung des Feeds), sowie Ausflockungen in

Retentat und Permeat abgebrochen.

Die Molekülgrößenverteilung der bei unterschiedlichen pH-Stufen erzeugten Feeds zeigt,

unabhängig von pH-Wert und Ionenstärke, dass Strukturen ≤ 1,35 kDa einen bestimmenden

Anteil des Feeds einnehmen (Abbildung 74 - Abbildung 77). Molekülstrukturen ≥ 20 kDa sind

jedoch in ausreichendem Maße vorhanden, um analytisch (SE-HPLC) nach der Fraktionierung

in den Retentatfraktionen abgebildet werden zu können.

Ergebnisse

114

Abbildung 73: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Nullprobe für die Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat, pH 4, a) ohne NaCl b) mit NaCl, qualitative Darstellung


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:




rot: hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Molkenprotein-Isolat, pH 4,Nullprobe, ohne NaCl

Molkenprotein-Isolat, pH 4,Nullprobe, mit NaCl



a) b)

a) b)

Ergebnisse

115



670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ





a) b)

a) b)

Ergebnisse

116


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ



a) b)

Ergebnisse

117

In Abbildung 78 - Abbildung 81 sind die Chromatogramme von Retentat- und Permeat-

Fraktionen des Molkenprotein-Isolat-Hydrolysats in Abhängigkeit von pH-Wert und

Ionenstärke des Feeds dargestellt.

Bei der Betrachtung der Chromatogramme der Retentat-Fraktion wird, weitestgehend

unabhängig vom pH-Wert, deutlich, dass neben Molekülverbindungen im Zielbereich auch

eine große Menge an Strukturen ≤ 1,35 kDa vorhanden sind (Abbildung 78 a, c - Abbildung 81

a, c). Diese konnten folglich, trotz der Verwendung des Diafiltrationsverfahrens, nicht aus den

Retentat-Fraktionen ausgewaschen werden. Eine Fraktionierung bei erhöhter Ionenstärke

(Zusatz von 150 mM NaCl) führte darüber hinaus, deutlich bei pH 7 und pH 8 (Abbildung 79 c,

Abbildung 80 c), zu einem geringeren Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa.

Anhand der Permeat-Fraktionen ist eine deutliche Verschiebung der Membrantrenngrenze hin

zu einem niedrigeren MWCO erkennbar (Abbildung 78 b, d - Abbildung 81 b, d). Nur ein

geringer Anteil an Verbindungen ≥ 20 kDa ist in den Permeaten feststellbar. Nähert man sich

der nominalen Trenngrenze der Membran (100 kDa) an, nimmt der Anteil weiter ab.

Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind stark repräsentiert.

Die Molekülgrößenverteilung der Permeatfraktion ist pH- und ionenstärke-abhängig. Für pH 9

(Abbildung 81 b) konnte bei einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz die anteilsmäßig größte

Menge an Strukturen ≥ 20 kDa die Membran passieren, wohingegen bei pH 6, 7, 8

anteilsmäßig nur sehr geringe Mengen festgestellt werde konnten (Abbildung 78 b - Abbildung

80 b).

Der Zusatz von 150 mM NaCl führte im Fraktionierungsprozess, weitestgehend unabhängig

vom pH-Wert, zu einem erhöhten Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im Permeat, der besonders

für pH 7 (Abbildung 79 d), pH 8 (Abbildung 80 d) und pH 9 (Abbildung 81 d) über dem Niveau

des ohne NaCl fraktionierten Feeds lag. Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind jedoch weiterhin

stark repräsentiert.

Ergebnisse

118

Abbildung 78: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der Ionenstärke, pH 6, a) Retentat ohne NaCl b) Permeat ohne NaCl c) Retentat mit NaCl d) Permeat mit NaCl, qualitative Darstellung

Molkenprotein-Isolat, pH 6 Retentat, ohne NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Molkenprotein-Isolat, pH 6 Permeat, ohne NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Molkenprotein-Isolat, pH 6 Retentat, mit NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Molkenprotein-Isolat, pH 6 Permeat, mit NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

a) b)

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

c) d)

Ergebnisse

119


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

a) b)

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

c) d)





Ergebnisse

120


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

a) b)

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

c) d)





Ergebnisse

121


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

a) b)

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

c) d)





Ergebnisse

122


Der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf den Permeatflux JFm des Feeds, den absoluten

Proteingehalt der gewonnen Fraktionen, die Wiederfindungsrate, sowie die

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen wurde für das Algen-Hydrolysat (Chlorella vulgaris)

anhand von fünf pH-Werten (3, 6, 7, 8, 11) überprüft. Darüber hinaus fand je pH-Stufe eine

Anpassung der Ionenstärke durch die Zugabe von 150 mM NaCl statt. Zudem wurde die

anhand einer grafischen Auswertung des Filtrationsprozess ermittelte Charakteristik des

Filtrationsprozesses bewertet. Zur Fraktionierung wurde eine PS-Membran mit einem MWCO

von 100 kDa (Microdyn Nadir GmbH, Wiesbaden, GER) verwendet.

Permeatflux JFm:

In Tabelle 31 und Abbildung 82 sind die Ergebnisse der Fraktionierung von hydrolysierter Alge

(Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke des Feeds dargestellt.

Der pH-Wert wirkte sich bei der Fraktionierung von Algen-Hydrolysat ohne NaCl-Zusatz,

abgesehen von einer Ausnahme, nicht signifikant (p > 0,05) auf den Permeatflux JFm der

Crossflow-Diafiltration aus. Lediglich die Fraktionierung bei pH 6 (42,91 ± 2,22 ml/min) führen

im Vergleich zu pH 3 (29,15 ± 0,35 ml/min) zu einem signifikant erhöhten Permeatflux (p <

0,05). Der höchste Permeatflux JFm wurde bei pH 6 (42,91 ± 2,22 ml/min), der niedrigste bei

pH 3 (29,15 ± 0,35 ml/min) beobachtet. Die pH-Stufen 7 (38,27 ± 2,86 ml/min), 8 (39,65 ±

4,19 ml/min) und 11 (37,94 ± 6,83 ml/min) unterschieden sich nicht signifikant (p > 0,05).

Tabelle 31: Laufzeit tFm & Permeatflux JFm von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

pH n


Laufzeit tFm MW (min)

Flux JFm MW (ml/min)

Laufzeit tFm MW (min)

Flux JFm MW (ml/min)

3 3 66,55 ± 0,81 a, 1 29,15 ± 0,35 a, 1 69,79 ± 9,20 a, 1 28,14 ± 3,96 a, 1

6 3 45,29 ± 2,30 b, c, 1 42,91 ± 2,22 b, c, 1 55,10 ± 7,95 a, 1 35,71 ± 5,22 a, 1

7 3 50,89 ± 3,94 a, c, 1 38,27 ± 2,86 a, c, 1 62,34 ± 2,34 a, 2 31,15 ± 1,16 a, 2

8 3 49,30 ± 5,26 a, c, 1 39,65 ± 4,19 a, c, 1 59,49 ± 9,81 a, 1 33,17 ± 5,04 a, 1

11 3 52,38 ± 10,48 a, c, 1 37,94 ± 6,83 a, c, 1 75,34 ± 18,31 a, 2 26,67 ± 5,68 a, 2

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Bei einer Fraktionierung unter Zusatz von 150 mM NaCl konnte für pH 6 (35,71 ± 5,22 ml/min)

abermals die beste Performance JFm erreicht werden, die sich jedoch nicht signifikant (p >

0,05) von den weiteren pH-Stufen unterschied. Der Permeatflux bei einer Fraktionierung unter

Zusatz von 150 mM NaCl lag zwischen 26,67 ± 5,68 ml/min (pH 11) und 35,71 ± 5,22 ml/min

(pH 6).

Ergebnisse

123

Abbildung 82: Permeatflux von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

Für die pH-Stufen 7 und 11 führte das Erhöhen der Ionenstärke (durch Zugabe von 150 mM

NaCl) zu signifikant (p < 0,05) niedrigerem Permeatflux JFm (pH 7 (ohne NaCl): 38,27 ± 2,86

ml/min, pH 7 (mit NaCl): 31,15 ± 1,16 ml/min; pH11 (ohne NaCl): 37,94 ± 6,83 ml/min, pH 11

(mit NaCl): 26,67 ± 5,68 ml/min). Auch für die weiteren pH-Stufen wurde eine Abnahme des

Flux beobachtet.


In Tabelle 32, sowie Abbildung 83 und Abbildung 84 sind die absoluten Proteingehalte der

Retentat (mRet)- und Permeatfraktionen (mPer) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

dargestellt.

Tabelle 32: Absolute Proteingehalte von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Retentat und Permeat in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke


mRet MW (g) mPer MW (g) mRet MW (g) mPer MW (g)

3 3 0,093 ± 0,008 b, c, 1 0,421 ± 0,024 a, c, 1 0,112 ± 0,010 a, 1 0,420 ± 0,032 a, c, 1

6 3 0,105 ± 0,007 b, c, 1 0,474 ± 0,018 b, c, 1 0,132 ± 0,018 a, 1 0,420 ± 0,019 a, c, 2

7 3 0,104 ± 0,010 b, c, 1 0,451 ± 0,030 b, c, 1 0,112 ± 0,015 a, 1 0,429 ± 0,008 a, 1

8 3 0,142 ± 0,047 a, c, 1 0,407 ± 0,038 a, c, 1 0,121 ± 0,013 a, 1 0,401 ± 0,040 a, c, 1

11 3 0,185 ± 0,029 a, 1 0,345 ± 0,041 a, 1 0,177 ± 0,044 a, 1 0,332 ± 0,051 b, c, 1


Der pH-Wert wirkte sich bei der Fraktionierung von Algen-Hydrolysat ohne NaCl-Zusatz in drei

Fällen (pH 11 (0,185 ± 0,029 g) vs. pH 3 (0,093 ± 0,008 g), pH 6 (0,105 ± 0,007 g), pH 7 (0,104

29,15

42,91

38,27

39,65

37,94

28,14

35,71

31,15

33,17

26,67

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

3

6

7

8

11

Permeatflux JFm (ml/min)

pH

-Wer

t

Flux (ml/min) - mit NaCl Flux (ml/min) - ohne NaCl

Ergebnisse

124

± 0,010 g)) signifikant (p < 0,05) auf den Proteingehalt der Retentat-Fraktionen mRet aus

(Abbildung 83).

Der höchste Retentat-Proteingehalt wurde für pH 11 (0,185 ± 0,029 g) festgestellt. Dieser

Proteingehalt liegt signifikant (p < 0,05) über den Proteingehalten der pH-Stufen 3 (0,093 ±

0,008 g), 6 (0,105 ± 0,007 g) und 7 (0,104 ± 0,010 g). Der bei pH 3 (0,093 ± 0,008 g) ermittelte

Proteingehalt des Retentats stellt den niedrigsten der Versuchsreihe dar.

Abbildung 83: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

Ein ähnliches Bild zeigt sich für die Permeat-Fraktionen, dargestellt in Abbildung 84.

Abbildung 84: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit von pH-Wert und Ionenstärke

Die Fraktionierung bei pH 11 (0,345 ± 0,041 g) resultierte hier, verglichen mit den pH-Stufen 3

(0,421 ± 0,024 g), 6 (0,474 ± 0,018 g) und 7 (0,451 ± 0,030 g), in einem signifikant niedrigeren

0,093

0,105

0,104

0,142

0,185

0,112

0,132

0,112

0,121

0,177

0,000 0,050 0,100 0,150 0,200 0,250

3

6

7

8

11

Proteingehalt Retentat (g)

pH

-Wer

t

Proteinmenge (g) Retentat - mit NaCl Proteinmenge (g) Retentat - ohne NaCl

0,421

0,474

0,451

0,407

0,345

0,420

0,420

0,429

0,401

0,332

0,000 0,100 0,200 0,300 0,400 0,500

3

6

7

8

11

Proteingehalt Permeat (g)

pH

-Wer

t

Proteinmenge (g) Permeat - mit NaCl Proteinmenge (g) Permeat - ohne NaCl

Ergebnisse

125

Permeat-Proteingehalt mPer (p < 0,05). Der höchste Permeat-Proteingehalt wurde bei pH 6

(0,474 ± 0,018 g) festgestellt.

Eine Fraktionierung unter Zusatz von NaCl resultierte für die Retentat-Fraktion nicht in

signifikant unterschiedlichen Proteingehalten mRet (p > 0,05). Der höchste Proteingehalt mRet

wurde hierbei für pH 11 (0,177 ± 0,044 g), der niedrigste für pH 3 (0,112 ± 0,010 g) und 7

(0,112 ± 0,015 g) festgestellt

Die Proteingehalte der Permeatfraktion mPer lagen im Bereich zwischen 0,332 ± 0,051 g (pH

11) und 0,429 ± 0,008 g (pH 7). Für diese pH-Stufen konnten signifikante Unterschiede

ermittelt werden (p < 0,05). Die Proteingehalte der weiteren unter Zusatz von 150 mM NaCl

gewonnenen Permeatfraktionen unterschieden sich nicht signifikant (p > 0,05). Im Vergleich

zu einer Fraktionierung ohne den Zusatz von 150 mM NaCl wurden im Permeat durchweg

geringere Proteingehalte festgestellt.

Die Erhöhung der Ionenstärke (durch Zusatz von 150 mM NaCl) führte jedoch lediglich für pH

6 zu signifikant geringerem Proteingehalt im Permeat (p < 0,05) (pH 6 (ohne NaCl): 0,474 ±

0,018 g, pH 6 (mit NaCl): 0,420 ± 0,019 g). Die weiteren pH-Stufen unterschieden sich nicht

signifikant (p > 0,05).

Wiederfindungsrate:

Die Wiederfindungsrate, dargestellt in Tabelle 33, lag bei der Fraktionierung von Algen-

Hydrolysat ohne NaCl-Zusatz zwischen 68, 64 ± 4,18 % (pH 3) und 77,11 ± 1,58 % (pH 6).

Der pH-Wert beeinflusste die WFR nicht signifikant (p> 0,05). Ein Großteil der

Molekülverbindungen (46,06 ± 5,43 % (pH 11) – 63,14 ± 2,42 % (pH 6)) passierte die

Membran. Die Transmission der Molekülverbindungen durch die Membran unterschied sich

für pH 11 signifikant von den pH-Stufen 6 und 7 (p < 0,05). Eine Fraktionierung bei pH 11

führte zu einer Verringerung des Proteinanteils im Permeat (pH 11: 46,06 ± 5,43 %, pH 6:

63,14 ± 2,42 %, pH 7: 60,14 ± 3,99 %) bei gleichzeitigem Anstieg des Gehalts im Retentat (pH

11: 24,61 ± 3,92 %, pH 3: 12,47 ± 1,04 %, pH 6: 13,96 ± 0,8 %, pH 7: 13,85 ± 1,30 %).

Für den Fraktionierungsprozess unter Zusatz von 150 mM NaCl wurde Vergleichbares

beobachtet. Die Wiederfindungsrate lag zwischen 67,83 ± 12,66 % (pH 11) und 73,51 ± 1,44

% (pH 6). Bis zu 32,17 % (pH 11) der Protein-Einwaage gingen folglich im

Fraktionierungsprozess verloren. 44,23 ± 6,77 % (pH 11) - 57,15 ± 1,12 % (pH 7) des im Feed

vorliegenden Proteins passierten die Membran. Abermals unterschieden sich lediglich die

Permeat-Proteinanteile der pH-Stufen pH 7 (57,15 ± 1,12 %) und pH 11 (44,23 ± 6,77 %).

Die Erhöhung der Ionenstärke resultierte nur für pH 6 (WFR (ohne NaCl): 77,11 ± 1,58 %,

WFR (mit NaCl): 73,51 ± 1,44 %) in einer signifikant niedrigeren WFR (p < 0,05). Die WFR

Ergebnisse

126

liegt bei einer Fraktionierung unter NaCl-Zusatz generell geringfügig unter der WFR bei einer

Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz (ausgenommen pH 3).

Tabelle 33: Wiederfindungsrate und Anteile der Retentat- und Permeat-Fraktion bei der Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

pH n


WFR

MW (%)

WFRRet MW

(%)

WFRPer MW

(%)

WFR MW

(%)

WFRRet MW

(%)

WFRPer MW

(%)

3 3 68,64 ±

4,18 a, 1

12,47 ±

1,04 b, c, 1

56,18 ±

3,20 a, c, 1

70,96 ±

5,26 a, 1

14,99 ±

1,32 a, 1

55,98 ±

4,25 a, c, 1

6 3 77,11 ±

1,58 a, 1

13,96 ±

0,89 b, c, 1

63,14 ±

2,42 b, c, 1

73,51 ±

1,44 a, 2

17,54 ±

2,41 a, 1

55,96 ±

2,58 a, c, 2

7 3 73,99 ±

5,19 a, 1

13,85 ±

1,30 b, c, 1

60,14 ±

3,99 b, c, 1

72,03 ±

1,15 a, 1

14,89 ±

1,98 a, 1

57,15 ±

1,12 b, c, 1

8 3 73,16 ±

4,00 a, 1

18,95 ±

6,22 a, c, 1

54,20 ±

5,08 a, c, 1

69,54 ±

6,55 a, 1

16,07 ±

1,78 a, 1

53,47 ±

5,36 a, c, 1

11 3 70,67 ±

9,12 a, 1

24,61 ±

3,92 a, 1

46,06 ±

5,43 a, 1

67,83 ±

12,66 a, 1

23,61 ±

5,91 a, 1

44,23 ±

6,77 a, 1


Weitere Daten zur Charakterisierung des Filtrationsprozesses:

Zur Charakterisierung des Filtrationsprozesses wurde die Permeatmenge VPer zum Zeitpunkt

t über die Prozesszeit tF aufgetragen und die Regressionsfunktion der Permeatzunahme,

sowie deren Bestimmtheitsmaß R2 ermittelt. Darüber hinaus wurde der mittlere pH-Wert des

Retentats ermittelt, um etwaige pH-Wert-abhängige Effekte beurteilen zu können. Die

Ergebnisse sind in Tabelle 34 dargestellt.

Ergebnisse

127

Tabelle 34: Bestimmtheitsmaß R2 und pH-Mittelwert, -Minima und -Maxima der Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

pH n


R2 pH

R2 pH

MW Min Max MW Min Max

3 3 0,984 ±

0,002

3,11 ±

0,03

3,01 ±

0,01

3,12 ±

0,04

0,983 ±

0,003

3,21 ±

0,09

3,00 ±

0,01

3,25 ±

0,11

6 3 0,991 ±

0,004

6,23 ±

0,06

6,02 ±

0,03

6,41 ±

0,08

0,986 ±

0,008

6,27 ±

0,09

6,02 ±

0,01

6,45 ±

0,13

7 3 0,998 ±

0,003

7,13 ±

0,08

7,02 ±

0,01

7,29 ±

0,11

0,990 ±

0,003

7,11 ±

0,06

7,01 ±

0,00

7,18 ±

0,12

8 3 0,986 ±

0,002

7,84 ±

0,26

7,60 ±

0,34

8,01 ±

0,04

0,984 ±

0,005

7,73 ±

0,14

7,51 ±

0,24

8,02 ±

0,01

11 3 0,980 ±

0,008

11,00 ±

0,04

10,96

± 0,04

11,05

± 0,02

0,964 ±

0,012

10,96

± 0,01

10,92 ±

0,02

11,01 ±

0,01

Legende: Bestimmtheitsmaß, R2. Arithmetischer Mittelwert, MW. Minimum, Min. Maximum, Max.

Die Zunahme der Permeatmenge VPer entsprach, unabhängig vom pH-Wert, sowohl bei einer

Fraktionierung unter Zugabe von NaCl als auch ohne NaCl-Zusatz den Kriterien einer linearen

Funktion, gemessen am Bestimmtheitsmaß R2 der Regressionsgeraden (Min (ohne NaCl):

0,980 ± 0,008 (pH 11), Max (ohne NaCl): 0,998 ± 0,003 (pH 7); Min (mit NaCl): 0,964 ± 0,012

(pH 11), Max (mit NaCl): 0,990 ± 0,003 (pH 7)).

Der pH-Wert des Retentats blieb, unabhängig von der untersuchten pH-Stufe, über die Dauer

der Filtration für die Fraktionierung mit und ohne NaCl-Zusatz weitestgehend konstant. Die

größte Abweichung zwischen pH-Minima und pH-Maxima wurde bei pH 8 festgestellt (∆pH

(ohne NaCl): 0,41, ∆pH (mit NaCl): 0,51).



Permeatproben durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind nachfolgend dargestellt.

Abbildung 85 - Abbildung 89 zeigen die Chromatogramme nicht-fraktionierter Algen-

Hydrolysat-Proben (Nullproben) nach der Vorfiltration. Die Nullproben wiesen pH- und

ionenstärke-abhängige Unterschiede auf.

Bei extremen pH-Werten (pH 3, pH 11) ohne Zusatz von NaCl resultierte die Vorfiltration in

einer Abtrennung großer Moleküle, sodass für pH 3 und pH 11 nur ein geringer Anteil an

Molekülen ≥ 10 kDa bzw. ≥ 20 kDa im Feed verblieben (Abbildung 85 a, Abbildung 89 a). Auch

bei pH 8 wurden Moleküle ≥ 20 kDa durch die Vorfiltration reduziert, jedoch weitaus wenig

Ergebnisse

128

drastisch als für die untersuchten Extrem-pH-Werte (Abbildung 88 a). Die Nullproben der pH-

Stufen 6 und 7 verfügen über eine breite Verteilung unterschiedlicher Molekülstrukturen

(Abbildung 86 a, Abbildung 87 a).

Durch Zusatz von NaCl konnte der Anteil an Molekülen ≥ 20 kDa für pH 3 (Abbildung 85 b)

und pH 8 (Abbildung 88 b) deutlich erhöht werden. Lediglich bei pH 9 (Abbildung 89 (b) wurde

weiterhin ein Großteil der Strukturen ≥ 10 kDa bzw. ≥ 20 kDa aus dem Feed abgetrennt.

Ergebnisse

129

Abbildung 85: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Nullprobe für die Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, a) ohne NaCl b) mit NaCl, qualitative Darstellung


a) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Nullprobe, ohne NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Nullprobe, mit NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa 670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ



Ergebnisse

130




670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ



Legende:





Legende:





qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Ergebnisse

131



670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





Legende:





qu

alit

ativ

qu

alit

ativ

Ergebnisse

132

In Abbildung 90 - Abbildung 94 sind die Chromatogramme von Retentat- und Permeat-

Fraktionen des Algen-Hydrolysats dargestellt.

Bei der Betrachtung der Chromatogramme der Retentat-Fraktion wird, weitestgehend

unabhängig vom pH-Wert, deutlich, dass neben Molekülverbindungen im Zielbereich auch

eine große Menge an Strukturen ≤ 1,35 kDa vorhanden sind (Abbildung 90 a, c - Abbildung 94

a, c). Diese konnten trotz der Verwendung des Diafiltrationsverfahrens auch im Falle der

Fraktionierung hydrolysierter Alge nicht aus der Retentat-Fraktion ausgewaschen werden.

Des Weiteren sind Molekülstrukturen ≥ 20 kDa bei Fraktionierungen ohne NaCl-Zusatz stark

unterrepräsentiert, obwohl in den Nullproben, mit Ausnahme von pH 3 und pH 11, Strukturen

≥ 158 kDa nachgewiesen werden konnten (Abbildung 90 a - Abbildung 94 a).

In den unter NaCl-Zusatz bei erhöhter Ionenstärke gewonnenen Retentat-Fraktionen konnten

insbesondere bei pH 3 (Abbildung 90 c) und pH 6 (Abbildung 91 c), sowie in geringem Umfang

auch bei pH 8 (Abbildung 93 c) Molekülverbindungen ≥ 20 kDa konzentriert werden.

Anhand der Permeat-Fraktionen ist sowohl für die Fraktionierung unter Zusatz von 150 mM

NaCl, als auch für die Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz eine deutliche Verschiebung der

Membrantrenngrenze hin zu einem niedrigeren MWCO erkennbar (Abbildung 90 b, d -

Abbildung 94 b, d). Molekülverbindungen ≥ 5 – 10 kDa sind unabhängig von pH-Wert und

Ionenstärke nicht, oder nur in verschwindend kleinen Anteilen nachweisbar (pH 7: Abbildung

92 d, pH 8: Abbildung 93 d). Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind stark repräsentiert.

Ergebnisse

133

Abbildung 90: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktion von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) in Abhängigkeit der Ionenstärke, pH 3, a) Retentat ohne NaCl b) Permeat ohne NaCl c) Retentat mit NaCl d) Permeat mit NaCl, qualitative Darstellung

a) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Retentat, ohne NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Permeat, ohne NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

c) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Retentat, mit NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

d) Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, Permeat, mit NaCl

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

134



670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

135


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

136


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

137


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

138

4.3.3 Einfluss der Ultraschall-Anwendung

Die Verwendung von Ultraschall hat sich bei der Optimierung von Filtrationsprozessen intakter

Proteine, besonders bei Crossflow-Systemen, als vielversprechend erwiesen. Die

fluxsteigernde Wirkung des Ultraschalls wird dabei auf eine Reduktion von

Konzentrationspolarisation und eine Abschwächung von Fouling durch Aufbrechen der

Deckschicht zurückgeführt (Kobayashi et al., 1999; Lamminen, Walker, & Weavers, 2004;

Muthukumaran et al., 2004).

In dieser Studie wurde der Einfluss von Ultraschall (35 kHz) auf den Prozessparameter

Permeatflux JFm, sowie auf die Trennschärfe der Fraktionierung für hydrolysiertes

Molkenprotein-Isolat untersucht. Abweichend zu den Hauptversuchen wurden für diese

Versuchsreihe zwei mit Polyethersulfon (PES) Membranen ausgestattete Crossflow-

Filtrationskammer (Vivaflow 50, Sartorius AG, Göttingen, GER) mit einer Trenngrenze von 100

kDa verwendet. Die Konzentration des vorfiltrierten Feeds (pH 7) aus hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat (Thermax 690, Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) lag bei 0,30 % (w/v).

Versuchsaufbau und Durchführung sind in Kapitel 3.2.2.2 (Seite 56) ausführlich beschrieben.

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 35 und Abbildung 95 – Abbildung 97 dargestellt.

Permeatflux JFm:

Tabelle 35: Laufzeit tFm, Permeatflux JFm und absolute Proteingehalte der Retentat- und Permeat-Fraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der Anwendung von Ultraschall

Probe n Laufzeit tFm MW (min)

Flux JFm MW

(ml/min) mRet MW (mg) mPer MW (mg)

Fraktionierung ohne Ultraschall

6 67,02 ± 15,55 a

6,38 ± 1,61 a

94,63 ± 9,14 a 183,78 ± 17,13 a

Fraktionierung mit Ultraschall

6 77,71 ± 27,40 a

5,81 ± 2,36 a

89,50 ± 10,03 a 187,24 ± 19,96 a

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Die Anwendung von Ultraschall resultierte in einem geringeren Permeatflux JFm bei gleichzeitig

hoher Standardabweichung (JFmUS: 5,81 ± 2,36 ml/min; JFmOUS: 6,38 ± 1,61 ml/min) (Abbildung

95). Eine signifikanter Unterschied hinsichtlich des Permeatflux konnte zwischen den

Fraktionierungsprozessen mit und ohne Ultraschall-Anwendung nicht festgestellt werden (p >

0,05).

Ergebnisse

139

Abbildung 95: Permeatflux JFm von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung


Retentat- und Permeat-Fraktion unterschieden sich hinsichtlich der Proteingehalte der

Fraktionen mRet/mPer nicht signifikant (p > 0,05) (mRetUS: 89,50 ± 10,03 mg; mRetOUS: 94,63 ±

9,14 mg; mPerUS: 187,24 ± 19,96 mg; mPerOUS: 183,78 ± 17,13 mg). Im Falle der Ultraschall-

Anwendung wurden geringfügig niedrigere Proteingehalte im Retentat und geringfügig höhere

Proteingehalte im Permeat festgestellt (Abbildung 96, Abbildung 97).

Abbildung 96: Absolute Proteinmenge der Retentat-Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung

Abbildung 97: Absolute Proteinmenge der Permeat-Fraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat n in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung

Wiederfindungsrate:

Die Wiederfindungsrate, dargestellt in Tabelle 36, lag bei der Fraktionierung von

Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat, in Abhängigkeit einer Ultraschall-Anwendung, zwischen

6,385,81

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Flux (ml/min)

Flux (ml/min) - mit US Flux (ml/min) - ohne US

94,6389,50

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

Proteingehalt (mg)

Protein Retentat (mg) - mit US Protein Retentat (mg) - ohne US

183,78187,24

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Proteingehalt (mg)

Protein Permeat (mg) - mit US Protein Permeat (mg) - ohne US

Ergebnisse

140

92,24 ± 7,65 % (mit US) und 92,80 ± 8,39 % (ohne US). 29,83 ± 3,34 % (mit US) - 31,54 ±

3,05 (ohne US) des Proteinanteils lagen im Retentat, 61,26 ± 5,71 % (ohne US) - 62,41 ± 6,65

% (mit US) im Permeat vor.

Tabelle 36: Wiederfindungsrate und Anteile der Retentat- und Permeat-Fraktion bei der Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der Anwendung von Ultraschall

Probe n WFR MW (%) WFRRet MW (%) WFRPer MW (%)

Fraktionierung mit Ultraschall 6 92,24 ± 7,65 a 29,83 ± 3,34 a 62,41 ± 6,65 a

Fraktionierung ohne Ultraschall 6 92,80 ± 8,39 a 31,54 ± 3,05 a 61,26 ± 5,71 a

Werte in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b unterschieden sich signifikant (p < 0,05).



Permeatproben durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen sind in Abbildung 98 dargestellt.

Die Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktionen wiesen in Abhängigkeit der

Ultraschall-Anwendung keine deutlichen Unterschiede auf. In den Retentat-Fraktionen (rot)

wurden Molekülverbindungen ≥ 20 kDa in beiden Fällen aufkonzentriert. In den Permeat-

Fraktionen (grün) konnte eine Trenngrenzverschiebung des MWCO der Membran hin zu

einem deutlich niedrigeren MWCO beobachtet werden, sodass nur eine geringe

Molekülmenge ≥ 10 kDa in den Permeat-Fraktionen verblieb.

Strukturen ≤ 1,35 kDa sind in beiden Fraktionen stark repräsentiert und stellen, besonders in

den Permeatfraktionen, eine Großteil der Fraktion dar.

Die Performance der Vivaflow-Filtrationskammern veränderte sich im Versuchsprozess nicht

(beispielhaft dargestellt anhand der Chromatogramme von Versuchswiederholung 1 und

Versuchswiederholung 5; Abbildung 98).

Ergebnisse

141

Abbildung 98: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat in Abhängigkeit der Anwendung von Ultraschall, pH 7, a) Retentat & Permeat ohne US, Wdh. 1 b) Retentat & Permeat mit US, Wdh. 1 c) Retentat & Permeat ohne US, Wdh. 5 d) Retentat & Permeat mit US, Wdh. 5, qualitative Darstellung

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Molkenprotein-Isolat, pH 7, ohne US, Whd. 5

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

c) Molkenprotein-Isolat, pH 7, mit US, Wdh. 1

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

d) Molkenprotein, pH 7, mit US, Wdh. 5

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

a) Molkenprotein-Isolat, pH 7, ohne US, Whd. 1

158 kDa

Legende:





(Retentat)

grün: hydrolysiertes Molkenprotein

(Permeat)

qu

alit

ativ

Legende:





(Retentat)


(Permeat)

qu

alit

ativ

Legende:





(Retentat)


(Permeat)

qu

alit

ativ

Legende:





(Retentat)


(Permeat)

qu

alit

ativ

Ergebnisse

142

4.3.4 Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose

Neben synthetischen Polyethersulfon Membranen finden auch Filtermedien aus regenerierter

Cellulose Anwendung in der Proteinaufreinigung (Walter et al., 2012). In einem Pilotversuch

wurde untersucht, ob die Nutzung von RC-Membranen in einer Verbesserung der

Trennleistung resultiert.

Abweichend zu den Hauptversuchen wurde für diese Versuchsreihe eine mit Membranen aus

regenerierter Cellulose (RC) ausgestattete Crossflow-Filtrationskammer (Vivaflow 50,

Sartorius AG, Göttingen, GER) mit einer Trenngrenze von 100 kDa genutzt. Die Konzentration

des vorfiltrierten Feeds (pH 9) aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Thermax 690, Glanbia

Nutritionals Ltd., IRL) lag bei 0,15 % (w/v). Versuchsaufbau und Durchführung sind in Kapitel

3.2.2.3 (Seite 58) beschrieben.

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 37 und Abbildung 99 dargestellt.

Abbildung 99: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat unter Verwendung einer RC-Membran, pH 9, a) Retentat, b) Permeat, qualitative Darstellung

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Molkenprotein-Isolat, pH 9, Permeat

670 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

a) Molkenprotein-Isolat, pH 9, Retentat

158 kDa

Molkenprotein-Isolat, pH 9, Nullprobe

Legende:





qu

alit

ativ

Legende:





qu

alit

ativ

Ergebnisse

143

Bei der Betrachtung der Chromatogramme der Retentat-Fraktion, dargestellt in Abbildung 99

a, wird abermals deutlich, dass neben Molekülverbindungen im Zielbereich auch eine große

Menge an Strukturen ≤ 1,35 kDa vorhanden sind. Ähnlich den Fraktionierungsprozessen unter

Verwendung von PS/PES-Membranen konnten in der Retentat-Fraktion Molekülverbindungen

≥ 20 kDa aufkonzentriert werden.

Anhand des Chromatogramms der Permeat-Fraktionen ist ebenfalls eine deutliche

Verschiebung der Membrantrenngrenze hin zu einem niedrigeren MWCO erkennbar

(Abbildung 99 b). Nur ein geringer Anteil an Verbindungen ≥ 20 kDa passierte die Membran.

Nähert man sich der nominalen Trenngrenze der Membran an, nimmt der Anteil weiter ab.

Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind in beiden Fraktionen stark repräsentiert.

Die Wiederfindungsrate lag bei 109,96 ± 17,00 %. 38,22 ± 7,28 % des Proteins lagen im

Retentat und 71,74 ± 10,27 % im Permeat vor. Die erhöhte WFR ist, unter Berücksichtigung

der Stammdaten, auf einen Ausreißer zurückzuführen, der den hier dargestellten Mittelwert

beeinflusst. Zudem können geringfügige Einwaagefehler aufgrund der geringen

Einwaagemenge von wenigen mg an dieser Stelle in einem erhöhten Endproteingehalt des

Feeds und somit höheren Proteingehalten in Retentat und Permeat resultieren.

Tabelle 37: Laufzeit tFm, Permeatflux JFm und absolute Proteingehalte der Retentat- und Permeat-Fraktion von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

Probe n Laufzeit tFm

MW (min)

Flux JFm MW

(ml/min) mRet MW (mg) mPer MW (mg)

Fraktionierung –

RC Membran 3 48,85 ± 10,07 8,46 ± 1,60 57,33 ± 10,92 107,61 ± 15,41

Ergebnisse

144

4.3.5 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed

Um die Möglichkeit zu untersuchen, ob Moleküle < 2 kDa aus dem vorfiltrierten Feed

abgetrennt werden können, wurden Dialyseversuche unter Variation des Initial-pH-Werts,

sowie der Dialysedauer durchgeführt. Unter Initial-pH wird der pH-Wert der Dialyseprobe

verstanden, der zu Beginn des Dialyseprozess, sowie bei Wechsel der Dialyselösung

eingestellt wurde. Darüber hinaus sollte durch Überprüfung verschiedener Feed-

Konzentrationen festgestellt werden, ob die Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle aus dem

vorfiltrierten Feed (Nullprobe) geeignet ist, da durch Adsorption von Molekülen in den Poren

der Membran die nominale Trenngrenze einer Membran herabgesetzt werden kann, sodass

zunehmend auch niedermolekulare Partikel zurückgehalten werden können (Wang &

Tarabara, 2008; Marshall et al., 1993). Die Dialyselosung „destilliertes Wasser“ wurde mit dem

Hintergrund gewählt, das Feed frei von den zur Herstellung von Dialysepuffern üblichen

Salzen, Aminen und ähnlichen Zusätzen mit Pufferwirkung zu halten, die eine Aufreinigung

des Retentats vor einem nachfolgenden Fraktionierungsprozess notwendig machen würden.

Tabelle 38: Absoluter Proteingehalt der Dialyseproben (Retentat) von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor (mvD) und nach (mnD) der Dialyse in Abhängigkeit von pH-Wert, Konzentration und Dialysedauer

pH n Dauer tDL

(h)

Konzentration CF

(%) mvD MW (mg) mnD MW (mg)

3 3 24 1 24,57 ± 0,29 c, 1 23,46 ± 0,80 a, 1

5 3 24 1 19,85 ± 0,38 a, 1 9,92 ± 0,27 c, 2

6 3 24 1 26,98 ± 0,73 b, 1 16,77 ± 0,38 b, 2

7,5 3 24 1 26,02 ± 0,49 b, c, 1 16,39 ± 0,74 b, 2

9 3 24 1 26,61 ± 0,50 b, 1 15,62 ± 0,57 b, 2

11 3 24 1 28,32 ± 1,06 b, 1 15,52 ± 0,36 b, 2

9 3 24 2 51,88 ± 0,39 a, α, 1 21,54 ± 1,71 a, α, 2

11 3 24 2 53,02 ± 0,13 b, α, 1 27,37 ± 1,04 b, α, 2

9 3 48 2 47,32 ± 1,27 a, β, 1 13,29 ± 0,68 a, β, 2

11 3 48 2 48,02 ± 1,48 a, β, 1 18,79 ± 1,41 b, β, 2

9 3 24 4 92,53 ± 0,24 a, 1 53,14 ± 2,97 a, 2

11 3 24 4 99,42 ± 0,72 b, 1 47,85 ± 1,22 b, 2

Werte einer Konzentration (%) & Dauer (h) in einer Spalte mit unterschiedlichen Buchstaben a, b, c unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte einer Konzentration (%) und eines pH mit unterschiedlicher Dauer (h) mit unterschiedlichen Symbolen α, β unterschieden sich signifikant (p < 0,05). Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Die Ergebnisse der Studie sind in Tabelle 38, sowie Abbildung 101 – Abbildung 110 dargestellt.

Aufgrund von Peptid-Ausflockung bei Konzentrationen ≥ 2 % im Bereich pH 3 – pH 7,5 wurden

Ergebnisse

145

die Untersuchungen für Konzentrationen ≥ 2 % nur für die Initial-pH-Stufen 9 und 11

durchgeführt.

pH-Wert & Dialysezeit tDL:

Initial-pH-bedingt konnten bei einer Konzentration von 1 % (w/v) und einer Prozessdauer tDL

von 24 h signifikant unterschiedliche Proteingehalte der Nullprobe mvD (p < 0,05) für pH 3

(24,57 ± 0,29 mg) und pH 5 (19,85 ± 0,38 mg) im Vergleich zu den weiteren Initial-pH-Stufen

(für Vergleich pH 3: ausgenommen pH 7,5) festgestellt werden, wobei bei pH 5 (19,85 ± 0,38

mg) die geringste und bei pH 11 (28,32 ± 1,06 mg) die höchste Proteinmenge der Nullprobe

festgestellt wurde.

Für die Konzentrationen 2 % (w/v) und 4 % (w/v), 24 h wurden ebenfalls signifikant

unterschiedliche Proteingehalte des Feed „vor Dialyse“ (p < 0,05) in Abhängigkeit des Initial-

pH-Werts ermittelt (2% (w/v): pH 9: 51,88 ± 0,39 mg; pH 11: 53,02 ± 0,13 mg; 4 % (w/v): pH

9: 92,53 ± 0,24 mg; pH 11: 99,42 ± 0,72 mg).

In den Fraktionen „nach Dialyse“ wurden vergleichbare Effekte beobachtet. Der Proteingehalt

mnD unterschied sich für die pH-Werte pH 3 (23,46 ± 0,80 mg) und pH 5 (9,92 ± 0,27 mg)

signifikant von den weiteren Initial-pH-Stufen (p < 0,05). Hierbei wird deutlich, dass bei pH 3

beinahe die gesamte Proteinmenge im Retentat verblieb. Die geringste Proteinmenge „nach

Dialyse“ wurde bei pH 5 (9,92 ± 0,27 mg), die höchste bei pH 3 (23,46 ± 0,80 mg) festgestellt.

Eine Verdopplung der Dialysezeit auf 48 h führte für die Initial-pH Stufen 9 und 11, im Vergleich

zu 24 h, zu signifikant geringeren Proteingehalten mnD der Proben „nach Dialyse“ (p < 0,05)

(pH 9, 48 h: 13,29 ± 0,68 mg vs. pH 9, 24 h: 21,54 ± 1,71 mg; pH 11, 48 h: 18,79 ± 1,41 mg

vs. pH 11, 24 h: 27,37 ± 1,04 mg). Allerdings konnten hier bereits beim Vergleich der

Nullproben (mvD 24 h vs. mvD 48 h) signifikante Unterschiede (p < 0,05) festgestellt werden (pH

9, 48 h: 47,32 ± 1,27 mg; pH 9, 24 h: 51,88 ± 0,39 mg; pH 11, 48 h: 48,02 ± 1,48 mg; pH 11,

24 h: 53,02 ± 0,13 mg).

Für alle Initial-pH-Stufen und Konzentrationen (ausgenommen pH 3, 1 % (w/v)) führte die

Dialyse der Proben bei einer Prozessdauer von 24 h und 48 h zu einem signifikant niedrigerem

Proteingehalt mnD der Proben „nach Dialyse“ im Vergleich zu den Nullproben (p < 0,05).


Die Chromatogramme ermöglichen eine nähere Beurteilung der Dialysevorgänge. Die

Nullprobe „vor Dialyse“ ist rot, das Retentat „nach Dialyse“ grün dargestellt. In Abbildung 101

- Abbildung 105 sind die Daten qualitativ, in Abbildung 106 - Abbildung 110 quantitativ

abgebildet.

Ergebnisse

146

Unabhängig vom Initial-pH-Wert führte der Dialyseprozess zu einer Abtrennung von Molekülen

≤ 1,35 kDa bei gleichzeitigem Rückhalt von Molekülen ≥ 20 kDa im Retentat. Dies wird

insbesondere aus den quantitativen Daten ersichtlich (Abbildung 106 - Abbildung 110). Im

Falle des Versuchs 1% (w/v), pH 3, 24 h wurde im Retentat „nach Dialyse“ ein über den

Ausgangsgehalt der Nullprobe erhöhter Anteil an Molekülstrukturen im Bereich > 20 kDa

festgestellt (Abbildung 106 a). Molekülverbindungen im Bereich ≤ 1,35 kDa sind pH-

unabhängig trotz einem MWCO von 2 kDa weiterhin in den dialysierten Probe vorhanden,

konnten jedoch deutlich reduziert werden (Abbildung 106 - Abbildung 110).

Die Abtrennung bzw. Reduzierung des Gehalts an Molekülen ≤ 2 kDa ist bis zu einer Feed-

Konzentration von 4 % möglich (vergleiche: Abbildung 107, Abbildung 108 & Abbildung 110).

Bei höherer Feed-Konzentration scheint die Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) zudem

deutlicher ausgeprägt (vergleiche: Abbildung 107, Abbildung 108 & Abbildung 110).

Eine Steigerung der Dialysezeit von 24 h auf 48 h führte nicht zu einer weiteren Reduktion von

kleinen Molekülen (< 2 kDa) im Retentat „nach Dialyse“, sondern zu einer anteiligen

Verringerung von Molekülstrukturen > 2 kDa (vergleiche: Abbildung 109 & Abbildung 110).

Dies ist vermutlich auf eine Deckschichtbildung an der Membraninnenseite bei Dialysezeiten

> 24 h zurückzuführen die zur Ausflockung von Peptid-Verbindungen führte (Abbildung 100).

Die deutlich niedrigeren Proteingehalte mnD „nach Dialyse“ im Vergleich zum 24-stündigen

Dialyseprozess bestärken die Annahme (pH 9, 48 h: 13,29 ± 0,68 mg vs. pH 9, 24 h: 21,54 ±

1,71 mg; pH 11, 48 h: 18,79 ± 1,41 mg vs. pH 11, 24 h: 27,37 ± 1,04 mg).

Abbildung 100: Ausflockung einer Dialyseprobe (pH 9, 48 h)

Ergebnisse

147

Abbildung 101: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 3, 1 %, 24 h, b) pH 5, 1 %, 24 h, c) pH 6, 1 %, 24 h, d) pH 7,5, 1 %, 24 h, qualitative Darstellung

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

a) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 3, 24 h

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 5, 24 h

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

c) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 6, 24 h

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

d) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 7,5, 24 h

158 kDa

Legende:





(Nullprobe „vor Dialyse“)

grün: hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat

(Retentat „nach Dialyse“)

qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Ergebnisse

148

Abbildung 102: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 9, 1 %, 24 h, b) pH 11, 1 %, 24 h, qualitative Darstellung


670 kDa

44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Ergebnisse

149

Abbildung 104: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts a) pH 9, 2 %, 48 h, b) pH 11, 2 %, 48 h, qualitative Darstellung


44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

44 kDa

1,35 kDa

b) Molkenprotein- Isolat 2 %, pH 11, 48 h 158 kDa

670 kDa 670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

44 kDa

1,35 kDa


158 kDa

670 kDa 670 kDa


Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Legende:








qu

alit

ativ

Ergebnisse

150

Abbildung 106: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 3, 1 %, 24 h, b) pH 5, 1 %, 24 h, c) pH 6, 1 %, 24 h, d) pH 7,5, 1 %, 24 h, quantitative Darstellung



c) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 6, 24 h

d) Molkenprotein- Isolat 1 %, pH 7,5, 24 h

Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

Ergebnisse

151

Abbildung 107: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts, a) pH 9, 1 %, 24 h, b) pH 11, 1 %, 24 h, quantitative Darstellung




Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv



Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

44 kDa

1,35 kDa

158 kDa

670 kDa

Ergebnisse

152

Abbildung 109: Molekülgrößenverteilung – SE-HPLC-Chromatogramme der Retentatfraktionen von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vor und nach Dialyse in Abhängigkeit des pH-Werts a) pH 9, 2 %, 48 h, b) pH 11, 2 %, 48 h, quantitative Darstellung






Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

Legende:








qu

an

tita

tiv

Ergebnisse

153

4.4 Sensorik

Im Rahmen der Studie sollten die durch Crossflow-Diafiltration gewonnenen Fraktionen auf

vorhandene Geschmacksqualitäten („süß“, „sauer“, „salzig“, „bitter“, „umami“) überprüft

werden. Besonderes Augenmerk lag hierbei zudem auf einer den „bitter“-Geschmack

hemmenden Eigenschaft bestimmter Peptidfraktionen.

Nachfolgend sind die Ergebnisse der Sensorik Schulung, die daraus hervorgehende Auswahl

der Prüfer, sowie die Erkenntnisse der sensorische Bewertung der Peptidfraktionen

dargestellt. Die Auswahl der Prüfer basiert, gestützt durch statistische Verfahren, auf den

Ergebnisse der Skalenschulung. Ziel war die Zusammenstellung eines homogenen Panels für

jede Grundgeschmacksart. Aufgrund eines Abbruchs der Teilnahme an der Schulung erfolgt

die Auswertung für 23 Prüfpersonen.

4.4.1 Schulung des Sensorik-Panels

4.4.1.1 Prüfung auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Die Prüfung auf Geschmacksblindheit diente zur Gewinnung einer Übersicht hinsichtlich des

Ist-Zustands des Panels und wurde nicht als Ausschlusskriterium gewertet. Gemäß DIN EN

ISO 8586:2014 müssen mindestens 80 % der Proben richtig erkannt werden, um als Prüfer

zugelassen zu werden (DIN Deutsches Institut für Normung e.V., 2014b). Die Ergebnisse der

Prüfung sind in Tabelle 39 dargestellt.

Das Prüfziel von 80 % richtigen Zuordnungen wurde von 22 der 23 Prüfer erreicht. In einem

Fall (Prüfer 7) wurden nur 70 % der Proben richtig erkannt. Zu fehlerhaften Zuordnungen kam

es überwiegend durch nicht-erkennen der „bitter“-Proben.

Ergebnisse

154

Tabelle 39: Ergebnisse des Tests auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Nr. Geschmack erkannt % Nr. Geschmack erkannt % Nr. Geschmack erkannt %

0 Ausschluss aufgrund von

Schulungsabbruch 8

süß 3/3

100 16

süß 3/3

90

sauer 1/1 sauer 1/1

salzig 1/1 salzig 1/1

bitter 3/3 bitter 2/3

umami 2/2 umami 2/2

1

süß 3/3

90 9

Süß 3/3

90 17

süß 3/3

100

sauer 1/1 sauer 1/1 sauer 1/1

salzig 1/1 salzig 1/1 salzig 1/1

bitter 2/3 bitter 2/3 bitter 3/3

umami 2/2 umami 2/2 umami 2/2

2

süß 3/3

100 10

Süß 3/3

100 18

süß 3/3

100





3

süß 3/3

100 11

Süß 3/3

100 19

süß 3/3

100





4

süß 3/3

80 12

süß 3/3

100 20

süß 3/3

100





5

süß 3/3

100 13

süß 3/3

80 21

süß 3/3

100





6

süß 2/3

90 14

süß 3/3

100 22

süß 3/3

100





7

süß 3/3

70 15

süß 3/3

80 23

süß 3/3

100





4.4.1.2 Prüfung zur Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Um festzustellen, ob die Prüferpersonen überschwellige Geschmacksreize von Blindproben

erkennen und einem Grundgeschmack zuordnen können, wurde gemäß DIN EN ISO

8586:2014 eine Dreiecksprüfung nach DIN EN ISO 4120:2007 durchgeführt. Die Prüfperson

sollte nach mehreren Wiederholungen des Tests in der Lage sein überschwellige Proben von

Blindproben zu unterscheiden und den Geschmacksreiz einem Grundgeschmack zuzuordnen

(DIN Deutsches Institut für Normung e.V., 2014b). Die Ergebnisse des Tests (Tabelle 40-

Tabelle 43) wurden zur Aufnahme des Ist-Zustands des Panels verwendete und führten nicht

zum Ausschluss.

Ergebnisse

155

Teilnehmer Geschmack Termin 1 Termin 2 Termin 3 % erkannt MW (%)

1

süß 1 1 1 100,00

60,00

sauer 0 1 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 0 0 0,00

umami 0 1 0 33,33

2

süß 1 1 1 100,00

80,00

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 0 1 1 66,67

3

süß 1 1 1 100,00

100,00

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 1 1 100,00

4

süß 1 1 1 100,00

66,67

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 0 0 0,00

umami 1 1 1 100,00

5

süß 1 1 0 66,67

80,00

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 0 0 33,33

6

süß 1 0 1 66,67

66,67

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 0 1 33,33

umami 0 1 0 33,33

Tabelle 40: Ergebnisse des Test zur Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Legende: 1, Ja (erkannt). 0, Nein (nicht erkannt). MW, arithmetischer Mittelwert.

Ergebnisse

156


7

süß 1 1 1 100,00

73,33

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 0 1 0 33,33

8

süß 1 1 0 66,67

73,33

sauer 0 1 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 0 0 1 33,33

9

süß 1 1 1 100,00

100,00

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 1 1 100,00

10

süß 1 1 1 100,00

80,00

sauer 0 1 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 0 1 66,67

umami 0 1 1 66,67

11

süß 1 1 1 100,00

100,00

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 1 1 100,00

12

süß 1 1 1 100,00

86,67

sauer 0 1 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 0 1 66,67

Tabelle 41: Ergebnisse des Test zur Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014) - Fortsetzung


Ergebnisse

157


13

süß 1 1 1 100,00

86,67

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 0 0 1 33,33

14

süß 1 1 1 100,00

93,33

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 0 1 66,67

15

süß 1 0 1 66,67

66,67

sauer 1 0 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 0 1 33,33

umami 1 0 1 66,67

16

süß 1 1 1 100,00

93,33

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 1 1 66,67

umami 1 1 1 100,00

17

süß 1 1 0 66,67

60,00

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 0 66,67

umami 0 0 1 33,33

18

süß 1 1 1 100,00

60,00

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 0 0 33,33

umami 1 0 0 33,33



Ergebnisse

158


19

süß 1 0 0 33,33

73,33

sauer 0 1 1 66,67

salzig 1 1 1 100,00

bitter 0 1 1 66,67

umami 1 1 1 100,00

20

süß 1 1 0 66,67

93,33

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 1 1 100,00

21

süß 1 1 1 100,00

80,00

sauer 0 0 1 33,33

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 0 66,67

umami 1 1 1 100,00

22

süß 1 1 1 100,00

93,33

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 1 1 100,00

umami 1 0 1 66,67

23

süß 1 1 1 100,00

86,67

sauer 1 1 1 100,00

salzig 1 1 1 100,00

bitter 1 0 0 33,33

umami 1 1 1 100,00



Ergebnisse

159

Zu mehrfach fehlerhaften Zuordnungen (33,33 % erkannt) kam es vor allem für die

Grundgeschmacksarten „umami“ (8 Fälle), „bitter“ (6 Fälle) und „sauer“ (6 Fälle). In einem Fall

wurde eine „süß“ Probe mehrfach nicht korrekt erkannt.

In Einzelfällen (66,67% erkannt) kam es für die Grundgeschmacksarten „umami“ (6 Fälle),

„süß“ (6 Fälle), „bitter“ (5 Fälle) und „sauer“ (5 Fälle) zu fehlerhaften Zuordnungen.

Tabelle 44: Gruppenauswertung des Test zur Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014)

Geschmack Mittelwert N (Prüfer)

„erkannt“

Mittelwert N (Prüfer)

„nicht erkannt“

Mittelwert

„% erkannt“

süß 19,33 ± 3,21 3,67 ± 3,21 84,06 ± 13,98

sauer 17,00 ± 5,57 6,00 ± 5,57 73,91 ± 24,21

salzig 23,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 100,00 ± 0,00

bitter 16,33 ± 1,15 6,67 ± 1,15 71,01 ± 5,02

umami 15,67 ± 2,08 7,33 ± 2,08 68,12 ± 9,05

Legende: N, Anzahl Prüfer.

Insgesamt erreichten 14 Prüfer ein Prüferergebnis ≥ 80 %, 3 Prüfer ≥ 73,33 % < 80 % und 6

Prüfer ≥ 60,00 % < 73,33 %. 3 Prüfer (3, 9, 11) konnten 100 % der Proben richtig zuordnen.

Die Grundgeschmacksarten „umami“, „bitter“ und „sauer“ bereiteten dem Panel die großten

Schwierigkeiten. Im Mittel wurden hier, dargestellt in Tabelle 44, 68,12 ± 9,05 % (umami) -

73,91 ± 24,21 % (sauer) der Prüflösungen korrekt wahrgenommen. Basierend auf

Rückmeldungen der Teilnehmer können die fehlerhaften Zuordnungen des Grundgeschmacks

„umami“ durch die Nähe zum Grundgeschmack „salzig“ herbeigeführt worden sein.

Die Wahrnehmung von „bitter“ verbesserte sich im Verlauf der drei Schulungstage nicht

wesentlich, wohingegen „umami“ und besonders „sauer“ am letzten Schulungstag zuverlässig

unterschieden werden konnten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 45 dargestellt.

Tabelle 45: Anteil der Prüferpersonen die eine Geschmacksausprägung erkennen – Verlauf der Schulung - Tag 1 – Tag 3

Geschmack

Tag 1

„% erkannt“

/ N (Prüfer)

Tag 2

„% erkannt“

/ N (Prüfer)

Tag 3

„% erkannt“

/ N (Prüfer)

sauer 52,17 / 12 69,57 / 16 100,00 / 23

bitter 73,91 / 17 65,22 / 15 73,91 / 17

umami 65,22 / 15 60,87 / 14 78,26 / 18

Legende: N, Anzahl Prüfer.

Ergebnisse

160

Das Gesamt-Panel wies zu jedem Zeitpunkt der Schulung eine signifikante

Unterscheidungsfähigkeit (p < 0,05) hinsichtlich aller Grundgeschmacksarten auf. Hierzu sind

bei einem Panel mit 23 Prüfern mindestens 12 korrekte Antworten nötig.

4.4.1.3 Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle (gemäß ISO 3972:2011)

Um Kenntnisse bezüglich der Erkennungsschwellen (ES) der Prüfer zu gewinnen, sowie die

Unterscheidungsfähigkeit des gesamten Panels abzubilden, wurden Reiz- und

Erkennungsschwelle der Prüfer gemäß ISO 3972:2011 unter Verwendung einer einfachen

beschreibende Prüfung nach DIN 10964:2014 ermittelt. Die Erkenntnisse sind in Abbildung

111 – Abbildung 115 und Tabelle 46 –Tabelle 50 dargestellt.

Ein abweichender Geschmacksreiz wurde von den Prüfern, weitestgehend unabhängig von

der Grundgeschmacksart, bereits bei geringen Probenkonzentrationen festgestellt. Die

Reizschwelle lag, ausgenommen „süß“ und „umami“, zwischen Probe 1 und Probe 2

(Abbildung 111 b - Abbildung 115 b; Tabelle 46 - Tabelle 50). Prüferspezifische Unterschiede

resultierten jedoch bei allen Grundgeschmacksarten in deutlichen Standardabweichungen

(Abbildung 111 a, b - Abbildung 115 a, b). Eine oder mehrere Prüferpersonen waren folglich

nicht in der Lage auch bei erhöhten Konzentrationen einen Geschmacksreiz wahrzunehmen.

Dies wurde auch bei der Betrachtung der jeweiligen Erkennungsschwellen deutlich. Während

„sauer“ und „bitter“ relativ früh benannt werden konnten (zwischen Probe 2 und Probe 3),

hatten die Prüfer großere Schwierigkeiten „salzig“, „umami“ und besonders „süß“ zu

identifizieren.

Die Unterscheidungsfähigkeit verschiedener Konzentrationen ist ebenfalls stark

prüferabhängig. Während einige Prüfer bereits geringe Änderungen der Probenkonzentration

zuverlässig unterscheiden konnten, wurde bei anderen eine mangelnde

Diskriminierungsfähigkeit festgestellt (Tabelle A17 – Tabelle A19, Anhang, Seite 322 – 324).

Dies führte besonders bei „salzig“ und „umami“ zu deutlichen Standardabweichungen. „süß“

wurde panelübergreifend erst bei relativ hohen Konzentrationen identifiziert.

Ergebnisse

161

„süß“:

Abbildung 111: Grafische Darstellung der a) Prüfersensibilität, b) Reiz- und Erkennungsschwelle „süß“

Tabelle 46: Reiz- und Erkennungsschwelle "süß"

Reizschwelle

(Probe) Reizschwelle MW (g/l)

Bereich der RS (g/l) Erkennungsschwelle

(Probe)

Erkennungsschwelle (g/l) Bereich der ES (g/l)

Min Max Mittelwert Median Min Max

2,43 ± 1,77 0,70 ± 0,44 0,28 1,85 4,87 ± 1,66 2,41 ± 1,89 2,19 0,79 8,54

Legende: RS, Reizschwelle. ES, Erkennungsschwelle. MW, Mittelwert.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

Bew

ertu

ng

Probe

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

1 2 3 4 5 6 7 8

Ko

nze

ntr

atio

n (

g/l)

Probe

Konzentrationsverlauf Reizschwelle Erkennungsschwelle

a) b)

Ergebnisse

162

„sauer“:

Abbildung 112: Grafische Darstellung der a) Prüfersensibilität, b) Reiz- und Erkennungsschwelle „sauer“

Tabelle 47: Reiz- und Erkennungsschwelle "sauer"

Reizschwelle

(Probe) Reizschwelle (g/l)


(Probe)



1,28 ± 0,98 0,14 ± 0,02 0,10 0,17 2,04 ± 1,17 0,16 ± 0,02 0,16 0,12 0,20


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

Bew

ertu

ng

Probe

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

1 2 3 4 5 6 7 8

Ko

nze

ntr

atio

n (

g/l)

Probe


a) b)

Ergebnisse

163

„salzig“:

Abbildung 113: Grafische Darstellung der a)Prüfersensibilität, b) Reiz- und Erkennungsschwelle „salzig“

Tabelle 48: Reiz- und Erkennungsschwelle "salzig"

Reizschwelle



(Probe)



1,58 ± 1,21 0,20 ± 0,08 0,14 0,48 3,22 ± 1,56 0,36 ± 0,20 0,34 0,16 0,98


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

Bew

ertu

ng

Probe

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

1 2 3 4 5 6 7 8

Ko

nze

ntr

atio

n (

g/l)

Probe


a) b)

Ergebnisse

164

„bitter“:

Abbildung 114: Grafische Darstellung der a) Prüfersensibilität, b) Reiz- und Erkennungsschwelle „bitter“

Tabelle 49: Reiz- und Erkennungsschwelle "bitter"

Reizschwelle



(Probe)



1,65 ± 1,68 0,07 ± 0,02 0,05 0,12 2,78 ± 2,00 0,09 ± 0,03 0,08 0,05 0,19


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

Bew

ertu

ng

Probe

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

1 2 3 4 5 6 7 8

Ko

nze

ntr

atio

n (

g/l)

Probe


a) b)

Ergebnisse

165

„umami“:

Abbildung 115: Grafische Darstellung der a) Prüfersensibilität, b) Reiz- und Erkennungsschwelle „umami“

Tabelle 50: Reiz- und Erkennungsschwelle "umami"

Reizschwelle

(Probe) Reizschwelle MW (g/l)


(Probe)



2,13 ± 1,62 0,12 ± 0,08 0,07 0,43 3,51 ± 2,00 0,20 ± 0,18 0,21 0,07 0,79


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8

Bew

ertu

ng

Probe

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1 2 3 4 5 6 7 8

Ko

nze

ntr

atio

n (

g/l)

Probe


a) b)

Ergebnisse

166

4.4.1.4 Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes (gemäß DIN EN ISO

8586:2014)

Die Diskriminierungsfähigkeit zwischen Proben unterschiedlicher Konzentration wurde gemäß

DIN EN ISO 8586:2014 unter Anwendung eines Rangordnungstests nach DIN ISO 8587:2010

durchgeführt. Die Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer wurde je Grundgeschmacksart mittels

Friedman-Test ermittelt (Tabelle 51). Im Falle signifikanter Ergebnisse wurden Wilcoxon-

Vorzeichen-Rangtests zur Ermittlung signifikanter Paardifferenzen durchgeführt (Tabelle 52)

(Quadt et al., 2009; Lawless & Heymann, 1999).

Tabelle 51: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Friedman-Test

Geschmack Chi-Quadrat p signifikant?

süß 156,830 0,000 Ja

sauer 160,874 0,000 Ja

salzig 172,254 0,000 Ja

bitter 65,566 0,000 Ja

umami 149,529 0,000 Ja

Ergebnisse

167

Tabelle 52: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Wilcoxon-Test

Geschmack Probenpaare Zb p signifikant?

süß

AB -1,923 0,054 Nein

AC -5,656 0,000 Ja

AD -7,320 0,000 Ja

BC -6,147 0,000 Ja

BD -7,625 0,000 Ja

CD -7,205 0,000 Ja

sauer

AB -4,275 0,000 Ja

AC -6,821 0,000 Ja

AD -7,494 0,000 Ja

BC -5,716 0,000 Ja

BD -7,415 0,000 Ja

CD -6,861 0,000 Ja

salzig

AB -5,498 0,000 Ja

AC -7,237 0,000 Ja

AD -7,481 0,000 Ja

BC -6,634 0,000 Ja

BD -7,495 0,000 Ja

CD -7,170 0,000 Ja

bitter

AB -1,848 0,065 Nein

AC -4,811 0,000 Ja

AD -5,804 0,000 Ja

BC -3,845 0,000 Ja

BD -4,990 0,000 Ja

CD -2,240 0,025 Ja

umami

AB -4,081 0,000 Ja

AC -7,043 0,000 Ja

AD -7,327 0,000 Ja

BC -5,281 0,000 Ja

BD -6,990 0,000 Ja

CD -5,832 0,000 Ja

Legende: b, basiert auf negativen Rängen

Friedman- und Wilcoxon-Test weißen auf eine gute Diskriminierungsfähigkeit des Panels

hinsichtlich aller Grundgeschmacksarten hin. Lediglich niedrige Konzentrationen der

Geschmacksausprägungen „süß“ und „bitter“ konnten nicht eindeutig voneinander

unterschieden werden. Bezieht man die mittleren Ränge der einzelnen Konzentrationen,

dargestellt in Tabelle 53, in die Bewertung mit ein wird klar, dass die Proben nicht nur

signifikant unterschiedlich wahrgenommen wurden, sondern auch betreffend ihrer

Konzentration korrekt gereiht werden konnten.

Ergebnisse

168

Tabelle 53: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer - Mittlerer Rang

Probe Mittlerer Rang

süß sauer salzig bitter umami

Probe A 1,56 1,31 1,25 1,75 1,32

Probe B 1,77 1,92 1,92 2,08 1,96

Probe C 2,72 2,86 2,89 2,83 2,91

Probe D 3,97 3,91 3,94 3,34 3,80

Legende: Konzentrationen, D > C > B > A.

Die Ergebnisse erlauben keine Aussage hinsichtlich der Homogenität der Bewertungen.

Betrachtet man die Minima und Maxima der jeweiligen Proben in der deskriptiven Teststatistik,

dargestellt in Tabelle 54, wird klar, dass ein oder mehrere Prüfer Probleme hatten, die korrekte

Rangordnung der Proben herzustellen.

Tabelle 54: Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer – Deskriptive Teststatistik der Rangordnungstests

Geschmack Proben n Mittelwert Minimum Maximum

süß

A 68 1,71 ± 0,69 1 3

B 68 1,92 ± 0,42 1 3

C 68 2,72 ± 0,54 1 4

D 68 3,97 ± 0,17 3 4

sauer

A 68 1,29 ± 0,55 1 3

B 68 1,90 ± 0,58 1 4

C 68 2,85 ± 0,63 1 4

D 68 3,94 ± 0,24 3 4

salzig

A 68 1,32 ± 0,50 1 3

B 68 1,97 ± 0,42 1 3

C 68 2,90 ± 0,43 1 4

D 68 3,94 ± 0,38 1 4

bitter

A 68 1,75 ± 0,87 1 4

B 68 2,06 ± 0,88 1 4

C 68 2,82 ± 0,96 1 4

D 68 3,31 ± 0,97 1 4

umami

A 68 1,38 ± 0,52 1 3

B 68 1,99 ± 0,74 1 4

C 68 2,93 ± 0,61 1 4

D 68 3,84 ± 0,48 2 4

Legende: Konzentrationen, D > C > B > A. n = 68, Bewertung eines Prüfers anhand von zwei Wiederholungen.

Besonders niedrige Konzentrationen konnten von einem oder mehreren Prüfern nicht

unterschieden werden.

Die Ergebnisse der Test zeigen eine vorhandene Diskriminierungsfähigkeit der Prüfer auf,

verdeutlichen aber auch die Notwendigkeit einer gezielten Prüferauswahl.

Ergebnisse

169

4.4.1.5 Schulung zur Anwendung der Skale

In der Schulung zur Anwendung der Skale wurde den Prüfern die Verwendung der 7-Punkt-

Skale näher gebracht. Je Grundgeschmack wurden 3 Intensitätsstufen gereicht und von den

Prüfern mit Skalennoten versehen. Die von der Prüfleitung vorgesehenen Bewertungen der

Intensitäten „niedrig“, „mittel“ und „hoch“ entsprachen jeweils die Skalenwerte „2“, „4“ bzw. „6“

zu. Tabelle 55 stellt die Ergebnisse der Probenbewertung dar.

Tabelle 55: Skalenbewertungen der Prüfer - Deskriptive Statistik der Skalenschulung

Geschmack Proben n Mittelwert Minimum Maximum Median Modus

süß

A 68 2,28 ± 0,96 1 4 2 2

B 68 3,50 ± 1,10 1 6 4 4

C 68 5,54 ± 0,95 2 7 6 6

sauer

A 68 2,25 ± 0,82 1 5 2 2

B 68 4,18 ± 0,98 1 7 4 4

C 68 5,94 ± 0,84 4 7 6 6

salzig

A 68 2,26 ± 0,99 1 6 2 2

B 68 4,09 ± 1,08 1 7 4 4

C 68 5,74 ± 1,02 1 7 6 6

bitter

A 68 2,68 ± 0,97 1 6 2 2

B 68 3,79 ± 1,02 1 6 4 4

C 68 5,53 ± 1,10 2 7 6 6

umami

A 68 2,60 ± 1,15 1 6 2 2

B 68 3,46 ± 1,13 1 6 4 4

C 68 5,10 ± 1,11 2 7 5 6

Legende: Konzentrationen, C > B > A. n = 68, Bewertung eines Prüfers anhand von zwei Wiederholungen.

Die mittleren Skalenbewertungen der Prüfer entsprechen grundlegend den Erwartungen der

Prüfleitung. Unabhängig vom Grundgeschmack der Proben wurde die niedrigste Intensität,

beurteilt anhand von Median und Modus, mit dem Skalenwert „2“, die mittlere Intensität mit „4“

und die hochste Intensität mit „6“ bewertet. Bezieht man Minima und Maxima, sowie die

Standardabweichungen in die Bewertung mit ein wird klar, dass ein oder mehrere Prüfer

Probleme mit der Diskriminierungsfähigkeit der Proben hatten bzw. eine nicht homogene

Nutzung der Skale vorliegt.

Wie bereits bei der „Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes“

festgestellt, verdeutlichen diese Ergebnisse die Notwendigkeit einer gezielten Prüferauswahl.


Bei der dreistufigen Prüferauswahl in Anlehnung an die DIN EN ISO 8586:2014, die auf den

Ergebnissen der „Schulung zur Anwendung der Skale“ (Kapitel 4.4.1.5) basierte, wurde zu

Beginn die Diskriminierungsfähigkeit jedes Prüfers für jeden Grundgeschmack unter

Verwendung des nichtparametrischen Friedman-Tests überprüft. Eine nicht signifikante

Ergebnisse

170

Diskriminierungsfähigkeit führte zum Ausschluss des Prüfers für den betroffenen

Grundgeschmack. Die Ergebnisse des Friedman-Tests sind in Tabelle 56 dargestellt.

Im Anschluss erfolgte ein Vergleich der Punktevergabe jeder Prüfperson und Intensitätsstufe

in Bezug auf den Gruppenmittelwert mit dem reduzierten Panel. Eine Abweichung > 0,6

Punkten je Konzentrationsstufe oder mehr als eine Abweichung > 0,5 Punkten führten zum

Ausschluss der betroffenen Prüferperson (Tabelle 57 – Tabelle 61).

Ergebnisse

171

Tabelle 56: Prüferauswahl - Friedman-Test zur Überprüfung der Diskriminierungsfähigkeit

Prüfer süß

Prüfer sauer

Prüfer salzig

Prüfer bitter

Prüfer umami

p signifikant? p signifikant? p signifikant? p signifikant? p signifikant?

1 0,3879 Nein 1 0,0970 Nein 1 0,0970 Nein 1 0,7165 Nein 1 0,7165 Nein

2 0,0498 Ja 2 0,0970 Nein 2 0,0970 Nein 2 0,0970 Nein 2 0,0970 Nein

3 0,0498 Ja 3 0,0498 Ja 3 0,0970 Nein 3 0,0970 Nein 3 0,0498 Ja

4 0,0970 Nein 4 0,0498 Ja 4 0,0498 Ja 4 0,2635 Nein 4 0,0498 Ja

5 0,0970 Nein 5 0,0970 Nein 5 0,0498 Ja 5 0,0498 Ja 5 0,0970 Nein

6 0,0970 Nein 6 0,0498 Ja 6 0,0498 Ja 6 0,7165 Nein 6 0,0970 Nein

7 0,0970 Nein 7 0,0498 Ja 7 0,0970 Nein 7 0,7165 Nein 7 0,2635 Nein

8 0,0970 Nein 8 0,0498 Ja 8 0,0970 Nein 8 0,0970 Nein 8 0,2635 Nein

9 0,0498 Ja 9 0,0498 Ja 9 0,7170 Nein 9 0,0498 Ja 9 1,0000 Nein

10 0,0970 Nein 10 0,0498 Ja 10 0,0970 Nein 10 0,0498 Ja 10 0,3678 Nein

11 0,0970 Nein 11 0,0970 Nein 11 0,0970 Nein 11 0,0498 Ja 11 0,0498 Ja

12 0,0498 Ja 12 0,0970 Nein 12 0,0970 Nein 12 0,0970 Nein 12 0,0970 Nein

13 0,0498 Ja 13 0,0498 Ja 13 0,0970 Nein 13 0,0970 Nein 13 0,3678 Nein

14 0,0970 Nein 14 0,0498 Ja 14 0,0498 Ja 14 0,0498 Ja 14 0,0970 Nein

15 0,0970 Nein 15 0,0970 Nein 15 0,0970 Nein 15 0,0970 Nein 15 0,0498 Ja

16 0,2331 Nein 16 0,1350 Nein 16 0,1350 Nein 16 0,2231 Nein 16 0,2231 Nein

17 0,0498 Ja 17 0,0498 Ja 17 0,0970 Nein 17 0,0970 Nein 17 0,0498 Ja

18 0,0970 Nein 18 0,0498 Ja 18 0,0498 Ja 18 0,0498 Ja 18 0,0970 Nein

19 0,0970 Nein 19 0,0498 Ja 19 0,2635 Nein 19 0,0498 Ja 19 0,0498 Ja

20 0,0498 Ja 20 0,0498 Ja 20 0,0498 Ja 20 0,0498 Ja 20 0,0498 Ja

21 0,0498 Ja 21 0,0498 Ja 21 0,0498 Ja 21 0,0970 Nein 21 0,0498 Ja

22 0,0498 Ja 22 0,0498 Ja 22 0,0970 Nein 22 0,0498 Ja 22 0,0970 Nein

23 0,0970 Nein 23 0,0498 Ja 23 0,0498 Ja 23 0,2635 Nein 23 0,3678 Nein

Summe p < 0,05 9 Summe p < 0,05 16 Summe p < 0,05 8 Summe p < 0,05 9 Summe p < 0,05 8

Ergebnisse

172

Tabelle 57: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „süß“

Anmerkung: Prüfer 2, 3, 9, 13, 22 ausgeschlossen

Tabelle 58: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „salzig“

Anmerkung: Prüfer 4, 18, 20 ausgeschlossen

Prüfer n

Probe A („niedrig“) Probe B („mittel“) Probe C („hoch“)

Mittelwert Differenz zum Mittelwert Mittelwert Differenz zum Mittelwert Mittelwert Differenz zum Mittelwert

2 3 2,00 ± 1,00 -0,07 4,00 ± 0,00 -0,44 6,33 ± 0,58 -0,85

3 3 3,00 ± 0,00 -1,07 4,00 ± 0,00 -0,44 5,33 ± 0,58 0,15

9 3 2,67 ± 0,58 -0,74 4,33 ± 0,58 -0,78 5,67 ± 0,58 -0,19

12 3 1,67 ± 0,58 0,26 3,33 ± 1,53 0,22 5,67 ± 0,58 -0,19

13 3 1,00 ± 0,00 0,93 2,67 ± 1,16 0,89 5,00 ± 01,73 0,48

17 3 1,67 ± 0,58 0,26 3,33 ± 0,58 0,22 5,67 ± 0,58 -0,19

20 3 1,33 ± 0,58 0,59 3,33 ± 1,16 0,22 5,67 ± 0,58 -0,19

21 3 1,67 ± 0,58 0,26 3,67 ± 0,58 -0,11 5,33 ± 1,53 0,15

22 3 2,33 ± 0,58 -0,41 3,33 ± 0,58 0,22 4,67 ± 0,58 0,81

Insgesamt 27 1,93 ± 0,78 3,56 ± 0,85 5,48 ± 0,89

Prüfer n



4 3 1,67 ± 0,58 0,21 3,33 ± 0,58 0,71 6,00 ± 0,00 0,04

5 3 1,33 ± 0,58 0,54 3,67 ± 0,58 0,38 6,00 ± 0,00 0,04

6 3 2,00 ± 0,00 -0,13 4,00 ± 0,00 0,04 6,00 ± 0,00 0,04

14 3 2,33 ± 1,16 -0,46 4,33 ± 1,16 -0,29 6,00 ± 1,00 0,04

18 3 1,67 ± 1,16 0,21 5,00 ± 1,00 -0,96 7,00 ± 0,00 -0,96

20 3 1,67 ± 1,16 0,21 4,00 ± 0,00 0,04 5,00 ± 0,00 1,04

21 3 2,33 ± 0,58 -0,46 4,00 ± 0,00 0,04 6,33 ± 0,58 -0,29

23 3 2,00 ± 1,00 -0,13 4,00 ± 0,00 0,04 6,00 ± 0,00 0,04

Insgesamt 24 1,88 ± 0,80 4,04 ± 0,69 6,04 ± 0,62

Ergebnisse

173

Tabelle 59: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „sauer“

Anmerkung: Prüfer 3, 4, 8, 9, 13, 17, 18, 20, 22 ausgeschlossen

Prüfer n



3 3 3,00 ± 0,00 -0,81 4,00 ± 0,00 0,06 5,33 ± 0,58 0,71

4 3 3,00 ± 0,00 -0,81 4,00 ± 0,00 0,06 5,67 ± 0,58 0,38

6 3 2,67 ± 0,58 -0,48 4,33 ± 0,58 -0,27 6,33 ± 0,58 -0,29

7 3 2,00 ± 0,00 0,19 4,00 ± 0,00 0,06 6,33 ± 0,58 -0,29

8 3 2,33 ± 0,58 -0,15 5,33 ± 0,58 -1,27 6,67 ± 0,58 -0,63

9 3 2,33 ± 0,58 -0,15 3,67 ± 0,58 0,40 5,33 ± 1,16 0,71

10 3 2,33± 0,58 -0,15 4,00 ± 0,00 0,06 5,67 ± 0,58 0,38

13 3 1,67 ± 1,16 0,52 4,67 ± 1,16 -0,60 6,33 ± 0,58 -0,29

14 3 2,00 ± 1,00 0,19 4,33 ± 0,58 -0,27 6,33 ± 0,58 -0,29

17 3 1,67 ± 0,58 0,52 4,00 ± 1,00 0,06 7,00 ± 0,00 -0,96

18 3 1,33 ± 0,58 0,85 3,00 ± 0,00 1,06 6,33 ± 0,58 -0,29

19 3 2,33 ± 0,58 -0,15 4,00 ± 1,00 0,06 6,00 ± 0,00 0,04

20 3 1,33 ± 0,58 0,85 3,33 ± 1,16 0,73 6,00 ± 0,00 0,04

21 3 1,67 ± 1,16 0,52 3,67 ± 0,58 0,40 5,67± 0,58 0,38

22 3 3,33 ± 1,53 -1,15 4,67 ± 1,16 -0,60 6,00 ± 1,00 0,04

23 3 2,00 ± 1,00 0,19 4,00 ± 0,00 0,06 5,67 ± 0,58 0,38

Insgesamt 48 2,19 ± 0,87 4,06 ± 0,78 6,04 ± 0,68

Ergebnisse

174

Tabelle 60: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „bitter“

Anmerkung: Prüfer 5, 11 ausgeschlossen

Tabelle 61: Prüferauswahl - Differenz der Prüfpersonen zum Gruppenmittelwert – „umami“

Anmerkung: Prüfer 3 ausgeschlossen (nach Überprüfung der Panelhomogenität)

Prüfer n



5 3 1,67 ± 0,58 0,67 4,00 ± 0,00 -0,19 6,33 ± 1,16 -0,56

9 3 2,67 ± 0,58 -0,33 4,33 ± 0,58 -0,52 6,00 ± 1,00 -0,22

10 3 2,33 ± 0,58 0,00 3,67 ± 0,58 0,15 5,33 ± 1,53 0,44

11 3 2,67 ± 0,58 -0,33 3,67 ± 0,58 0,15 5,00 ± 0,00 0,78

14 3 2,67 ± 0,58 -0,33 4,00 ± 1,00 -0,19 6,33 ± 0,58 -0,56

18 3 2,33 ± 0,58 0,00 3,33 ± 0,58 0,48 6,00 ± 0,00 -0,22

19 3 2,00 ± 0,00 0,33 3,67 ± 0,58 0,15 6,00 ± 0,00 -0,22

20 3 2,67 ± 0,58 -0,33 4,00 ± 0,00 -0,19 5,33 ± 0,58 0,44

22 3 2,00 ± 0,00 0,33 3,67 ± 0,58 0,15 5,67 ± 0,58 0,11

Insgesamt 27 2,33 ± 0,56 3,81 ± 0,58 5,78 ± 0,80

Prüfer n



3 3 2,67 ± 0,58 -0,46 4,00 ± 0,00 -0,17 5,00 ± 0,00 0,58

4 3 2,00 ± 0,00 0,21 3,33 ± 0,58 0,50 5,33 ± 0,58 0,25

11 3 2,67 ± 0,58 -0,46 4,00 ± 0,00 -0,17 5,33 ± 0,58 0,25

15 3 2,00 ± 0,00 0,21 3,33 ± 0,58 0,50 5,33 ± 0,58 0,25

17 3 2,00 ± 0,00 0,21 4,00 ± 0,00 -0,17 6,00 ± 0,00 -0,42

19 3 2,00 ± 1,00 0,21 4,33 ± 0,58 -0,50 6,00 ± 0,00 -0,42

20 3 1,67 ± 0,58 0,54 3,67 ± 0,58 0,17 5,67 ± 0,58 -0,08

21 3 2,67 ± 0,58 -0,46 4,00 ± 0,00 -0,17 6,00 ± 0,00 -0,42

Insgesamt 24 2,21 ± 0,59 3,83 ± 0,48 5,58 ± 0,50

Ergebnisse

175

Aus den Ergebnissen des Friedman-Tests ergab sich eine vorläufige

Panelzusammensetzung. Die Panelgröße variierte abhängig vom Grundgeschmack zwischen

8 – 16 Prüfern. Aufgrund von großen oder wiederholt auftretenden Abweichungen vom

Gruppenmittel erfolgte je Grundgeschmack eine Reduktion der Panelgröße auf 4 – 8 Prüfer.

Die Homogenität des jeweils resultierenden Panels wurde je Grundgeschmack mittels Kruskal-

Wallis H Tests überprüft. Bei unzureichender Homogenität der Merkmalsausprägung

(niedrige, mittlere, hohe Intensität) eines Grundgeschmacks erfolgte eine Überprüfung der

Panelzusammenstellung unter Verwendung von Mann-Whitney U Tests. Signifikante



Aufgrund signifikant vom Panel abweichender Bewertungen kam es für den Grundgeschmack

„umami“ zum Ausschluss eines weiteren Prüfers. Die Bewertungen der jeweiligen finalen

Panels sind in Tabelle 62 – Tabelle 66 dargestellt.

Tabelle 62: Prüferauswahl - Panelhomogenität "süß"

Probe N

(Prüfer) Mittelwert Minimum Maximum

Chi-

Quadrat Signifikanz

A („niedrig“) 4 1,58 ± 0,52 1 2 0,943 0,815

B („mittel“) 4 3,42 ± 0,90 2 5 0,388 0,943

C („hoch“) 4 5,58 ± 0,79 4 7 0,365 0,947

Tabelle 63: Prüferauswahl - Panelhomogenität "sauer"

Probe N


Chi-

Quadrat Signifikanz

A („niedrig“) 7 2,14 ± 0,73 1 3 3,326 0,767

B („mittel“) 7 4,05 ± 0,50 3 5 3,836 0,699

C („hoch“) 7 6,00 ± 0,55 5 7 6,667 0,353

Tabelle 64: Prüferauswahl - Panelhomogenität "salzig"

Probe N


Chi-

Quadrat Signifikanz

A („niedrig“) 5 2,00 ± 0,76 1 3 3,500 0,478

B („mittel“) 5 4,00 ± 0,54 3 5 2,333 0,675

C („hoch“) 5 6,07 ± 0,46 5 7 1,299 0,862

Ergebnisse

176

Tabelle 65: Prüferauswahl - Panelhomogenität "bitter"

Probe N


Chi-

Quadrat Signifikanz

A („niedrig“) 7 2,38 ± 0,50 2 3 6,538 0,366

B („mittel“) 7 3,81 ± 0,60 3 5 5,146 0,525

C („hoch“) 7 5,81 ± 0,75 4 7 4,694 0,584

Tabelle 66: Prüferauswahl - Panelhomogenität "umami"

Probe N


Chi-

Quadrat Signifikanz

A („niedrig“) 7 2,14 ± 0,57 1 3 8,102 0,231

B („mittel“) 7 3,81 ± 0,51 3 5 9,889 0,129

C („hoch“) 7 5,67 ± 0,48 5 6 8,571 0,199

Die gezielte Auswahl der Panelteilnehmer resultierte für alle Grundgeschmacksarten in einer

deutlichen Reduktion der Standardabweichungen bei guter bis sehr guter Panelhomogenität.

In Einzelfällen kommt es jedoch besonders bei niedrigen Intensitäten zu voneinander

abweichenden Bewertungen.


Im Rahmen der sensorischen Beurteilung der Fraktionen wurden je Proteinquelle vier Proben

zur Bewertung herangezogen. Neben der jeweiligen Permeat- (CPer: 1 g/l) und

Retentatfraktion (CRet: 1 g/l) wurde ein Bitterstandard (CBitter: 0,22 g/l) und eine Mischung aus

Bitterstandard und Permeat (CBitter/Per: 0,22 g/l/1 g/l) gereicht um zu überprüfen, ob die

Geschmacksausprägung „bitter“ durch Zusatz einer Permeatfraktion reduziert werden kann.

Wie in Kapitel 2.5.4 (Seite 47) dargelegt, verfügen besonders niedermolekulare

Peptidverbindungen über Geschmacksqualitäten. Den „bitter“-Geschmack hemmende

Eigenschaften, dargestellt in Kapitel 2.5.3.2 (Seite 44), werden ebenfalls mit

niedermolekularen Strukturen in Verbindung gebracht. Die Ergebnisse der sensorischen

Bewertung sind in Tabelle 67 – Tabelle 68 sowie Abbildung 116 - Abbildung 117 dargestellt.

Für die „Retentat“-Fraktion (> 100 kDa, pH 9) des hydrolysierten Molkenprotein-Isolats wurde

von den Prüfern eine sehr schwache „süß“ Wahrnehmung beschrieben (Tabelle 67, Abbildung

116). Weitere Grundgeschmackarten konnten nicht oder nur in geringem Umfang ermittelt

werden.

In der „Permeat“-Fraktion (< 100 kDa, pH 9) wurde ein schwacher „salzig“ Geschmack

festgestellt, der ebenfalls in der „Bitter-Standard & Permeat“ diagnostiziert wurde (Tabelle 67,

Ergebnisse

177

Abbildung 116). Die Zugabe von „Permeat“ zum „Bitter-Standard“ führte zu einer nicht

signifikanten Reduktion der „bitter“ Wahrnehmung (p > 0,05).

Für die „Retentat“-Fraktion (> 100 kDa, pH 6) der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris) (>

100 kDa, pH 6) wurde von den Prüfern eine schwache „salzig“-, sowie eine sehr schwache

„umami“ Wahrnehmung beschrieben (Tabelle 68, Abbildung 117).

In der „Permeat“-Fraktion (< 100 kDa, pH 6) wurde eine schwache „salzig“-, sowie sehr

schwache „sauer“ und „umami“ Geschmacksausprägungen festgestellt (Tabelle 68, Abbildung

117). Der „salzig“ Geschmack blieb im „Bitter-Standard & Permeat“ erhalten und wurde dort

schwach bis mittel wahrgenommen. Die Zugabe von „Permeat“ zum „Bitter-Standard“ führte

zu einer signifikanten Reduktion der durch Koffein ausgelösten „bitter“ Wahrnehmung (p <

0,05).

Tabelle 67: Sensorische Bewertung – Fraktionen hydrolysierten Molkenprotein-Isolats (Retentat > 100 kDa, pH 9; Permeat < 100 kDa, pH 9)

Grundgeschmack N

(Prüfer) n

Retentat Permeat Bitter-

Standard

Bitter-Standard &

Permeat

Mittelwert Mittelwert Mittelwert Mittelwert

süß 4 3 1,08 ± 1,17

0,75 ± 1,22

0,34 ± 0,65 0,34 ± 0,89

sauer 7 3 0,38 ± 0,92

0,81 ± 1,29

0,57 ± 1,03 0,95 ± 1,20

salzig 5 3 0,67 ± 1,05

2,40 ± 1,60

0,27 ± 0,80 2,47 ± 2,13

bitter 7 3 0,67 ± 0,91

0,29 ± 0,72

2,81 ± 1,40 1 2,19 ± 1,81 1

umami 7 3 0,76 ± 1,00

0,81 ± 0,98

0,62 ± 0,87 1,19 ± 1,08

Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Tabelle 68: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) (Retentat > 100 kDa, pH 6; Permeat < 100 kDa, pH 6)

Grundgeschmack N

(Prüfer) n

Retentat Permeat Bitter-

Standard

Bitter-Standard &

Permeat

Mittelwert Mittelwert Mittelwert Mittelwert

süß 4 3 0,42 ± 0,52

0,83 ± 0,94

0,00 ± 0,00 0,25 ± 0,45

sauer 7 3 0,57 ± 0,98

1,05 ± 1,60

0,33 ± 0,58 0,86 ± 1,49

salzig 5 3 1,40 ± 1,40

2,33 ± 2,38

0,40 ± 0,91 3,00 ± 1,93

bitter 7 3 0,29 ± 0,56

0,24 ± 0,44

2,48 ± 1,57 1 1,48 ± 1,50 2

umami 7 3 1,10 ± 1,18

1,62 ± 1,50

0,38 ± 0,67 1,57 ± 1,17

Werte in einer Zeile mit unterschiedlichen Zahlen 1,2 unterschieden sich signifikant (p < 0,05).

Ergebnisse

178

Abbildung 116: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierten Molkenprotein-Isolats (Retentat > 100 kDa, pH 9; Permeat < 100 kDa, pH 9)

Abbildung 117: Sensorische Bewertung - Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) (Retentat > 100 kDa, pH 6; Permeat < 100 kDa, pH 6)

0

1

2

3

4Süß

Sauer

SalzigBitter

Umami

Molkenprotein-Isolat

Retentat Permeat Bitter-Standard Bitter-Standard & Permeat

0

1

2

3

4Süß

Sauer

SalzigBitter

Umami

Alge (Chlorella vulgaris)

Retentat Permeat Bitter-Standard Bitter-Standard & Permeat

Diskussion

179

5. Diskussion

5.1 Analytik

Die Bewertung der in Kapitel 3.4.2 (Seite 64)/Kapitel 4.1.2 (Seite 87) beschriebenen

„Spektralphotometrischen Proteingehaltbestimmung“, sowie der in Kapitel 3.4.4 (Seite

67)/Kapitel 4.1.1 (Seite 79) dargelegten „Analytik der Peptidfraktionen mittels SE-HPLC“ findet

im Rahmen der abschließenden Diskussion der „Methodischen Aspekte“ (Kapitel 5.5.2, Seite

237) statt.

5.2 Hydrolyse


Mikroalgen der Gattung Chlorella, in die auch die in dieser Studie verwendete Chlorella

vulgaris fällt, sind, trotz großen Potentials im Lebensmittelbereich, nur wenig erforscht (Ursu

et al., 2014). Grund dafür ist, unter anderem, die starke Zellwandstruktur, die zur Nutzung

funktioneller Komponenten aufgebrochen werden muss (Morris et al., 2008).

In Pilotversuchen bestätigte sich die Problematik der Unzugänglichkeit des Algenproteins für

den enzymatischen Hydrolyseprozess, die auch durch erhöhte Enzymkonzentration von 0,5

% (Pronase (225 PU), Pancreatin (40 USP)), bzw. 3 % (Corolase (82,5 UHB)) nicht gelöst

werden konnte. In einer lichtmikroskopischen Analyse der Hydrolysate konnten lediglich

intakte Zellstrukturen festgestellt werden. Da Mikroalgen der Gattung Chlorella vorwiegend

über Cellulose-, Hemicelluslase- und Pektin-basierte Zellwände verfügen, wurde die

Wirksamkeit einer Pektinase-Behandlung (18 h, 48 h, 72 h) der Zellwand durch Rohament®

PL, sowie einer sauren Vorbehandlung unter Verwendung von HCl, pH 3 (18 h, 48 h) überprüft.

Zur Hydrolyse der Algenproteine wurden die Endopeptidasen Pancreatin (0,25 %, 20 USP)

und Pronase (0,25 %, 112,5 PU) verwendet.

Behandlung mit Rohament® PL:

Die enzymatische Vorbehandlung durch die Pektinase Rohament® PL mit anschließender 45-

minütiger Hydrolyse resultierte für Pronase und Pancreatin, abhängig von der Prozessdauer

tEV, in Hydrolysegraden zwischen 15,32 ± 1,19 % (Pancreatin, 18 h), bzw. 14,63 ± 2,73 %

(Pronase, 18 h) und 20,14 ± 1,56 % (Pancreatin, 48 h), bzw. 21,39 ± 1,77 % (Pronase, 48 h).

Eine weitere Steigerung der Prozesslaufzeit auf 72 h führte nicht zu einer weiteren Erhöhung

des Hydrolysegrads, sondern resultierte im Gegensatz dazu in einer geringfügigen Abnahme.

Die maximalen Hydrolysegrade entsprechen den Ergebnissen von Morris et al. (2008) und

Tchorbanov & Bozhkova (1988) die bei der Hydrolyse von mit organischen Lösungsmitteln

extrahierten Algenproteinen unter Verwendung von Pancreatin und Subtilisin Hydrolysegrade

von 20 – 22 % erreichten. Eine Steigerung der Prozesszeit führte nicht zu einer weiteren

Erhöhung des Hydrolysegrads und äußerte sich lediglich in einer gesteigerten Ausbeute

Diskussion

180

hydrolysierten Proteins (Tchorbanov & Bozhkova, 1988). Tchorbanov & Bozhkova (1988)

führten dies auf einen maximalen Hydrolysegrad zurück, der mit Subtilisin erreicht werden

kann. Diese Erkenntnisse stimmen mit den Ergebnissen anderer Autoren überein, die bei

langen Hydrolyseprozessen von Weizengluten eine Annäherung an einen enzym- und

substratspezifischen DH-Grenzwert feststellten (Koo et al., 2011; Kong, Zhou, & Qian, 2007a,

2007b). Die geringfügige Abnahme der Hydrolysegrade bei einer Steigerung der Dauer der

enzymatischen Vorbehandlung von 48 h auf 72 h bei den mit Pronase und Pancreatin

durchgeführten Hydrolyse ist vermutlich auf prozessbedingte Schwankungen, bei

gleichzeitiger Erreichung des vorab beschriebenen maximalen Hydrolysegrads der Enzyme

zurückzuführen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, dass durch die Steigerung der Dauer

der enzymatischen Vorbehandlung mehr Protein bereitgestellt werden konnte, welches in der

anschließenden Hydrolyse aufgrund der Prozessbedingungen (Enzymkonzentration, Dauer

der Hydrolyse) nicht in vergleichbarer Weise umgesetzt werden konnte.

Die Chromatogramme der Hydrolysate weisen einen großen Anteil an Molekülen ≥ 1,35 kDa

auf. Mit zunehmender Dauer der Vorbehandlung ist zudem eine Zunahme noch kleinerer

Strukturen erkennbar (Abbildung 59, Abbildung 60, Abbildung 61; Seite 95 - 96). Die

Ergebnisse deuten in Verbindung mit den Hydrolysegraden darauf hin, dass der

Hydrolyseprozess weit fortgeschritten ist und Molekülstrukturen ≥ 1,35 kDa enzymatisch

abgebaut oder aufgrund mangelnder Löslichkeit durch den Zentrifugationsprozess abgetrennt

worden sind. Nach Ursu et al. (2014) liegt der IEP intakter Chlorella vulgaris Proteine zwischen

4,0 und 5,5. Vollständige Löslichkeit wurde bei pH 7,0 beobachtet. Der End-pH der

Hydrolysate fiel zu keinem Zeitpunkt unter pH 7 und bewegte sich zwischen 8,0 und 7,0. Eine

Abtrennung aufgrund des Zentrifugationsprozess erscheint somit nicht in mangelnder

Löslichkeit begründet.

Behandlung mit HCl, pH 3:

Die saure Vorbehandlung mit anschließender 45-minütiger Hydrolyse resultierte für Pronase

und Pancreatin in Hydrolysegraden zwischen 10,29 ± 0,97 (Pancreatin, 18 h) bzw. 17,04 ±

2,83 (Pronase, 18 h) und 12,76 ± 1,21 (Pancreatin, 48 h) bzw. 18,16 ± 2,59 (Pronase, 48 h).

Anhand des Hydrolysegrads beurteilt, resultiert eine Vorbehandlung für 18 h in

Hydrolysegraden im angestrebten Zielbereich zwischen 8 – 12 %. Die saure Hydrolyse von

Cellulose, die besonders beim Umsatz von Biomasse zur Glucose-Gewinnung Anwendung

findet, kann sowohl unter hohen (100 – 240 °C), als auch unter niedrigen (18 – 50 °C)

Temperaturen zum effektiven Aufschluss von Cellulose führen (Lai, 2000). Park et al. (2016)

konnten bei der Hydrolyse von Chlorella vulgaris zur Gewinnung fermentierbarer Zucker mit

HCl (2 %, 121 °C, 20 min) 92,5 % der Kohlenhydrate in reduzierende Zucker umsetzen.

Diskussion

181

Ähnlich hohe Umsätze (83 %) wurden von Zhou et al. (2011) bei einer Hydrolyse mit HCl (2

%, 180 °C, 10 min) im Beisein von 2.5% Magnesiumchlorid (MgCl2) erreicht.

Da der Fokus dieser Studie nicht auf dem Umsatz von Cellulose in reduzierende Zucker lag,

wurde zur sauren Vorbehandlung eine Temperatur von 45 °C verwendet. Die

Chromatogramme zeigen für die 18-stündige Vorbehandlung Molekülstrukturen im Bereich ≥

20 kDa – 158 kDa. Eine Steigerung der Dauer der Vorbehandlung mit HCl, pH 3 auf 48 h

führte, besonders für Pronase, zu einem deutlich höheren Anteil an Strukturen ≥ 44 kDa. Die

Ergebnisse deuten, unter Berücksichtigung der Erkenntnisse von Zhou et al. (2011) und Park

et al. (2016), darauf hin, dass die Zellwand der Algenzellen erfolgreich lysiert werden konnte.

Dies resultierte vermutlich in erhöhter Zugänglichkeit des Algenproteins für die zur Hydrolyse

verwendeten Endopeptidasen. Betrachtet man hierzu jedoch die von Morris et al. (2008)

ermittelte Molekülgrößenverteilung der Algenproteine (12 – 120 kDa) wird klar, dass,

zumindest im Hydrolysat (HCl, pH 3, 48 h, Pronase 0,25 % (112,5 PU)), neben Peptiden auch

Proteinaggregate vorliegen müssen (vergleiche: Abbildung 64 b, Seite 99). Nicht-native,

denaturierte oder teilgefaltete Proteine sind gemäß Roberts (2007), unter anderem bedingt

durch frei zugängliche hydrophobe Gruppen, anfällig für die Ausbildung von irreversiblen

Protein-Aggregaten. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnis kann nicht alleinig von einer

Steigerung der Zugänglichkeit der Proteine für das Enzym ausgegangen werden. Vielmehr

wird ein simultanes Auftreten beider Phänomene (erhöhte Zugänglichkeit der Proteine durch

saure Vorbehandlung mit HCl, pH 3, Aggregatbildung durch frei zugängliche hydrophobe

Gruppen) vermutet.

5.2.1.1 Zusammenfassung der Diskussionspunkte

Eine Hydrolyse von Algenprotein ist nicht ohne Aufbrechen der Algenzellwände

möglich.

Der IEP der Algenproteine führt nicht zur Interferenzen mit den pH-Optima gängiger

Enzyme.

Die Zellwand der Alge Chlorella vulgaris lässt sich durch saure Hydrolyse lysieren.

Die Bildung von Protein-Aggregaten ist während/nach dem Hydrolyseprozess nicht

auszuschließen.

5.2.1.2 Zusammenfassung & Darstellung der Ergebnisse

Eine Lyse der Zellwand durch Pektinase (Rohament® PL, 0,02 %, 14000 PGU)

erscheint effektiv, erwies sich aber unter den gegebenen Versuchsbedingungen als

ungeeignet.

Eine Lyse mit HCl (18 h, 48 h) mit anschließender Hydrolyse durch Pronase (0,25 %,

112,5 PU) oder Pancreatin (0,25 %, 20 USP) eignet sich zur Erzeugung von

Algenhydrolysaten mit Hydrolysegraden zwischen 10 – 20 %.

Diskussion

182

Eine Steigerung der Dauer der Vorbehandlung auf 48 h führt zu einer Zunahme an

Molekülstrukturen ≥ 44 kDa.

Eine 48-stündige Vorbehandlung resultiert vermutlich in der Ausbildung von Protein-

Aggregaten.

5.3 Crossflow-Diafiltration & Fraktionierung

5.3.1 Membran- & Anlagencharakterisierung

Für Reinstmedien steigt der Permeatflux JFm, proportional zum Transmembrandruck ∆pTMP.

Bei beladenen Medien zeigt sich, abhängig von Feed-Konzentration und

Strömungsgeschwindigkeit, eine Abweichung vom linearen Zusammenhang des Permeatflux

JF,t bei steigendem Transmembrandruck ∆pTMP. (Kofod Nielsen, 2004; Irmler, 2001; Lojkine et

al., 1992). Die Abnahme des Permeatflux JFm ist hierbei auf die Ausbildung einer

Konzentrationspolarisation an der Membranoberfläche und im weiteren Verlauf durch die

Ausbildung einer Foulingschicht auf der Membran zurückzuführen (Taddei et al., 1989). Die

Ausbildung von Fouling kann, durch eine Prozessführung unterhalb eines Drucks pCP reduziert

werden. Unterhalb eines kritischen Drucks pCP entspricht der kritische Flux JCF weitestgehend

dem limitierend Flux JLF. Unter limitierendem Flux JLF versteht man den Flux, für den eine

Steigerung des Transmembrandrucks ∆pTMP nicht länger in einem Anstieg des Permeatflux

resultiert (Vyas et al., 2000; Defrance & Jaffrin, 1999). Um die Ausbildung und den Einfluss

von Fouling auf den Fraktionierungsprozess zu reduzieren wurde die verwendete Membran

unter Verwendung des jeweiligen Feeds (0,15 % (w/v)) vor Beginn der Versuchsreihe

charakterisiert.

5.3.1.1 Molkenprotein-Isolat & Alge (Chlorella vulgaris)

Die in Abbildung 68 (Seite 106)/Abbildung 69 (Seite 107) dargestellten Flux-Charakteristika

von destilliertem Wasser, sowie hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat, bzw. hydrolysierter Alge

(Chlorella vulgaris) entspricht den in der Literatur, unter anderem von Bacchin et al. (2006)

und Irmler (2001) dargestellten, Flux-Verläufen von Reinst- und beladenen Feeds. Der

Permeatflux von destilliertem Wasser verzeichnet in beiden Fällen eine lineare Zunahme bei

steigendem Druck pTMP. Eine Erhöhung des Drucks pTMP von 0,4 bar auf 0,6 bar resultierte

sowohl bei der Filtration von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat (Abbildung 68), als auch bei

der Filtration von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) (Abbildung 69) in einer Abweichung

des Permeatflux-Anstiegs vom linearen Fluxverlauf. Der kritische Druck pCP wurde infolge für

beide Feeds auf 0,5 bar festgelegt.

Wie bereits vorab beschrieben, ist die Abnahme des Permeatflux bei der Filtration beladener

Feeds, unter anderem unter Berufung auf Bacchin et al. (2006), Field et al. (1995), Howell

(1995) und Taddei et al. (1989) auf die Ausbildung von Konzentrationspolarisation und Fouling

zurückzuführen. In Anbetracht der Flux-Charakteristika ist in Anlehnung an Bacchin et al.

Diskussion

183

(2006) davon auszugehen, dass es sich um eine „harte/starke“ Form der Flux-Druck-

Abhängigkeit handelt, bei welcher der Feed-Flux analog des Reinstwasserflux bis zum

Erreichen des kritischen Flux JCF, bzw. kritischen Druck pCP ansteigt und nachfolgend deutlich

abnimmt (siehe auch: Abbildung 9, Seite 17). Bei beiden Membrancharakterisierungen wird

deutlich, dass der Abfall des Permeatflux nicht durch den Rückhalt nativer Proteine, sowie den

daraus durch Hydrolyse entstehenden Peptiden über der Membran, bzw. der Ausbildung einer

Deckschicht von aufgrund ihrer Molekülgröße zurückgehaltenen Proteinen/Peptiden

begründet werden kann, da die Molekülgrößen der Feed-Proteine unter der nominalen

Trenngrenze der Membran liegen. In der nachfolgenden Diskussion zum Einfluss des pH-

Werts und der Ionenstärke (Kapitel 5.3.2) werden die für den Flux-Abfall verantwortlichen

Effekte ausführlich diskutiert und in Kapitel 5.3.2.3 (Seite 201), sowie Kapitel 5.3.2.4 (Seite

201) abschließend zusammengefasst. Um der Diskussion nicht vorzugreifen, sowie

Wiederholungen zu vermeiden, wird an dieser Stelle auf die genannten Kapitel verwiesen.

5.3.2 Einfluss des pH-Werts & der Ionenstärke

In den folgenden Abschnitten wird der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf die

Parameter Permeatflux JFm, Proteingehalt in Retentat mRet und Permeat mPer (Transmission),

sowie die Wiederfindungsrate diskutiert. Effekte, die auf weitere, im Rahmen dieser Studie

nicht variierte, hydrodynamische und physikalisch-chemische Eigenschaften des

Filtrationsprozesses zurückgehen, werden im Kapitel 5.3.6 näher beleuchtet.


Die Verwendung der Crossflow-Filtration zur Fraktionierung und Aufkonzentration von

Milchkomponenten oder Molkenproteinen hat sich in den vergangenen Jahren etabliert. Bei

der Fraktionierung intakter Molkenproteine (geklärte Molke) stellen Almécija et al. (2007) fest,

dass sich sowohl der Permeatflux, als auch die Proteinausbeute in der Retentat- und Permeat-

Fraktion pH-abhängig unterscheiden. Eine Filtration im Bereich des IEP resultierte in Fouling

und Aggregation von Proteinen, während der Permeatflux mit zunehmender Entfernung vom

IEP zunahm (pH 3, pH 9, pH 10). Die Transmission der Proteine war darüber hinaus ebenfalls

pH-abhängig unterschiedlich. Pouliot, Wijers, Gauthier, & Nadeau (1999) untersuchten den

Einfluss von Ionenstärke und pH auf die Fraktionierung eines Molkenproteinhydrolysat mit

Molekülstrukturen ≤ 10 kDa. Eine Erhöhung des pH von 5 auf 9 resultierte bei der

Fraktionierung mit einer Cellulose-Acetat-Membran (MWCO 1 – 5 kDa) in Permeatflux- und

Transmissionssteigerung, sowie einer Reduktion der Fouling-Tendenz. Eine Erhöhung der

Ionenstärke resultierte darüber hinaus in einer verbesserten Transmission, führte aber auch

zu verstärktem Fouling. Diese Erkenntnisse sind weitestgehend deckungsgleich mit den in

dieser Studie ermittelten, nachfolgend näher beschriebenen Beobachtungen.

Diskussion

184

Gemessen am technologischen Potential der Crossflow-Filtrationstechnik zur Fraktionierung

von Molkenproteinen und Proteinhydrolysaten mit dem Zweck der Gewinnung von bioaktiven

Substanzen und funktionellen Lebensmittelbestandteilen, ist die Anzahl der

Veröffentlichungen, insbesondere bei Hydrolysaten, überschaubar. Ein Großteil der

Veröffentlichungen fokussiert sich auf die Aufkonzentration intakter Proteine und/oder arbeitet

mit Modellsystemen.

Permeatflux JFm:

In der vorliegenden Arbeit wurde der Permeatflux JFm durch die Anpassung des pH-Werts nicht

signifikant beeinflusst und lag zwischen 20,01 ± 0,84 ml/min (pH 8) und 29,44 ± 8,19 ml/min

(pH 9). Eine Steigerung des Permeatflux für die pH-Stufe 9 im Vergleich zu darunter liegenden

pH-Werten wurde von Almécija et al. (2007) bei der Fraktionierung geklärter Molke festgestellt.

Der niedrigste Permeatflux wurde von den Autoren im Bereich des IEP der Molkenproteine

(pH 4 – pH 5) festgestellt. Die pH-abhängigen Unterschiede fielen für intakte Molkenproteine

mit einem minimalen Permeatflux JF,t von 25 - 51 l/(m2h) (pH 4, pH 5) und einem maximalen

Permeatflux JF,t von 89 – 125 l/(m2h) (pH 10) sehr deutlich aus. Die Autoren begründen dies

durch ladungsbedingtes Fouling im Bereich des IEP (pH 4, pH 5), bzw. ladungsbedingte

Abstoßungseffekte bei Extrem-pH-Werten (pH 3, pH 10). Pouliot et al. (1999) führten einen

Anstieg des Permeatflux bei der Erhöhung des pH von pH 5 auf pH 9 bei der Fraktionierung

von Molkenproteinhydrolysat mit Molekülstrukturen ≤ 10 kDa auf ladungsbedingte

Abstoßungseffekte zwischen Peptiden und Membran zurück. Ein pH-Wert von pH 9 resultierte

bei der Verwendung negativ geladener Cellulose-Acetat-Membranen in ebenfalls negativ

geladenen oder neutralen Peptiden. Bei pH 5 gingen die Autoren von größtenteils positiv

geladenen Peptiden aus, die durch Adsorption auf der Membran zur Reduktion des Flux durch

Fouling führten.

Bei der Filtration intakter Proteine beeinflusst der pH-Wert die Struktur der Foulingschicht. Bei

der Filtration von BSA-Molekülen unter Verwendung von Polysulfon-Membran (MWCO 300

kDa) stellten Huisman et al. (2000) mit Hilfe von rasterkraftmikroskopischen Aufnahmen pH-

abhängige Unterschiede der Struktur der Foulingschicht fest. Im Bereich des IEP (pH 5) bildete

sich eine dichte Foulingschicht aus, die zu einem minimalen Permeatflux führte. pH 3 führte

zu einer lockeren Foulingschicht mit hohen Fluxwerten. Die Trenngrenze der Membran hatte

nur geringfügigen Einfluss auf die Struktur der Foulingschicht.

Die Reduktion des Flux durch Fouling ist dabei abhängig von der Partikelgrößenverteilung.

Tarleton & Wakeman (1993) stellten bei der Filtration von Calcite-Suspensionen mit

verschiedenen Partikelgrößenverteilungen fest, dass besonders kleine Moleküle zur

Entstehung der Foulingschicht beitragen. Darüber hinaus spielt die Form der Partikel eine

entscheidende Rolle. Je geringer die Kugelhaftigkeit von Partikeln ist, desto höher ist die

Diskussion

185

Durchlässigkeit der Foulingschicht, sofern es sich nicht um plättchenförmige Partikel handelt

(Foust et al., 2008; Dullien, 1992). Proteinhydrolysate bestehen, abhängig vom Hydrolysegrad

und der Art des Enzyms (Exopeptidase, Endopeptidase), aus einer Vielzahl unterschiedlicher

Moleküle (Clemente, 2000). Diese können durch pH-abhängige Ladungsveränderung durch

ionische und hydrophobe Wechselwirkungen, sowie die Ausbildung von

Wasserstoffbrückenbindungen verschiedene Raumstrukturen annehmen (Schmid, 2016).

Bezieht man die Erkenntnisse der Autoren auf die in der vorliegenden Studie durchgeführte

Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz (keine Erhöhung der Ionenstärke) legen diese die

Vermutung nahe, dass Unterschiede im Permeatflux JFm bei der Fraktionierung von

Molkenproteinhydrolysaten durch Fouling hervorgerufen wurden, sich verschiedene pH-Stufen

aber nicht signifikant auf die Struktur der Foulingschicht und der damit verbundenen pH-

abhängigen Reduktion des Permeatflux auswirken.

Die Ausbildung der Foulingschicht wird hauptsächlich durch kleine Moleküle induziert. Diese

resultieren durch ladungsbasierte Adsorption in der Verblockung einzelner Membranporen

(internem Fouling), gemäß des Modells von Wang & Tarabara (2008) (siehe Abbildung 5; Seite

9). In einem weiteren Schritt kommt es zur Ausbildung einer Deckschicht (externes Fouling),

deren Struktur durch die Partikelgrößenverteilung der Hydrolysatmoleküle abhängig ist. Die

Partikelgrößenverteilung ist wiederum pH-abhängig. Aufgrund einer Vielzahl an

verschiedenen Molekülstrukturen resultierte eine Änderung des pHs nicht in deutlichen

Veränderungen der Struktur der Foulingschicht. Die in dieser Arbeit festgestellten

geringfügigen Unterschiede des Permeatflux lassen sich auf ladungsbedingte Abstoßungs-

bzw. Adsorptionseffekte zwischen Molekül und Membran zurückführen, die vermutlich

besonders in der Startphase des Filtrationsprozesses eine Rolle spielen.

Die Erhöhung der Ionenstärke durch Zusatz von 150 mM NaCl resultierte in der vorliegenden

Studie in einem Permeatflux JFm zwischen 30,27 ± 6,01 ml/min (pH 6) und 49,11 ± 3,23 ml/min

(pH 9) und lagen für die pH-Stufen 7, 8, 9 signifikant über dem Permeatflux einer

Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz. pH-Stufe 9 unterschied sich darüber hinaus signifikant von

den übrigen Stufen (pH 6, pH 7, pH 8). Vergleichbare Erkenntnisse stammen von She et al.

(2009), die bei der Filtration von BSA eine Steigerung des Permeatflux für die pH-Stufen 5,8

und 7 bei der Zugabe von NaCl beobachteten. Während die Konzentration bei pH 7 keinen

Einfluss besaß, resultierte eine Erhöhung der NaCl-Konzentration von 1 mM auf 10 mM und

weiter auf 100 mM in jeweils deutlichen Steigerungen des Permeatflux. Die Autoren führen

dies auf ein geringere Molekülgröße (hydrodynamisches Volumen) des BSA Moleküls zurück,

das in Folge nicht als Foulant auf der Membran zurückbleibt, sondern diese passiert. pH-

induzierte Abstoßungseffekte können dabei ebenfalls zu geringerer Foulingneigung und

höherem Permeatflux führen (Salgın, 2007). Es ist folglich davon auszugehen, dass beide

Diskussion

186

Effekte auch in der vorliegenden Arbeit eine Rolle spielen. Der Einfluss der Ionenstärke auf

den Permeatflux lässt sich nicht verallgemeinern. Bei der Fraktionierung von

Molkenproteinhydrolysat mit Molekülstrukturen ≤ 10 kDa stellten Pouliot et al. (1999) einen

signifikant niedrigeren Permeatflux für die pH-Stufe 9 fest, der darüber hinaus in einer

Zunahme des Widerstands durch Fouling führte. Die Autoren führen dies auf eine gesteigerte

Ionisation bzw. Abschirmung der ansonsten negativ geladenen Peptide zurück, die folglich,

aufgrund verringerter Interaktion zwischen Peptid und Membran, verstärkt zur Adsorption auf

der Membranoberfläche neigen. Teng et al. (2006) gehen darüber hinaus davon aus, dass

eine Erhöhung der Ionenstärke durch Abnahme des hydrodynamischen Volumens eines

Moleküls (hier: BSA) bei druckgetriebenen Filtrationsprozessen zur Ausbildung einer dichteren

Deckschicht führen, die zur Reduktion des Permeatflux führt.

Bezieht man die Erkenntnisse der Autoren auf die in der vorliegenden Studie durchgeführte

Fraktionierung mit NaCl-Zusatz (Erhöhung der Ionenstärke), legen diese die Vermutung nahe,

dass die Ionenstärke bei der Fraktionierung von Molkenproteinhydrolysaten einen

signifikanten Einfluss auf den Permeatflux JFm hat, der auf strukturellen Veränderungen der

Moleküle und ein verändertes Ladungsprofil zurückzuführen ist. Anders als bei intakten

Proteinen resultierte die Erhöhung der Ionenstärke nicht in einer Reduktion des Permeatflux,

sondern in einer Fluxsteigerung. Diese ist im Falle der im Rahmen dieser Arbeit

dokumentierten Ergebnisse pH-abhängig und nimmt mit steigenden pH-Wert zu. Die

Ausbildung einer dichteren Foulingschicht im Vergleich zu einer Filtration ohne NaCl-Zugabe

erscheint nicht wahrscheinlich. Vielmehr ist davon auszugehen, dass es durch die Erhöhung

der Ionenstärke zu einer Veränderung des Ladungsprofils des Hydrolysats kommt. Durch eine

ionenstärke-induzierte Reduktion des hydrodynamischen Radius kann es im Vorfeld zu der

Entstehung von Molekülaggregaten kommen, welche die Struktur der ausgebildeten

Foulingschicht durch einen erhöhten Anteil größerer Strukturen positiv beeinflussen. Darüber

hinaus führt eine Reduktion des hydrodynamischen Radius zu verbesserter Transmission.

Proteingehalt von Retentat mRet & Permeat mPer, Wiederfindungsrate:

Die Wiederfindungsrate wurde durch die Anpassung des pH-Werts nicht signifikant beeinflusst

und lag bei der Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz zwischen 76,91 ± 5,53 % (pH 7) und 94,85

± 4,63 % (pH 8). 27,92 ± 8,03 % (pH 7) bis 47,18 ± 8,94 % (pH 8) der verbleibenden

detektierbaren Verbindungen lagen im Retentat, 47,67 ± 3,43 % (pH 8) bis 53,02 ± 3,22 % (pH

9) im Permeat vor. Der Proteingehalt im Retentat lag damit zwischen 0,209 ± 0,060 g (pH 7)

und 0,354 ± 0,067 g (pH 8), sowie zwischen 0,358 ± 0,026 g (pH 8) und 0,398 ± 0,024 g (pH

9) im Permeat. Der Proteingehalt des Retentats bei einer Fraktionierung bei pH 7 lag signifikant

unter den Gehalten der verbleibenden pH-Stufen.

Diskussion

187

Zahlreiche Studien bestätigen die Abhängigkeit der Transmission vom pH-Wert des Feeds.

Bei der Filtration von BSA am IEP erreichten de la Casa et al. (2007), Persson et al. (2003)

und Huisman et al. (2000) eine BSA-Transmission von 55 – 100 %. Laut Huisman et al. (2000)

lässt sich dies auf pH-induzierte Veränderungen der Molekülgröße von Proteinen und

Proteinaggregaten, der Protein-Membran-Interaktion und der Eigenschaften der externen

Foulingschicht zurückführen. Die Molekülgröße eines Proteins (hydrodynamischer Radius) ist

am IEP am kleinesten (Pincet, Perez, & Belfort, 1995; Pincet, Perez, & Belfort, 1994). Persson

et al. (2003) gehen darüber hinaus davon aus, dass die Verbesserung der Transmission im

Ausbleiben von Ladungseffekten zwischen Protein und Membran, sowie Protein und

Foulingschicht begründet ist. Die Transmission von BSA am IEP kann jedoch nicht losgelöst

von weiteren Faktoren beurteilt werden. Membrantrenngrenze und Dauer des Prozesses

spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle. Huisman et al. (2000) stellten bei der Filtration von

BSA am IEP unter Verwendung einer Polysulfon-Membran mit einem MWCO von 300 kDa

nach 10 h die vergleichsweise niedrigste Transmission fest, obwohl zu Filtrationsbeginn die

höchste Transmission verzeichnet wurde. Die Autoren führen dies auf die Ausbildung einer

besonders dichten Foulingschicht zurück. Die Verwendung einer Trenngrenze von 100 kDa

resultierte hingegen in durchweg höherer Transmission. Unter den richtigen Bedingungen

(Membran, pH, Transmembrandruck) lässt sich auch ein Feed aus zwei Modellproteinen im

Bereich des IEP fraktionieren. Das Zielprotein wird dabei, bedingt durch eine Reduktion des

hydrodynamischen Radius, sowie einem neutralen Ladungszustand ins Permeat transportiert,

während die weiteren Proteine durch ladungsbedingte Abstoßung und größeren

hydrodynamischen Radius im Retentat zurückgehalten wird (Nyström et al., 1994). Eine

selektive Fraktionierung ist sogar gegen den Größengradienten möglich, wie Nyström et al.

(1994) für die Fraktionierung von Ovalbumin (45 kDa) und Myoglobin (17,4 kDa) bei einem pH

von 4,8 unter Kaliumchlorid (KCl) Zugabe zeigten. Saksena & Zydney (1994) stellten

vergleichbare Effekte bei der Fraktionierung von BSA (69 kDa) und IgG (155 kDa) unter

Verwendung einer Polyethersulfon Membran (MWCO 300 kDa), pH 7,4, 1,5 mM NaCl fest.

Abseits von Modellsystemen gestaltet sich eine selektive Fraktionierung am IEP schwierig. Bei

der Fraktionierung von geklärter Molke unter Verwendung einer Keramikmembran (MWCO

300 kDa) stellten Almécija et al. (2007) für die pH-Stufen 4 und 5 eine Retention von annährend

100 % für α-Lactalbumin, β-Lactoglobulin, BSA und IgG fest. Eine hohe Transmission für α-

Lactalbumin und β-Lactoglobulin wurde bei den pH-Stufen 7, 8 und 9 festgestellt. BSA wurde,

trotz einer Molekülgröße von ca. 69 kDa, in allen pH-Stufen (pH 3 – pH 10) zu 94 – 100 % im

Retentat zurückgehalten. Die Autoren führen dies für α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin, unter

Berufung auf Taulier & Chalikian (2001), sowie Boye, Alli, & Ismail (1997), auf die Ausbildung

von Proteinaggregaten aus bis zu acht Molekülen zurück. Die Ausbildung weiterer Aggregate

erscheint ebenfalls möglich. Die Ergebnisse von Almécija et al. (2007) deuten darauf hin, dass

Diskussion

188

die in Modellsystemen ermittelten optimalen Filtrationsbedingungen nicht ohne Weiteres auf

komplexere Medien übertragbar sind. Vielmehr ist eine experimentelle Ermittlung der

optimalen Bedingungen in Abhängigkeit des Feeds erforderlich. Darüber hinaus wird anhand

BSA (69 KDa) deutlich, dass auch Moleküle deren Größe weit unter der Trenngrenze (MWCO

300 kDa) der Membran liegen nicht alleinig anhand ihrer Größe getrennt werden können.

Die Erhöhung der Ionenstärke durch Zusatz von 150 mM NaCl resultierte in der vorliegenden

Arbeit in einer Wiederfindungsrate zwischen 74,88 ± 3,39 % (pH 7) und 81,74 ± 4,36 % (pH

8). Für die pH-Stufen 8 und 9 führte die Erhöhung der Ionenstärke zu einer signifikant

niedrigeren WFR. 18,10 ± 4,92 % (pH 7) bis 27,87 ± 4,22 (pH 6) lagen im Retentat, 47,27 ±

1,79 % (pH 6) bis 56,78 ± 5,23 % (pH 7) im Permeat vor. Der Proteingehalt im Retentat lag

zwischen 0,136 ± 0,037 g (pH 7) und 0,209 ± 0,031 g (pH 6), sowie zwischen 0,354 ± 0,014 g

(pH 6) und 0,426 ± 0,039 g (pH 7) im Permeat. Die Erhöhung der Ionenstärke resultierte in

einem gesteigerten Proteinanteil im Permeat, bei gleichzeitig geringerem Proteingehalt im

Retentat. Für die pH-Stufen 6 und 9 wird deutlich, dass der geringere Proteinanteil im Retentat

nicht nur auf einen gesteigerten Proteingehalt im Permeat, sondern vielmehr auf den Verlust

von Protein zurückzuführen ist.

Der Einfluss der Ionenstärke auf die Transmission ist unter anderem abhängig von pH-Wert,

Salzkonzentration und der Art des Feeds. Bei der Filtration von BSA konnten Persson et al.

(2003) die Transmission für pH 3 und 7 unter Zugabe von 0,15 M NaCl auf über 80 % steigern.

Die Zugabe von NaCl führte jedoch, besonders bei pH 7, zu einer deutlichen Minderung des

Permeatflux. Die Autoren führen dies auf eine Abschirmung der geladenen Moleküle durch

NaCl-Ionen zurück, die dazu führt, dass die Moleküle zur Ausbildung von Aggregaten und

einem daraus resultierenden dichteren Filterkuchen neigen. Die erhöhte Transmission

resultiert aus verminderten Abstoßungseffekten zwischen Membran und Protein aufgrund der

Ladungsneutralität des Proteins. Die durch das Fouling hohe Proteinkonzentration an der

Membranoberfläche begünstigt dabei die Transmission. Der selbe Effekt scheint auch bei

Hydrolysaten zu greifen. Pouliot et al. (1999) stellten bei der Fraktionierung von

Molkenproteinhydrolysat mit Molekülstrukturen ≤ 10 kDa unter Zugabe von 0,5 M NaCl bei

einem pH von 9 ebenfalls eine Steigerung der Transmission fest. Die Neutralisierung von

Ladungen zur Steigerung der Transmission entspricht dem zuvor beschriebenen Prinzip der

gezielten Filtration am IEP des Zielproteins und resultiert ebenfalls in verstärktem Fouling und

daraus folgendem Absinken des Permeatflux. Aber auch am IEP des Zielproteins lässt sich

die Transmission über eine gewisse Filtrationsdauer durch Zugabe geringer Mengen NaCl

verbessern. Eine Zugabe von 5 mM NaCl führte für de la Casa et al. (2007) bei einer Filtration

von BSA (pH 4,9) nicht nur zu einer Steigerung der Transmission zu Filtrationsbeginn (71 %),

sondern ermöglichte eine hohe Transmission über den gesamten Filtrationsprozess (57 – 62

Diskussion

189

%). Die Autoren führen dies ebenfalls auf eine Abschirmung verbleibender Partialladungen

von Proteinen und Membran durch NaCl-Ionen zurück. Die Erkenntnisse von Martin-Orue et

al. (1998) gehen noch einen Schritt weiter. Bei der Nanofiltration von vier kurzkettigen

Modellpeptiden arbeiten die Autoren heraus, dass nicht Nettoladung, sondern die Anzahl und

Art (positiv, negativ) der Partialladung entscheidend für den Transmissionsprozess eines

Peptids ist. Dem pH-Wert des Feeds wird dabei der größte Einfluss zugeschrieben, da dieser

die Ionisation des Feeds und die Oberflächenladung der Membran beeinflusst. Die Anzahl

negativer Partialladungen scheint entscheidend für die verminderte Transmission eines

Peptids zu sein. Durch eine Anpassung der Ionenstärke konnten ladungsbedingte

Rückweisungseffekte reduziert werden. Aus den Erkenntnissen wird deutlich, dass mit

steigender Komplexität des Feeds auch ladungsbedingte Effekte komplexer ausfallen. So sind

bei komplexeren Medien auch Verluste von intakten Proteinen durch Adsorption auf der

Membran, Denaturierung durch Scherkräfte oder den Zusammenschluss mit anderen

Proteinen möglich (Almécija et al., 2007). Diese Verluste resultieren in einer Reduktion der

Wiederfindungsrate während des jeweiligen Prozesses.

Der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf den Filtrationsprozess im Rahmen dieser Studie

ist folglich auf mehrere Effekte zurückzuführen. Bei der Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz

resultierte die Anpassung des pH-Werts in Veränderungen des Ladungszustands und des

hydrodynamischen Radius der Moleküle. Abhängig vom pH-Wert kommt es darüber hinaus

zur Beeinflussung der Zusammensetzung und Dichte der Foulingschicht. Da in einem

Hydrolysat verschiedenste, nicht näher kategorisierte Molekülstrukturen vorliegen, können die

Effekte ohne eine detaillierte Analyse der Hydrolysatzusammensetzung nicht auf bestimmte

Strukturen zurückgeführt werden. Die verhältnismäßig niedrige WFR in Verbindung mit dem

geringeren Proteingehalt des Retentats bei pH 7 ist diesbezüglich auf eine irreversible

Adsorption bestimmter Moleküle auf der Membran zurückzuführen. Die Erhöhung der

Ionenstärke führte zu geringfügig gesteigerter Transmission, aber gleichzeitig auch zu

durchweg geringerer WFR. Dies ist vermutlich auf eine Reduktion der zwischenmolekularen

Abstoßungseffekte, sowie der Peptid-Membraninteraktion zurückzuführen, die aus NaCl-

basierenden Abschirmungseffekten resultiert. Die geringere WFR lässt sich abermals durch

irreversible Adsorption bestimmter Moleküle auf der Membran erklären. Interessant ist die

Tatsache, dass die erhöhte Transmission nicht mit einer Reduktion des Permeatflux, sondern

vielmehr mit gesteigertem Flux einherging, obwohl anhand der WFR auf eine ausgeprägte

Foulingschicht geschlossen werden kann. Im Vergleich zu einer Filtration ohne NaCl-Zusatz

handelte es sich hierbei vermutlich um eine schwerpunktmäßig extern auftretende

Foulingschicht, die durch die Ausbildung von größeren Aggregaten eine gesteigerte

Permeation der Foulingschicht und der Membran zulässt. Im Fall der Filtration ohne NaCl-

Diskussion

190

Zusatz ist die Ausbildung von internem Fouling denkbar, die zu einer Reduktion des

Porendurchmessers der Membran und daraus folgend zu geringerem Permeatflux führte.


Bei der Betrachtung der Chromatogramme der Retentat-Fraktion wurde, weitestgehend

unabhängig vom pH-Wert, eine große Menge an Strukturen ≤ 1,35 kDa festgestellt (Abbildung

78 a, c - Abbildung 81 a, c). Moleküle ≥ 20 kDa wurden in allen Versuchen, unabhängig von

pH-Wert und Ionenstärke, im Retentat zurückgehalten (Abbildung 78 a, c - Abbildung 81 a, c).

Für pH 9 (Abbildung 81 b) konnte bei einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz die anteilsmäßig

größte Menge an Strukturen ≥ 20 kDa im Permeat festgestellt werden. Eine Fraktionierung bei

erhöhter Ionenstärke (Zusatz von 150 mM NaCl) führte, deutlich bei pH 7 und pH 8 (Abbildung

79 c, Abbildung 80 c) erkennbar, zu einem geringeren Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im

Retentat. Bei Betrachtung der Permeat-Fraktionen wurde eine Verschiebung der

Membrantrenngrenze hin zu einem niedrigeren MWCO festgestellt (Abbildung 78 b, d -

Abbildung 81 b, d). Der Zusatz von 150 mM NaCl führte im Fraktionierungsprozess,

insbesondere für pH 7 (Abbildung 79 d), pH 8 (Abbildung 80 d) und pH 9 (Abbildung 81 d), zu

erhöhten Anteilen von Strukturen ≥ 20 kDa. Die Molekülgrößenverteilung der Nullproben war,

mit Ausnahme des nicht zur Bewertung herangezogenen pH 4 (Abbildung 73 a, b),

weitestgehend identisch (Abbildung 74 a, b - Abbildung 77 a, b).

Der pH-Wert besaß im Rahmen dieser Arbeit durch seinen Einfluss auf den Ladungszustand

der Moleküle einen entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der Retentat- und

Permeat-Fraktionen, wie besonders am Vergleich der Fraktionierung ohne Zusatz von NaCl

bei pH 7 und pH 9 erkennbar ist. Die Retentat-Fraktion von pH 7 (Abbildung 79 a) zeichnet

sich durch einen besonders hohen Anteil an Molekülen ≥ 20 kDa aus, während der Anteil an

Molekülen ≥ 20 kDa im Permeat (Abbildung 79 b) gering ist. Bei pH 9 ist ein wesentlich höherer

Anteil an Molekülen ≥ 20 kDa im Permeat (Abbildung 81 b) vorzufinden, der in ähnlichem

Umfang nur bei einer Fraktionierung unter NaCl-Zusatz (pH 7 (mit NaCl): Abbildung 79 d, pH

8 (mit NaCl): Abbildung 80 d, pH 9 (mit NaCl): Abbildung 81 d) erreicht werden konnte. Das

lässt darauf schließen, dass die von Almécija et al. (2007) und Pouliot et al. (1999)

beschriebenen ladungsbedingten Abstoßungs- bzw. Interaktionseffekte zwischen

verschiedenen Molekülen, sowie zwischen Molekülen und Membran den

Fraktionierungsprozess maßgeblich beeinflusst haben. Die Transmission von Feed-Molekülen

ist unter Berufung auf die zitierten Autoren, abhängig von den Partialladungen der Moleküle,

sowie deren daraus resultierenden Interaktion mit der Membran, der Foulingschicht oder

anderen Molekülen und führt im Falle von pH 7 (Abbildung 79 a, b) zu einem vergleichsweise

hohen Rückhalt von Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat, wohingegen im Falle der Fraktionierung

bei pH 9 (Abbildung 81 a, b) das Ladungsprofil bestimmter Moleküle eine Transmission durch

Diskussion

191

die Membran ermöglichte. In Anlehnung an die von Huisman et al. (2000) für die Fraktionierung

von BSA erarbeiteten Ergebnisse wird darüber hinaus davon ausgegangen, dass

Eigenschaften wie Dicke und Dichte der Foulingschicht den Fraktionierungsprozess in

Abhängigkeit des pHs maßgeblich beeinflussen. Diese Faktoren führen in Kombination mit

dem vorab beschriebenen Einfluss des Ladungsprofils der Moleküle auf deren Transmission

zu einer komplexen Kaskade an Abläufen während des Fraktionierungsprozesses, die pH-

abhängig in Rückhalt oder Transmission bestimmter Moleküle resultiert.

Die anhand der WFR beurteilte, geringfügig höhere Transmission (Tabelle 30, Seite 112) bei

der Filtration unter NaCl-Zugabe resultierte in einem höheren Anteil an Molekülstrukturen ≥ 20

kDa im Permeat, insbesondere anhand der Chromatogramme von pH 7 (Abbildung 79 d), pH

8 (Abbildung 80 d) und pH 9 (Abbildung 81 d) erkennbar, der wahrscheinlich auf die von de la

Casa et al. (2007) und Persson et al. (2003) beschriebenen NaCl-induzierte

Abschirmungseffekte von Partialladungen zurückzuführen ist. Dabei spielte vermutlich die

Zusammensetzung und Dichte der entstehenden Foulingschicht eine Rolle. Abhängig von

Ladungszustand und dem Vorhandensein von NaCl-Ionen ist hierbei, in Anlehnung an

Persson et al. (2003), die Ausbildung von Aggregaten denkbar, die durch Ablagerung auf der

Membran eine für ungeladene Moleküle durchlässige Foulingschicht bildeten. Es wird folglich

davon ausgegangen, dass die Partialladungen bestimmter Moleküle ≥ 20 kDa durch NaCl-

Ionen abgeschirmt wurden, sodass diese aufgrund geringerer Abstoßungseffekte zwischen

Membran und Molekül, bzw. Molekül und Foulingschicht, die Membran passieren konnten.

Vergleicht man die in Retentat und Permeat festgestellten Anteile an Molekülen ≥ 20 kDa der

Fraktionierung ohne Zusatz von NaCl mit den Anteilen an Molekülen ≥ 20 kDa der

Fraktionierung unter Zusatz von NaCl und bezieht die erhöhte WFR des Permeat bei

gleichzeitig reduzierter WFR im Retentat der Fraktionierung unter Zusatz von NaCl mit ein,

lässt dies darauf schließen, dass der erhöhte Anteil an Molekülen ≥ 20 kDa im Permeat auf

eine Transmission selbiger durch die Membran zurückzuführen ist. Die im Falle der

Fraktionierung mit NaCl ermittelte, deutliche niedrigere Gesamt-WFR (pH 8 (ohne NaCl):

94,85 ± 4,63 %, pH 8 (mit NaCl): 81,74 ± 4,36 %; pH 9 (ohne NaCl): 91,10 ± 4,63 %, pH 9 (mit

NaCl): 77,67 ± 4,82 %) ist vermutlich in einer irreversiblen Adsorption von Molekülen auf der

Membran, bzw. der Foulingschicht, vergleichbar den von Pouliot et al. (1999) für

Molkenprotein-Hydrolysat beschriebenen ladungsbedingten Effekte zurückzuführen, da

insbesondere die Molekül-Membran-Interaktion bei Filtrationsprozessen zu einer irreversiblen

Adsorption von Molekülen auf der Membran führen kann (Huisman et al., 2000)

Das Zurückbleiben kleiner Moleküle im Retentat (Abbildung 78 a, c - Abbildung 81 a, c) lässt

sich, in Anlehnung an Nyström et al. (1994) und Saksena & Zydney (1994), durch

Ladungseffekte erklären, die unter bestimmten Feed-Bedingungen, insbesondere dem pH-

Diskussion

192

Wert zu einer Auftrennung gegen den Größengradienten der Moleküle führen können. In Falle

dieser Studie ist davon auszugehen, dass Strukturen ≤ 1,35 kDa durch Abstoßungseffekte

zwischen Molekül-Membran oder Molekül-Foulingschicht im Retentat zurückgehalten wurden.


Für Molkenprotein-Isolat wurde der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf die Parameter

Permeatflux JFm, Proteingehalt in Retentat mRet und Permeat mPer (Transmission), sowie die

Wiederfindungsrate diskutiert. Im Falle der Alge Chlorella vulgaris wurden darüber hinaus

weitere Daten zur Charakterisierung des Filtrationsprozesses erfasst. Die Permeatmenge VPer

zum Zeitpunkt t wurde über die Prozesszeit tF aufgetragen und die Regressionsfunktion der

Permeatzunahme, sowie deren Bestimmtheitsmaß R2 ermittelt. Zudem wurde der mittlere pH-

Wert des Retentats bestimmt, um etwaige pH-Wert abhängige Effekte beurteilen zu können.

Auf membrangestützten Filtrationsverfahren basierende Prozesse werden im Falle von

Mikroalgen insbesondere bei der Erzeugung (z.B. Behandlung des Wachstumsmedium für die

Rezirkulation) und Gewinnung (z.B. Separation der Biomasse aus dem flüssigen

Wachstumsmedium) der Algen eingesetzt, wie Drexler & Yeh (2014) in einem aktuellen

Review bezüglich der Anwendung membranbasierter Prozesse im Zusammenhang mit Algen

darlegen. Zur Gewinnung bestimmter Peptidverbindungen aus Algen-Hydrolysaten sind

säulenbasierte Gel-Filtrationsverfahren in Kombination mit weiteren

säulenchromatographischen Verfahren beschrieben (Sheih, Fang, & Wu, 2009a; Sheih, Wu,

& Fang, 2009b). Bei der Gewinnung intakter Algenzellen aus dem flüssigen

Wachstumsmedium per „Ausflockung“ spielt der pH-Wert eine entscheidende Rolle, wie

Studien von Pérez, Salgueiro, Maceiras, Cancela, & Sánchez (2017), Liu et al. (2013) & Wu

et al. (2012) belegen. Wu et al. (2012) erreichten für Chlorella vulgaris, Scenedesmus sp. und

Chlorococcum sp. eine Ausflockungs-Effizienz von > 90 % für pH-Werte > 10,6. Der Beginn

der Agglomeration wurde von den Autoren bereits ab einem pH > 8,6 beobachtet. Die

Ausflockungs-Effizienz, sowie das Auftreten von Fouling bei membranbasierten Prozessen

können dabei nicht losgelöst vom Vorhandensein extrazellulärer polymerer Substanzen

(EPS)/extrazellulärer organischer Stoffe (EOM) betrachtet werden (Drexler & Yeh, 2014; Wu

et al., 2012). Wu et al. (2012) untersuchten den Einfluss von freien Polysacchariden (RPS) auf

die Ausflockungs-Effizienz von Chlorella vulgaris. Konzentrationen von 25 mg/l bzw. 70 mg/l

RPS resultierten in einer Reduktion der Ausflockungs-Effizienz bei pH 10,6 von > 90 % auf <

40 % bzw. < 10 % (Wu et al., 2012).

Für die vorliegende Studie muss folglich der Einfluss von im Feed vorliegenden EPS/RPS,

insbesondere unter Berücksichtigung des Kohlenhydratanteils (12 %) im Rohstoff „Chlorella

vulgaris Powder“ (Lot. 201410215) (Allma, Lissabon, PRT) miteinbezogen werden.

Diskussion

193

Permeatflux JFm:

Die Anpassung des pH-Werts resultierte bei der im Rahmen dieser Studie durchgeführten

Fraktionierung von Algen-Hydrolysat ohne NaCl-Zusatz lediglich im Falle von pH 6 (42,91 ±

2,22 ml/min) (höchster Permeatflux der Versuchsreihe) im Vergleich zu pH 3 (29,15 ± 0,35

ml/min) (niedrigster Permeatflux der Versuchsreihe) in signifikant erhöhten Permeatflux (p <

0,05). Die verbleibenden pH-Stufen unterschieden sich nicht signifikant (p > 0,05).

Im Falle der vorausgehend diskutierten Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysat

wurde der Einfluss des pH-Wert auf den Permeatflux durch das Auftreten von Fouling

begründet (Kapitel 5.3.2.1, Seite 183). Die durch Fouling hervorgerufene Verminderung des

Flux wurde unter Berufung auf Arbeiten von, unter anderem, Huisman et al. (2000), Pouliot et

al. (1999) und Tarleton & Wakeman (1993) auf den Einfluss des pH-Werts auf die

Partikelgrößenverteilung, ladungsbedingten Interaktions- und Abstoßungseffekten, sowie die

damit in Verbindung stehende Struktur der Foulingschicht zurückgeführt. Die für

Molkenprotein-Isolat erarbeitete Argumentationskette stellt auch für den Einfluss des pH-

Werts auf die Fraktionierung der Alge Chlorella vulgaris ein Erklärungsszenario dar, bedarf

zusätzlich aber weiterer Betrachtung.

Eine Erhöhung des pH-Werts führt für intakte Mikroalgenzellen in Abhängigkeit des

Vorhandenseins extrazellulärer Substanzen (z.B. freie Polysaccharide), wie vorab dargestellt,

zur Ausflockung von bis zu 90 % der Zellen (Wu et al., 2012). Setzt man eine durch die

Ausflockung bedingte Ausbildung einer Foulingschicht voraus, entsprechen die Ergebnisse

der Autoren den Beobachtungen der vorliegenden Studie, in der ein Abfall des Permeatflux

bei steigendem pH (von pH 6 auf pH 11) beobachtet wurde, dessen Ausprägung, unter

Berufung auf das für Molkenprotein-Isolat dargestellt Szenario, durch eine pH-abhängig

unterschiedlich strukturierte Foulingschicht und somit einen pH-abhängig Verminderung des

Permeatflux zurückgeführt werden kann. Die Erkenntnisse weiterer Autoren lassen darüber

hinaus darauf schließen, dass auch eine Absenkung des pHs in den sauren Bereich in einer

Ausflockung intakter Algenproteine resultiert (Pérez et al., 2017; Liu et al., 2013). Liu et al.

(2013) beobachteten für die Mikroalgen Chlorococcum ellipsoideum, Chlorococcum nivale und

Scenedesmus sp. eine beginnenden Ausflockung bei der Absenkung des pHs von pH 6,7 auf

pH 5. Eine weitere Absenkung des pHs resultierte in einer Ausflockung > 85 % - > 95 %

zwischen pH 4,5 und pH 1,5, in Abhängigkeit der Alge. In der vorliegenden Studie wurde ein

signifikanter Abfall des Permeatflux für pH 3 im Vergleich zu pH 6 festgestellt, der unter

Voraussetzung der Annahme der Ausbildung einer Foulingschicht durch Ausflockung, mit den

Erkenntnissen der Autoren übereinstimmt.

Die durch Fouling hervorgerufene Reduktion des Permeatflux kann nicht alleinig durch eine

pH-Wert-abhängige Ausbildung von Fouling begründet werden. Das Vorhandensein von

Diskussion

194

extrazellulären polymeren Substanzen trägt ebenso zum Foulingprozess bei (Drexler & Yeh,

2014). Diese EPS bestehen zum Großteil aus Polysacchariden und Proteinen (Wicaksana,

Fane, Pongpairoj, & Field, 2012; Her, Amy, Park, & Song, 2004). Wie bereits vorab dargestellt,

resultiert das Vorhandensein von freien Polysacchariden in Abhängigkeit der Konzentration

(25 mg/l bzw. 70 mg/l) in einer deutlichen Reduktion der Ausflockung um bis zu > 80 % bei

durch Erhöhung des pH-Werts ausgelöster Ausflockung (Wu et al., 2012). In Anbetracht der

Ergebnisse dieser Studie, in denen die pH-abhängige Veränderung des Permeatflux lediglich

in einem Fall (vergleiche: pH 3 vs. pH 6) signifikant ausfiel, sowie der Berücksichtigung der

Rohstoffzusammensetzung (Auszug: Proteingehalt: 52,0 %; Fett: 9,6 %; Kohlenhydrate: 12,0

%; Ballaststoffe: 13,6 %; Asche: 6,8 %), muss davon ausgegangen werden, dass das

Vorhandensein von EPS den Filtrationsprozess beeinflusst hat. Hierfür kommen insbesondere

während des Vorbehandlungs-, Filtrations- und Hydrolyseprozess freigesetzte freie

Polysaccharide infrage. Algenzellen (Microcystis aeruginosa, Chlorella vulgaris) tragen über

einen breiten pH-Bereich negative Ladungen auf der Oberfläche (Hadjoudja et al., 2010).

Diese verhindern eine Aggregation der Zellen. Eine Verminderung der Oberflächenladung

über einen bestimmten Punkt hinaus führt zur Ausflockung (Liu et al., 2013). Auch das

Vorhandensein von positiv geladenen Ionen führt zu einer Reduktion der Abstoßung zwischen

den Zellen und förderte deren Ausflockung. Bei der Ausflockung von intakten Mikroalgen-

Zellen „konkurrieren“ RPS mit den (negativ geladenen) Algenzellen um (positiv geladene)

multivalente Ionen und führend hierbei zu einer Reduktion der Ausflockung (Chen, Li, Liu, &

Jiao, 2009).

Das im Rahmen dieser Studie verwendete Feed aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

verfügt über eine komplexe Zusammensetzung unterschiedlicher Molekülstrukturen, deren

Ladungsprofil pH-abhängig ist. Die Erkenntnisse der vorab zitierten Autoren beruhen auf

Untersuchungen zu intakten Algenzellen und können somit nicht ohne Weiteres auf Algen-

Hydrolysate übertragen werden. Die aufgezeigten Übereinstimmungen hinsichtlich der pH-

Abhängigkeit des Permeatflux deuten jedoch darauf hin, dass die für intakte Algenzellen

bekannten Einflussfaktoren auch als Hinweis für das pH-abhängige Verhalten hydrolysierter

Algen, wie die im Fall dieser Studie verwendete Chlorella vulgaris, betrachtet werden können.

Das Vorhandensein von EPS/RPS vermindert im Rahmen dieser Studie vermutlich den Effekt

der pH-Anpassung. Es wird darüber hinaus angenommen, dass die Gegenwart von EPS/RPS

zu einer Stabilisierung des Filtrationsprozesses durch geringere Ausflockung von Feed-

Molekülen führt.

Die Erhöhung der Ionenstärke durch Zusatz von 150 mM NaCl resultierte in dieser Studie in

einem Permeatflux JFm zwischen 26,67 ± 5,68 ml/min (pH 11) und 35,71 ± 5,22 ml/min (pH 6)

und lagen für die pH-Stufen 7, 11 signifikant unter dem Permeatflux einer Fraktionierung ohne

Diskussion

195

NaCl-Zusatz JFm (pH 7 (ohne NaCl): 38,27 ± 2,86 ml/min, pH 7 (mit NaCl): 31,15 ± 1,16 ml/min;

pH 11 (ohne NaCl): 37,94 ± 6,83 ml/min, pH 11 (mit NaCl): 26,67 ± 5,68 ml/min). Auch für die

weiteren pH-Stufen wurde eine Abnahme des Flux beobachtet.


wurde der Einfluss der Ionenstärke auf den Permeatflux, unter Berufung auf, unter anderem,

She et al. (2009) und Salgın (2007) in einer ionenstärke-abhängigen Veränderung des

hydrodynamischen Radius und des Ladungsprofils der Moleküle im Hydrolysat zurückgeführt

die sich auf die Ausbildung und Struktur der Foulingschicht auswirken (Kapitel 5.3.2.1, Seite

183).

Chatsungnoen & Chisti (2016) stellten bei Ausflockungsversuchen für Chlorella vulgaris unter

Zuhilfenahme verschiedener Fällungsmittel (Aluminium-Sulfat, Eisenchlorid) einen Einfluss

der Ionenstärke des Mediums auf die Menge an benötigtem Fällungsmittel fest. Mit steigender

Ionenstärke wurde weniger Fällungsmittel benötigt. Bilanovic, Shelef, & Sukenik (1988)

untersuchten den Einfluss der Polymere Chitosan, Zetag 63 und Zetag 92 auf die Ausflockung

von Mikroalgen. Dabei stellten die Autoren fest, dass eine Erhöhung der Ionenstärke in einer

deutlichen Reduktion der Ausflockungs-Effizienz resultierte. Molina Grima, Belarbi, Acién

Fernández, Robles Medina, & Chisti (2003) führen eine Verminderung der Wirksamkeit

kationischer Polymere auf eine strukturelle Veränderung (Zusammenfalten) selbiger zurück.

Die Annahme vorausgesetzt, dass im Feed vorhandene RPS, sowie weitere EPS über

Ladungspotentiale verfügen und somit beispielsweise ähnlich kationischer Polymere, bzw. als

deren Konkurrenten um eine freie Bindungsstelle wirken, kann auch im Falle des in dieser

Studie verwendeten Feeds aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) davon ausgegangen

werden, dass sich eine Veränderung der Ionenstärke auf das Ladungsprofil dieser Moleküle

auswirkt und somit zu einer Molekül-Molekül Interaktion führt, die in der Ausbildung einer pH-

und ionenstärke-abhängigen Foulingschicht resultiert. Wie bereits im Diskussionsteil für die

Versuche mit Molkenprotein-Isolat hergeleitet, ist darüber hinaus davon auszugehen, dass die

Erhöhung der Ionenstärke sich im Fall dieser Studie auf den hydrodynamischen Radius und

das Ladungsprofil der Feed-Moleküle auswirkt. Der Einfluss der Ionenstärke auf den

Permeatflux von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ist somit vermutlich auf mehrere

Effekte zurückzuführen und resultiert in der Ausbildung einer pH-abhängig unterschiedlich

strukturierten Foulingschicht, die den Permeatflux maßgeblich beeinflusst. Diese Effekte

wirken sich im Vergleich zu einer Filtration ohne den Zusatz von 150 mM NaCl negativ auf den

Permeatflux aus, sodass dieser unter den korrespondierenden Flux-Werten einer

Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz liegen.

Diskussion

196


Die Wiederfindungsrate wurde durch die Anpassung des pH-Werts nicht signifikant beeinflusst

und lag bei der Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz zwischen 68,64 ± 4,18 % (pH 3) und 77,11

± 1,58 % (pH 6). 12,47 ± 1,04 % (pH 3) bis 24,61 ± 3,92 % (pH 11) der verbleibenden

detektierbaren Verbindungen lagen im Retentat, 46,06 ± 5,43 % (pH 11) bis 63,14 ± 2,42 %

(pH 6) im Permeat vor. Der Proteingehalt im Retentat lag damit zwischen 0,093 ± 0,008 g (pH

3) und 0,185 ± 0,029 g (pH 11), sowie zwischen 0,345 ± 0,041 g (pH11) und 0,474 ± 0,018 g

(pH 6) im Permeat. Der Proteingehalt des Retentats bei einer Fraktionierung bei pH 11 lag

signifikant über den Gehalten der pH-Stufen pH 3, pH 6, pH 7, der Proteingehalt des Permeats

für pH 6 und pH 7 signifikant darunter.

Eine (Crossflow-)Filtration intakter Algenzellen findet vornehmlich zur Gewinnung von Zellen

aus dem Wachstumsmedium statt. Eine Vielzahl von Studien, unter anderem von Zhao et al.

(2017), Wicaksana et al. (2012) und Castaing et al. (2010) beleuchtet beispielsweise den

Einfluss des MWCO und Typ der Membranen, der Strömungsgeschwindigkeit und der Feed-

Konzentration auf den Filtrationsprozess verschiedener Mikroalgen. Hierbei werden die

Algenzellen stets im Retentat zurückgehalten. Der bei Separierungsprozessen zur Bewertung

herangezogene Faktor der Transmission wird selten betrachtet und behandelt, wie im Falle

der Studie von Wicaksana et al. (2012), die Transmission von EPS ermittelt über den Gehalt

des „Gesamten organischen Kohlenstoffs“ (TOC). Die Diskussion des Einflusses des pH-

Werts auf die Transmission im Falle der in dieser Studie durchgeführte Fraktionierung von

hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) basiert aufgrund der Quellenlage auf

Veröffentlichungen anderer pflanzlicher Proteine.


wurde der Einfluss des pH-Wert auf Transmission und WFR, unter Berufung auf, unter

anderem, Huisman et al. (2000), auf der pH-abhängigen Veränderungen der Molekülgröße

von Proteine und Proteinaggregaten, der Protein-Membran-Interaktion und der Eigenschaften

der externen Foulingschicht zurückgeführt (Kapitel 5.3.2.1, Seite 183). In diesem

Zusammenhang spielt der Ladungszustand der Moleküle eine entscheidende Rolle. Studien

von Nyström et al. (1994) und Saksena & Zydney (1994) belegen anhand von

Modellversuchen, dass in Abhängigkeit des Ladungszustands der Feed-Moleküle sogar eine

selektive Fraktionierung gegen den Größengradienten möglich ist. Unter den richtigen

Bedingungen (Membran, pH, Transmembrandruck) lässt sich ein Feed aus zwei

Modellproteinen im Bereich des IEP fraktionieren. Hierbei wird das Zielprotein bedingt durch

eine Reduktion des hydrodynamischen Radius, sowie neutralem Ladungszustand ins Permeat

transportiert. Weitere Proteine werden durch ladungsbedingte Abstoßung und größeren

hydrodynamischen Radius im Retentat zurückgehalten (Nyström et al., 1994). Für komplexere

Diskussion

197

Feeds wie Molke ist eine selektive Fraktionierung nicht ohne Weiteres möglich, wie Ergebnisse

von Almécija et al. (2007) belegen.

Nach Ursu et al. (2014) liegt der IEP eines Großteils der Proteine der Alge Chlorella vulgaris

bei 4,0 – 5,5, sowie für einen kleineren Teil der Proteine bei 6,0 – 8,0. Im Rahmen dieser

Studie wurden im pH-Bereich 6 – 8 bei einer Fraktionierung ohne Zusatz von 150 mM NaCl

die höchste WFR, sowie eine hohe Transmission festgestellt, während eine Fraktionierung bei

pH 11 in verminderter WFR und Transmission resultierte. Anders als bei den von Nyström et

al. (1994) und Saksena & Zydney (1994) anhand von Modelllösungen aus Ovalbumin und

Myoglobin, sowie BSA und IgG durchgeführten Versuchen handelt es sich in dieser Studie um

ein Feed aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris), dessen molekulare Zusammensetzung

nicht näher charakterisiert ist. Es wird jedoch vermutet, dass der Einfluss des pHs auf

Transmission und WFR, unter Berufung auf die zitierten Autoren, sowie die bereits für die

Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat entwickelte Hypothese in einer pH-induzierten

Änderung des hydrodynamischen Radius, sowie Abstoßungs- und Adhäsions-Effekten

resultiert, welche die Transmission, sowie die Foulingneigung und Struktur der Foulingschicht

beeinflussen. Die Gegenwart von RPS/EPS besitzt darüber hinaus vermutlich ebenfalls, wie

vorab dargestellt, einen Einfluss auf die pH-Stabilität des Feeds und beeinflusst somit auch

die Neigung zur Deckschichtbildung und Deckschichtstruktur.

Die Erhöhung der Ionenstärke durch Zusatz von NaCl resultierte in einer Wiederfindungsrate

zwischen 67,83 ± 12,66 % (pH 11) und 73,51 ± 1,44 % (pH 6). 14,89 ± 1,98 % (pH 7) bis 23,61

± 5,91 (pH 11) lagen im Retentat, 44,23 ± 6,77 % (pH 11) bis 57,15 ± 1,12 % (pH 7) im Permeat

vor. Der Proteingehalt im Retentat lag zwischen 0,112 ± 0,010 g (pH 3)/0,112 ± 0,015 g (pH

7) und 0,177 ± 0,044 g (pH 11), sowie zwischen 0,332 ± 0,051 g (pH 11) und 0,429 ± 0,008 g

(pH 7) im Permeat. Die Erhöhung der Ionenstärke resultierte in einem geringeren Proteinanteil

im Permeat.


wurde der Einfluss der Ionenstärke auf Transmission und WFR, unter Berufung auf, unter

anderem, de la Casa et al. (2007), Persson et al. (2003) und Pouliot et al. (1999) auf eine

Abschirmung geladener Moleküle durch NaCl-Ionen zurückgeführt. Die Abschirmung der

Partialladung resultierte in einer veränderten Struktur der Foulingschicht, beeinflusste die

Foulingneigung, sowie die Molekül-Molekül und Molekül-Membran-Interaktion und sorgte

somit für veränderte Transmissionseigenschaften. Im Falle des in dieser Studie verwendeten

Feeds aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ist zusätzlich davon auszugehen, dass der

vorab dargestellt Einfluss von EPS/RPS sich auch bei einer Fraktionierung unter Zusatz von

150 mM NaCl auf das Ladungsprofil der Feed-Moleküle auswirkt und somit den

Foulingprozess und daraus resultierende Einflüsse auf die Transmission und WFR

Diskussion

198

mitbestimmt. Die im Vergleich mit der bei einer Fraktionierung ohne Zusatz von 150 mM NaCl

niedrigere WFR, sowie die geringeren Proteinanteile im Permeat bei gleichzeitig ähnlichen

Proteinanteilen im Retentat sind damit vermutlich in einer geringeren Transmission begründet

die durch die Ausbildung einer weniger durchlässigen Foulingschicht aufgrund von Molekül-

Molekül-, sowie Molekül-Membran-Interaktion zustande kommt, welche teilweise zu einer

irreversible Adsorption bestimmter Moleküle auf der Membran führen. Im Falle einer Filtration

intakter Mikroalgen scheint der durch Fouling verursachte Einfluss auf den

Filtrationsprozesses hauptsächlich in der Ausbildung eines Filterkuchens begründet (Ahmad,

Mat Yasin, Derek, & Lim, 2012; Castaing et al., 2010). Aufgrund der komplexeren

Zusammensetzung des Feeds in dieser Studie, sind den Filtrationsprozess beeinflussende

Effekte, die durch Adsorption auf der Membran, bzw. in den Poren der Membran gemäß des

Modells von Wang & Tarabara (2008) auftreten, jedoch nicht auszuschließen.


Die Beurteilung der „Güte der Fraktionierung“ findet im Rahmen dieser Studie unter

Zuhilfenahme der für die Fraktionierung hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) zusätzlich

ermittelten und im Ergebnis-Abschnitt „Weitere Daten zur Charakterisierung des

Filtrationsprozesses“ dargestellten Daten statt.

Bei der Betrachtung der Chromatogramme der Retentat-Fraktion wurde vergleichbar der

anhand von Molkenprotein-Isolat gewonnenen Ergebnisse, weitestgehend unabhängig vom

pH-Wert eine große Menge an Strukturen ≤ 1,35 kDa festgestellt (Abbildung 90 a, c - Abbildung

94 a, c). Moleküle ≥ 20 kDa wurden im Falle einer Fraktionierung ohne 150 mM NaCl-Zusatz

nicht (pH 3: Abbildung 90 a, pH 8: Abbildung 83 a, pH 11: Abbildung 94 a) oder nur in sehr

geringen Anteilen (pH 6: Abbildung 91 a, pH 7: Abbildung 92 a) im Retentat zurückgehalten

bzw. festgestellt. Die Beobachtungen decken sich mit den Auswertungen zum

Bestimmtheitsmaß R2, das eine Aussage über die Linearität der Permeatzunahme ermöglicht

und somit eine Aussage über den Einfluss von Fouling auf den Filtrationsprozess ermöglicht.

Hier wurde für pH 6 (0,991 ± 0,004) und pH 7 (0,998 ± 0,003) die höchste Linearität der

Permeatzunahme festgestellt. Eine Fraktionierung bei erhöhter Ionenstärke (Zusatz von 150

mM NaCl) führte für pH 3 (Abbildung 90 c), pH 6 (Abbildung 91 c) und in geringerem Umfang

pH 8 (Abbildung 93 c) zu einem erhohten Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat. Über das

höchste Bestimmtheitsmaß R2 verfügte die bei pH 7 (0,990 ± 0,003) durchgeführte

Fraktionierung. Anhand der Permeat-Fraktionen ist, sowohl für die Fraktionierung unter Zusatz

von 150 mM NaCl als auch für die Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz, eine deutliche

Verschiebung der Membrantrenngrenze hin zu einem niedrigeren MWCO erkennbar

(Abbildung 90 b, d - Abbildung 94 b, d). Molekülverbindungen ≥ 5 – 10 kDa konnten

unabhängig von pH-Wert und Ionenstärke nicht, oder nur in verschwindend kleinen Anteilen

Diskussion

199

nachgewiesen werden (pH 7: Abbildung 92 d, pH 8: Abbildung 93 d). Molekülstrukturen ≤ 1,35

kDa sind stark repräsentiert.

Der mangelnde Rückhalt, bzw. das Fehlen von Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat ist im Falle

der Fraktionierung für pH 3, pH 8 und pH 11 ohne Zusatz von NaCl auf den anteilsmäßig nicht

nachweisbaren (pH 3, pH 11)/geringen (pH 8) Gehalt an Strukturen ≥ 20 kDa in der Nullprobe

zurückzuführen (pH 3: Abbildung 85 a, pH 8: Abbildung 88 a, pH 11: Abbildung 89 a). Die

Abtrennung von Molekülen ≥ 20 kDa ist unter Berufung auf Liu et al. (2013) bzw. Wu et al.

(2012) möglicherweise auf Ausflockung von Feed-Molekülen im Rahmen der Vorfiltration

zurückzuführen. Die Autoren beobachteten bei intakten Algenzellen eine Ausflockungs-

Effizienz von > 85 - 95 % bei Absenken des pHs unter pH 4,5, bzw. Anheben des pHs über

10,6. Für pH 6 (Abbildung 86 a) und pH 7 (Abbildung 87 a) verfügten die Nullproben über eine

breite Molekülgrößenverteilung. In Anbetracht der im Vergleich zur Filtration von

hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat deutlich reduzierten WFR (vergleiche: WFR

(Molkenprotein-Isolat, pH 6: 89,64 ± 11,46 %, WFR (Alge (Chlorella vulgaris), pH 6: 77,11 ±

1,58 %) wird vermutet, dass Strukturen ≥ 20 kDa durch Molekül-Membran-, ähnlich der von

Pouliot et al. (1999) für Molkenprotein-Hydrolysat beschriebenen ladungsbedingten Effekte,

Molekül-Foulingschicht-Interaktion oder eine hohe Dichte der Foulingschicht als Teil einer

irreversiblen Deckschicht auf der Membran zurückgehalten wurden. Insbesondere die

Molekül-Membran-Interaktion kann bei Filtrationsprozessen zu einer irreversiblen Adsorption

von Molekülen auf der Membran führen (Huisman et al., 2000). Der bei erhöhter Ionenstärke

(Zusatz von 150 mM NaCl) für pH 3 (Abbildung 90 c), pH 6 (Abbildung 91 c) und in geringerem

Umfang pH 8 (Abbildung 93 c) nachgewiesene erhohte Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im

Retentat kann, vergleichbar der Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat, auf die von de la

Casa et al. (2007) und Persson et al. (2003) beschriebenen, NaCl-induzierte

Abschirmungseffekte von Partialladungen zurückgeführt werden. So wird im Rahmen dieser

Studie davon ausgegangen, dass eine Abschirmung der Partialladung bestimmter Moleküle

zu einer Reduktion der Molekül-Membran-Interaktion führe. Strukturen ≥ 20 kDa wurden in

Folge aufgrund einer Reduktion des MWCO der Membran durch Ausbildung einer

Foulingschicht im Retentat zurückgehalten ohne eine irreversible Interaktion mit Membran

oder Foulingschicht einzugehen.

Die Chromatogramme der Permeat-Fraktionen werden unabhängig von pH und Ionenstärke

von Molekülen ≤ 1,35 kDa dominiert. Für die pH-Stufen pH 3, pH 8 und pH 11 ohne Zusatz

von NaCl ist der Mangel an Molekülen ≥ 1,35 kDa auf die anteilsmäßig nicht nachweisbaren

(pH 3, pH 11)/geringen (pH 8) Gehalte an Strukturen ≥ 20 kDa in der Nullprobe zurückzuführen

(pH 3: Abbildung 85 a, pH 8: Abbildung 88 a, pH 11: Abbildung 89 a). Diese gilt jedoch nicht

für die Nullproben von pH 3 (Abbildung 85 b), pH 8 (Abbildung 88 b) und pH 11 (Abbildung 89

Diskussion

200

b), die unter Zusatz von 150 mM NaCl gewonnen wurden. Unter Berufung auf die vorab

genannten Autoren wird davon ausgegangen, dass die geringen/nicht feststellbaren Anteil an

Strukturen ≥ 20 kDa im Permeat auf ein komplexes Zusammenspiel der beschriebenen Effekte

beruht. Kernpunkt der Argumentation ist dabei der pH- und ionenstärke-abhängige Einfluss

der Partialladungen, bzw. der NaCl-induzierten Abschirmungen von geladenen Molekülen.

Diese resultieren in einer pH- und ionenstärke-abhängigen Ausbildung einer Foulingschicht

durch Molekül-Molekül-, Molekül-Membran- und im weiteren Prozessverlauf Molekül-

Foulingschicht-Interaktion. Die Transmission von Molekülen ≥ 20 kDa wird in Folge durch die

pH- und ionenstärke-abhängige Molekülladung, sowie ladungsbedingte Interaktions- und

Abstoßungseffekte zwischen Molekülen, bzw. zwischen Molekülen und Membran bestimmt.

Wie bereits vorab dargestellt, wird dabei davon ausgegangen, dass bestimmte Moleküle

aufgrund irreversibler Adsorption auf der Membran bzw. durch Rückhalt aufgrund eines durch

Fouling reduzierten MWCO über der Membran zurückgehalten werden. Das Vorhandensein

von EPS/RPS im Feed, sowie die komplexe Feed-Zusammensetzung erschwert eine

dezidierte Zuweisung der Effekte zu bestimmten Verbindungen.

Zusätzlich zu der dargestellten Hypothese muss ein weiterer Faktor bei der Bewertung der

Zusammensetzung der Retentat- und Permeat-Fraktionen miteinbezogen werden. In Kapitel

5.2.1 (Seite 179) wurde unter Berufung auf Morris et al. (2008) und Roberts (2007)

herausgearbeitet, dass die Molekülgrößenverteilung der hydrolysierten Alge (Chlorella

vulgaris) für den Fall des im Rahmen dieser Studie verwendeten Hydrolyseverfahrens

(Vorbehandlung: HCl, pH 3, 48 h; Hydrolyse: Pronase 0,25 % (112,5 PU), 45 min) auf das

Vorhandensein von Aggregaten schließen lässt. Hinsichtlich des geringen Anteils an

Molekülen ≥ 20 kDa in Permeat und Retentat der Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella

vulgaris) besteht die Möglichkeit, dass sich Aggregate, sowie auch langkettige Peptide durch

die Hydrodynamik des Prozesses in Verbindung mit den physikalisch-chemischen

Eigenschaften von Feed und Membran strukturell verändert haben. Meireles, Aimar, &

Sanchez (1991) stellten bei der Ultrafiltration von Bovin-Serum-Albumin (BSA) eine

Denaturierung des Proteins in Abhängigkeit der Strömungsgeschwindigkeit fest. Die

Aggregation von Proteinen, beispielweise ausgelöst durch elektrostatische oder hydrophobe

Wechselwirkungen, gilt zudem in Abhängigkeit von pH-Wert, Salzgehalt, der Größe des

Aggregats, sowie der Phase der Aggregation als reversibel (Wang, Nema, & Teagarden,

2010). Eine Veränderung der Molekülgrößenverteilung durch hydrodynamische, sowie

chemisch-physikalische Einflussfaktoren während der Fraktionierung kann, insbesondere in

Anbetracht der hohen WFR im Permeat (Fraktionierung ohne 150 mM NaCl: 46,06 ± 5,43 %

(pH 11) - 63,14 ± 2,42 % (pH 6); Fraktionierung mit 150 mM NaCl: 44,23 ± 6,77 % (pH 11) -

57,15 ± 1,12 % (pH 7)), nicht ausgeschlossen werden. Es wird vermutet, dass dieser Vorgang

parallel zu der vorab dargestellten pH- und ionenstärke-abhängigen Beeinflussung des

Diskussion

201

Fraktionierungsprozess durch ladungs- und abschirmungsbedingte Molekül-Molekül, Molekül-

Membran und Molekül-Foulingschicht-Interaktionen stattfindet.


Permeatflux und Proteinausbeute in Retentat- und Permeat-Fraktion unterschieden

sich pH- und ionenstärke-abhängig.

Fouling spielt im Hinblick auf Permeatflux und Transmission eine entscheidende Rolle.

Die initiale Ausbildung einer Foulingschicht wird insbesondere durch kleine Moleküle

initiiert.

pH-Wert und Ionenstärke wirken auf die molekulare (Raum-)Struktur, beeinflussen die

Ausbildung und Struktur der Foulingschicht und somit auch die Transmission.

Ladungsbedingte Abstoßungs- bzw. Adsorptionseffekte bestimmten maßgeblich die

Filtrationscharakteristika und die Transmission von Proteinen.

Die Komplexität der während des Fraktionierungsprozess auftretenden Effekte steigt

mit der Komplexität der Feed-Zusammensetzung.


Molkenprotein-Isolat:

o Der pH-Wert beeinflusst den Permeatflux von hydrolysiertem Molkenprotein-

Isolat nicht signifikant. Der höchste Permeatflux wurde für pH 9 (29,44 ± 8,19

ml/min), der niedrigste für pH 8 (20,01 ± 0,84 ml/min) festgestellt.

o Der pH-Wert beeinflusst die Transmission, sowie die Wiederfindungsrate in

Retentat und Permeat nicht signifikant.

o Der pH-Wert beeinflusst die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen

geringfügig. Bei der Fraktionierung kommt es zu einer

Trenngrenzenverschiebung der Membran hin zu einem deutlich kleineren

MWCO. Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind in Retentat- und Permeatfraktion

stark repräsentiert.

o Die Ionenstärke beeinflusst den Permeatflux in Abhängigkeit des pHs

signifikant. Unter Zusatz von 150 mM wurde für pH 9 (49,11 ± 3,23 ml/min) der

höchste und für pH 6 (30,27 ± 6,01 ml/min) der niedrigste Permeatflux

festgestellt. Der Zusatz von 150 mM NaCl führt in Abhängigkeit des pH-Werts

zu signifikant erhöhtem Permeatflux im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne

NaCl-Zusatz.

o Die Ionenstärke beeinflusst die Transmission, sowie die Wiederfindungsrate in

Retentat und Permeat in Abhängigkeit des pHs nicht signifikant. Der Zusatz von

150 mM NaCl führt in Abhängigkeit des pH-Werts zu signifikant niedrigerer

Wiederfindungsrate (pH 8, pH 9) im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne

Diskussion

202

NaCl-Zusatz, ausgelöst durch geringere Proteingehalte im Retentat bei

gleichzeitig nur geringfügig erhöhten Proteingehalten im Permeat.

o Die Ionenstärke beeinflusst die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen in

Abhängigkeit des pHs geringfügig. Der Zusatz von 150 mM NaCl führt in

Abhängigkeit des pH-Wert zu einem erhöhten Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im

Permeat im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz.

Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind in Retentat- und Permeatfraktion stark

repräsentiert.

Alge (Chlorella vulgaris):

o Der pH-Wert beeinflusst den Permeatflux von hydrolysierter Alge (Chlorella

vulgaris) mit Ausnahme des Vergleichs der pH Stufen pH 6 (42,91 ± 2,22

ml/min) (höchster Permeatflux der Versuchsreihe) und pH 3 (29,15 ± 0,35

ml/min) (niedrigster Permeatflux der Versuchsreihe) nicht signifikant.

o Der pH-Wert beeinflusst die Wiederfindungsrate nicht signifikant. Die

Transmission wird durch den pH-Wert signifikant beeinflusst und resultiert in

einem höheren Proteingehalt im Retentat bei gleichzeitig niedrigerem

Proteingehalt im Permeat für pH 11 im Vergleich zu pH 3, pH 6, pH 7.

o Der pH-Wert beeinflusst die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen

geringfügig. Bei der Fraktionierung kommt es zu einer

Trenngrenzenverschiebung der Membran hin zu einem deutlich kleineren

MWCO. Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind in Retentat- und Permeatfraktion

stark repräsentiert. Der pH-Wert besitzt jedoch maßgeblichen Einfluss auf die

Molekülgrößenverteilung der vorfiltrierten Nullprobe und führt für die pH Stufen

3, 8 und 11 zu einem nicht nachweisbaren (pH 3, pH 11)/geringen (pH 8) Anteil

an Strukturen ≥ 20 kDa.

o Die Ionenstärke beeinflusst den Permeatflux in Abhängigkeit des pHs nicht

signifikant. Der Zusatz von 150 mM NaCl führt in Abhängigkeit des pH-Werts

für die pH Stufen 7 und 11 zu signifikant niedrigerem Permeatflux im Vergleich

zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz.

o Die Ionenstärke beeinflusst die Transmission, sowie die Wiederfindungsrate in

Retentat und Permeat in Abhängigkeit des pHs lediglich in einem Fall signifikant

(Permeat-Proteingehalt: pH 11 (0,332 ± 0,051) vs. pH 7 (0,429 ± 0,008 g)). Der

Zusatz von 150 mM NaCl führt in Abhängigkeit des pH-Werts zu signifikant

niedrigerer Wiederfindungsrate (pH 6) im Vergleich zu einer Fraktionierung

ohne NaCl-Zusatz.

o Die Ionenstärke beeinflusst die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen in

Abhängigkeit des pHs geringfügig. Lediglich bei pH 3, pH 6 und, in geringem

Diskussion

203

Umfang, pH 8 wurden erhöhte Anteile an Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat

festgestellt. Der Zusatz von 150 mM NaCl führt in Abhängigkeit des pH-Werts

nicht zu einem erhöhten Anteil an Strukturen ≥ 20 kDa im Permeat im Vergleich

zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz. Molekülstrukturen ≤ 1,35 kDa sind

in Retentat- und Permeatfraktion stark repräsentiert.

Hypothese zum Einfluss von pH- und Ionenstärke auf den Fraktionierungsprozess:

o pH-Wert und Ionenstärke beeinflussen ladungsbedingte Abstoßungs- und

Adsorptionseffekte während der Fraktionierung und nehmen somit Einfluss auf

die Ausbildung und Struktur der Foulingschicht.

o Die Ladungsprofile der Moleküle, Membran und Foulingschicht, sowie deren

Interaktionseffekte bestimmten den Fraktionierungs- und

Transmissionsprozess.

o Die komplexe Zusammensetzung und Molekülgrößenverteilung von

Hydrolysaten erschwert die Identifikation fouling-induzierender Verbindungen

in Abhängigkeit der physikalisch-chemischen Feed-Charakteristika.

o Im Falle der Fraktionierung hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) ist der

Einfluss von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS)/freien

Polysacchariden (RPS) auf den Fraktionierungsprozess nicht auszuschließen.

o „Ideale“ Fraktionierungsbedingungen für Hydrolysate konnen unter

Berücksichtigung aktueller Primärliteratur nur durch „trial and error“ identifiziert

und durch auf den Erkenntnissen basierenden Folgestudien reduziert werden.

5.3.3 Einfluss der Ultraschall-Anwendung

Die Verwendung von Ultraschall kann bei Filtrationsprozessen in einer Erhöhung des

Permeatflux resultieren, wie Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al. (2005), Kobayashi et

al. (1999) und Chai et al. (1998) bei der Filtration von Molke bzw. Dextran-Lösungen

feststellten. Die Wirksamkeit der Ultraschallanwendung ist dabei unter anderem abhängig von

der US-Frequenz, der Feed-Konzentration und dem Transmembrandruck (Kyllönen et al.,

2005; Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al., 2005). Neben der Anwendung von

Ultraschall während des Filtrationsprozesses erwies sich auch die US-Vorbehandlung von

erhitzter Molke als gangbarer Weg zur Reduktion von Porenverblockung und Wachstum des

Filterkuchens, führte aber zu geringerem Permeatflux (Koh et al., 2014). Erkenntnisse zur

Filtration von Molkenprotein-Hydrolysaten unter Ultraschall existieren bisher nicht.

Permeatflux JFm:

Der Permeatflux JFm wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Anwendung von Ultraschall

nicht signifikant beeinflusst und lag zwischen 6,38 ± 1,61 ml/min (ohne US) und 5,81 ± 2,36

ml/min (mit US). Die Ergebnisse stehen im Widerspruch zu den Erkenntnissen von

Diskussion

204

Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al. (2005), die bei der Filtration von Molke (intakte

Proteine) eine Fluxsteigerung um Faktor 1,4 – 1,7 feststellten. Die Erkenntnisse weiterer

Autoren beziehen sich ebenfalls auf die Filtration intakter Proteine (z. B. BSA) oder verwenden

Modellsysteme (z. B. Sulfat-Polystyren-Latex-Partikel) (Lamminen et al., 2004; Matsumoto et

al., 1996). Die Wirksamkeit der Ultraschall-Anwendung ist abhängig von einer Vielzahl an

Faktoren, die von Kyllönen et al. (2005) in einem umfangreichen Review-Artikel

zusammengefasst wurden. Entscheidend für ultraschall-basierende Effekte sind unter

anderem die US-Frequenz, die Leistungsstärke der US-Einheit, Feed- und Membran-

Eigenschaften, sowie die Prozesshydrodynamik. Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al.

(2005) führen die Wirkweise des Ultraschall auf den Einfluss von Kavitation, akustischer

Gleichströmung, Agglomerations- und Suspensionseffekt zurück. Diese Effekte treten mitunter

gleichzeitig auf und wirken synergetisch (Kyllönen et al., 2005). Gemäß Lamminen et al. (2004)

tragen Kavitations-Mechanismen zur Ablösung von Partikeln von der Membranoberfläche bei,

die darauf folgend, bedingt durch akustische Gleichströmung, von der Membranoberfläche

abgetragen werden. Kavitation tritt bei US-Frequenzen zwischen 20 kHz und 1000 kHz auf

(Kyllönen et al., 2005). Der Kavitation-Effekt ist druckabhängig und nimmt mit steigendem

externen Druck ab (Leighton, 1997). Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al. (2005)

gewichten den Einfluss der akustischen Gleichströmung höher, da durch Ultraschall auch bei

erhöhtem Transmembrandruck und damit verringerter Kavitation einen gleichbleibend hoher

Permeatflux erzielt werden konnte. Der Einfluss von US auf die Proteinstruktur und die damit

verbundenen Agglomerations- bzw. Suspensionseigenschaften wird kontrovers diskutiert.

Chandrapala, Zisu, Palmer, Kentish, & Ashokkumar (2011) stellten bei der US-Behandlung

(20 kHz) von Molkenproteinkonzentrat nur geringfügige Änderungen der Sekundärstruktur der

Proteine fest. Eine lange Prozessdauer führte jedoch zur Ausbildung von Proteinaggregaten.

Die Bildung von Agglomeraten kann generell durch eine durch hydrodynamische Turbulenzen

verstärke Kollision strukturell veränderter Proteine ausgelöst werden (Jambrak, Mason, Lelas,

Paniwnyk, & Herceg, 2014). Dem entgegen stehen Jambrak et al. (2014) die bei der US-

Behandlung (20 kHz und 40 kHz) von Molkenproteinkonzentrat eine Abnahme des

Molekülgewichts und der Partikelgrößen, sowie eine Verengung der Partikelgrößenverteilung

feststellten. Die Autoren führten die Abnahme der Partikelgröße auf das Lösen

intermolekularer, hydrophober Wechselwirkungen zurück. Die Abnahme der

Molekülgrößenverteilung erfolgt durch Aufspaltung der Peptidbindungen. Hiervon waren

besonders große Moleküle (14 – 70 kDa) betroffen (Jambrak et al., 2014).

Die US-Behandlung hat im Rahmen dieser Studie nur einen vernachlässigbaren Einfluss auf

den Permeatflux JFm. Es ist davon auszugehen, dass der Filtrationsprozess von

Molkenproteinhydrolysaten, vergleichbar mit der zuvor diskutierten Filtration im größeren

Maßstab, durch ladungsbasierte Abstoßungs- und Interaktionseffekte zwischen Membran und

Diskussion

205

Molekül, bzw. zwischen verschiedenen Molekülen, wie von Almécija et al. (2007) und Pouliot

et al. (1999) beschrieben, zurückzuführen ist, die den Prozess aufgrund der komplexen

Zusammensetzung des Feeds dominieren. Der in der vorliegenden Studie festgestellte

geringere Permeatflux unter US Anwendung mit verhältnismäßig großer Standardabweichung

ist durch Foulingeffekte gemäß des Modells von Wang & Tarabara (2008) erklärbar. Bei der

Filtration mit US wurde eine deutliche Abnahme des Permeatflux zu Versuchsende, bei

gesteigertem Flux zu Versuchsbeginn festgestellt. Hierbei scheint vor allem internes Fouling

unter Einfluss akustischer Gleichströmung eine Rolle zu spielen. Ein mögliches Szenario ist

nachfolgend dargestellt.

Zu Versuchsbeginn erfolgt unter dem Einfluss akustischer Gleichströmung ein erhöhter

Transport von Molekülen zur Membran (Lamminen et al., 2004). Kleine Partikel penetrieren

die Membran und adsorbieren in den Membranporen. Während der Einfluss externen Foulings

durch US-Behandlung verringert werden kann, lässt sich der Einfluss internen Foulings durch

US nicht mindern (Muthukumaran et al., 2007; Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al.,

2005; Muthukumaran et al., 2004). Mit zunehmender Prozesslaufzeit wächst der Fouling-

Widerstand durch zusätzlich auftretendes, vergleichsweise vermindertes externes Fouling und

resultiert in Verbindung mit vergleichsweise stärkerem internem Fouling in einem deutlichen

Abfall des Permeatflux. Durch Ausbleiben US-induzierter Effekte, passiert die Ausbildung von

externem und internem Fouling bei der Filtration ohne US gleichmäßig über den

Prozesszeitraum. Durch den für die Versuche gewählten pH-Wert (pH 7) ist

prozessübergreifend, unter Berufung auf die zuvor dargestellten Ergebnisse, davon

auszugehen, dass externes Fouling maßgeblichen Einfluss auf den Filtrationsprozess hat.


Die Wiederfindungsrate wurde durch die Anwendung von Ultraschall nicht signifikant

beeinflusst und lag zwischen 92,24 ± 7,65 % (mit US) und 92,80 ± 8,39 % (ohne US). 29,83 ±

3,34 % (mit US) - 31,54 ± 3,05 (ohne US) des Proteinanteils lagen im Retentat, 61,26 ± 5,71

% (ohne US) - 62,41 ± 6,65 % (mit US) im Permeat vor. Der Proteingehalt im Retentat lag

damit zwischen 89,50 ± 10,03 mg (mit US) und 94,63 ± 9,14 mg (ohne US), sowie zwischen

183,78 ± 17,13 mg (ohne US) und 187,24 ± 19,96 mg (mit US) im Permeat.

Während der Einfluss des pHs und der Ionenstärke auf die Transmission von Molkenproteinen

und Proteinmodellsystemen, wie zuvor dargestellt, umfangreich behandelt wurde, gibt es keine

Erkenntnisse über den Einfluss einer Ultraschall-Anwendung auf die Transmission von

Molkenproteinen und Molkenprotein-Hydrolysaten. Kobayashi et al. (1999) konnten aus den

Ergebnissen der Filtration einer Dextran-Lösung unter US lediglich eine verminderte

Konzentration gelöster Stoffe an der Membranoberfläche herleiten. Dies würde, ausgehend

von der Annahme des überwiegenden Vorhandenseins ladungsbedingt zurückgewiesener

Diskussion

206

Moleküle, in einer Steigerung der Transmission resultieren (Ghosh, 2003). Im Gegenzug

begünstigt eine erhöhte Konzentration gelöster Moleküle an der Membranoberfläche die

Transmission, wenn keine ladungsbedingten Rückweisungseffekte auftreten (Persson et al.,

2003). In dieser Studie wurde kein US-Einfluss auf die Transmission von Molkenprotein-

Hydrolysaten durch eine PES-Membran (MWCO 100 kDa) festgestellt. Dies ist, unter Berufung

auf die im vorhergehenden Abschnitt hergeleiteten Effekte, vermutlich auf den dominanten

Einfluss ladungsbedingter Molekül-Membran- und Molekül-Molekül-Interaktionen

zurückzuführen, die Geschwindigkeit und Art des Membranfoulings beeinflussen. Der US ist

somit nicht in der Lage eine Steigerung der Transmission bei komplexen Feed-Medien

herbeizuführen, da ladungsbedingte Interaktions- und damit verbundene Fouling-Effekte

prozessbestimmend sind.


Die Chromatogramme weisen, vergleichbar mit der WFR und den Proteingehalten der

Fraktionen, keine US-induzierten Unterschiede auf. Ähnlich der Filtration von Molkenprotein-

Isolat-Hydrolysat in größerem Maßstab, wurden im Retentat Moleküle ≥ 44 kDa, sowie eine

große Menge an Verbindungen ≤ 1,35 kDa zurückgehalten. Im Permeat ist lediglich eine

geringe Molekülmenge ≥ 10 kDa vertreten. Die Fraktion wird von Molekülen ≤ 1,35 kDa

dominiert. Auf einen die Molekülgrößenverteilung oder den Transmissionsprozess

beeinflussenden Effekt des Ultraschalls, durch beispielweise kavitationsbedingte Ablösung

von Partikeln von der Membranoberfläche oder Agglomeration von Proteinen und damit in

einer veränderten Struktur der Foulingschicht resultierenden Vorgang, kann anhand der

Chromatogramme nicht geschlossen werden, sodass die Beobachtungen auf die in den

vorhergehenden Abschnitten, sowie in Kapitel 5.3.2.1 bereits ausführlich beleuchten Effekte

zurückgeführt werden.


Die fluxsteigernde Eigenschaft des US lässt sich auf Kavitation, akustischer

Gleichströmung, Agglomerations- und Suspensionseffekt zurückführen.

Der Einfluss der akustischen Gleichströmung wird höher gewichtet als

Kavitationseffekte.

US kann zur Agglomeration von Proteinen, sowie zu strukturellen Veränderung und

einer Abnahme des Molekülgewichts führen.

Ladungs- und ionenstärkeabhängige Interaktionseffekte sind auch durch die

Einwirkung von US nicht zu verhindern.

Diskussion

207


Permeatflux, WFR, Proteingehalte in Retentat und Permeat, sowie die

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen sind durch die Anwendung von US bei der

Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysaten nicht signifikant beeinflussbar.

Die Anwendung von US resultierte in vergleichsweise geringerem Permeatflux bei

höheren Standardabweichungen.

Bei der Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat sind ladungs- und

ionenstärke-induzierte Effekte stärker ausgeprägt als US-Effekte.

5.3.4 Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose

Hydrophile PS/PES- (Polysulfon/Polyethersulfon) und RC- (regenerierte Cellulose)

Membranen werden in der Filtrationstechnik häufig eingesetzt. Neben Cellulose Acetat (CA)

ist regenerierte Cellulose das hydrophilste Membranmaterial (Walter et al., 2012). CA-

Membranen sind jedoch aufgrund ihrer geringeren pH-Stabilität nicht für alle

Filtrationsprozesse geeignet (Pearce, 2007).

Im Rahmen dieser Studie wurden hydrophilierte PS bzw. PES Membranen verwendet. PES

Membranen verfügen über eine höhere nichts-spezifische Bindungsaffinität als RC

Membranen, neigen somit also eher zu Protein-Membran-Interaktionen (Pitt, 1987). Durch

eine in der Herstellungspraxis gängige gezielte Oberflächenbehandlung lassen sich die nicht-

spezifische Bindungsaffinität der PES Membran jedoch deutlich mindern (Walter et al., 2012).

Die Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose für den Fraktionierungsprozess von

Molkenprotein-Isolat-Hydrolysaten wurde exemplarisch für die pH-Stufe 9 unter Verwendung

von kleinvolumigen Membrantrennkammern überprüft.

Permeatflux JFm:

Der Permeatflux JFm bei der Fraktionierung von Molkenproteinhydrolysat lag in der

vorliegenden Studie bei 8,46 ± 1,60 ml/min. Aufgrund der Durchführung des Versuchs im

Kleinmaßstab ist kein direkter Vergleich zum Permeatflux der Anlagenkonzeption der

Hauptversuche möglich. Der Flux liegt jedoch über dem Wert (6,38 ± 1,61 ml/min) der im

Rahmen der US-Versuche unter Verwendung von PES-Membranen ohne US-Anwendung

ermittelt wurde. Hier wurde allerdings eine höhere Feed-Konzentration verwendet. Die

Performance von PES-Membranen kann sich herstellerbedingt unterscheiden (Jönsson &

Jönsson, 1995). Dizge, Soydemir, Karagunduz, & Keskinler (2011) führen Unterschiede des

Initial- und Steady-State-Flux bei der Filtration von Belebtschlamm auf

Oberflächeneigenschaften wie Rauigkeit, Porengeometrie und Regelmäßigkeit zurück.

Unregelmäßige, raue Membranoberfläche führen dabei zu verstärktem Fouling und daraus

resultierendem Fluxabfall. Der Einfluss des hydrophilen Charakters einer Membran scheint nur

Diskussion

208

zu Beginn eines Prozess entscheidend für adsorptionsbedingtes Fouling zu sein. Bei der

Filtration von BSA stellten Nakamura & Matsumoto (2006) fest, dass die Adsorption von

Protein nur in der Startphase durch den hydrophoben/hydrophilen Charakter der Membran

beeinflusst wird, im weiteren Verlauf aber pH- und ionenstärke-abhängig ist. Der Permeatflux

von hydrophilen Membran ist jedoch vergleichsweise höher (Jönsson & Jönsson, 1995).


Die Wiederfindungsrate lag bei 109,96 ± 17,00 %. 38,22 ± 7,28 % des Proteins lagen im

Retentat und 71,74 ± 10,27 % im Permeat vor. Dies entsprach 57,33 ± 10,92 mg Protein im

Retentat und 107,61 ± 15,41 mg im Permeat. Die erhöhte WFR ist, unter Berücksichtigung der

Stammdaten, auf einen Ausreißer zurückzuführen, der den hier dargestellten Mittelwert

beeinflusst. Zudem können geringfügige Einwaagefehler aufgrund der geringen

Einwaagemenge von wenigen mg an dieser Stelle in einem erhöhten Endproteingehalt des

Feeds und somit höheren Proteingehalten in Retentat und Permeat resultieren. Das Verhältnis

zwischen Transmission und Rückhalt der Molekülverbindungen entspricht in etwa den

Ergebnissen der Hauptversuche für pH 9 (WFR: 91,10 ± 4,63 %, Retentat: 38,07 ± 1,56 %,

Permeat: 53,02 ± 3,22 %). Die die Transmission der Proteine beeinflussenden Prozesse

lassen sich auf die in Kapitel 5.3.2 beschriebenen Effekte zurückführen.


Die Chromatogramme der Retentat- und Permeatfraktion unter Verwendung von RC

Membranen entsprechen den Chromatogramme der Fraktionen, die unter Verwendung von

hydrophilierten PS-Membranen ermittelt wurden. In der Retentatfraktion wurden

Molekülstrukturen ≥ 44 kDa zurückgehalten, Strukturen ≤ 1,35 kDa sind weiterhin stark

repräsentiert. In der Permeatfraktion wurde nur eine geringfügige Menge an Strukturen ≥ 20

kDa detektiert, während Verbindungen ≤ 1,35 kDa überrepräsentiert sind. Die Ergebnisse der

Versuche sind aufgrund der anlagenbedingten Unterschiede der Versuchssysteme als

Hinweis zu werten. Unter Berücksichtigung der Gegebenheiten offenbarte die Verwendung

von RC-Membranen keinen Vorteil gegenüber der Verwendung von hydrophilierten PS-

Membranen.


Hydrophile Membranen werden in Filtrationsprozessen aufgrund geringer

Foulingneigung und hohem Permeatflux bevorzugt.

Unterschiedliche Membranmaterialien beeinflussen Permeatflux und Fouling.

Die Adsorption von Protein auf Membranen ist nur in der Startphase der Filtration

abhängig von hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften der Membran.

Diskussion

209


RC-Membranen verfügen im Vergleich zu PS-Membranen, unter Berücksichtigung der

Versuchsbedingungen, nicht über veränderte Trenncharakteristika.

5.3.5 Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed

Die Dialyse ist ein auf dem Diffusionsprinzip basierendes Trennverfahren zur Abtrennung

niedermolekularer Substanzen (Klein, Ward & Lacey, 1987). Die Trennung im Dialyse-Prozess

erfolgt durch einen Konzentrationsgradienten zwischen zwei membrangetrennten Phasen

(Baynes & Dominiczak, 2014). Die Effektivität der Dialyse nimmt mit steigender Molekülgröße

(> 1000 Da) ab (Nath, 2008).

Im Rahmen dieser Studie wurde überprüft, ob niedermolekulare Bestandteile (< 2 kDa) aus

einem zur Fraktionierung vorgesehenen vorfiltrierten Feed unter Variation des Initial-pH-Werts

per Dialyse abgetrennt werden können. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer Variation der

Dialysedauer und der Konzentration des Feeds betrachtet. Hintergrund des Versuchs war die

Überprüfung der Eignung der Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus der zur

Fraktionierung vorgesehenen Nullprobe.

pH-Wert, Dialysezeit tDL & Molekülgrößenverteilung der Fraktionen:

Die pH-Versuche fanden unter Verwendung eines „Initial-pHs“ statt. Unter Initial-pH wird der

pH-Wert der Dialyseprobe verstanden der zu Beginn des Dialyseprozess, sowie bei Wechsel

der Dialyselösung eingestellt wurde. Der pH-Wert der Dialyseprobe ist somit über die Dauer

des Prozesses als nicht konstant zu betrachten, wurde jedoch zu definierten Zeitpunkten

(Wechsel der Dialyselosung) neu justiert. Die Dialyselosung „destilliertes Wasser“ wurde mit

dem Hintergrund gewählt, das Feed frei von den zur Herstellung von Dialysepuffern üblichen

Salzen, Aminen und ähnlichen Zusätzen mit Pufferwirkung zu halten, die eine Aufreinigung

des Retentats vor einem nachfolgenden Fraktionierungsprozess notwendig machen würden.

Die für die untersuchten pH-Stufen identifizierten Effekte werden nachfolgend dargestellt.

In Abhängigkeit des Initial-pH-Werts wurde für die pH-Stufen 3 und 5 (1 % (w/v)

Molkenprotein-Isolat, 24 h) eine Veränderung der Molekülgrößenverteilung der Nullprobe

festgestellt. Diese ist vermutlich auf eine Abtrennung von Molekülen ≥ 20 kDa im Rahmen der

Vorfiltration der Proben zurückzuführen. Der IEP der meisten intakten Molkenproteine liegt

zwischen pH 4 und pH 5 (Töpel, 2004). Ein Ausfall intakter Moleküle erscheint möglich. Die

Löslichkeit von Molkenproteinhydrolysaten nimmt jedoch mit steigendem Hydrolysegrad,

weitestgehend unabhängig vom pH-Wert zu und liegt bei einem DH von 8 – 12 % zwischen

70 % und 85 % (Perea, Ugalde, Rodriguez, & Serra, 1993). Hinsichtlich dieser Erkenntnis

erscheinen ladungsbedingte Interaktions- und Abstoßungseffekte zwischen Molekül und

Membran, sowie Molekül und Molekül, wie von Pouliot et al. (1999) und Pincet et al. (1995)

Diskussion

210

beschrieben, wahrscheinlicher. Eine daraus resultierende Deckschichtbildung kann darüber

zu einer Reduktion der nominalen Trenngrenze der Filtrationsmembran führen (Wang &

Tarabara, 2008; Marshall et al., 1993). Dies ermöglicht den Rückhalt von Molekülverbindungen

≥ 20 kDa während der Vorfiltration.

Die Nullproben der Initial-pH-Stufen 9 und 11 (2 % (w/v) Molkenprotein-Isolat, 48 h) wiesen

ebenfalls eine veränderte Molekülgrößenverteilung auf. Bei den Nullproben derselben Initial-

pH-Stufen wurden für den 24-stündigen Prozess, sowie bei einer Konzentration von 4 % (w/v)

keine Abweichungen von der erwarteten Molekülgrößenverteilung der Nullprobe festgestellt.

Eine Abtrennung im Rahmen der Vorfiltration durch ungenügend in Lösung gebrachtes

Probenmaterial, könnte bei der Vorbereitung des 48-stündigen Prozess in einer Abtrennung

von Molekülverbindungen ≥ 20 kDa resultiert haben. Dies erscheint in Anbetracht der

Durchführung separater Dreifachversuche jedoch unwahrscheinlich.

Feed-Konzentrationen ≥ 2 % (w/v) führten für die Initial-pH-Stufen < 9 zum Ausfall von gelösten

Stoffen im Verlauf des Dialyseprozesses. Während des Dialyseprozesses wurden vom

Ausgangswert abhängige Veränderungen (pH-Abfall) des pH-Werts, basierend auf dem pH-

Unterschied zwischen Probe und Dialyselösung, beobachtet. Vergleichbares wurde von Craig,

King, & Stracher (1957) bei der Verwendung der gleichen Dialyselösung beobachtet. Abhängig

vom pH-Wert kann es zur Aggregation einzelner Peptide kommen (Fung, Hong, Keyes-Baig,

& Chen, 2005). Die pH-bedingte Ausbildung einer Peptid-Peptid-Interaktion ist abhängig von

der Art der Peptidverbindung (Sette et al., 1992). Ein Aggregatbildung kann, vergleichbar zum

Löslichkeitsverhalten intakter Proteine, zu einem Ausfall des Peptid-Aggregats führen

(Samanen, 1990). Das Auftreten von Ausfällungserscheinungen wird folglich auf eine

Verringerung der Löslichkeit gelöster Stoffe durch eine pH-induzierte Ausbildung von Peptid-

Peptid-Aggregaten zurückgeführt.

Der Dialyseprozess führte für alle Initial-pH-Stufen (ausgenommen pH 3, 1 % (w/v)

Molkenprotein-Isolat) zu einer signifikanten Reduktion des Proteingehalts mnD im Retentat

„nach Dialyse“. Diese Reduktion kann, unter Berufung auf die chromatographisch ermittelte

Probenzusammensetzung, auf ein Auswaschen kleiner Moleküle durch den Dialyseprozess

zurückgeführt werden. Der Auswaschungsprozess erscheint, übereinstimmend mit Nath

(2008), besonders für Strukturen ≤ 1 kDa effektiv zu sein. Der Grad der Auswaschung

unterscheidet sich bei einer Feed-Konzentration von 1 % (w/v) nicht pH-abhängig. Bei einer

Steigerung der Feed-Konzentration wurden signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit des

Initial-pHs und der Dialysedauer tDL festgestellt. Eine höhere Dialysezeit resultierte Initial-pH-

abhängig in signifikant niedrigeren Konzentrationen im Retentat „nach Dialyse“. Der Einfluss

des Initial-pH kann für eine Feed-Konzentration von 2 % (w/v) nicht alleinig auf den pH-Wert

zurückgeführt werden, da sich die Proteingehalte der Nullproben bereits pH-bedingt

Diskussion

211

unterscheiden. Selbiges gilt für den Einfluss der Dialysedauer. Bei einer Feed-Konzentration

von 4 % (w/v) erscheint der Einfluss des Initial-pHs jedoch gesichert. Trotz höherem

Anfangsproteingehalt resultierte die Dialyse bei pH 11 im Vergleich zu pH 9 in einem

geringeren Proteingehalt mnD „nach Dialyse“. Darüber hinaus konnte bei erhöhtem

Anfangsproteingehalt (2 % (w/v) Molkenprotein-Isolat, 4 % (w/v) Molkenprotein-Isolat) eine

schärfere Abtrennung von Molekülen ≤ 1 kDa festgestellt werden. Bei einer Dialyse von

Hämoglobin stellten Guidotti & Craig (1963), in Übereinstimmung mit dieser Studie, eine

vergleichsweise höhere Transmission bei pH 11 im Vergleich zu pH 9 fest. Die treibende Kraft

des Dialyseprozesses ist der transmembrane Konzentrationsgradient. Eine Erhöhung der

Feed-Konzentration resultierte, bis zum Erreichen eines Grenzwertes, in einem effektiveren

Dialyseprozess (Klein, Ward & Lacey, 1987). Dies wurde auch im Rahmen dieser Studie

beobachtet. Darüber hinaus spielen bei der Dialyse, vergleichbar zu druckgetriebenen

Filtrationsprozessen, ladungsbedingte Abstoßungs- und Interaktionseffekte eine Rolle.

Dialyse-Membranen sind meist negativ geladen. Dies führt zu einer Rückweisung von

Molekülen negativer Ladung, sowie zu einer Abnahme der effektiven Porengröße für das

betroffenen Molekül (Mota & Simaes Goncalves, 1996). Die Initial-pH-abhängigen,

signifikanten Unterschiede zwischen pH 9 und pH 11 (4 % (w/v) Molkenprotein-Isolat)

hinsichtlich des Proteingehalts lassen sich folglich, wie für druckgetriebenen

Filtrationsprozessen bereits ausführlich dargestellt wurde (Kapitel 5.3.2), auf unterschiedliche

Ladungsprofile der Feed-Medien zurückführen. Chromatographisch waren keine pH-

abhängigen Unterschiede erkennbar. Bereits Craig & King (1955) führten unterschiedliche

Transmissionsraten (hier: „escape rate“) in Dialyseprozessen von Strukturen ähnlichen

Molekülgewichts auf Membraninteraktion und ladungsbedingte Effekte zurück. Darüber hinaus

führten die Autoren, sowie auch Craig, King, & Stracher (1957) strukturelle Veränderungen als

Grund für unterschiedliche Transmissionsraten (hier: „escape rate“) ins Feld. Diese resultieren

in einer Auftrennung bei der nicht direkt auf das Molekülgewicht der die Membran

passierenden Moleküle geschlossen werden kann.

Geringere Protein-Gehalte im Retentat „nach Dialyse“ können beim 48-stündigen

Dialyseprozess auf eine verstärkte, ladungsinduzierte Peptid-Membran-Interaktionen

zurückgeführt werden, wie sie auch bei druckgetriebenen Membrantrennverfahren auftreten.

Hierbei kommt es durch elektrostatische Interaktion zwischen Membran und Molekül zur

Anlagerung des Moleküls (Jones & O’Melia, 2000). Darüber hinaus wurde beim 48-stündigen

Prozess ein Ausfall gelöster Stoffe zum Versuchsende beobachtet. Bei 65-stündigen

Diffusionsversuchen von humanem Albumin (Fraktion V) wurde von Hoch & Turner (1960)

ebenfalls Trübung und „Unloslichkeit“ der Feed-Moleküle zu Prozessende festgestellt. Im

Rahmen dieser Studie ist die Beobachtung vermutlich auf eine Aggregatbildung verschiedener

Peptide zurückzuführen, die das Löslichkeitsverhalten beeinflusst (Samanen, 1990). Denkbar

Diskussion

212

wäre auch eine Kombination beider Phänomene, bei der es zu Beginn zu einer Anlagerung

von Molekülen auf der Membranoberfläche kommt. Daraus resultiert eine Deckschichtbildung

die den gradientengetriebenen Transportprozess von Molekülen zur Membran in einer

erhöhten Kontaktrate zwischen Peptiden und somit verstärkt zur Ausbildung von Peptid-Peptid

Aggregaten führt.

In Anbetracht der Ergebnisse ist die Anwendung der Dialyse hinsichtlich eines Einsatzes bei

der Abtrennung von niedermolekularen Strukturen (< 2 kDa) aus dem Feed (Nullproben)

geeignet. Hierfür können höher konzentrierte, kleine Flüssigkeitsmengen dialysiert und darauf

folgend auf die gewünschte Feed-Konzentration verdünnt werden. Im Falle einer Abtrennung

niedermolekularer Strukturen aus Retentat- oder Permeatfraktionen sind diese bevorzugt in

eingeengtem Zustand zur dialysieren, da der Dialyseprozess bei erhöhter Konzentration und

damit höherem Konzentrationsgradienten effektiver arbeitet.


Die Abtrennung von Molekülen ≤ 1,35 kDa erfolgt in Dialyseprozessen besonders

effektiv.

Abhängig vom Initial-pH-Wert kommt es während des Dialyseprozesses zum Ausfall

gelöster Stoffe, der auf Peptid-Peptid-Interaktion und daraus resultierender

Aggregatbildung zurückzuführen ist.

Initial-pH-abhängige Performance-Unterschiede sind, vergleichbar druckgetriebenen

Trennverfahren, auf ladungsbedingten Interaktions- und Abstoßungseffekten zwischen

Molekülen, bzw. Molekül und Membran zurückzuführen.


Durch Dialyse lassen sich Moleküle ≤ 1,35 kDa aus Molkenprotein-Isolat-Hydrolysaten

auswaschen.

Eine Dialysezeit tDL von 24 h ist dafür ausreichend. Erhöhte Dialysezeit führt zum

Ausfall von gelösten Stoffen durch Aggregatbildung.

Hohe Konzentrationen (4 % (w/v)) resultierten im Vergleich mit niedrigeren

Konzentrationen (1 % (w/v)) in verbesserter Auswaschung.

Initial-pH-bedingte Unterschiede sind chromatographisch nicht oder nur schwer

erkennbar und spiegeln sich nur in signifikant unterschiedlichem Proteingehalt der

Retentatfraktion „nach Dialyse“ wider. In Abhängigkeit des Initial-pH wurde jedoch ein

Ausfall gelöster Stoffe beobachtet.

5.3.6 Einfluss weiterer Faktoren

Nachfolgend wird der Einfluss weiterer filtrationsrelevanter Faktoren diskutiert, die im Rahmen

dieser Studie, basierend auf Literaturempfehlungen, ausgewählt wurden.

Diskussion

213

Strömungsgeschwindigkeit ʋ:

Die Strömungsgeschwindigkeit ʋ korreliert mit dem Permeatflux. Eine Steigerung der

Strömungsgeschwindigkeit ʋ resultiert in einem gesteigerten Permeatflux, sowie einem

höheren kritischen Flux JCF (Choi et al., 2005; Madaeni, Fane, & Wiley, 1999; Li, Fane, Coster,

& Vigneswaran, 1998). Höherer Permeatflux, bzw. JCF in Verbindung mit einer Erhöhung der

Strömungsgeschwindigkeit, werden auf ein Abtragen von Partikeln von der

Membranoberfläche durch gesteigerte Scherkräfte zurückgeführt (Melin & Rautenbach, 2007;

Wang & Song, 1999).

Im Rahmen dieser Studie wurde eine Strömungsgeschwindigkeit ʋ von 0,94 m/s verwendet.

Madaeni et al. (1999) und Choi et al. (2005) stellten bei der Filtration von Belebtschlamm einen

Anstieg des JCF für Strömungsgeschwindigkeiten ʋ zwischen 0,5 m/s und 1,5 m/s bzw. 0,1

m/s und 4,5 m/s fest. Der Anstieg des Permeatflux fiel bei Choi et al. (2005) für

Mikrofiltrationsmembranen deutlicher aus als für Ultrafiltrationsmembranen. Auch in

Modellsystemen unter Verwendung von Latexpartikeln (3 µm, 6,4 µm, 11,9 µm) wurde von Li

et al. (1998) ein Anstieg des Permeatflux bei steigenden Strömungsgeschwindigkeiten ʋ bis

0,82 m/s festgestellt. Darüber hinaus stieg der Permeatflux in Abhängigkeit der

Strömungsgeschwindigkeit ʋ mit zunehmender Partikelgröße unter Verwendung einer

Membran mit einem MWCO von 0,02 µm.

Die Strömungsgeschwindigkeit ʋ kann nicht losgelöst von weiteren Kenngrößen beurteilt

werden. Ein Anheben der Strömungsgeschwindigkeit resultierte für Madaeni et al. (1999) in

einem Anstieg des Transmembrandrucks ΔpTMP. Dieser Anstieg hat lässt sich auf

verschiedene Ursachen zurückführen. Insbesondere beim Rücktransport größerer Partikel

kann es bei gesteigerter Strömungsgeschwindigkeit zu einer Erhöhung des

Deckschichtwiderstands durch Verminderung der Deckschichtporosität kommen (Fane et al.,

2000; Lojkine et al., 1992). Trotz gesteigertem Permeatflux kann laut Thomassen, Faraday,

Underwood, & Cleaver (2005) eine daraus resultierende Erhöhung des Transmembrandrucks

ΔpTMP zu verminderter Transmission führen. Darüber hinaus ist bei hohen

Strömungsgeschwindigkeiten eine Denaturierung gelöster Moleküle möglich, wie Meireles et

al. (1991) bei der Ultrafiltration von BSA feststellten.

Feed-Konzentration CF:

Hohe Feed Konzentrationen CF resultieren in Abhängigkeit von Strömungsgeschwindigkeit

und den Charakteristika des Feeds in vergleichsweise niedrigem Permeatflux (Harker et al.,

2013; Wakeman & Tarleton, 2005; Tarleton & Wakeman, 1994).

Die während der Vorarbeit für diese Studie gewählte Feed-Konzentration CF von 3 % (w/v)

stellte sich als zu hoch für die Fraktionierung von Molkenprotein-Isolat-Hydrolysaten heraus.

Diskussion

214

Die SE-HPLC Analyse offenbarte eine starke Verschiebung der Trenngrenze der Membran,

sodass ein Großteil der Moleküle > 10 kDa in der Retentatfraktion verblieb.

Zur Optimierung der Fraktionierung wurde im Rahmen dieser Studie eine Feed-Konzentration

von 0,15 % (w/v) verwendet. Bei der Fraktionierung von Protein-Modelllösungen oder

Hydrolysaten werden häufig Feed-Konzentrationen < 1 % verwendet. Pouliot et al. (1999)

nutzten bei der Ultra- und Nanofiltration von Molkenproteinhydrolysat zur Bestimmung der

individuellen Filtrationsperformance verschiedener Membranen unter Variation der

Ionenstärke und des pH-Werts eine Feed-Konzentration von 1 % (w/v). Wijers et al. (1998)

arbeiteten bei der Entsalzung von Molkenproteinhydrolysaten mittels Nanofiltration mit einer

Feed-Konzentration von 0,5 % (w/v). Huisman et al. (2000) verwendeten zur Identifizierung

von Protein-Protein- und Protein-Membran-Interaktionseffekte bei der Mikrofiltration von BSA

eine Feed-Konzentration von 0,05 % (w/v). Selbst bei Feed-Konzentrationen < 0,001 % (w/v)

sinkt der Permeatflux im Laufe eines Filtrationsprozesses deutlich ab und nähert sich einem

Steady-State Flux an, wie She et al. (2009) bei der Ultrafiltration von BSA feststellten.

Die Wahl der optimalen Feed-Konzentration für die Fraktionierung ist des Weiteren von

verschiedenen Feed-Charakteristika abhängig. Tarleton & Wakeman (1993) beobachteten bei

Filtration von Kalzit-Partikeln eine Erhöhung des Permeatflux mit Zunahme der Partikelgröße.

Außerdem stellten die Autoren fest, dass bei unterschiedlicher Partikelgrößenverteilung die

Ausbildung von Fouling hauptsächlich von kleinen Partikeln bestimmt wird. Darüber hinaus

beeinflussen Strömungsgeschwindigkeit und Transmembrandruck Deckschichtcharakteristika

und resultieren damit bei gleicher Feed-Konzentration in unterschiedlichen

Filterkuchenwiderständen und Transmissionseigenschaften (Park et al., 2008; Lawler &

Kweon, 2004; Vyas et al., 2000; Tarleton & Wakeman, 1993).

Die Wahl der Feed-Konzentration kann unter den dargestellten Gesichtspunkten folglich nicht

alleinig anhand des Einflusses der Feed-Konzentration auf den Permeatflux beurteilt werden.

Die Partikelgrößenverteilung, sowie die Wahl der Strömungsgeschwindigkeit und des

Transmembrandrucks, wirken sich auf Transmission und Eigenschaften der Deckschicht aus

und beeinflussen somit den Trennprozess. Zur Ermittlung der Performance einer neuen

Anlagenkonzeption erscheinen niedrige Feed-Konzentrationen daher sinnvoll. Bei Erreichen

des gewünschten Trennziels kann eine schrittweise Erhöhung der Feed-Konzentration die

Wirtschaftlichkeit der Methode erhöhen.

Temperatur T:

Eine gezielte Temperatursteuerung des Prozesses kann, durch Viskosität-Abnahme, zu einem

erhöhtem Permeatflux führen. Dies wird unter anderem auf eine Verringerung der

Deckschichtdicke bei geringerer Viskosität zurückgeführt (Vetier et al., 1988). Wie bereits in

Diskussion

215

Kapitel 2.1.4.2 dargestellt, kann der Einfluss der Temperatur dabei nicht losgelöst von pH-Wert

und Ionenstärke betrachtet werden, da strukturelle Veränderungen von Molekülen zu einer

Verminderung elektrostatischer Abstoßung zwischen Molekül und Membran, bzw. zwischen

Molekülen, führen können (Mo et al., 2008).

Im Rahmen dieser Studie wurde die Feed-Lösung auf 45 °C temperiert. Butylina et al. (2006)

wählten bei der Fraktionierung von Molkenpeptiden eine Prozesstemperatur von 50 °C um

bakterielles Wachstum einzuschränken und industriellen Anforderungen zu genügen. Atra et

al. (2005) stellten bei der Ultrafiltration von Milch und Molke eine Steigerung des Permeatflux

bei einer Prozesstemperatur von 50 °C im Vergleich zu 30 °C und 40 °C fest. Die Autoren

führen dies auf eine Abnahme der Viskosität sowie verbesserte Diffusionseigenschaften und

gesteigerten Rücktransport gelöster Stoffe zurück.

Pelegrine & Gasparetto (2005) untersuchten das Löslichkeitsverhalten von Molkenproteinen

im Bereich zwischen 40 °C – 60 °C für verschiedene pH-Werte im Bereich zwischen 3,5 – 7,8.

Bei 43 °C lag die Proteinlöslichkeit pH-abhängig zwischen 78,78 ± 0,41 % (pH 4,5) und 88,94

± 0,35 % (pH 7,8). Erst ab Temperaturen > 50 °C kam es pH-abhängig zu einem deutlichen

Abfall der Löslichkeit für die pH-Stufen 4,5 und 6,8. Die Autoren führen dies auf gesteigerte

Protein-Protein Interaktion aufgrund geringer elektrostatischer Abstoßungskräfte für die

betroffenen pH-Stufen zurück. Hydrolysate sind weniger temperaturempfindlich als intakte

Proteine. Die Hydrolyse von Molkenprotein erhöht die Temperaturstabilität und Löslichkeit

(Adler-Nissen, Eggum, & Munck, 2014; Hidalgo & Gamper, 1977). Im Vergleich zu

unhydrolysiertem Molkenprotein verfügt mit Trypsin hydrolysiertes Molkenprotein über hohe

Löslichkeit bei 80 °C in einem pH Bereich von 2 – 12 (Adler-Nissen et al., 2014; Hidalgo &

Gamper, 1977). Auch bei Weizengluten führt bereits eine Teilhydrolyse (DH 2,8 %) zu

deutlicher verbesserter Wasserlöslichkeit zwischen 40 % (pH 6) und 80 % (pH 10).

Temperaturen > 50 °C führen jedoch zu einer Abnahme der Löslichkeit (Wang et al., 2006).

Unter den Gesichtspunkten der Löslichkeitseigenschaften, der Temperaturstabilität der

Hydrolysate und mikrobiologischen Gesichtspunkten erscheint die Wahl einer

Prozesstemperatur von 45 °C geeignet für die Filtration von Proteinhydrolysaten. Ein deutlich

erhöhter Permeatflux durch Reduktion der Viskosität des Feeds erscheint bei der gewählten

Feed-Konzentration CF von 0,15 % unwahrscheinlich.

Diafiltration:

Die Trennschärfe von hoch- und niedermolekularen Substanzen kann bei Crossflow-

Prozessen durch das Verfahren der Diafiltration verbessert werden (Irmler, 2001). Abhängig

von der Häufigkeit der Zugabe eines Diavolumens lässt sich, unter Verwendung des

Diafiltrationsverfahren, eine erhöhte Reinheit der Retentatfraktion erreichen (Baldasso,

Diskussion

216

Barros, & Tessaro, 2011; Venkiteshwaran, Heider, Teysseyre, & Belfort, 2008; Wakeman &

Tarleton, 2005; van Eijndhoven, Saksena, & Zydney, 1995).

Im Rahmen dieser Studie wurde auf eine diskontinuierliche Diafiltration unter Verwendung von

vier Diavolumina VDia (Nd = 4) zurückgegriffen. Goodnight Jr., Hartman Jr., & Marquardt (1976)

nutzen eine Kombination aus Ultra- und Diafiltration zur Abreicherung von Kohlenhydraten in

einer wässrigen Soja-Protein-Suspension. Bereits ab einer Zugabe von eineinhalb VDia (Nd =

1,5) stieg die Reinheit des Retentats von 77 % auf 95 %. Durch die Verwendung von drei VDia

(Nd = 3) wurde eine Reinheit von 97 % erreicht. Baldasso et al. (2011) verwendeten ebenfalls

eine Kombination aus Ultra- und Diafiltration zur Abreicherung von Lactose bei der

Aufreinigung von Molkenproteinen. Die Autoren steigerten die Proteinkonzentration im

Retentat von 15 % auf bis zu 71 % unter Verwendung von vier Diafiltrationsschritten. Hierbei

wurde in den ersten beiden Schritten je ein VDia und in den darauf folgenden je ein halbes VDia

zugegeben (∑ Nd = 3). Darüber hinaus erwies sich die Diafiltration kleinerer Volumina (5 l

verglichen mit 6 l) als geeignet für die Aufkonzentration von Molkenproteinen. Venkiteshwaran

et al. (2008) nutzten das Diafiltrationsverfahren bei der Mikrofiltration zur Trennung von

ausgefälltem IgG und BSA bei der Filtration von Rinderserum. Durch die Zugabe von fünf VDia

(Nd = 5) gelang es 97 % des BSA aus dem Retentat zu entfernen und eine Reinheit des IgG

von 93 % zu erreichen. Die Autoren führten den Verbleib von geringen BSA Menge im Retentat

unter Berufung auf Saksena & Zydney (1994) auf die Ausbildung von BSA-Aggregaten, bzw.

BSA-IgG-Interaktion, zurück.

Das Verfahren der Diafiltration eignet sich folglich zur Auswaschung niedermolekularer

Komponenten aus komplexen Feed-Medien. Ein komplettes Entfernen niedermolekularer

Bestandteile ist dennoch nicht möglich, deren Anteil kann aber deutlich reduziert werden

(Walter et al., 2012). Bereits durch die Zugabe von 3 – 5 VDia (Nd = 3 – 5) lassen sich, in

Abhängigkeit des Feeds, Retentat-Reinheiten von bis zu 97 % erreichen (Baldasso et al.,

2011; Venkiteshwaran et al., 2008; Goodnight Jr. et al., 1976).

Diskussion

217

5.4 Sensorik

5.4.1 Schulung des Sensorik-Panels

Prüfung auf Geschmacksblindheit (gemäß DIN EN ISO 8586:2014):

Zur Aufnahme des Ist-Zustand des Panels wurde eine Prüfung auf Geschmacksblindheit

gemäß DIN EN ISO 8586:2014 unter Verwendung überschwelliger Konzentrationen wässriger

Standards durchgeführt.

Die daraus hervorgehenden Ergebnisse bestätigen grundlegend die Eignung aller

Prüfpersonen für die Teilnahme an einer sensorischen Studie. Lediglich in einem Fall wurde

der Grenzwert von 80 % korrekter Zuordnungen unterschritten (DIN Deutsches Institut für

Normung e.V., 2014b). Das Nichterkennen einer Geschmacksausprägung wurde überwiegend

für „bitter“ beobachtet. Erkenntnisse von Hall, Bartoshuk, Cain, & Stevens (1975) deuten auf

eine bimodale Verteilung des Schwellenwerts der Bitterstoffe Phenylthiocarbamid (PTC) und

Koffein hin. Dies resultiert, besonders bei niedrigen Konzentrationen der Bitterstoffe, in einem

Erkennen bzw. Nichterkennen des Grundgeschmacks „bitter“ in Abhängigkeit des individuellen

Schwellenwerts (Hall et al., 1975). Die Ergebnisse von Tanimura & Mattes (1993) bestätigten

diese These. Die Autoren untersuchten die „bitter“-Sensibilität von Koffein- und Nicht-Koffein-

Konsumenten und ermittelten einen signifikant niedrigeren „bitter“-Schwellenwert für die

Population der Nicht-Koffein-Konsumenten. Für PTC sind mehrere Arten von Nicht-

Schmeckern bekannt. Frank & Korchmar (1985) unterteilten die Gruppe der „PTC-Nicht-

Schmecker“ in zwei Untergruppen, basierend auf einer Reaktionszeit-Analyse. Ähnliche

Unterschiede hinsichtlich der Sensibilität gegenüber Koffein sind denkbar. Reed, Tanaka, &

McDaniel (2006) gehen davon aus, dass eine unterschiedliche „bitter“-Wahrnehmung in

Abhängigkeit individueller genetischer Unterschiede besteht.

Die Prüfung auf Geschmacksblindheit wurde nicht als Ausschlusskriterium für die Teilnahme

am Panel gewertet, da von einer Verbesserung der Panel-Performance hinsichtlich

individueller Schwellenwerte und Vorhersagegenauigkeit im Rahmen der Prüferschulung

ausgegangen wurde (Labbe, Rytz, & Hugi, 2004; Pangborn, 1959).

Prüfung auf Wahrnehmung eines Reizes (gemäß DIN EN ISO 8586:2014):

Zur Schulung des Panels wurde eine Prüfung auf Wahrnehmung eines Reizes gemäß DIN EN

ISO 8586:2014 unter Anwendung einer Dreiecksprüfung gemäß DIN EN ISO 4120:2007

durchgeführt. Die dabei verwendeten überschwelligen Probenkonzentrationen orientierten

sich an den Vorgaben der Norm.

Die Ergebnisse belegen grundsätzlich die Eignung des gesamten Panels zur signifikanten

Unterscheidung (p < 0,05) von Prüflösungen. Hierfür sind bei einer Panelgröße von 23 Prüfern

Diskussion

218

mindestens 12 korrekte Antworten (je Prüfkategorie) notwendig (Quadt et al., 2009). Mehrfach

auftretende fehlerhafte Zuordnungen einiger Prüferpersonen verdeutlichen dennoch die

Sinnhaftigkeit einer gezielten Prüferauswahl im Anschluss an den Schulungsprozess.

Für die Grundgeschmacksarten „umami“, „sauer“ und „bitter“ kam es am häufigsten zu

fehlerhaften Zuordnungen. Die bei einigen Teilnehmern ersichtlichen Probleme bei der „bitter“-

Wahrnehmung können, wie bereits dargestellt, auf das Vorhandensein unterschiedlicher

Schwellenwerte für Koffein, sowie individuelle genetische Unterschiede zurückgeführt werden

(Reed et al., 2006; Hall et al., 1975). Fehlerhafte Zuordnungen von „umami“ resultierten nach

Angaben der Prüfer auf die Ähnlichkeit der Geschmacksausprägung zu „salzig“. Durch die

Wiederholung des Tests verbesserte sich der Anteil an korrekten „umami“-Zuordnungen von

65,22 % (Tag 1) auf 78,26 % (Tag 3). Ergebnisse von Kobayashi & Kennedy (2002) bestätigen

den positiven Effekt von sensorischer Erfahrung auf die Wahrnehmung von „umami“-Reizen

in Lebensmitteln. Darüber hinaus ist eine geringe Sensibilität für „umami“, ähnlich der von Hall

et al. (1975) beschriebenen „bitter“-Blindheit in der Literatur belegt. Sinesio, Comendador,

Peparaio, & Moneta (2009) schulten 12 Prüfpersonen auf die qualitative und quantitative

Wahrnehmung von „umami“. Im Rahmen ihrer Schulung stellten die Autoren fest, dass 14 %

der nicht geschulten Teilnehmer eine MSG-Konzentration von 1,87 g/l nicht von einer

Wasserprobe unterscheiden konnten. Lugaz, Pillias, & Faurion (2002) wiesen nach, dass 27

% eines 109-kopfigen Panels nicht spezifisch zwischen „salzig“ (NaCl) und „umami“ (MSG)

diskriminieren können und identifizierten „umami-Nicht-Schmecker“. Die Performance des

Gesamt-Panels für „sauer“ konnte von 52,17 % (Tag 1) auf 100,00 % (Tag 3) verbessert

werden. Der Schwellenwert für saure Komponenten variiert von Person zu Person. Ergebnisse

von Tempere et al. (2011) belegen, dass selbst erfahrene Experten stark unterschiedliche

Schwellenwerte für saure Komponenten wie Weinsäure aufweisen. Im Falle der „sauer“-

Wahrnehmung kann, gemessen an den Ergebnissen, ebenfalls von einem Trainingseffekt im

Rahmen der Prüferschulung ausgegangen werden. Die gereichte überschwellige

Konzentration wurde am Ende des Schulungsabschnitts zuverlässig erkannt.

Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle (gemäß ISO 3972:2011):

Um Kenntnisse bezüglich der Erkennungsschwellen der Prüfer zu erlangen, wurde eine

Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschelle gemäß ISO 3972:2011 unter Verwendung einer

einfachen beschreibenden Prüfung gemäß DIN 10964:2014 durchgeführt.

Ein vom Neutralgeschmack abweichender Reiz (Reizschwelle) wurde von den Prüfern bereits

bei den niedrigsten Konzentrationsstufen festgestellt. Der von „süß“ und „umami“ ausgehende

Reiz wurde im Vergleich zu den übrigen Geschmacksausprägungen später, sprich bei einer

höheren Konzentrationsstufe, wahrgenommen. Die prüferspezifischen

Wahrnehmungsunterschiede resultierten stellenweise in deutlichen Standardabweichungen

Diskussion

219

und individuellen Erkennungsschwellen. Von Schiffman, Crumbliss, Warwick, & Graham

(1990), Paulus & Reisch (1980), Pfaffmann, Bartoshuk, & McBurney (1971) dokumentierte

Konzentrationen der Erkennungsschwelle verschiedener Geschmacksstoffe sind beispielhaft

in Tabelle 69 dargestellt.

Tabelle 69: Konzentrationen der Erkennungsschwelle verschiedener Geschmacksstoffe (Schiffman et al., 19901; Paulus & Reisch, 19802; Pfaffmann et al., 19713)

Geschmack Substanz Mittelwert (g/l) Median (g/l) Bereich (g/l)

Min Max

süß3 Saccharose - 5,82 4,11 12,66

salzig3 Natriumchlorid - 1,76 0,18 4,97

sauer2 Zitronensäuremonohydrat 0,31 ± 0,16 - 0,07 0,50

bitter3 Koffein - 0,14 0,06 0,19

umami1 L-Mononatriumglutamat 0,08 ± 0,03a 0,61 ± 0,13b

- - -

Legende: a, erfahrene, junge Panelisten. b, unerfahrene, junge Panelisten.

Median (0,08 g/l) und Mittelwert (0,09 ± 0,03 g/l) von „bitter“ (Koffein) lagen in dieser Studie

geringfügig unter den Referenzwerten von Pfaffmann et al. (1971), Paulus & Haas (1980)

(MW: 0,16 ± 0,12 g/l), sowie Paulus & Reisch (1980) (MW: 0,17 ± 0,12 g/l; Min: 0,05 g/l; Max:

0,30 g/l), während die maximale (0,19 g/l) und minimale Erkennungsschwelle (0,05 g/l)

(annährend) deckungsgleich war. Die im Vergleich zu Paulus & Haas (1980) und Paulus &

Reisch (1980) geringe Standardabweichung bestätigt die Leistungsfähigkeit des Panels.

Unterschiede in der „bitter“-Wahrnehmung lassen sich, wie in den vorausgehenden

Abschnitten dargelegt, auf individuell verschiedene Schwellenwerte, sowie genetische

Unterschiede zurückführen.

Der Mittelwert (0,20 ± 0,18 g/l) für „umami“ lag im von Schiffman et al. (1990) für erfahrene

und unerfahrene Panelisten ermittelten Wertebereich, unterschied sich jedoch von Hong et al.

(2005) (MW: 1,47 ± 2,06 g/l). Die im Vergleich zu Schiffman et al. (1990) erhöhte

Standardabweichung deutet auf prüferspezifische Unterschiede in der „umami“-

Wahrnehmung hin. Diese Annahme findet in den Minima- und Maximawerten der

Erkennungsschwelle (Min: 0,07 g/l; Max: 0,79 g/l) Bestätigung. Eine unterschiedliche

Erkennungsschwelle für „umami“ kann, wie bereits dargelegt, nach Lugaz et al. (2002) auf

individuell unterschiedliche Erkennungsschwellen, sowie Probleme bei der Unterscheidung

von „salzig“ und „umami“ zurückgeführt werden. Die Erkenntnisse bestätigen die

Notwendigkeit einer gezielten Auswahl der Prüfpersonen zur Bewertung von „umami“-

Eindrücken.

Der Mittelwert (0,16 ± 0,02 g/l), sowie die maximale Erkennungsschwelle (0,20 g/l) für „sauer“

lag in dieser Studie deutlich unter den Referenzwerten von Paulus & Reisch (1980), während

die minimale Erkennungsschwelle (0,12 g/l) höher ausfiel. Wise & Breslin (2013) wiesen in

Diskussion

220

einer aktuellen Veröffentlichung noch niedrigere Werte aus (MW: 0,04 g/l; Min: 0,03 g/l; Max:

0,05 g/l). Die Autoren griffen jedoch auf ein erfahrenes Panel zurück. Die Erkennungsschwelle

für saure Geschmacksstoffe ist abhängig von der Erfahrung der Prüfer (Tempere et al., 2011).

Die niedrige Standardabweichung, sowie die geringe Differenz zwischen Minimum und

Maximum der Erkennungsschwelle, deuten auf eine gute Leistungsfähigkeit des Panels für die

Bewertung von „sauer“-Eindrücken hin.

Für die Geschmacksausprägung „süß“ lagen die Werte für Median (2,19 g/l), Minimum (0,79

g/l) und Maximum (8,54 g/l) der Erkennungsschwelle deutlich unter den Referenzwerten von

Pfaffmann et al. (1971). Eine größere Übereinstimmung wird im Vergleich zu Paulus & Reisch

(1980) besonders hinsichtlich von Minimum (1,2 g/l) und Maximum (8,8 g/l) der

Erkennungsschwelle deutlich. Die von Paulus & Haas (1980), sowie Paulus & Reisch (1980)

ermittelten Mittelwerte (5,17 ± 4,03 g/l bzw. 4,60 ± 3,12 g/l) liegen dennoch über dem Mittelwert

des Panels (2,41 ± 1,89 g/l). Die Wahrnehmung von durch Saccharose verursachten „süß“-

Reizen kann sich in Abhängigkeit genetischer Faktoren unterscheiden (Fushan, Simons,

Slack, & Drayna, 2010). Angaben zu Erkennungsschwellenwerten sind zudem

studienabhängig unterschiedlich, wie die Ergebnisse von Hong et al. (2005), Paulus & Haas

(1980), Paulus & Reisch (1980), Pfaffmann et al. (1971) und Henkin, Gill, & Bartter (1963)

belegen. Gemessen an der Erkennungsschwelle ist das Panel ausreichend sensibel für „süß“-

Reize. Eine deutliche Standardabweichung bestätigt jedoch die Notwendigkeit einer gezielten

Auswahl der Prüfpersonen.

Median (0,34 g/l) und die maximale Erkennungsschwelle (0,98 g/l) von „salzig“ lagen unter den

Referenzwerten von Pfaffmann et al. (1971), während die minimale Erkennungsschwelle (0,16

g/l) vergleichbar ausfiel. Vergleichbar zu „süß“ existieren in der Literatur auch bei „salzig“

teilweise deutlich voneinander abweichende Angaben für die Erkennungsschwelle. Wise &

Breslin (2013) ermittelten bei jungen Prüfern eine mittlere Erkennungsschwelle von 0,83 g/l

(Min: 0,54 g/l; Max: 1,27 g/l), während Hong et al. (2005) von 1,33 ± 1,05 g/l ausgehen.

Schiffman et al. (1990) nennen, in Abhängigkeit der Erfahrung der Prüfpersonen mittlere

Erkennungsschwellen zwischen 0,21 ± 0,04 g/l (erfahrene, junge Prüfer) und 0,74 ± 0,19 g/l

(unerfahrene, junge Prüfer). Diese Erkenntnisse decken sich mit den Ergebnissen der

vorliegenden Studie (MW: 0,36 ± 0,20 g/l). Die Erkenntnisse bestätigen im Hinblick auf die

Standardabweichung, ähnlich „umami“, die Notwendigkeit einer gezielten Auswahl der

Prüfpersonen zur Bewertung von „salzig“-Eindrücken.

Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes (gemäß DIN EN ISO

8586:2014):

Die Kenntnis der Erkennungsschwelle ermöglicht lediglich eine Aussage bezüglich der

Sensibilität einer Prüfperson für eine bestimmte Geschmacksausprägung. Anhand der

Diskussion

221

Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes kann, unter Verwendung einer

Rangordnungsprüfung gemäß DIN ISO 8587:2010, die tatsächliche Diskriminierungsfähigkeit

der Prüfperson ermittelt werden (DIN Deutsches Institut für Normung e.V., 2014b).

Um die Diskriminierungsfähigkeit des Panels zu bewerten ist ein mehrstufiger

Auswertungsprozess notwendig. Die grundlegende Diskriminierungsfähigkeit wurde mittels

Friedman-Test ermittelt. Der Test bestätigte, dass die Prüfpersonen die Proben aller

Geschmacksausprägungen signifikant (p < 0,05) voneinander unterscheiden konnten (Tabelle

51, Seite 166). Auf Basis des signifikanten Friedman-Tests erfolgte je

Geschmacksausprägung eine Betrachtung der einzelnen Probenpaare unter Verwendung des

Wilcoxon-Vorzeichen-Rangtests. Lediglich bei den Grundgeschmacksarten „süß“ und „bitter“

konnten die niedrigsten Konzentrationsstufen (Probenkombination: AB) nicht signifikant

voneinander differenziert werden (Tabelle 52, Seite 167). Die Ergebnisse deuten auf eine gute

Diskriminierungsfähigkeit des Panels hin. Diese Aussage wird durch die Betrachtung der

„mittleren Ränge“ (Tabelle 53, Seite 168), bei der jeweils eine Reihung der Konzentrationen D

> C > B > A vorgenommen wurde, bestätigt. Betrachtet man Minima und Maxima der Ränge

wird jedoch klar, dass ein oder mehrere Prüfer nicht in der Lage waren eine korrekte Reihung

der Proben vorzunehmen (Tabelle 54, Seite 168). Hiervon sind insbesondere niedrige

Probenkonzentrationen (A, B) betroffen. Unter Berücksichtigung der ermittelten mittleren

Erkennungsschwellen der Geschmacksausprägungen (Kapitel 4.4.1.3) wird deutlich, dass die

verwendete Probenkonzentration A (süß: 0,55 g/l; sauer: 0,16 g/l; salzig: 0,24 g/l; bitter: 0,07

g/l; umami: 0,12 g/l) stellenweise unter der Erkennungsschwelle einiger Prüfpersonen lag (süß

(MW): 2,41 ± 1,89 g/l; sauer (MW): 0,16 ± 0,02 g/l; salzig (MW): 0,36 ± 0,20 g/l; bitter (MW):

0,09 ± 0,03 g/l; umami (MW): 0,20 ± 0,18 g/l), sodass Verwechslungen der niedrigen

Probenkonzentrationen A und B nicht in mangelnder Differenzierung einer

Geschmacksausprägung sondern in einem Nicht-Erkennen des Geschmacks begründet sein

können. Gründe für prüferspezifische Unterschiede der Erkennungsschwellen wurden in den

vorausgehenden Abschnitten bereits näher beleuchtet. Prüferspezifische Unterschiede in der

Diskriminierungsfähigkeit von Geschmacksausprägungen lassen sich grundlegend auf

ähnliche Effekte zurückführen. Genetische Faktoren verfügen über einen signifikanten Einfluss

auf die Wahrnehmung und Intensität von Geschmackseindrücken (Bartoshuk, 2000). Miller Jr.

& Reedy Jr. (1990) untersuchten den Einfluss der prüferspezifisch vorhandenen Anzahl an

Geschmacksknospen auf die Intensitätswahrnehmung der Grundgeschmacksarten „süß“,

„salzig“, „sauer“ und „bitter“. Die Autoren verwiesen auf signifikant unterschiedliche Intensitäts-

Ratings in Abhängigkeit der Dichte an Geschmacksknospen bei der Beurteilung von

Saccharose-, NaCl- und Propylthiouracil-Lösungen durch zwei Gruppen von Prüferpersonen

(Gruppe 1 – hohe Dichte an Geschmacksknospen: 374 ± 134 Geschmacksknospen/cm2;

Gruppe 2 – niedrige Dichte an Geschmacksknospen: 135 ± 43 Geschmacksknospen/cm2).

Diskussion

222

Schulung zur Anwendung der Skale:

Um die Geschmackswahrnehmungen der Prüfpersonen quantifizieren zu können, wurden die

Prüfer auf die Nutzung einer ordinalen 7-Punkt Skale zur Intensitätsmessung trainiert. Die

Schulung erfolgte in Anlehnung an Rummel (2002) „Ausbildung eines deskriptiven Panels –

Schulungsphase: Training von Intensitätsmessungen“.

Die Prüfer erhielten je Grundgeschmacksart drei Proben unterschiedlicher Konzentration und

sollten diese zuerst hinsichtlich ihrer Intensität den Kategorien „schwach“, „mittel“ und „stark“

zuzuordnen. Im nächsten Schritt wurden die Prüfer gebeten auf einer 7-Punkt Skale

anzugeben, wie ausgeprägt sie den jeweiligen Geschmackseindruck empfunden haben. Die

mittleren Skalenbewertungen entsprachen den vorgesehenen Skalenwerten 2 „niedrig“, 4

„mittel“ und 6 „hoch“ (Tabelle 55, Seite 169). Einzelne Prüfpersonen hatten, beurteilt anhand

von Minima und Maxima der vergebenen Skalenwerte, jedoch Probleme bei der korrekten

Verwendung der Skale. Zu einer deutlichen Unterschätzung der Konzentrationen „mittel“ und

„hoch“ kam es jedoch nur in Einzelfällen, wie sich anhand Median und Modus der jeweiligen

Probenbewertungen erkennen lässt.

Voneinander abweichende Skalenbewertungen lassen sich einerseits auf prüferspezifisch

unterschiedlich wahrgenommene Intensitäten der jeweiligen Geschmacksreize zurückführen.

Gründe hierfür wurden bereits in den vorangegangenen Abschnitten dargestellt. Ebenso spielt

die individuell unterschiedliche Nutzung der Skale eine Rolle (Romano, Brockhoff, Hersleth,

Tomic, & Næs, 2008). Von Bedeutung sind hierbei, unter anderem, Level-Effekt (Wahl des

Skalenmittelpunkts), Scaling-Effekt (Ausnutzung der Skalenspanne), sowie eine individuell

unterschiedliche Empfindung der Differenz der Geschmacksausprägung zwischen Proben

(Næs, 1990). Eine Vermeidung der Vergabe extremer Skalenbewertungen kann ebenfalls zu

individuellen Unterschieden der Skalenbewertungen führen (Lawless & Heymann, 1999)

Darüber hinaus spielt die Reproduzierbarkeit der Bewertung bei identischen

Geschmacksreizen eine Rolle (Næs & Solheim, 1991). Skaleneffekte lassen sich durch

zielgerichtetes Training reduzieren, können aber niemals vollkommen ausgeschlossen werden

(Romano et al., 2008). Um Skaleneffekte im Rahmen dieser Studie zu minimieren, wird eine

gezielte Auswahl der Prüferpersonen vorgenommen.


Die Performance von Prüfpersonen unterscheidet sich individuell. Gründe hierfür sind,

unter anderen, unterschiedliche Sensibilitäten für bestimmte

Geschmacksausprägungen, sensorische Vorkenntnisse, Art und Umfang

sensorischen Trainings, sowie genetische Unterschiede zwischen den Prüfpersonen.

Diskussion

223

Erkenntnisse bezügliche den Erkennungsschwellen der fünf

Geschmacksausprägungen unterscheiden sich in Abhängigkeit der gewählten Quelle

teilweise deutlich.

Skaleneffekte (Unterschiedliche Verwendung der Prüfskale) beeinflussen individuell

die Nutzung der Prüfskale und können auch durch Training nicht vollständig vermieden

werden.


Die Panelteilnehmer sind in der Lage die fünf Grundgeschmacksarten zu erkennen und

unterschiedliche Geschmacksausprägungen zu unterscheiden.

Einige Prüfer hatten zur Beginn der Schulung Schwierigkeiten bei der zuverlässigen

Bestimmung von „umami“-, „sauer“- und „bitter“-Reizen.

Die mittleren Erkennungsschwellen des Panels decken sich mit Literaturerkenntnissen

und bestätigen grundsätzlich die Eignung des Panels.

Das Panel ist in der Lage unterschiedliche Intensitäten einer Geschmacksausprägung

voneinander zu unterscheiden und bezüglich der Intensität zu reihen.

Das Panel ist in der Lage unterschiedlichen Intensitäten einer Geschmacksausprägung

einen einheitlichen Skalenwert zuzuweisen.

Die Angaben einiger Prüfer weichen vom Mittel des Panels ab, sodass eine gezielte

Auswahl der am Panel teilnehmenden Prüfer notwendig ist.


Die Ergebnisse der Prüferschulung bestätigten die Notwendigkeit einer gezielten Auswahl der

Prüfpersonen für die finalen Panels. Als Grundlage für die Auswahl wurden die Ergebnisse der

Schulung zur Anwendung einer Skale (Kapitel 4.4.1.5) genutzt. Die Bewertung und Auswahl

der Prüfpersonen erfolgte in Anlehnung an die DIN EN ISO 8586:2014. Je

Geschmackausprägung wurde aus dem Prüferpool ein Panel zusammengestellt. Aufgrund

des ordinalen Skalenniveaus und der Verletzung der Annahme der Normalverteilung der

Daten wurden verteilungsunabhängige, nichtparametrische Testverfahren zur Auswertung

herangezogen.

Die Vorauswahl basierte auf dem nichtparametrischen Friedman-Test und diente dem

Ausschluss von Prüfpersonen mit geringer Diskriminierungsfähigkeit. Hieraus resultierten je

Geschmacksausprägung vorläufige Panels aus 8 – 16 Prüfern. Durch einen Vergleich der

individuellen Bewertungen mit dem Gruppenmittel je Geschmacksausprägung und

Merkmalsausprägung (niedrige, mittlere, hohe Intensität) wurden stark vom Gruppenmittel

abweichende Prüfer aus dem betroffenen Panel ausgeschlossen. Hieraus resultierten aus 4 –

8 Prüfern bestehende Panels. Die Homogenität der Panelbewertung wurde mittels Kruskal-

Wallis H Test überprüft. Im Falle von unzureichender Homogenität erfolgte ein Vergleich der

Diskussion

224

Bewertungen der einzelnen Prüfpersonen mittels Mann-Whitney U Test. Signifikante



Die für die Auswertung dieser Studie angewendete DIN EN ISO 8586:2014 gilt als

allgemeingültige Richtlinie, bleibt aber, besonders im Falle von ordinalen Skalenniveaus und

Verletzungen der Annahme der Normalverteilung, relativ vage. Als grundlegende

Anforderungen bleiben

eine Analyse der Varianz jeder Prüfperson zur Beurteilung der Verlässlichkeit der

Bewertungen,

eine statistische Auswertung der Unterschiede zwischen Prüfpersonen,

eine statistische Auswertung der Unterschiede zwischen den Proben, sowie

eine Auswertung bezüglich der Eignung einer Prüfperson in Bezug auf das

Gruppenergebnis.

Hierfür dürfen parametrische und nicht-parametrische Testverfahren verwendet werden.

Grundlegend ist gemäß DIN EN ISO 8586:2014 sicherzustellen, dass die Prüfpersonen

verlässliche, wiederholbare Bewertungen abgeben und in Form eines Panels als homogene

Einheit agieren. Die Norm empfiehlt für ein finales Panel eine Prüferanzahl von mindestens 10

Prüfern, sofern dies im Rahmen des Studiendesigns realisierbar ist (DIN Deutsches Institut für

Normung e.V., 2014b).

Die Auswertung der Diskriminierungsfähigkeit der Prüfpersonen verdeutlichte die individuell

unterschiedliche Leistungsfähigkeit der Prüfer in Abhängigkeit der Geschmacksausprägung.

Während bei „sauer“ ein Großteil des Panels (16 Prüfer) zur Differenzierung der

unterschiedlichen Merkmalsausprägungen imstande war, konnten bei den übrigen

Geschmacksausprägungen jeweils nur 8 – 9 Prüfer zwischen den verschiedenen

Konzentrationsstufen unterscheiden. Nur eine Prüfperson (Prüfer 20) verfügte dabei über eine

statistisch nachgewiesene Diskriminierungsfähigkeit für alle Geschmacksausprägungen. Auch

die Homogenität der Bewertungen unterschied sich in Abhängigkeit der

Geschmacksausprägung. Für „bitter“ und „umami“ wurden nur wenige Prüfpersonen aufgrund

von abweichenden Bewertungen vom Gruppenmittel aus den Panels ausgeschlossen (1 – 2

Prüfer). Im Falle von „süß“ und „sauer“ resultierten abweichende Bewertungen in einer

Halbierung der Anzahl der Prüfpersonen. Die anhand der Vorgaben der Norm erarbeiteten,

finalen Panels genügten, abgesehen von der Mindestanzahl von zehn Prüfern je Panel, den

Anforderungen der Norm und verfügten besonders hinsichtlich der Geschmacksausprägungen

„süß“, „sauer“ und „salzig“ über eine sehr homogene Bewertungsvergabe (p = 0,353 – 0,947).

Diese konnte lediglich für die Geschmacksausprägung „umami“ nicht in vergleichbarer Weise

Diskussion

225

erreicht werden (p = 0,129 – 0,231). Abweichende Punktevergaben, die in einer Reduzierung

der Panelhomogenität resultierten, wurden im Falle von „sauer“ bei „hoher Intensität“ (p =

0,353) und in Falle von „bitter“ bei „niedriger Intensität“ (p = 0,366) festgestellt.

Hinsichtlich der Auswahl von Prüfpersonen und Bewertung der Schulungsergebnisse sind

Problemstellungen bekannt. Traditionell werden beispielsweise Rangordnungstests

verwendetet, um die Differenzierungsfähigkeiten der Prüfer zu ermitteln und die

Leistungsfähigkeit eines einzelnen Prüfers in Bezug auf das Gruppenmittel des Panels zu

bewerten (Stone & Sidel, 2004). Hierbei wird das Gruppenmittel als Referenz für den Vergleich

genutzt. Die Verwendung des Gruppenmittels resultiert, gemäß Mangan (1992), jedoch in zwei

grundlegenden Auffälligkeiten:

Die Bewertung jedes Prüfers ist im Mittel enthalten, wodurch bei Vergleichen dieser Art

keine statistisch unabhängigen Variablen verglichen werden.

Die Bewertung basiert auf der Annahme, dass das Mittel ein akkurater

Vergleichsstandard für die Bewertung einer individuellen Prüfperson darstellt.

Problematisch bei sensorischen Bewertungen ist grundlegend die nicht vorhandene Kenntnis

bezüglich der „wahren“ Ausprägung eines Merkmals. Die Annahme, dass das Gruppenmittel

dem wahren Wert eines Merkmals entspricht, birgt die Gefahr des Ausschlusses einzelner

Prüfpersonen mit geringer Varianz und folglich hoher Vorhersagegenauigkeit die jedoch nicht

dem Mittel entsprechen (Mangan, 1992). Die beschriebenen Problemstellungen führten zu

intensiven Forschungen hinsichtlich alternativer Auswertungsmöglichkeiten. Latreille et al.

(2006), Brockhoff (2003), Schlich (1994) und Mangan (1992) erarbeiteten, unter anderen,

komplexe statistische Methoden um die genannten Problemstellungen einzudämmen und die

Aussagekraft sensorischer Bewertungen durch Panels zu verbessern. Die Komplexität dieser

Methoden erschwert jedoch deren Anwendung in sensorischen Kleinstudien. Die Ergebnisse

statistischer Test können darüber hinaus, in Abhängigkeit der gewählten Methode, zu

unterschiedlichen Aussagen führen, sodass die finale Bewertung über die Eignung eines

Prüfers letztendlich der Erfahrung des Prüfleiters überlassen bleibt. Die grundlegenden

Anforderungen an die Prüfer, wie Differenzierungsfähigkeit und Wiederholungspräzision,

sowie die Homogenität des Panels bleiben, unabhängig von der Art der Auswertung, erhalten

(Bárcenas, Elortondo, & Albisu, 2000).

Die in Kapitel 5.4.1 und Kapitel 5.4.2 dargestellte Bewertung der Ergebnisse der

Panelschulung und Prüferauswahl belegen die Konformität der finalen Panels mit den

Anforderungen der DIN EN ISO 8586:2014. Die Güte der Ergebnisse für die jeweiligen

Geschmacks- und Merkmalsausprägungen muss bei der Bewertung der sensorischen

Ergebnisse beachtet werden, um die Belastbarkeit der getroffenen Aussagen zu

gewährleisten.

Diskussion

226


Die Auswahl und Bewertung der Performance sensorischer Prüfer und Panels

beinhaltet, je nach Anforderung, komplexe statistische Methoden.

Maßgeblich für die Bewertung sind, unabhängig von der Auswertungsmethode,

Differenzierungsfähigkeit und Wiederholungspräzision der Prüfer, sowie die

Homogenität des Panels.


Zur Sicherstellung der Homogenität der Panelaussagen war der Ausschluss von

Prüfern aus den Panels notwendig.

Je Geschmacksausprägung wurden individuelle Panels aus 4 – 7 Prüfern

zusammengestellt.

Besonders hinsichtlich der Geschmacksausprägungen „süß“, „sauer“ und „salzig“

wurden sehr homogene Bewertungsvergabe (p = 0,353 – 0,947) erreicht.

Bei der Bewertung der sensorischen Ergebnisse muss die Güte der Bewertungen

einzelner Geschmacks- und Merkmalsausprägungen beachtet werden.


Retentat- und Permeatfraktion der fraktionierten Proteinhydrolysate wurden sensorisch

hinsichtlich der Geschmacksausprägungen „süß“, „sauer“, „salzig“, „bitter“ und „umami“

untersucht. Zusätzlich wurde ein Bitterstandard, sowie ein Gemisch aus Bitterstandard und

Permeat gereicht um zu überprüfen, ob die Permeatfraktion in der Lage ist, die „bitter“-

Wahrnehmung zu reduzieren.


Die Retentat- und Permeatfraktion des hydrolysierten Molkenprotein-Isolats wurde sensorisch

als überwiegend geschmacksneutral bewertet. Im Retentat wurde eine sehr schwache

„süß“-, im Permeat eine schwache „salzig“-Komponente wahrgenommen. Die „bitter“-

Ausprägung des Standards konnte durch die Zugabe von Permeat nicht signifikant verringert

werden, wurde jedoch als weniger intensiv empfunden.

Die sensorischen Eigenschaften von Molkenprodukten, Molkenproteinkonzentraten (WPC)

und Molkenproteinisolaten (WPI) sind in der Literatur bereits umfassend dokumentiert. Drake,

Karagul-Yuceer, Cadwallader, Civille, & Tong (2003) erarbeiteten eine standardisierte

Prüfsprache für getrocknete Milchpulver und getrocknete Milcherzeugnisse. Die

Geschmacksauprägungen „süß“, „salzig“, „gekocht“, „adstringierend“ und „kartonartig“ wurden

in den untersuchten 63 Produkten am häufigsten festgestellt. Untersuchungen von Russell,

Drake, & Gerard (2006) bestätigten diese Erkenntnisse und ergänzten die

Geschmacksausprägungen um „metallisch“ und „seifig“.

Diskussion

227

Mortenson, Vickers, & Reineccius (2008) verarbeiteten Molkenproteinisolate und

–Konzentrate zu Cheddar und Mozzarella um den Einfluss des Verarbeitungsprozesses auf

die sensorischen Eigenschaften der Endprodukte zu untersuchen. Bei den Endprodukten

wurden vor allem „Milch“- und „Koch“-Aromen, sowie ein „süß“-Geschmack festgestellt. Die

weiteren Grundgeschmacksausprägungen wurden nur in geringem Maße wahrgenommen.

Off-Flavours bei WPIs wie „kartonartig“ können, unter anderem auf die Entstehung von

Maillard-Reaktionsprodukten, Oxidation von Inhaltsstoffen und weitere prozessbedingte

Veränderungen des Rohstoffs zurückgeführt werden (Morr & Ha, 1991).

Molkenproteinhydrolysate werden aufgrund ihres Gehalts an kurzkettigen, hydrophoben

Peptiden häufig als „bitter“ empfunden (Matoba & Hata, 1972). Leksrisompong, Miracle, &

Drake (2010) arbeiteten bei der umfangreichen Charakterisierung von 22

Molkenproteinhydrolysaten darüber hinaus die Geschmacksausprägungen „sauer“,

„adstringierend“, „malzig“, „käsig“, „kartoffelig“ und „verbrannt“ heraus. Eine „bitter“

Geschmacksausprägung wurde im Rahmen dieser Studie für Molkenproteine weder im

Retentat noch im Permeat festgestellt, obwohl, bezugnehmend auf die Ergebnisse der SE-

HPLC Analytik, vom Vorhandensein kurzkettiger Di- und Tripeptidverbindungen ausgegangen

werden muss. Der verhältnismäßig hohe Anteil an Leucin (ca. 9,6 %) im Ausgangsprodukt

scheint ebenfalls nicht in einer erhohten „bitter“-Ausprägung zu resultieren (Glanbia

Nutritionals Ltd., 2012). L-Leucin ist dafür bekannt eine bitteren Geschmack zu verursachen

(Warendorf, Belitz, Gasser, & Grosch, 1992). Die sehr schwach empfundene „süß“-

Komponente der Retentatfraktion ist möglicherweise durch das Vorhandensein geringer

Mengen Lactose (ca. 1,5 %) im Rohstoff erklärbar. Lactose verfügt über eine leicht süßen

Geschmack (Shallenberger, 1993). Dagegen spricht, bezugnehmend auf die Trenngrenze der

Membran (100 kDa), die molare Masse von ca. 342 Da (Butylina et al., 2006). Es muss davon

ausgegangen werden, dass die im Feed vorhandene Lactose die Membran nahezu vollständig

passiert hat und sich im Permeat anreichert. Dafür sprechen auch Ergebnisse von Chollangi

& Hossain (2007), die bei der Ultrafiltration von Abwässern der Milchproduktherstellung bereits

bei einem MWCO von 10 kDa eine Lactoserückgewinnung im Permeat von 100 % erreichten.

Das Vorhandensein von Lactose im Retentat kann, betrachtet man die SE-HPLC

Chromatogramme, jedoch nicht ausgeschlossen werden, da in der Retentatfraktion

Verbindungen im Bereich von ca. 300 – 400 Da nachgewiesen wurden. Die schwache „salzig“

Komponente kann, unter anderem, auf im Rohstoff befindliche Salze zurückzuführen werden,

die sich im Permeat anreichen. Hellemann (1992) stelle fest, dass der wahrgenommene

„salzig“-Eindruck von NaCl durch den Zusatz geringer Mengen Säure (Milchsäure, Essigsäure)

verstärkt wird. Smith, Metzger, & Drake (2016) arbeiteten heraus, dass Molke- und

Milchpermeate die „salzig“ Wahrnehmung von Suppen steigern und führten dies, unter

anderem auf den Milchsäure-Gehalt der Permeate zurück. Eine vergleichbare, säureinduzierte

Diskussion

228

Erhohung des „salzig“-Eindrucks erscheint auch im Falle des verkosteten Permeats möglich.

Andererseits besteht die Moglichkeit, dass der „salzig“ Eindruck durch niedermolekulare

Peptidverbindungen zustande kommt. Tamura et al. (1989) identifizierten „salzig“/“umami“

schmeckende Dipeptide aus Glutamin- (Glu) und Asparaginsäure (Asp). Nakata et al. (1995)

stellten bei der Untersuchung des „schmackhaften Peptides“ welchem ein „umami“- und

„salzig“-Geschmack zugeschrieben wird fest, dass die Position der Aminosäuren

Glutaminsäure und Asparaginsäure eine wesentlichen Einfluss auf den „umami“/“salzig“-

Eindruck des Peptids haben. Hohe Konzentrationen, der durch den Hydrolyseprozess frei

zugänglichen Aminosäuren Glutaminsäure (16,7 %) und Asparaginsäure (10,7 %) im Rohstoff

legen die Vermutung einer ladungsbedingten Ausbildung von Asp-Glu-Dipeptiden oder, in

Verbindung mit NaCl, die Ausbildung von Dipeptidsalzen nahe.


Die Retentatfraktion der hydrolysierten Alge (Chlorella vulgaris) wurde sensorisch als schwach

„salzig“, sowie sehr schwach „umami“ bewertet. Das Permeat wurde als schwach „salzig“-,

sowie sehr schwach „sauer“ und „umami“ empfunden. Die „bitter“-Ausprägung des Standards

konnte durch die Zugabe von Permeat signifikant verringert werden, während „salzig“ als

schwach bis mittel empfunden wurde.

Der Geschmack von Algen bzw. Algenprotein ist, bedingt durch das ernährungsphysiologische

Potential des Rohstoffs, besonders in Sachbüchern charakterisiert. Die Beschreibungen

reichen von „charakteristisch“ bis „salzig“ und „fischig“ (Donhauser, 2017; Kreischer,

Schuttelaar, & Farm, 2016). Darüber hinaus wird eine „umami“-Geschmacksauprägung

beschrieben (Kreischer et al., 2016). In der wissenschaftlichen Primärliteratur sind

Algenproteine und –Hydrolysate bis dato nicht umfassend charakterisiert. Becker (2007) zieht

den fischigen Geruch, die pulverförmige Konsistenz und die dunkelgrüne Farbe als Grund für

den geringen Einsatz von getrocknetem Algenprotein in Lebensmitteln heran. Die Einarbeitung

von Algenprotein in Lebensmitteln ist, trotz der genannten Nachteile, intensiver Gegenstand

der Forschung. Morimura & Tamiya (1954) arbeiteten Chlorella Pulver in Brot, Nudeln und

Kekse ein. Fradique et al. (2010) bewerteten die sensorischen Eigenschaften von mit Chlorella

vulgaris und Spirulina maxima versetzten Nudelprodukten als positiv hinsichtlich der

Produktakzeptanz. Zumeist wirkt sich der Zusatz von Algenprotein jedoch nachteilig auf die

sensorischen Attribute des Produkts aus (Beheshtipour, Mortazavian, Mohammadi,

Sohrabvandi & Khosravi-Darani, 2013).

Weder Retentat noch Permeat des Algenproteinhydrolysats wurden als „bitter“ empfunden.

Die für einen bitteren Geschmack bekannten Aminosäuren L-Try, L-Phe, L-Tyr und L-Leu sind

in Algenprotein, mit Ausnahme von Leucin mit 7,5 – 9,5 %, nur schwach repräsentiert (Safi et

al., 2014). Glutaminsäure und Asparaginsäure stellt im Algenprotein mit 9,1 – 13,7 % bzw. 9,3

Diskussion

229

– 10,9 % den größten Anteil dar (Safi et al., 2014). Die in Retentat und Permeat identifizierte

„salzig“/“umami“-Ausprägung kann von Dipeptiden aus Glu und Asp hervorgerufen werden.

Da der Na-Gehalt des Rohstoffes nicht aus der Spezifikation hervorgeht, kann das

Zustandekommen des „salzig“-Geschmacks durch Na-Verbindungen jedoch nicht

ausgeschlossen werden (Allma, 2014). Der im Permeat festgestellte „sauer“-Eindruck ist

möglichweise durch Glu- und Asp-haltige Oligopeptide zu begründen (Tamura et al., 1989).

Auch frei vorliegende Glu, Asp und Asn oder eine Verbindung aus His und HCl, sowie weitere

Dipeptide auf Glu-, Asp-, sowie Ser- und Ala-Basis kommen dafür in Frage (Kirimura et al.,

1969).

Die „bitter“-Geschmacksauprägung von Koffein wurde durch Zugabe der Permeatfraktion

signifikant reduziert. Eine Reduzierung des „bitter“-Geschmacks ist, wie in Kapitel 2.5.3

dargestellt, durch verschiedene Mechanismen möglich. Hiervon erscheinen besonders

Modulationen auf molekularer Ebene als wahrscheinlich. Darunter fallen das Einwirken von

Molekülen die eine Komplexbildung bewirken, Bitterstoffe zersetzen oder deren Transport zum

Rezeptor einschränken, als Gegenspieler der T2R-Rezeptor Bindungsstellen wirken, sowie

Moleküle, welche die T2R-Rezeptorbindungsstellen verändern, Moleküle die weitere Proteine

der Transduktionskette modulieren, Moleküle die die Funktion des TRPM5-Ionenkanals oder

die Ausschüttung, Bindung und Wiederaufnahme von Neurotransmittern beeinflussen (Ley,

2008). Natrium-Salze sind dafür bekannt die „bitter“-Wahrnehmung zu reduzieren (Keast et

al., 2001; Breslin & Beauchamp, 1995). Keast et al. (2001) setzten, unter anderem, NaCl,

Natrium-Acetat und Natrium-Glucanat dazu ein um die „bitter“-Ausprägung von KCl,

Harnsäure und Amilorid zu reduzieren, während der „bitter“-Eindruck von Koffein und Chinin-

HCl nur geringfügig vermindert werden konnte. Breslin & Beauchamp (1995) gelang es

darüber hinaus die durch Koffein erzeugte „bitter“-Wahrnehmung durch die Zugabe von 0,3 M

– 0,5 M NaCl um 55 ± 6 % zu reduzieren. Der Effekt scheint insbesondere von den Na+-Ionen

auszugehen (Breslin & Beauchamp, 1995). Keast et al. (2001) postulierten verschiedene

Wirkmechanismen, darunter die Ausbildung eines ladungsbedingten Abschirmungseffekts am

Rezeptor, sowie die Modulation der am Transduktionsprozess beteiligten Ionen-Kanäle.

Aufgrund der niedrigen Na-Konzentration von ca. 0,1 % im Rohstoff wird nicht von einer auf

der Wirkung von Natrium-Salzen basierende Reduktion der „bitter“-Geschmacksausprägung

ausgegangen. Eine Reduktion des „bitter“-Eindrucks durch strukturelle Änderungen des

Bitterstoffs erscheint aufgrund der chemischen Stabilität von Koffein unwahrscheinlich. Koffein

liegt bis 141 °C in der β-Form vor und wandelt sich bei Überschreitung der Grenztemperatur

in die α-Form (Epple, Cammenga, Sarge, Diedrich, & Balek, 1995). Der Siedepunkt liegt

zwischen 234 – 236 °C (Bothe & Cammenga, 1979; Anselmino, Biberfeld, & Gilg, 1911).

Binello, Cravotto, Nano, & Spagliardi (2004) gelang eine Abschwächung des „bitter“-Eindrucks

von Koffein um ca. 90 % durch Zugabe von 0,4 % β-Cyclodextrin oder 0,4 % eines Chitosan-

Diskussion

230

β-Cyclodextrin Polymer zu einer 0,05 %-Koffeinlösung. Basierend auf Bibby, Davies, & Tucker

(2000) ist die Ausbildung nicht-kovalenter Komplexe denkbar, die in einer Reduktion des

„bitter“-Eindrucks resultiert. Eine Verminderung des „bitter“-Geschmacks durch

Komplexbildung erscheint unter Berücksichtigung der bekannten Komplexbildner und der

chemischen Zusammensetzung des Rohstoffes unwahrscheinlich. Mattes (2007) erreichte

eine Abschwächung der „bitter“-Wahrnehmung von Koffeinmodelllösungen, sowie eine

Erhohung der „bitter“-Erkennungsschwelle durch die Zugabe von 1% Linolsäure. Der Zusatz

von Linolsäure erhoht darüber hinaus auch die Erkennungsschwellen für „sauer“ und „salzig“.

Zur Herstellung homogener Probenlösungen wurde ein Emulgator verwendet. Linolsäure, eine

zweifach ungesättigte Fettsäure, ist nur schlecht wasserlöslich (Belitz et al., 2008). Der

Mechanismus der Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung durch Fettsäuren ist nicht geklärt.

Mattes (2007) führt, unter Berufung auf Koriyama, Wongso, Watanabe, & Abe (2002), Metcalf

& Vickers (2002), Lynch, Liu, Mela, & MacFie (1993), sowie Forss (1973), Möglichkeiten zur

Modulation der Geschmackswahrnehmung durch Fettsäuren auf. Diese beinhalten

eine Reduktion der Konzentration des für den Reiz verantwortlichen Stoffes durch eine

fettsäureninduzierte Anregung des Speichelflusses,

die Ausbildung einer Barriere, die den Zugang von reizauslösenden Molekülen zu den

Rezeptoren hemmt, oder

die Modulation der Raumstruktur einer Geschmackskomponente, sowie der effektiven

Konzentration.

Der zur Hydrolyse verwendete Rohstoff verfügt über einen Fettgehalt von ca. 9,6 % (Allma,

2014). Aufgrund der mangelnden Wasserlöslichkeit von Fetten wird vermutet, dass der

Fettsäureanteil im Hydrolysat durch den Aufbereitungsprozess (Zentrifugation, Filtration)

abgetrennt wurde. Der Effekt von Fettsäuren ist, in Abhängigkeit der Fettsäure, zudem nicht

besonders stark und an erhöhte Konzentrationen gebunden (Ley, 2008). Es wird folglich nicht

davon ausgegangen, dass die notwendigen Fettsäure-Konzentrationen erreicht werden, um

eine signifikante Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung auszulösen. Am wahrscheinlichsten ist

eine Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung durch im Permeat vorliegende Peptidverbindungen.

Für die Bitterwahrnehmung sind Rezeptoren der T2R-Familie verantwortlich (Mueller et al.,

2005). Eine Reduktion des „bitter“-Geschmacks auf molekularer Ebene kann durch die

Hemmung der Bindung von Bitterstoffen an die relevanten Rezeptoren erreicht werden

(Nadathur & Carolan, 2016). Als „bitter“-Blocker sind mittlerweile sieben Substanzen bekannt,

deren Wirkung auf eine Interaktion mit bestimmten „bitter“-Rezeptoren zurückzuführen ist.

Darunter fallen

GIV3727 (4-(2,2,3-tri-Methylcyclopentyl)-Buttersäure) als Gegenspieler des

hTAS2R31 (Slack et al., 2010),

Diskussion

231

Probenecid (4-(di-Propylsulfamoyl)benzoesäure), welches, vermutlich über einen

allosterischem Mechanismus mit hTAS2R16 interagiert (Greene et al., 2011),

4‘-fluoro-6-Methoxyflavanon, welches die „bitter“-Wahrnehmung an hTAS2R39

beeinflusst (Roland et al., 2014),

die Sesquiterpenlactone (STL) 3β-Hydroxydihydrocostunolid (3HDC) und 3β-

hydroxypelenolid (3HD) die an hTAS2R46 wirken (Brockhoff et al., 2011), sowie

die Aminosäurenderivate α-Aminobuttersäure (GABA) und Nα,Nα-bis(Carboxymethyl)-

L-Lysin (BCML) an T2R4 (Pydi et al., 2014)

Zudem berichteten Belikov & Gololobov (1986) von einer Eliminierung der „bitter“-

Geschmacksausprägung von Koffein, Brucin und Proteinhydrolysaten durch das Dipeptid L-

Glu-L-Glu. Die Aussage der Autoren ist jedoch nicht durch quantitative Daten belegt.

Die genannten Substanzen reduzieren die „bitter“-Wahrnehmung nicht nur an den genannten

Rezeptor-Typen. GIV3727, 3HD und 3HDC wirken beispielsweise übergreifend an hTAS2R31,

hTAS2R40 und hTAS2R43 (Brockhoff et al., 2011; Slack et al., 2010). Die Wirkweise der

verschiedenen Verbindungen ist nicht abschließend geklärt. Brockhoff et al. (2011) vermuten

beispielsweise ein antagonistisches Prinzip, bei dem 3HD oder 3HDC an die Bindungsstelle

der Rezeptoren andocken, dort aber nicht zu einer Aktivierung führen. Dies führen die Autoren

auf eine strukturelle Ähnlichkeit der Antagonisten zu den eine „bitter“-Wahrnehmung

auslösenden Agonisten zurück. Die Annahmen fußen auf einer Hypothese von Brockhoff,

Behrens, Niv, & Meyerhof (2010) die von dem Vorhandensein nur einer Bindungsstelle an

hTAS2Rs ausgehen. Von der Existenz eines universalen „bitter“-Blockers wird nicht

ausgegangen, da die bekannten Substanzen nicht für alle 25 T2Rs Wirkung zeigten, sodass

eine komplette Blockierung des „bitter“-Geschmacks, im besten Fall, nur durch eine

Kombination verschiedener Substanzen erreicht werden kann (Pydi et al., 2014).

Aufgrund der Zusammensetzung des Rohstoffs, sowie der daraus vermuteten

Zusammensetzung des Hydrolysats wird abschließend davon ausgegangen, dass die Wirkung

als „bitter“-Blocker von einer oder mehreren Peptidverbindungen ausgelöst wurde. In Frage

kommen hierfür, unter Berücksichtigung des hohen Glu-Anteils in Algen der Gattung Chlorella

vulgaris und Berufung auf Belikov & Gololobov (1986), das Dipeptid L-Glu-L-Glu. Um diese

Hypothese bestätigen zu können, ist eine Sequenzierung der in der Permeatfraktion

vorhandenen Verbindungen, sowie weitere sensorische Versuche mit den identifizierten und

isolierten Reinsubstanzen notwendig. Es wird nicht davon ausgegangen, dass eine

Verminderung des „bitter“-Geschmacks auf den von Mattes (2007) identifizierten Effekte der

„bitter“-Reduktion durch das Vorhandensein von Fettsäuren, insbesondere Linolsäure

zurückzuführen ist. Aufgrund der mangelnden Wasserlöslichkeit von Fetten wird auch an

dieser Stelle vermutet, dass der Fettsäureanteil im Hydrolysat durch den

Diskussion

232

Aufbereitungsprozess (Zentrifugation, Filtration) abgetrennt wurde. Darüber hinaus führt der

Zusatz von Linolsäure zu einer Erhohung der Erkennungsschwellen für „sauer“ und „salzig“

(Mattes, 2007). Im Falle einer Reduktion der „bitter“-Ausprägung durch Linolsäure wären

folglich auch die Geschmacksausprägungen „sauer“ und „salzig“ in der Probe „Bitter-Standard

& Permeat“ niedriger bewertet worden. Denkbar ist ebenfalls eine Reduktion der „bitter“-

Wahrnehmung durch „salzig“ schmeckende Peptide, ähnlich der Erkenntnisse von Keast et

al. (2001) und Breslin & Beauchamp (1995) für Natrium-Verbindungen. Eine Reduktion des

bitteren Geschmacks durch Na-Salze, kann aufgrund der fehlenden Kenntnis hinsichtlich des

Na-Gehalt des Rohstoffs nicht vollständig ausgeschlossen werden.

Zusammenfassende Theorie zur Hemmung der „bitter“-Ausprägung durch Fraktionen von

hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris):

Die Wirkmechanismen „bitter“-blockender Verbindungen sind, trotz intensiver

Forschungsbemühungen, nicht abschließend geklärt. Aktuelle Veröffentlichungen zum Thema

gehen zumeist von einer Rezeptorinteraktion der „bitter“-blockenden Substanzen aus. Neben

der Möglichkeit einer allosterischen Hemmung der Enzymfunktion stellt insbesondere das

„Gegenspieler-Prinzip“ eine nachvollziehbare Theorie dar (Brockhoff et al., 2011; Slack et al.,

2010). Hierbei blockiert der „bitter“-Blocker, bedingt durch strukturelle Ähnlichkeit, die

Bindungsstelle des Rezeptors und sorgt somit für eine Abschwächung der „bitter“-

Wahrnehmung (Brockhoff et al., 2011). Die Annahmen fußen auf einer Hypothese von

Brockhoff, Behrens, Niv, & Meyerhof (2010), die von dem Vorhandensein nur einer

Bindungsstelle am Rezeptor hTAS2Rs ausgehen. Im Hinblick auf die in humansensorischen

Studien festgestellte Reduktion aber nicht vollständige Maskierung einer „bitter“-Ausprägung

erscheint ein derartiger Mechanismus stimmig, da dieser aufgrund der Vielzahl an Rezeptoren

der T2R-Familie nicht für alle Rezeptortypen greift. Eine von Ley (2008) angeführte Modulation

von „second-messenger“-Botenstoffen, sowie der Ausschüttung und Wiederaufnahme von

Neurotransmittern gilt ebenfalls als schlüssig, ist aufgrund er Komplexität der Vorgänge des

Transduktionsprozesses vermutlich nur schwer nachweisbar.

Im Rahmen dieser Studie wird, wie vorab dargestellt, davon ausgegangen, dass

Peptidverbindungen für die Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung verantwortlich sind. In

Anbetracht der angeführten Moglichkeit zur Hemmung einer „bitter“-Ausprägung erscheint

besonders das von Brockhoff et al. (2011) bereits vorab beschriebene antagonistische Prinzip

einen denkbaren Lösungsansatz zu liefern. Hierbei ist das Vorhandensein eines oder mehrerer

Antagonisten denkbar. Unter Berücksichtigung der SE-HPLC-Analysen der Permeatfraktionen

wird davon ausgegangen, dass die verantwortliche(n) Struktur(en) < 1,35 kDa sind oder aus

Fragmenten < 1,35 kDa bestehen, die sich beispielweise durch ladungsbedingte ionische

Bindungen oder Wasserstoffbrückenbindungen zu komplexeren Strukturen

Diskussion

233

zusammengeschlossen haben, welche in der Lage sind die Bindungsstelle eines oder

mehrerer Rezeptortypen zu besetzen.

Um diese Aussagen zu verifizieren, sind neben der Sequenzierung der verwendeten

Fraktionen weitere, umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion der

identifizierten Strukturen mit den Bindungsstellen verschiedener Rezeptortypen, sowie deren

Interaktion bei bestimmten Milieuverhältnissen notwendig.


„bitter“-Geschmack kann durch niedermolekulare Peptidverbindungen ausgelöst

werden.

Die Peptide L-Tryptophan (Try), L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr), L-Leucin (Leu)

werden mit einem „bitter“-Geschmackseindruck in Verbindung gebracht.

Glu und Asp-haltige Di- und Oligopeptide verfügen über „salzig“, „umami“ und „sauer“

Geschmacksausprägungen.


Aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat gewonnene Fraktionen verfügen nicht über

nennenswerte Geschmacks- oder geschmacksmodulatorische Eigenschaften. Im

Retentat wurde eine sehr schwache „süß“-Ausprägung im Permeat ein schwacher

„salzig“-Geschmack identifiziert.

Aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) gewonnene Fraktionen weisen „salzig“,

„umami“ und „sauer“ Ausprägungen auf. Diese werden vermutlich durch Glu und Asp-

haltige Di- und Oligopeptide ausgelöst.

Permeatfraktionen (< 100 kDa) aus hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) führten zu

einer Reduktion der „bitter“-Wahrnehmung.

Der Wirkmechanismus der „bitter“-Reduktion durch niedermolekulare

Peptidverbindungen ist bis dato nicht abschließend geklärt.

Das Agieren der Peptidverbindungen als Antagonisten zu bestimmten Bitterstoffen,

vergleichbar des für 3β-Hydroxydihydrocostunolid und 3β-hydroxypelenolid

postulierten Mechanismus, erscheint möglich.

Diskussion

234

5.5 Evaluation der Ergebnisse

In den folgenden Abschnitten werden die Ergebnisse in Bezug auf die formulierten Hypothesen

bewertet und abschließend zusammengefasst.

5.5.1 Evaluation der Ergebnisse in Bezug auf die formulierten Hypothesen

Nachfolgend werden die Ergebnisse in Bezug auf die zu Beginn formulierten Hypothesen

betrachtet.

Hypothese 1: Proteinhydrolysate lassen sich durch Filtration in Fraktionen auftrennen.

Status: teilweise verifiziert

Grundlegend eignet sich die erarbeitete Methode zur Auftrennung von Proteinhydrolysaten.

Die im Rahmen dieser Studie untersuchten Hydrolysate konnten per Crossflow-Filtration in

zwei Fraktionen getrennt werden. Hierzu wurde ein MWCO von 100 kDa verwendet. Zur

Optimierung des Fraktionierungsprozesses wurde der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke

auf die Filtrationsparameter Permeatflux JFm, Transmission, sowie die

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen, überprüft.

Entgegen den Erwartungen konnten jedoch nicht mehr als zwei Fraktionen pro Rohstoff

erzeugt werden. Zudem wurden für Permeatflux JFm und Transmission rohstoffabhängig

teilweise signifikante Einflüsse von pH-Wert und Ionenstärke festgestellt, die, vermutlich

aufgrund des dominanten Einflusses ladungsbedingter Molekül-Membran- und Molekül-

Molekül-Interaktionen, jedoch keinen maßgeblichen Einfluss auf die per SE-HPLC ermittelte

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen haben. Entscheidend für die Güte der Fraktionierung

ist die Beschaffenheit der Foulingschicht. Unter Berufung auf die Erkenntnisse von She et al.

(2009), Salgın (2007), Huisman et al. (2000) und Pouliot et al. (1999) wird davon ausgegangen,

dass pH-Wert, sowie Nähe zum IEP der gelösten Stoffe, Ionenstärke und pH-induzierte

Abstoßungseffekte die Foulingneigung und Struktur der Foulingschicht beeinflussen. Während

sich deren Einfluss in zumeist unter Verwendung von BSA ermittelten Modellsystem

reduzieren lässt, deuten unter anderem Erkenntnisse von Almécija et al. (2007) darauf hin,

dass sich die in Modellsystemen ermittelten optimalen Filtrationsbedingungen nicht ohne

Weiteres auf komplexere Medien übertragen lassen. Bei komplexen Medien ist diesbezüglich

eine Minimierung der Foulingeinfüsse, jedoch keine vollständige Vermeidung selbiger zu

erwarten. Dies resultiert in teilweise deutlichen Verschiebungen des MWCO und konnte auch

durch die Anwendung von Ultraschall während der Filtration nicht umgangen werden. Die

Erzeugung von mehreren, hinsichtlich der Molekülgrößenverteilung enger definierter

Fraktionen, gestaltet sich somit schwierig. Einen Ansatzpunkt zur Verbesserung der

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen stellt die Dialyse des Feeds vor dem eigentlichen

Filtrationsprozess dar. Hierbei lassen sich bereits durch 24-stündige Dialyse unter

Diskussion

235

Verwendung eines MWCO von 2 kDa Moleküle ≤ 1,35 kDa zuverlässig auswaschen. Die

Ausbildung von internem Fouling kann so potentiell reduziert werden. Eine Verifizierung dieser

These steht jedoch noch aus. Unabhängig davon kann die zu Beginn aufgestellte Hypothese

unter Berücksichtigung des aktuellen Kenntnisstands somit teilweise verifiziert werden.

Hypothese 2: Durch Hydrolyse kann aus der Alge (Chlorella vulgaris) ein für die

Fraktionierung nutzbares Feed gewonnen werden.

Status: verifiziert

Durch Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris) konnte ein für Fraktionierungszwecke nutzbares

Feed unter Verwendung Pronase erzeugt werden.

Eine Hydrolyse der Alge Chlorella vulgaris resultiert bedingt durch die geringe Zugänglichkeit

des Proteins in einer komplexen Abfolge mehrerer Verfahrensschritte. Eine der Hydrolyse

vorausgehende Vorbehandlung mit HCl, pH 3 ist notwendig um die Zellwandstrukturen der

Alge zu lysieren. Die daraus resultierende Molekülgrößenverteilung verfügt über ein breites

Molekülgrößenspektrum mit Strukturen von bis zu 670 kDa. In Anbetracht der von Morris et al.

(2008) durchgeführten Charakterisierung von Chlorella vulgaris Proteinen muss davon

ausgegangen werden, dass die Ausbildung von Proteinaggregaten nicht auszuschließen ist.

Unter Berücksichtigung der Zielsetzung der Fraktionierung kann die aufgestellt Hypothese

verifiziert werden.

Hypothese 3: Die anhand von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat gewonnenen

Kenntnisse hinsichtlich der Fraktionierung lassen sich auf weitere Proteinquellen

übertragen.

Status: teilweise verifiziert

Die grundlegenden Betriebsparameter Pumpenfördermenge Q/Strömungsgeschwindigkeit ʋ,

Transmembrandruck pTMP, Feed-Temperatur TCF, sowie die Anzahl der verwendeten

Diavolumina VDia wurden bei allen Versuchen beibehalten.

pH-Wert und Ionenstärke des Feeds besitzen, wie bereits unter Hypothese 1 dargestellt,

jedoch einen maßgeblichen Einfluss auf Permeatflux JFm, Transmission, sowie die

Molekülgrößenverteilung der Fraktionen. Eine vollständige Verifizierung der Hypothese ist

somit nicht möglich.

Diskussion

236

Hypothese 4: Einzelne Peptid-Fraktionen verfügen über unterschiedliche

Geschmacksqualitäten.

Status: verifiziert

Die sensorisch untersuchten Retentat- und Permeatfraktionen wurden als „süß“ (Retentat

hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat), „salzig“ (Permeat hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat,

Retentat/Permeat hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris)), „sauer“ (Permeat hydrolysierte Alge

(Chlorella vulgaris)) und „umami“ (Retentat/Permeat hydrolysierte Alge (Chlorella vulgaris))

charakterisiert.

Während die „süß“-Komponente von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat vermutlich auf im

Retentat befindliche Lactose-Rückstände zurückzuführen ist, wird davon ausgegangen, dass

die weiteren Geschmackseindrücke überwiegend auf Glu und Asp-haltige Di- und

Oligopeptidverbindungen zurückzuführen ist. Um diese Aussage zu verifizieren, ist eine

Sequenzierung der Strukturen mit anschließender sensorischer Bemusterung notwendig. Die

Hypothese kann diesbezüglich unter Vorbehalt verifiziert werden.

Hypothese 5: Eine Peptidfraktion besitzt die Eigenschaft eines Bittergeschmack-

Blockers.

Status: verifiziert

Die aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat, sowie hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

gewonnenen Permeatfraktionen wurden hinsichtlich ihrer „bitter“-blockenden Eigenschaften

auf den durch Koffein hervorgerufenen Bittergeschmack untersucht. Hierzu wurde ein flüssiger

„bitter“-Standard (0,22 g/l Koffein) mit „bitter“-Standard/Permeat-Lösungen (0,22 g/l

Koffein/1,0 g/l fraktioniertes Proteinhydrolysat) bezüglich der „bitter“-Ausprägung vergleichend

bewertet.

Durch Zusatz von fraktioniertem Proteinhydrolysat aus Alge (Chlorella vulgaris) konnte der

„bitter“-Eindruck von Koffein signifikant um 40,3 % verringert werden. Dies ist vermutlich auf

das Wirken einer oder mehrerer Peptidverbindung als Bitterstoff-Antagonist zurückzuführen.

Diese blockieren, wie von Brockhoff et al. (2011) beschrieben, die Bindungsstelle bestimmter

Bitterrezeptoren und beeinflussen somit den Transduktionsprozess. Um diese Aussagen zu

verifizieren, sind neben der Sequenzierung der Fraktionen weitere, umfangreiche

Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion der identifizierten Strukturen mit den

Bindungsstellen verschiedener Rezeptortypen notwendig. Die Hypothese kann diesbezüglich

unter Vorbehalt verifiziert werden.

Diskussion

237

Hypothese 6: Die Peptidfraktionen lassen sich mit der erarbeiteten Methode in

produktionstauglichem Maßstab herstellen.

Status: falsifiziert

Im Rahmen dieser Studie wurde, aufgrund des bereits unter Hypothese 1 dargestellten

Einfluss von Fouling auf die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen, auf eine Feed-

Konzentration von 0,15 % zurückgegriffen.

Die Widerfindungsrate bei der Fraktionierung der als „bitter“-Blocker wirksamen Algen-

Fraktionen (Chlorella vulgaris) lag bei 77,11 ± 1,58 %. Hiervon entfallen 63,14 ± 2,42 % auf

die jeweiligen Permeatfraktionen. Zur Herstellung von ca. 0,1 %igen Lösungen der

Permeatfraktion waren bei der verwendeten Anlagenkonzeption 45,29 ± 2,30 min notwendig.

Nachfolgend sind weitere Aufarbeitungsschritte, beispielsweise eine Aufkonzentration des

durch Diafiltration verdünnten Permeats, notwendig. Eine Umsetzung der Methodik unter

Verwendung höherer Feed-Konzentrationen erscheint aufgrund der erreichten Güte der

Fraktionierung unwahrscheinlich. Die Hypothese muss diesbezüglich unter dem jetzigen

Kenntnisstand falsifiziert werden.

5.5.2 Methodische Aspekte

Im nachfolgenden Abschnitt werden methodische Aspekte, die potentiell einen wesentlichen

Einfluss auf die Ergebnisse haben könnten, bewertet.

5.5.2.1 Rohstoffe


Für die Etablierung des Crossflow-Filtrations-Prozesses wurden aufgrund der

standardisierten, von produzierenden Unternehmen analytisch kontrollierten

Zusammensetzung, der kommerziellen Erhältlichkeit, sowie dem breiten Angebot und der

preiswerten Anschaffung hydrolysierte Molkenprotein-Isolate verwendet. Im Rahmen der

Vorarbeiten für diese Studie wurden verschiedene hydrolysierte Molkenprotein-Isolate auf ihre

Eignung überprüft. Die Auswahl erfolgte bedingt durch den im Vergleich zu

Konkurrenzprodukten geringen „bitter“-Geschmack, sowie das gute Lösungsverhalten des

Rohstoffs in wässrigen Medien. „Thermax 690“ (Lot. 02923210) (Glanbia Nutritionals Ltd., IRL)

verfügt über einen hohen Protein-Anteil (> 90 %) bei gleichzeitig niedrigem Gehalt an Fett (<

1 %) und weiteren niedermolekularen Bestandteilen (Tabelle 2, Seite 49). Die

Amionsäurenzusammensetzung (Tabelle 3, Seite 50), sowie der Anteil an Mineralstoffen ist

zudem bekannt (Glanbia Nutritionals Ltd. 2012).

Die Wahl von „Thermax 690“ (Lot. 02923210) (Glanbia Nutritionals Ltd., IRL) kann im Hinblick

auf die Eignung des Rohstoffs, sowie die umfangreiche Kenntnis der Zusammensetzung als

Diskussion

238

zufriedenstellend betrachtet werden. Der hohe Anteil an Protein bei gleichzeitig niedrigem

Anteil weiterer Komponenten vereinfacht die Herleitung der während des

Fraktionierungsprozess auftretenden Effekte, da diese mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit auf

die variierten physikalisch-chemischen Eigenschaften des Feeds (pH-Wert, Ionenstärke),

sowie die Prozesshydrodynamik zurückgeführt werden können. Der Einfluss des „Nicht-

Protein-Anteils“ des Rohstoffs, insbesondere des Gehalts an Salzen, auf die Sensorik der

Retentat- & Permeatfraktionen, kann im Rahmen dieser Studie nicht vollständig

ausgeschlossen werden, erscheint im Hinblick auf die in der Spezifikation festgehaltenen

geringen Mengen jedoch als zu vernachlässigen.


Neben Molkenprotein-Isolat wurde in dieser Studie das Hydrolysat der Alge Chlorella vulgaris

fraktioniert und die gewonnenen Fraktionen sensorisch bewertet. Der Bezug

versuchsdienlicher Mengen an Alge bzw. Algenprotein stellte sich zum Studienzeitpunkt als

aufwendig heraus. Unter Berücksichtigung der Rohstoffzusammensetzung wurde „Chlorella

vulgaris Powder“ (Lot. 201410215) (Allma, Lissabon, PRT) für die beschriebenen Versuche

verwendet.

„Chlorella vulgaris Powder“ (Allma, Lissabon, PRT) verfügt über eine ähnliche

Zusammensetzung wie Konkurrenzprodukte (z.B. „Protein Rich Whole Algae“ (AlgaVia®, San

Francisco, USA)) und eignete sich grundlegend für die Versuchszwecke. Der vergleichsweise

hohe Gehalt an Kohlenhydraten und Ballaststoffen (Tabelle 4, Seite 50) erschwerten allerdings

die präzise Zuweisung der beobachteten Effekte, sowie der sensorischen Profile der

Fraktionen, da deren Einfluss auf den Fraktionierungsprozess, bzw. die

Geschmacksausprägungen der Fraktionen, nicht vollständig ausgeschlossen werden konnten.

Nichtsdestotrotz ließen sich die im Rahmen dieser Studie dokumentierten Beobachtungen

unter Berufung auf aktuelle Primärliteratur einordnen und diskutieren.

5.5.2.2 Crossflow-Diafiltration

Membran- & Anlagen-Charakterisierung:

Die im Rahmen dieser Studie durchgeführte Membrancharakterisierung lieferte jeweils in

Dreifachwiederholung reproduzierbare Ergebnisse mit sehr geringen Standardabweichungen

und erwies sich im Rahmen dieser Studie als geeignet. Alternativ zu der aufgrund der

einfacheren Durchführung angewandten Charakterisierung der Membran über den kritischen

Druck pCP besteht die Möglichkeit der Membrancharakterisierung mit dem von Field et al.

(1995) und Howell (1995) beschriebenen Verfahren der Charakterisierung des

Filtrationsvorgangs anhand des kritischen Flux JCF.

Diskussion

239

Einfluss von pH-Wert & Ionenstärke:

Der Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke auf den Filtrationsprozess wurde anhand von je 5

pH-Stufen (Molkenprotein-Isolat: 4, 6, 7, 8, 9; Alge (Chlorella vulgaris): 3, 6, 7, 8, 11), sowie

einer NaCl-Konzentration (150 mM) überprüft. Die Auswahl der Parameter basierte auf

Literaturrecherchen unter Berücksichtigung des Einflusses der physikalisch-chemischen

Eigenschaften des Feeds auf die Struktur und Eigenschaften der im Feed enthaltenen

Moleküle. Die Auswahl der pH-Stufen und Ionenstärke erwies sich als geeignet um den

Einfluss der Faktoren auf den Fraktionierungsprozess abzubilden. Im Falle der Fraktionierung

von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat konnten die im Rahmen dieser Studie beobachteten

Erkenntnisse mit den anhand von intakten Proteinen oder Modellsystemen ermittelten

Ergebnissen aktueller Primärliteratur abgeglichen werden. Im Falle der Fraktionierung von

hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris) wurden die beobachteten Effekte unter Zuhilfenahme

verwandter Proteinquellen, sowie grundlegender Erkenntnisse zu Mikroalgen hergeleitet.

Zur Optimierung des Prozesses im Hinblick auf Permeatflux, Transmission und Ausbeute sind

kleinstufigere pH-Studien, sowie eine breiter aufgestellte Versuchsreihe zum Einfluss der

Ionenstärke denkbar.

Einfluss der Ultraschall-Anwendung:

Der Einfluss der Ultraschall-Anwendung auf die Fraktionierung von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat wurde anhand eines Modellversuchs in kleinem Maßstab (Methodik:

Kapitel 3.2.2.2, Seite 56) untersucht. Die ermittelten Ergebnisse stehen im Wiederspruch zu

den Erkenntnissen vieler Autoren, darunter Muthukumaran, Kentish, Ashokkumar, et al.

(2005), Lamminen et al. (2004) und Matsumoto et al. (1996). Diese arbeiteten jedoch mit

intakten Proteinen, weniger komplexen Feeds oder verwendeten Modellsysteme. Die

Fraktionierung hydrolysierter Proteinquellen unter Einsatz von Ultraschall ist in der

Primärliteratur bis dato nicht dokumentiert. Die in der vorliegenden Studie ermittelten

Ergebnisse besitzen, aufgrund des geringen Umfangs der Untersuchungen, Hinweischarakter.

Um die Aussagekraft zu erhöhen, sind weitere Versuchsreihen notwendig, bei denen neben

dem Einfluss des Ultraschalls auch Faktoren wie die US-Frequenz, die Leistungsstärke der

US-Einheit, weitere Feed- und Membran-Eigenschaften, sowie die Prozesshydrodynamik

näher betrachtet werden müssen. Nichtsdestotrotz liefern die Ergebnisse wichtige

Erkenntnisse bezüglich des Einflusses des Ultraschalls auf die Fraktionierung von

Proteinhydrolysaten.

Eignung von Membranen aus regenerierter Cellulose:

Die Foulingneigung einer Membran wird neben den Trenneigenschaften auch durch deren

Morphologie und hydrophobe/hydrophile Eigenschaften beeinflusst (Melin & Rautenbach,

Diskussion

240

2007). Regenerierte Cellulose ist neben Cellulose Acetat das hydrophilste Membranmaterial

(Walter et al., 2012). Neben den im Rahmen dieser Studie verwendeten PS- bzw. PES-

Membranen, wurde anhand eines Modellversuchs in kleinem Maßstab (Methodik: Kapitel

3.2.2.3, Seite 58) eine RC-Membran auf ihre Eignung zur Filtration von hydrolysiertem

Molkenprotein-Isolat überprüft. Vergleichbar der Versuchsreihe zum Einfluss von Ultraschall

besitzen die Ergebnisse, aufgrund des geringen Untersuchungsumfangs, Hinweischarakter.

Zur Erhöhung der Aussagekraft sind weitere Versuche unter Variation der physikalisch-

chemischen Eigenschaften des Feeds, der Prozesshydrodynamik, sowie der Verwendung

verschiedener Membranen notwendig.

Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed:

Um zu überprüfen, ob kleine Moleküle (< 2 kDa) aus dem Feed durch Dialyse abgetrennt

werden können, wurde der Einfluss von pH-Wert und Dialysedauer auf die

Molekülgrößenverteilung der Retentatfraktion überprüft. Die pH-Versuche fanden unter

Verwendung eines „Initial-pHs“ statt. Unter Initial-pH wird der pH-Wert der Dialyseprobe

verstanden, der zu Beginn des Dialyseprozess, sowie bei Wechsel der Dialyselösung

eingestellt wurde. Der pH-Wert der Dialyseprobe ist somit über die Dauer des Prozesses als

nicht konstant zu betrachten, wurde jedoch zu definierten Zeitpunkten (Wechsel der

Dialyselösung) neu justiert. Die in Abhängigkeit des pH-Werts ermittelten Ergebnisse basieren

somit nicht rein auf dem Einfluss des pH-Werts, sondern auch auf der im Laufe des

Dialyseprozess stattfindenden pH-Änderung. Nichtsdestotrotz können die in Abhängigkeit des

pH-Werts ermittelten Ergebnisse auf einen definierten Einflussfaktor zurückgeführt werden. In

Anbetracht des geringen Versuchsumfangs besitzen die Erkenntnisse Hinweischarakter. Um

die Aussagen zu verifizieren, sowie den Prozess zu optimieren, sind weitere Versuchsreihen

unter Verwendung von pH-stabilen Pufferlösungen denkbar.

Einfluss weiterer Faktoren:

Der Einfluss der konstant gehaltenen Filtrationsparameter Strömungsgeschwindigkeit ʋ, Feed-

Konzentration CF, Temperatur des Feeds TCF, sowie die Anzahl der verwendeten Diavolumina

VDia wurde bereits in Kapitel 5.3.6 näher betrachtet. Die Auswahl der Parameter wurde anhand

des aktuellen Kenntnisstands einschlägiger Fachliteratur (unter anderem: Baldasso, Barros, &

Tessaro, 2011; Butylina, Luque, & Nyström, 2006; Choi, Zhang, Dionysiou, Oerther, & Sorial,

2005; Pelegrine & Gasparetto, 2005; Huisman, Prádanos, & Hernández, 2000; Madaeni, Fane,

& Wiley, 1999; She, Tang, Wang, & Zhang, 2009) unter Berücksichtigung der

Anlagenkonzeption und der Eigenschaften der verwendeten Rohstoffe getroffen. Die im

Rahmen dieser Studie erarbeitet Erkenntnisse verifizieren und erweitern den literaturseitig

dokumentierten Kenntnisstand.

Diskussion

241

5.5.2.3 Hydrolyse der Alge Chlorella vulgaris

Mikroalgen verfügen über stabile, vorwiegend cellulosebasierte Zellwände, die eine Digestion

der Algenproteine erschweren können (Renneberg & Berkling, 2012; Morris et al., 2008;

Tchorbanov et al., 1986). Um die Proteine/Peptide der Alge Chlorella vulgaris als Feed nutzen

zu können, war die Entwicklung eines Hydrolyseverfahrens notwendig. Für Chlorella vulgaris

erwies sich eine saure Vorbehandlung (HCl, pH 3, 48 h) mit anschließender Hydrolyse durch

Pronase (0,25 %, 112,5 PU, 45 min) als geeignet.

Das erarbeitete Hydrolyseverfahren lieferten wiederholbare Ergebnisse hinsichtlich

Hydrolysegraden, Standardabweichungen und Molekülgrößenverteilungen, die mit aktueller

Primärliteratur wie beispielsweise Morris et al. (2008) vergleichbar sind. Um den

Vorbehandlungs- und Hydrolyseprozess zu optimieren, ist die Überprüfung weiterer

leistungsfähiger Enzyme, wie beispielsweise Alcalase oder Subtilisin, denkbar.

5.5.2.4 Instrumentelle Analytik & Probenaufbereitung

Spektralphotometrische Proteingehaltbestimmung:

Die Proteingehalte von Feed, Retentat und Permeat wurden spektralphotometrisch bei einer

Wellenlänge von 280 nm ermittelt. Die zur Bestimmung der Proteingehalte verwendete

spektralphotometrische Methode verfügt über eine solide Kalibrierfunktionen, deren Eignung

durch Bestimmtheitsmaße R2 zwischen 0,997 (Alge (Chlorella vulgaris)) und 0,999

(Molkenprotein-Isolat), bei gleichzeitig sehr geringen Standardabweichungen, belegt werden.

Bei der quantitativen Bestimmung der Proteingehalte einer Probe ist die Analyse bei 280 nm

am weitesten verbreitet (Simonian, 2002). Im Bereich der Wellenlänge 280 nm sind

schwerpunktmäßig die Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin, sowie Disulfid-Brücken für die

Extinktion verantwortlich (Aitken & Learmonth, 2009; Simonian, 2002). Eine Alternative hierzu

stellt die Bestimmung des Proteingehalts im Fern-UV-Bereich, z.B. bei 205 nm dar (Aitken &

Learmonth, 2009; Ahmed, 2004). Für die Extinktion sind bei dieser Wellenlänge

schwerpunktmäßig (in absteigender Reihenfolge) die Aminosäuren Tryptophan, Phenylalanin,

Tyrosin, Histidin, Cystein, Methionin und Arginin verantwortlich (Aitken & Learmonth, 2009).

Die Messung bei 205 nm gilt als sehr sensibel und ist insbesondere für Proben mit niedrigen

Proteingehalten geeignet, wird jedoch durch in der Probe enthaltene Reagenzien (z.B.

Puffersubstanzen) beeinträchtigt (Ahmed, 2004; Simonian, 2002). Whitaker & Granum (1980)

etablierten eine Methode, bei welcher die Bestimmung des Proteingehalts einer Probe ohne

Referenzproteine oder die Erstellung einer Standardkurve vorgenommen werden kann. Hierzu

wird die Extinktion der Probe bei 280 nm und 235 nm gemessen und der Proteingehalt

rechnerisch ermittelt. Vorteil der Methode ist unter anderem der Ausschluss von durch

Nukleinsäuren ausgelöste Interferenzen, sowie der Ausschluss des Einfluss verschiedener

Aminosäurenzusammensetzungen auf die Genauigkeit des Messergebnis (Whitaker &

Diskussion

242

Granum, 1980). Für nachfolgenden Versuche ist eine Verifizierung der Messergebnisses

durch Verwendung einer der vorab beschriebenen Methoden denkbar.

Bestimmung des Hydrolysegrads der Proteinhydrolysate:

Zur Schnell-Bestimmung des Hydrolysegrads wurde die von Nielsen et al. (2001)

beschriebene OPA-Methode verwendet. Die OPA-Methode gilt als einfach, genau, wenig

fehleranfällig und liefert vergleichbare Ergebnisse zu anderen Bestimmungsmethoden

(Nielsen et al., 2001). Bei Cystein-reichen Proteinen wird der durch die OPA-Methode

ermittelte Hydrolysegrad im Vergleich zur TNBS- und pH-stat-Methode geringfügig

unterschätzt (Spellman et al., 2003). Spellman et al. (2003) führen dies auf die instabile

Bindung von Cystein und OPA zurück. Im Rahmen dieser Studie ist ein Einfluss des Cystein-

Gehalts auf den per OPA-Methode ermitteln Hydrolysegrad, in Anbetracht des

Aminosäurenprofils des Rohstoffs Molkenprotein-Isolat, bzw. der bekannten

Aminosäurenzusammensetzung der Alge Chlorella vulgaris, als gering zu bewerten.

Analytik der Peptidfraktionen mittels SE-HPLC:

Die SE-HPLC gilt als leistungsfähiges Verfahren zur Größencharakterisierung einer

Probensubstanz (Hong, Koza, & Bouvier, 2012). Die Auftrennung einer Probe erfolgt dabei, im

Idealfall, lediglich anhand des hydrodynamischen Radius der Moleküle (Tieke, 2014; Yau &

Kirkland, 1981). In der Praxis lassen sich Wechselwirkungen zwischen Probe und stationärer

Phase jedoch nicht vollkommen ausschließen. Um dadurch entstehende nachteilige Effekte

auf die Vorhersage zu minimieren, ist diese beispielsweise durch experimentelle Anpassung

von Ionenstärke und pH-Wert des Puffers zu reduzieren. In Kapitel 4.1.1 (Seite 79) ist die im

Rahmen dieser Studie durchgeführte SE-HPLC-Methodenerstellung dargestellt. Die Eignung

und Zuverlässigkeit der SE-HPLC-Methode wurde durch sehr geringe Standardabweichungen

der Retentionszeiten tR (SD: 0,51 - 1,74 %) bei gleichzeitig höchst linearem Verlauf der

Kalibriergeraden (R2 = 0,996) im Zehnfachversuch belegt. Die geringfügigen,

anlagespezifischen Performance-Unterschiede (Auftrennung des Myoglobin-Peaks) zwischen

den beiden Test-Systemen sind auf die gerätespezifisch unterschiedliche Bauform

zurückzuführen.

5.5.2.5 Sensorik

Schulung des Sensorik-Panels:

Die im Rahmen dieser Studie durchgeführte sensorische Schulung der Prüfpersonen basierte

auf der DIN EN ISO 8586:2014. Zusätzlich zu den in der vorab erwähnten Norm beschriebenen

und im Kapitel 3.5.1 (Seite 68) dargestellten Prüfungen wurde das Schulungskonzept um die

Prüfung „Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle“ gemäß ISO 3972:2011 erweitert, um

die Leistung der Prüfpersonen, sowie des Panels besser charakterisieren zu können. Die

Diskussion

243

Skalen-Schulung wurde in Anlehnung an das Kapitel „Ausbildung eines deskriptiven Panels -

Schulungsphase: Training von Intensitätsmessungen“ von Rummel (2002) durchgeführt.

Geschult wurden 24 Teilnehmer (8 männlich, 16 weiblich) im Alter von 19 – 29 (MW: 22,75 ±

2,44) Jahren. Die Teilnehmer wurden in zwei Gruppe à 12 Teilnehmern aufgeteilt. Die

Schulung der Gruppen erfolgte an aufeinanderfolgenden Tagen.

Das gewählte Schulungsprocedere eignete sich, gemessen an den Ergebnissen der Schulung,

für den vorgesehenen Schulungszweck. Bei der „Prüfung der Wahrnehmung eines Reizes“

konnte der Anteil korrekter Zuordnungen insbesondere bei „sauer“ und „umami“ deutlich

verbessert werden. Die Grundgeschmacksarten „salzig“ und „süß“ wurden bereits zu Beginn

des Schulungsprozesses von einem Großteil der Panelteilnehmer korrekt bestimmt. Die im

Anschluss durchgeführte Prüfung „Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle“ (gemäß ISO

3972:2011) offenbarte prüferspezifische Unterschiede hinsichtlich der Reiz- und

Erkennungsschwelle, insbesondere für „salzig“, „umami“ und „süß“, welche die Notwendigkeit

einer gezielten Prüferauswahl verdeutlichten. Die Diskriminierungsfähigkeit des Panels

konnte, beurteilt anhand der „Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes“,

jedoch mit Ausnahme niedriger Konzentrationen von „bitter“ und „süß“ gewährleistet werden.

Gemessen an den Ergebnissen der Skalenschulung (Mittelwert, Modus, Median; Tabelle 55,

Seite 169) konnten den Prüfpersonen der Zusammenhang zwischen Geschmackseindruck

und korrespondierendem Skalenwert verdeutlich werden.

Prüferauswahl:

Aufgrund des ordinalen Skalenniveaus und der Verletzung der Annahme der Normalverteilung

der Daten wurden verteilungsunabhängige, nichtparametrische Testverfahren zur Auswertung

herangezogen. Die Prüferauswahl erfolgte mehrstufig in Anlehnung an die Vorgaben der DIN

EN ISO 8586:2014. Der zur Überprüfung der Diskriminierungsfähigkeit der Prüfpersonen

zwischen Proben mit den Intensitätsstufen „niedrig“, „mittel“, „hoch“ durchgeführte Friedman-

Test gilt als nicht-parametrische Alternative der ANOVA bei der Analyse verbundener

Stichproben (Kühlmeyer, 2001). Der zur Bestimmung der Panelhomogenität verwendete

Kruskal-Wallis H Test stellt eine nicht-parametrische Alternative der ANOVA bei der Analyse

unverbundener Stichproben dar (MacFarland & Yates, 2016; Corder & Foreman, 2009). Da

der Kruskal-Wallis H Test eine Aussage hinsichtlich der gesamten Stichprobe (hier: Panel)

trifft, wurde in Anlehnung an Corder & Foreman (2009) im Bedarfsfall eine paarweise

Überprüfung der Bewertungsunterschiede zwischen Prüfteilnehmern durchgeführt, um deren

Eignung für das jeweilige Panel zu bestimmen. Die Teststärke nicht-parametrischer Tests gilt

generell als geringer als die des zugehörigen parametrischen Tests (Cunningham & Aldrich,

2013). Gemäß Kraemer & Thiemann (1987) sind die geringen Verlust der Teststärke in

Anbetracht des Erhalts der Validität der Daten jedoch vernachlässigbar. Unter

Diskussion

244

Berücksichtigung der Datenlage sind nicht-parametrische Test parametrischen Verfahren

vorzuziehen, wenn die Anforderung der Normalverteilung verletzt wird (Ryan, 2013; Cohen &

Holliday, 1996). Die Auswertung der Daten mit nicht-parametrischen Test gestaltet sich

komplexer und aufwändiger als eine vergleichbare Analyse unter Verwendung parametrischer

Verfahren. Die Anforderungen der DIN EN ISO 8586:2014 hinsichtlich der Auswertung

sensorischer Daten, sowie der Zusammenstellung eines Panels konnten jedoch eingehalten

werden.

Die Homogenität der Panel-Aussage hinsichtlich der Intensitäts-Bewertung der

Geschmacksausprägungen „niedrig“, „mittel“ und „hoch“ der fünf Grundgeschmacksarten ist

insbesondere für „süß“, „sauer“ und „salzig“ gegeben. Lediglich im Falle von „umami“ wurde

eine deutlich geringere Aussage-Homogenität festgestellt. Dies ist vermutlich auf eine von den

Normvorgaben abweichende Prüferanzahl je Panel zurückzuführen. Die in der DIN EN ISO

8586:2014 geforderte Prüferanzahl von mindestens 10 Prüfern pro Panel konnte im Rahmen

dieser Studie, insbesondere Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit der Panelisten nicht

gewährleistet werden. Für nachfolgende Studien unter vergleichbaren Umständen empfiehlt

sich eine frühzeitige Rekrutierung und Schulung eines größeren Prüferpools, z.B. durch

Rekrutierung von Studierenden des 1. und 2. Semesters zu Beginn einer Studie. Diese

könnten über einen längeren Zeitraum intensiver geschult werden, wodurch potentiell die

Sicherheit der Prüfaussage, sowie die Homogenität des Prüfergebnisses verbessert werden

könnten. Schwierig dabei ist jedoch vermutlich der Erhalt der Motivation der Panelteilnehmer

über eine längere Zeitspanne.

Sensorik der Peptidfraktionen:

Im Rahmen dieser Studie wurden je Proteinquelle (Molkenprotein-Isolat, Alge „Chlorella

vulgaris“) Retentat- und Permeatfraktion der fraktionierten Proteinhydrolysate sensorisch

hinsichtlich der Geschmacksausprägungen „süß“, „sauer“, „salzig“, „bitter“ und „umami“

untersucht. Zusätzlich wurde ein Bitterstandard, sowie ein Gemisch aus Bitterstandard und

Permeat verkostet, um zu überprüfen, ob die Permeatfraktion in der Lage ist, die

Bitterwahrnehmung zu reduzieren. Retentat- und Permeatfraktion wurden in einer

Konzentration von 1g/l gereicht. Der Bitterstandard entsprach der Konzentrationsstufe D2

(0,22 g/l Koffein) der Prüfung „Ermittlung der Reiz- und Erkennungsschwelle“ und somit einer

hohen Geschmacksintensität. Das Gemisch aus Bitterstandard und Permeat bestand aus 1 g/l

fraktioniertem Proteinhydrolysat und 0,22 g/l Koffein. Die Wahl der Konzentration basiert auf

einer rechnerischen ermittelten, maximalen Probenkonzentration unter Berücksichtigung der

verfügbaren Probenmengen. In Anbetracht der zumeist mit niedrigen Skalennoten bewerteten

Geschmacksausprägungen wäre eine sensorische Beurteilung höher konzentrierter Proben

der verkosteten Fraktionen interessant. Hierdurch könnten die im Rahmen dieser Studie

Diskussion

245

erlangten Ergebnisse verifiziert werden, da die Aussagegenauigkeit der Prüfteilnehmer mit

steigender Intensität der Geschmacksausprägung an Sicherheit gewinnt. Diese Annahme

setzt voraus, dass eine höhere Konzentration an hydrolysiertem, fraktioniertem Protein über

eine höhere Geschmacksintensität verfügt. Aufgrund des aufwendigen und zeitintensiven

Gewinnungsprozesses war dies im Zuge dieser Studie nicht möglich. Die Untersuchung der

Permeatfraktion auf „bitter“-blockende Eigenschaften basierte auf Literaturerkenntnissen

(unter anderem dargestellt in Kapitel 2.5.3.2, Seite 44) die insbesondere niedermolekulare

Substanzen mit einer „bitter“-blockenden Eigenschaft in Verbindung bringen.

5.5.3 Ausblick

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefern Ansatzpunkte für weitere Forschungsarbeiten

zur Optimierung des Fraktionierungsprozesses von Proteinhydrolysaten.

Nachfolgende Studien sollten die Eignung eines vorfiltrierten, dialysierten Feeds für den

Crossflow-Fraktionierungsprozess näher betrachten. In der vorliegenden Studie konnte

anhand der Dialyse verschieden konzentrierter Feeds hydrolysierten Molkenprotein-Isolats

gezeigt werden, dass sich der Anteil an Strukturen ≤ 1,35 kDa durch eine 24 h Dialyse bis zu

einer Feed-Konzentration von 4 % (w/v) reduzieren lässt. Unter der Annahme, dass

insbesondere kleine Moleküle für die Ausbildung von Fouling und die damit in Verbindung

stehende Reduktion des MWCO verantwortlich sind, besteht die Möglichkeit einer Optimierung

des Fraktionierungsprozesses, insbesondere im Hinblick auf die Molekülgrößenverteilung der

gewonnenen Fraktionen.

Der Einsatz von Ultraschall (35 kHz) zur Verminderung des Foulingeinflusses und Steigerung

des Permeatflux erwies sich im Rahmen dieser Studie als nicht zielführend. Unter

Berücksichtigung der zuvor beschriebenen Verwendung vorfiltrierter, dialysierter Feeds bedarf

diese Beobachtung allerdings einer erneuten Bewertung. Selbiges gilt für den Einsatz

alternativer Membranmaterialien, wie beispielsweise die im Rahmen dieser Studie untersuchte

Membran aus regenerierter Cellulose.

Um die im Zuge dieser Untersuchung festgestellten Geschmackseigenschaften der

Fraktionen, sowie den „bitter“-blockenden Effekt der Permeatfraktion hydrolysierter Alge

Chlorella vulgaris bestimmten Molekülen zuzuordnen ist eine Sequenzierung der Fraktionen,

sowie eine umfangreiche Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion der identifizierten

Strukturen mit den Bindungsstellen verschiedener Rezeptortypen notwendig. Weitere

sensorische Studien zur Verifizierung des beschriebenen Effekts unter Verwendung eines

Expertenpanels werden empfohlen.

Zusammenfassung

246

6. Zusammenfassung

Bestimmte Peptidverbindungen, wie beispielweise das Dipeptid Aspartam („süß“), verfügen

über Geschmacksqualitäten welche sie für einen Einsatz in Lebensmitteln qualifizieren. Neben

„süß“ und „bitter“ schmeckenden Verbindungen wurden bereits Stoffe identifiziert, die einen

„umami“ und „sauer“ Eindruck auslosen. Neben der chemischen Synthese konnen

Peptidverbindungen durch eine Hydrolyse intakter Proteine gewonnen werden. Durch

chromatographische Verfahren wie beispielsweise die Gel-Permeation Chromatography

können aus hydrolysierten Feeds einzelne Peptidverbindungen isoliert werden. Im Hinblick auf

eine großtechnische Gewinnung geschmacksaktiver Peptide stellen Membrantrennverfahren

eine vielversprechende, skalierbare Alternative dar.

Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde deshalb ein Crossflow-Membrantrennverfahren zur

Fraktionierung von hydrolysierten Protein-Feeds unter Verwendung von hydrophilierten

Polysulfon-Membranen (MWCO: 100 kDa) entwickelt. Als Proteinquellen dienten

hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat, sowie die Alge Chlorella vulgaris, für deren Hydrolyse ein

eigenes Verfahren erarbeitet wurde. Zur Optimierung des Fraktionierungsprozesses wurde der

Einfluss von pH-Wert und Ionenstärke (Anpassung durch Zugabe von 150 mM NaCl) auf

Permeatflux, Wiederfindungsrate, Transmission und die molekulare Zusammensetzung der

Fraktionen beider Proteinquellen ermittelt. Die Molekülgrößenverteilung der Fraktionen wurde

mittels SE-HPLC analysiert. Ausgewählte Retentat- und Permeatfraktionen wurden durch ein

im Rahmen der Studie geschultes Sensorik-Panel im Hinblick auf das Vorhandensein der fünf

Grundgeschmacksausprägungen „süß“, „salzig“, „sauer“, „bitter“ und „umami“ untersucht.

Darüber hinaus wurde geprüft, ob die Permeatfraktionen über eine den „bitter“-Geschmack

blockende Eigenschaft verfügen. In kleinem Maßstab wurde für hydrolysiertes Molkenprotein-

Isolat untersucht ob sich der Fraktionierungsprozess hinsichtlich Permeatflux und molekularer

Zusammensetzung der Fraktionen durch den Einsatz von Ultraschall (35 kHz) und alternativer

Membranmaterialien (regenerierte Cellulose) verbessern lässt. Zudem wurde die Eignung

einer Dialyse zur Abtrennung kleiner Moleküle (< 2 kDa) aus dem vorfiltrierten Feed unter

Variation von Initial-pH-Wert, Feed-Konzentration und Dialysedauer (24 h, 48 h) für

hydrolysiertes Molkenprotein-Isolat bewertet.

Aufgrund von während der Pilot-Versuche identifizierten, massiven Verschiebungen der

Trenngrenze der Membran (50 kDa) hin zu einem deutlich kleineren MWCO (< 17 kDa) bei

einer Feed-Konzentration von 3 % (w/v) (bezogen auf den Proteingehalt) und 1,5 % (w/v)

(bezogen auf den Proteingehalt), wurde die Feed-Konzentration auf 0,15 % (w/v) (bezogen

auf den Proteingehalt) gesenkt.

Der Einfluss des pH-Werts auf Permeatflux, Wiederfindungsrate und molekulare

Zusammensetzung der Fraktionen wurde je Proteinquelle (Molkenprotein-Isolat, Alge

Zusammenfassung

247

Chlorella vulgaris) anhand von fünf pH-Stufen untersucht (Molkenprotein-Isolat: pH 4, pH 6,

pH 7, pH 8, pH 9; Alge Chlorella vulgaris: pH 3, pH 6, pH 7, pH 8, pH 11).

Bei der Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat beeinflusste der pH-Wert

Permeatflux, Transmission und Wiederfindungsrate nicht signifikant. Die chromatographisch

ermittelte Molekülgrößenverteilung der Fraktionen offenbarte einen weitestgehend pH-

unabhängigen Rückhalt von Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat bei gleichzeitig hohem Rückhalt

von Strukturen ≤ 1,35 kDa. Im Permeat wurden mit Ausnahme von pH 9 lediglich geringe

Anteile an Strukturen ≥ 20 kDa festgestellt. Strukturen im Bereich ≤ 1,35 kDa dominierten die

Fraktion.

Eine Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von 150 mM NaCl führte zu einer signifikanten

Erhöhung des Permeatflux im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz für die pH-

Stufen pH 7, pH 8, pH 9. Darüber hinaus wurde unter Zusatz von 150 mM NaCl ein Anstieg

des Permeatflux mit steigendem pH-Wert festgestellt. Im Vergleich zu einer Fraktionierung

ohne NaCl-Zusatz führte die Erhöhung der Ionenstärke jedoch zu einer niedrigeren

Wiederfindungsrate, die sich für die pH-Stufen pH 8, pH 9 signifikant unterschied. Hierbei

wurden geringere Proteingehalte im Retentat bei gleichzeitig nur geringfügig erhöhten

Proteingehalten im Permeat festgestellt. Die chromatographisch ermittelte

Molekülgrößenverteilung zeigte, vergleichbar zu der Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz einen

Rückhalt von Strukturen ≥ 20 kDa im Retentat bei gleichzeitig hohem Rückhalt von Strukturen

≤ 1,35 kDa. Im Permeat wurden jedoch durchweg höhere Anteile an Strukturen ≥ 20 kDa

festgestellt.

Bei der Fraktionierung von hydrolysierter Alge Chlorella vulgaris beeinflusste der pH-Wert den

Permeatflux nur in einem Fall signifikant. Für pH 6 wurden im Vergleich zu pH 3 signifikant

höhere Fluxwerte erzielt. Die Wiederfindungsrate unterschied sich in Abhängigkeit des pH-

Werts nicht signifikant, es wurden jedoch ein signifikant erhöhter Proteingehalt im Retentat bei

gleichzeitig niedrigerem Proteingehalt im Permeat für die pH-Stufe 11, im Vergleich zu pH 3,

pH 6 und pH 7 festgestellt. Der pH-Wert beeinflusste die Molekülgrößenverteilung der

Fraktionen nur geringfügig. Unabhängig von der pH-Stufe wurden in Retentat und Permeat

hauptsächlich Strukturen ≤ 1,35 kDa festgestellt. Dies ist nicht alleinig auf den Einfluss des

pH-Werts während der Fraktionierung, bzw. den Fraktionierungsprozess zurückzuführen.

Bereits nach der Vorfiltration des Feeds konnten in der Nullprobe für die pH-Stufen pH 3, pH

11 chromatographisch keine und für die pH-Stufe pH 8 nur geringe Anteile an Strukturen ≥ 20

kDa ermittelt werden.

Eine Erhöhung der Ionenstärke durch Zugabe von 150 mM NaCl führte zu einem signifikant

niedrigeren Permeatflux im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz für die pH-

Stufen pH 7 und pH 11. Auch für die weiteren pH-Stufen wurde eine Reduktion des

Zusammenfassung

248

Permeatflux festgestellt. Wiederfindungsrate und Transmission wurden durch die Erhöhung

der Ionenstärke im Vergleich zu einer Fraktionierung ohne NaCl-Zusatz lediglich im Falle einer

Prozessführung bei pH 6 signifikant beeinflusst. Die chromatographisch ermittelte

Molekülgrößenverteilung unterschied sich in Abhängigkeit der Ionenstärke nur geringfügig.

Lediglich für pH 3, pH 6 und, in geringem Umfang, pH 8 wurden erhöhte Anteile an Strukturen

≥ 20 kDa im Retentat festgestellt. Die Permeatfraktionen wurden von Strukturen ≤ 1,35 kDa

dominiert.

Für die Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat und hydrolysierter Alge

Chlorella vulgaris wird von einem dominanten Einfluss ladungsbedingter Abstoßungs- und

Adsorptionseffekte ausgegangen, welche den Fraktionierungsprozess durch Ausbildung einer

Foulingstruktur, sowie Interaktionseffekten zwischen Molekül und Membran bzw. Molekül und

Molekül maßgeblich beeinflussen. Die komplexe Zusammensetzung des Feeds erschwert

dabei die Identifikation fouling-induzierender Verbindungen. Im Falle der Fraktionierung

hydrolysierter Alge Chlorella vulgaris ist der Einfluss extrazellulärer polymerer Substanzen

(EPS)/freien Polysacchariden (RPS) auf den Fraktionierungsprozess nicht auszuschließen.

Bei der sensorischen Bewertung der Fraktionen aus hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

wurde im Retentat ein sehr schwacher „süß“-, im Permeat ein schwacher „salzig“-Geschmack

identifiziert. Die „bitter“-Ausprägung des Koffein-Standards (0,22 g/l) wurde durch Zugabe von

1 g/l Permeat nicht signifikant reduziert. Die Retentatfraktion hydrolysierter Alge Chlorella

vulgaris wurden als schwache „salzig“-, sowie sehr schwache „umami“ schmeckend, die

Permeatfraktion als schwach „salzig“-, sowie sehr schwach „sauer“ und „umami“ beschrieben.

Die „bitter“-Ausprägung des Koffein-Standard (0,22 g/l) konnte durch Zugabe von Permeat

(1g/l) signifikant reduziert werden.

Der Wirkmechanismus der „bitter“-Reduktion durch niedermolekulare Peptidverbindungen ist

bis dato nicht abschließend geklärt. Im Rahmen dieser Studie erscheint das von Brockhoff et

al. (2011) beschriebene „Gegenspieler-Prinzip“, sprich die Blockierung der (einzigen)

Bindungsstelle bestimmter Rezeptoren und die damit verbundene Maskierung des

Geschmacksreizes ein schlüssiges Erklärungskonzept zu liefern. Es wird vermutet, dass die

im Rahmen dieser Studie beschriebenen Effekte durch Moleküle < 1,35 kDa ausgelöst werden

oder aus Verbindungen < 1,35 kDa bestehen, die sich zu komplexeren Strukturen

zusammengeschlossen haben, welche in der Lage sind, die Bindungsstelle eines oder

mehrerer Rezeptortypen zu besetzen. Um diese Aussage zu verifizieren, sind weitere

Untersuchungen notwendig.

Aus den zuvor beschriebenen Erkenntnissen dieser Arbeit geht hervor, dass die

Fraktionierung von hydrolysierten Protein-Feeds unter Verwendung eines Crossflow-

Filtrationsverfahrens grundsätzlich möglich ist. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung

Zusammenfassung

249

des Feeds können die optimalen Prozessbedingungen allerdings nur per „trial-and-error“ unter

Zuhilfenahme aktueller Primärliteratur ermittelt werden. Eine Übertragung der Erkenntnisse

auf weitere Proteinquellen ist in Ansätzen möglich, benötigt aber weitere Feinabstimmung zur

Optimierung des Prozesses. Die im Rahmen dieser Studie sensorisch bewerteten Fraktionen

verfügten über unterschiedliche Geschmacksqualitäten, sowie „bitter“-blockende

Eigenschaften (Permeat (< 100 kDa): hydrolysierte Alge Chlorella vulgaris).

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Anhang

294

Anhang

Crossflow-Fraktionierung - Versuchsdaten

Tabelle A1: Versuchsdaten – Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

Probenname CF (%) WH MWCO pH tF (min) tF-korrigiert (min) tFm MW (min) JFm (ml/min) JFm MW (ml/min) VPer (ml) JWvor (ml/min)

WPI, pH 4, WH 1 0,15 1 100 4 47 48,26

48,26

37,61

37,61

1735 81

WPI, pH 4, WH 2 0,15 2 100 4 - - - - -

WPI, pH 4, WH 3 0,15 3 100 4 - - - - -

WPI, pH 6, WH 1 0,15 1 100 6 66 68,32

73,06 ± 16,16

26,57

25,62 ± 5,27

1640 85

WPI, pH 6, WH 2 0,15 2 100 6 88 91,06 19,93 1680 83

WPI, pH 6, WH 3 0,15 3 100 6 57 59,80 30,35 1495 92

WPI, pH 7, WH 1 0,15 1 100 7 58 58,12

74,33 ± 15,16

31,23

25,16 ± 5,48

1694 85

WPI, pH 7, WH 2 0,15 2 100 7 78 88,15 20,59 1680 76

WPI, pH 7, WH 3 0,15 3 100 7 71 76,73 23,65 1690 79

WPI, pH 8, WH 1 0,15 1 100 8 78 86,59

90,81 ± 3,74

20,96

20,01 ± 0,84

1688 77

WPI, pH 8, WH 2 0,15 2 100 8 78 93,72 19,37 1668 72

WPI, pH 8, WH 3 0,15 3 100 8 77 92,13 19,70 1675 72

WPI, pH 9, WH 1 0,15 1 100 9 45 47,22

64,68 ± 16,95

38,44

29,48 ± 8,19

1677 82

WPI, pH 9, WH 2 0,15 2 100 9 58 65,75 27,60 1720 74

WPI, pH 9, WH 3 0,15 3 100 9 64 81,08 22,39 1675 68

WPI, pH 4, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 4 81 82,56

82,56

21,98

21,98

1815 78

WPI, pH 4, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 4 - - - - -

WPI, pH 4, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 4 - - - - -

WPI, pH 6, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 6 48 53,28

61,79 ± 13,85

34,07

30,27 ± 6,01

1605 81

WPI, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 6 65 77,77 23,34 1675 72

WPI, pH 6, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 6 46 54,33 33,41 1490 82

WPI, pH 7, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 7 60 56,70

49,80 ± 5,99

32,01

36,78 ± 4,14

1735 88

WPI, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 7 48 46,57 38,97 1690 88

WPI, pH 7, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 7 42 46,11 39,36 1685 78

WPI, pH 8, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 8 46 48,37

49,12 ± 5,25

37,52

37,23 ± 3,91

1694 81

WPI, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 8 43 44,28 40,99 1730 81

WPI, pH 8, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 8 41 54,70 33,18 1690 64

WPI, pH 9, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 9 34 39,35

37,07 ± 2,41

46,13

49,11 ± 3,23

1685 74

WPI, pH 9, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 9 35 34,54 52,54 1700 86

WPI, pH 9, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 9 38 37,31 48,65 1670 88

Legende: CF, Feed-Konzentration. WH, Wiederholung. MWCO, Molecular Weight Cut-Off. tF, Unkorrigierte Prozesslaufzeit. tF-korrigert, korrigierte Prozesslaufzeit. tFm, mittlere korrigerte Prozesslaufzeit. JFm, mittlerer Permeatflux. VPer, Permeat Volumen. JWvor, Permeatflux von dest. Wasser einer neuen Membran. MW, arithmetischer Mittelwert.

Anhang

295

Tabelle A2: Versuchsdaten – Fraktionierung von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

Probenname CF (%) WH MWCO pH tF (min) tF-korrigiert (min) tFm MW (min) JFm (ml/min) JFm MW (ml/min) VPer (ml) JWvor (ml/min)

Alge, pH 3, WH 1 0,15 1 100 3 65 65,63

66,55 ± 0,81

29,56

29,15 ± 0,35

1820 48

Alge, pH 3, WH 2 0,15 2 100 3 65 66,93 28,99 1900 45

Alge, pH 3, WH 3 0,15 3 100 3 68 67,10 28,91 1940 46

Alge, pH 6, WH 1 0,15 1 100 6 48 45,86

45,29 ± 2,30

42,30

42,91 ± 2,22

1880 49

Alge, pH 6, WH 2 0,15 2 100 6 49 47,25 41,06 1820 50

Alge, pH 6, WH 3 0,15 3 100 6 47 42,76 45,37 1921 50

Alge, pH 7, WH 1 0,15 1 100 7 46 47,79

50,89 ± 3,94

40,59

38,27 ± 2,86

1744 48

Alge, pH 7, WH 2 0,15 2 100 7 48 55,32 35,07 1881 40

Alge, pH 7, WH 3 0,15 3 100 7 45 49,55 39,15 1840 43

Alge, pH 8, WH 1 0,15 1 100 8 44 48,80

49,30 ± 5,26

39,76

39,65 ± 4,19

1640 48

Alge, pH 8, WH 2 0,15 2 100 8 45 44,31 43,78 1880 47

Alge, pH 8, WH 3 0,15 3 100 8 50 54,79 35,41 1760 45

Alge, pH 11, WH 1 0,15 1 100 11 46 64,45

52,38 ± 10,48

30,10

37,94 ± 6,83

1440 43

Alge, pH 11, WH 2 0,15 2 100 11 37 45,61 42,54 1501 47

Alge, pH 11, WH 3 0,15 3 100 11 50 47,09 41,20 1841 50

Alge, pH 3, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 3 65 59,42

69,79 ± 9,20

32,65

28,14 ± 3,96

1920 49

Alge, pH 3, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 3 73 73,00 26,58 1940 44

Alge, pH 3, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 3 77 76,96 25,21 1941 44

Alge, pH 6, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 6 59 55,22

55,10 ± 7,95

35,13

35,71 ± 5,22

1900 48

Alge, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 6 60 62,99 30,80 1920 42

Alge, pH 6, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 6 48 47,09 41,20 1883 46

Alge, pH 7, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 7 57 60,17

62,34 ± 2,34

32,24

31,15 ± 1,16

1740 46

Alge, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 7 64 64,82 29,93 1841 45

Alge, pH 7, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 7 50 62,03 31,27 1681 40

Alge, pH 8, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 8 46 55,14

59,49 ± 9,81

35,18

33,17 ± 5,04

1600 44

Alge, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 8 68 70,72 27,43 1840 44

Alge, pH 8, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 8 49 52,60 36,88 1861 42

Alge, pH 11, WH 1, 0,15 M NaCl 0,15 1 100 11 80 96,48

75,34 ± 18,31

20,11

26,67 ± 5,68

1756 40

Alge, pH 11, WH 2, 0,15 M NaCl 0,15 2 100 11 47 64,92 29,88 1420 45

Alge, pH 11, WH 3, 0,15 M NaCl 0,15 3 100 11 46 64,62 30,02 1381 46

Legende: CF, Feed-Konzentration. WH, Wiederholung. MWCO, Molecular Weight Cut-Off. tF, Unkorrigierte Prozesslaufzeit. tF-korrigert, korrigierte Prozesslaufzeit. tFm, mittlere korrigerte Prozesslaufzeit. JFm, mittlerer Permeatflux. VPer, Permeat Volumen. JWvor, Permeatflux von dest. Wasser einer neuen Membran. MW, arithmetischer Mittelwert.

Anhang

296

Tabelle A3: Versuchsdaten – Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat mit/ohne Ultraschall

Probenname CF (%) WH MWCO pH tF (min)

tVF (min) tVF-korrigiert (min) tFm MW (min) JFm (ml/min) JFm MW (ml/min) VV-Per-korrigiert (ml) JV-W-Initial (ml/min) JV-W-W (ml/min)

WPI – OUS, WH 1 0,30 1 100 7 68 54 54,00

67,02 ± 15,55

7,64

6,38 ± 1,61

412,73 9,0 - WPI – OUS, WH 2 0,30 2 100 7 80 64 66,11 6,04 399,55 - 9,2

WPI – OUS, WH 3 0,30 3 100 7 65 46 46,31 8,85 409,98 - 8,0

WPI – OUS, WH 4 0,30 4 100 7 90 66 66,78 6,11 407,94 - 8,2

WPI – OUS, WH 5 0,30 5 100 7 106 82 83,81 4,82 403,81 - 8,8

WPI – OUS, WH 6 0,30 6 100 7 114 84 85,14 4,78 407,21 - 8,0

WPI – US, WH 1 0,30 1 100 7 50 50 51,04

77,71 ± 27,40

7,85

5,81 ± 2,36

400,55 11,0 -

WPI – US, WH 2 0,30 2 100 7 100 96 96,97 4,17 404,82 - 10,5

WPI – US, WH 3 0,30 3 100 7 47 44 44,00 9,29 408,91 - 10,2

WPI – US, WH 4 0,30 4 100 7 100 100 107,17 3,56 381,54 - 11,5

WPI – US, WH 5 0,30 5 100 7 62 62 64,46 6,10 393,32 - 11,0

WPI – US, WH 6 0,30 6 100 7 91 92 98,32 3,89 382,61 - 11,5

Legende: CF, Feed-Konzentration. WH, Wiederholung. MWCO, Molecular Weight Cut-Off. tF, Unkorrigierte Prozesszeit. tVF, Unkorrigierte Prozesslaufzeit nach Performance-Anpassung. tVF-korrigert, korrigierte Prozesslaufzeit. tFm, mittlere korrigerte Prozesslaufzeit. JFm, mittlerer Permeatflux. VV-Per-korrigiert, korrigiertes Permeat Volumen. JV-W-Initial, Initialflux von dest. Wasser einer Vivaflow-Einheit. JV-V-W, Permeatflux von dest. Wasser vor Start eines Wiederholungsversuchs. MW, arithmetischer Mittelwert.

Tabelle A4: Versuchsdaten – Fraktionierung von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat mit RC-Membran

Probenname CF (%) WH MWCO pH tF (min) tRCF (min) tRCF-korrigiert (min) tFm MW (min) JFm (ml/min) JFm MW (ml/min) VV-Per-korrigiert (ml) JV-W-Initial (ml/min) JV-W-W (ml/min)

WPI, pH 9, WH 1 0,15 1 100 9 40 40 40,42

48,85 ± 10,07

9,90

8,46 ± 1,60

400,18 12,0 - WPI, pH 9, WH 2 0,15 2 100 9 62 46 46,14 8,74 403,19 - 9,3

WPI, pH 9, WH 3 0,15 3 100 9 64 60 60,00 6,74 404,41 - 11,3 Legende: CF, Feed-Konzentration. WH, Wiederholung. MWCO, Molecular Weight Cut-Off. tF, Unkorrigierte Prozesszeit. tVF, Unkorrigierte Prozesslaufzeit nach Performance-

Anpassung. tVF-korrigert, korrigierte Prozesslaufzeit. tFm, mittlere korrigerte Prozesslaufzeit. JFm, mittlerer Permeatflux. VV-Per-korrigiert, korrigiertes Permeat Volumen. JV-W-Initial, Initialflux von dest. Wasser einer Vivaflow-Einheit. JV-V-W, Permeatflux von dest. Wasser vor Start eines Wiederholungsversuchs. MW, arithmetischer Mittelwert.

Anhang

297

Tabelle A5: Versuchsdaten – Proteingehalt der hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat-Fraktionen

Probenname yEx-Ret yEx-Per CS-Ret (g/l) CS-Per (g/l) VRet (ml) VPer (ml) mRet (g) mRet MW (g) mPer (g) mPer MW (g)

WPI, pH 4, WH 1 0,381 0,172 0,505 0,228 690 1735 0,348

0,348

0,395

0,395 WPI, pH 4, WH 2 - - - - - - - -

WPI, pH 4, WH 3 - - - - - - - -

WPI, pH 6, WH 1 0,487 0,198 0,645 0,262 485 1640 0,313

0,300 ± 0,056

0,430

0,373 ± 0,050 WPI, pH 6, WH 2 0,554 0,157 0,734 0,208 475 1680 0,348 0,349

WPI, pH 6, WH 3 0,473 0,171 0,626 0,226 380 1495 0,238 0,339

WPI, pH 7, WH 1 0,294 0,185 0,389 0,245 485 1694 0,189

0,209 ± 0,060

0,415

0,367 ± 0,047 WPI, pH 7, WH 2 0,395 0,144 0,523 0,191 530 1680 0,277 0,320

WPI, pH 7, WH 3 0,272 0,164 0,360 0,217 450 1690 0,162 0,367

WPI, pH 8, WH 1 0,575 0,157 0,761 0,208 540 1688 0,411

0,354 ± 0,067

0,351

0,358 ± 0,026 WPI, pH 8, WH 2 0,47 0,152 0,622 0,201 595 1668 0,370 0,336

WPI, pH 8, WH 3 0,455 0,174 0,602 0,230 465 1675 0,280 0,386

WPI, pH 9, WH 1 0,397 0,168 0,526 0,222 530 1677 0,279

0,286 ± 0,012

0,373

0,398 ± 0,024 WPI, pH 9, WH 2 0,393 0,175 0,520 0,232 536 1720 0,279 0,399

WPI, pH 9, WH 3 0,354 0,19 0,469 0,252 638 1675 0,299 0,421

WPI, pH 4, WH 1, 0,15 M NaCl 0,471 0,192 0,624 0,254 435 1815 0,271

0,271

0,461

0,461 WPI, pH 4, WH 2, 0,15 M NaCl - - - - - - - -

WPI, pH 4, WH 3, 0,15 M NaCl - - - - - - - -

WPI, pH 6, WH 1, 0,15 M NaCl 0,436 0,169 0,577 0,224 425 1605 0,245

0,209 ± 0,032

0,359

0,355 ± 0,013 WPI, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl 0,392 0,153 0,519 0,203 374 1675 0,194 0,339

WPI, pH 6, WH 3, 0,15 M NaCl 0,388 0,185 0,514 0,245 365 1490 0,188 0,365

WPI, pH 7, WH 1, 0,15 M NaCl 0,181 0,204 0,240 0,270 472 1735 0,113

0,136 ± 0,037

0,469

0,426 ± 0,039 WPI, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl 0,258 0,175 0,342 0,232 522 1690 0,178 0,392

WPI, pH 7, WH 3, 0,15 M NaCl 0,201 0,187 0,266 0,248 435 1685 0,116 0,417

WPI, pH 8, WH 1, 0,15 M NaCl 0,246 0,197 0,326 0,261 527 1694 0,172

0,194 ± 0,020

0,442

0,419 ± 0,037 WPI, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl 0,289 0,164 0,383 0,217 534 1730 0,204 0,376

WPI, pH 8, WH 3, 0,15 M NaCl 0,372 0,196 0,493 0,260 420 1690 0,207 0,439

WPI, pH 9, WH 1, 0,15 M NaCl 0,227 0,173 0,301 0,229 528 1685 0,159

0,163 ± 0,049

0,386

0,420 ± 0,045 WPI, pH 9, WH 2, 0,15 M NaCl 0,182 0,209 0,241 0,277 480 1700 0,116 0,470

WPI, pH 9, WH 3, 0,15 M NaCl 0,259 0,182 0,343 0,241 625 1670 0,214 0,402

Legende: yEx-Ret, Extinktion Retentat. yEx-Per, Extinktion Permeat. CS-Ret, Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Retentats. CS-Per, Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Permeats. VRet, Retentat Volumen. VPer, Permeat Volumen. mRet, absolute Proteinmenge Retentat. mPer, absolute Proteinmenge Permeat. MW, arithmetischer Mittelwert.

Anhang

298

Tabelle A6: Versuchsdaten – Proteingehalt der Fraktionen hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)

Probenname yEx-Ret yEx-Per CS-Ret (g/l) CS-Per (g/l) VRet (ml) VPer (ml) mRet (g) mRet MW (g) mPer (g) mPer MW (g)

Alge, pH 3, WH 1 0,413 0,366 0,244 0,216 350 1820 0,085

0,093 ± 0,008

0,394

0,421 ± 0,024 Alge, pH 3, WH 2 0,393 0,386 0,232 0,228 405 1900 0,094 0,433

Alge, pH 3, WH 3 0,402 0,381 0,238 0,225 425 1940 0,101 0,437

Alge, pH 6, WH 1 0,447 0,422 0,264 0,249 410 1880 0,108

0,105 ± 0,007

0,469

0,474 ± 0,018 Alge, pH 6, WH 2 0,449 0,426 0,265 0,252 410 1820 0,109 0,458

Alge, pH 6, WH 3 0,421 0,435 0,249 0,257 390 1920 0,097 0,494

Alge, pH 7, WH 1 0,442 0,409 0,261 0,242 355 1744 0,093

0,104 ± 0,010

0,422

0,451 ± 0,030 Alge, pH 7, WH 2 0,456 0,433 0,270 0,256 410 1881 0,110 0,481

Alge, pH 7, WH 3 0,453 0,414 0,268 0,245 405 1840 0,108 0,450

Alge, pH 8, WH 1 0,496 0,431 0,293 0,255 335 1640 0,098

0,142 ± 0,047

0,418

0,407 ± 0,038 Alge, pH 8, WH 2 0,573 0,394 0,339 0,233 405 1880 0,137 0,438

Alge, pH 8, WH 3 0,851 0,350 0,503 0,207 380 1760 0,191 0,364

Alge, pH 11, WH 1 0,975 0,369 0,576 0,218 266 1440 0,153

0,185 ± 0,029

0,314

0,345 ± 0,041 Alge, pH 11, WH 2 0,999 0,373 0,590 0,220 320 1501 0,189 0,331

Alge, pH 11, WH 3 0,873 0,360 0,516 0,213 410 1840 0,212 0,391

Alge, pH 3, WH 1, 0,15 M NaCl 0,428 0,343 0,253 0,203 400 1920 0,101

0,112 ± 0,010

0,389

0,420 ± 0,032 Alge, pH 3, WH 2, 0,15 M NaCl 0,467 0,395 0,276 0,233 420 1940 0,116 0,453

Alge, pH 3, WH 3, 0,15 M NaCl 0,478 0,364 0,283 0,215 425 1940 0,120 0,417

Alge, pH 6, WH 1, 0,15 M NaCl 0,543 0,357 0,321 0,211 475 1900 0,152

0,132 ± 0,018

0,401

0,420 ± 0,019 Alge, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl 0,476 0,369 0,281 0,218 430 1920 0,121 0,419

Alge, pH 6, WH 3, 0,15 M NaCl 0,472 0,395 0,279 0,233 435 1883 0,121 0,440

Alge, pH 7, WH 1, 0,15 M NaCl 0,527 0,422 0,311 0,249 355 1740 0,111

0,112 ± 0,015

0,434

0,429 ± 0,008 Alge, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl 0,551 0,385 0,326 0,228 390 1841 0,127 0,419

Alge, pH 7, WH 3, 0,15 M NaCl 0,492 0,436 0,291 0,258 335 1680 0,097 0,433

Alge, pH 8, WH 1, 0,15 M NaCl 0,472 0,375 0,279 0,222 400 1600 0,112

0,121 ± 0,013

0,355

0,401 ± 0,040 Alge, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl 0,582 0,390 0,344 0,230 395 1840 0,136 0,424

Alge, pH 8, WH 3, 0,15 M NaCl 0,502 0,386 0,297 0,228 385 1860 0,114 0,424

Alge, pH 11, WH 1, 0,15 M NaCl 0,975 0,374 0,576 0,221 395 1756 0,228

0,177 ± 0,044

0,388

0,332 ± 0,051 Alge, pH 11, WH 2, 0,15 M NaCl 0,894 0,378 0,528 0,223 300 1420 0,159 0,317

Alge, pH 11, WH 3, 0,15 M NaCl 0,846 0,355 0,500 0,210 290 1381 0,145 0,290


Anhang

299

Tabelle A7: Versuchsdaten – Proteingehalt der hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat-Fraktionen mit/ohne Ultraschall

Probenname yEx-Ret yEx-Per CS-Ret (mg/ml) CS-Per (mg/ml) VRet (ml) VPer (ml) mRet (mg) mRet MW (mg) mPer (mg) mPer MW (mg)

WPI – OUS, WH 1 0,830 0,374 1,099 0,495 93 400 102,21

94,63 ± 9,14

198,09

183,78 ± 17,13

WPI – OUS, WH 2 0,812 0,320 1,075 0,424 85 400 91,39 169,49

WPI – OUS, WH 3 0,692 0,333 0,916 0,441 89 400 81,55 176,38

WPI – OUS, WH 4 0,817 0,325 1,082 0,430 82 393 88,71 172,14

WPI – OUS, WH 5 0,848 0,340 1,123 0,450 87 396 97,69 180,08

WPI – OUS, WH 6 0,764 0,404 1,012 0,535 105 395 106,22 213,98

WPI – US, WH 1 0,770 0,427 1,020 0,565 87 400 88,70

89,50 ± 10,03

226,17

187,24 ± 19,96

WPI – US, WH 2 0,781 0,356 1,034 0,471 102 400 105,48 188,56

WPI – US, WH 3 0,689 0,328 0,912 0,434 94 400 85,76 173,73

WPI – US, WH 4 0,816 0,327 1,081 0,433 89 399 96,17 173,20

WPI – US, WH 5 0,773 0,352 1,024 0,466 82 393 83,93 186,44

WPI – US, WH 6 0,807 0,338 1,069 0,448 72 400 76,94 179,03


Tabelle A8: Versuchsdaten – Proteingehalt der hydrolysierten Molkenprotein-Isolat-Fraktionen bei der Filtration mittels RC-Membran

Probenname yEx-Ret yEx-Per CS-Ret (mg/ml) CS-Per (mg/ml) VRet (ml) VPer (ml) mRet (mg) mRet MW (mg) mPer (mg) mPer MW (mg)

WPI, pH 9, WH 1 0,495 0,189 0,655 0,250 72 401 47,19

57,33 ± 10,92

100,36

107,61 ± 15,41 WPI, pH 9, WH 2 0,598 0,236 0,792 0,313 87 401 68,89 125,31

WPI, pH 9, WH 3 0,603 0,203 0,749 0,268 70 401 55,89 97,17


Anhang

300

Tabelle A9: Versuchsdaten – Wiederfindungsrate bei der Filtration von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat

Probenname WFR (%) WFR MW (%) WFRRet (%) WFRRet MW (%) WFRPer (%) WFRPer MW (%)

WPI, pH 4, WH 1 99,10

99,10

46,41

46,41

52,69

52,69 WPI, pH 4, WH 2 - - -

WPI, pH 4, WH 3 - - -

WPI, pH 6, WH 1 99,03

89,64 ± 11,46

41,70

39,96 ± 7,52

57,33

49,68 ± 6,67 WPI, pH 6, WH 2 93,03 46,46 46,57

WPI, pH 6, WH 3 76,87 31,73 45,14

WPI, pH 7, WH 1 80,50

76,91 ± 5,53

25,17

27,92 ± 8,03

55,33

48,99 ± 6,31 WPI, pH 7, WH 2 79,67 36,96 42,71

WPI, pH 7, WH 3 70,54 21,61 48,93

WPI, pH 8, WH 1 101,61

94,85 ± 6,43

54,82

47,18 ± 8,94

46,79

47,67 ± 3,43 WPI, pH 8, WH 2 94,14 49,37 44,76

WPI, pH 8, WH 3 88,81 37,35 51,46

WPI, pH 9, WH 1 86,89

91,10 ± 4,63

37,15

38,07 ± 1,56

49,74

53,02 ± 3,22 WPI, pH 9, WH 2 90,33 37,19 53,14

WPI, pH 9, WH 3 96,06 39,88 56,19

WPI, pH 4, WH 1, 0,15 M NaCl 97,70

97,70

36,17

36,17

61,53

61,53 WPI, pH 4, WH 2, 0,15 M NaCl - - -

WPI, pH 4, WH 3, 0,15 M NaCl - - -

WPI, pH 6, WH 1, 0,15 M NaCl 80,60

75,14 ± 4,90

32,72

27,87 ± 4,22

47,89

47,27 ± 1,79 WPI, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl 71,13 25,88 45,25

WPI, pH 6, WH 3, 0,15 M NaCl 73,67 25,00 48,67

WPI, pH 7, WH 1, 0,15 M NaCl 77,57

74,88 ± 3,39

15,08

18,10 ± 4,92

62,49

56,78 ± 5,23 WPI, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl 75,99 23,78 52,22

WPI, pH 7, WH 3, 0,15 M NaCl 71,07 15,44 55,63

WPI, pH 8, WH 1, 0,15 M NaCl 81,81

81,74 ± 4,36

22,89

25,91 ± 2,62

58,92

55,83 ± 4,97 WPI, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl 77,34 27,25 50,09

WPI, pH 8, WH 3, 0,15 M NaCl 86,07 27,58 58,48

WPI, pH 9, WH 1, 0,15 M NaCl 72,63

77,67 ± 4,82

21,16

21,72 ± 6,60

51,47

55,95 ± 5,97 WPI, pH 9, WH 2, 0,15 M NaCl 78,15 15,42 62,73

WPI, pH 9, WH 3, 0,15 M NaCl 82,24 28,58 53,66

Legende: WFR, Wiederfindungsrate. WFRRet, Wiederfindungsrate im Retentat. WFRPer, Wiederfindungsrate im Permeat. MW, arithmetischer Mittelwert

Anhang

301

Tabelle A10: Versuchsdaten – Wiederfindungsrate bei der Filtration von hydrolysierter Alge (Chlorella vulgaris)


Alge, pH 3, WH 1 63,88

68,64 ± 4,18

11,39

12,47 ± 1,04

52,49

56,18 ± 3,20 Alge, pH 3, WH 2 70,34 12,54 57,79

Alge, pH 3, WH 3 71,71 13,46 58,25

Alge, pH 6, WH 1 76,96

77,11 ± 1,58

14,44

13,96 ± 0,89

62,52

63,14 ± 2,42 Alge, pH 6, WH 2 75,60 14,51 61,10

Alge, pH 6, WH 3 78,75 12,94 65,82

Alge, pH 7, WH 1 68,57

73,99 ± 5,19

12,36

13,85 ± 1,30

56,21

60,14 ± 3,99 Alge, pH 7, WH 2 78,92 14,73 64,18

Alge, pH 7, WH 3 74,49 14,46 60,03

Alge, pH 8, WH 1 68,79

73,16 ± 4,00

13,09

18,95 ± 6,22

55,70

54,20 ± 5,08 Alge, pH 8, WH 2 76,66 18,29 58,37

Alge, pH 8, WH 3 74,03 25,48 48,54

Alge, pH 11, WH 1 62,31

70,67 ± 9,12

20,44

24,61 ± 3,92

41,87

46,06 ± 5,43 Alge, pH 11, WH 2 69,31 25,19 44,12

Alge, pH 11, WH 3 80,40 28,21 52,20

Alge, pH 3, WH 1, 0,15 M NaCl

65,39

70,96 ± 5,26

13,49

14,99 ± 1,32

51,90

55,98 ± 4,25 Alge, pH 3, WH 2, 0,15 M NaCl

75,84 15,46 60,39


71,66 16,01 55,65


73,78

73,51 ± 1,44

20,33

17,54 ± 2,41

53,45

55,96 ± 2,58 Alge, pH 6, WH 2, 0,15 M NaCl

71,96 16,13 55,83


74,79 16,18 58,61


72,61

72,03 ± 1,15

14,74

14,89 ± 1,98

57,86

57,15 ± 1,12 Alge, pH 7, WH 2, 0,15 M NaCl

72,79 16,93 55,85


70,71 12,99 57,72


62,16

69,54 ± 6,55

14,88

16,07 ± 1,78

47,28

53,47 ± 5,36 Alge, pH 8, WH 2, 0,15 M NaCl

74,66 18,12 56,55


71,81 15,23 56,58


82,10

67,83 ± 12,66

30,35

23,61 ± 5,91

51,75

44,23 ± 6,77 Alge, pH 11, WH 2, 0,15 M NaCl

63,43 21,13 42,30


57,97 19,33 38,63


Anhang

302

Tabelle A11: Versuchsdaten – Wiederfindungsrate bei der Filtration von hydrolysiertem Molkenprotein-Isolat mit/ohne Ultraschall


WPI – OUS, WH 1 100,10

93,22 ± 8,50

34,07

31,54 ± 3,05

66,03

61,68 ± 5,80

WPI – OUS, WH 2 86,96

30,46

56,50 WPI – OUS, WH 3 85,98

27,18

58,79

WPI – OUS, WH 4 86,95

29,57

57,38 WPI – OUS, WH 5 92,59

32,56

60,03

WPI – OUS, WH 6 106,74

35,41

71,33 WPI – US, WH 1 104,96

92,45 ± 7,56

29,57

29,83 ± 3,34

75,39

62,62 ± 6,60

WPI – US, WH 2 98,01

35,16

62,85 WPI – US, WH 3 86,50

28,59

57,91

WPI – US, WH 4 89,79

32,06

57,73 WPI – US, WH 5 90,12

27,98

62,15

WPI – US, WH 6 85,32

25,65

59,68 Legende: WFR, Wiederfindungsrate. WFRRet, Wiederfindungsrate im Retentat. WFRPer, Wiederfindungsrate im Permeat. MW, arithmetischer Mittelwert

Tabelle A12: Versuchsdaten – Wiederfindungsrate bei der Filtration von hydrolysiertem Molkenproteinen-Isolat mittels RC-Membran


WPI, pH 9, WH 1 98,37

109,96 ± 17,00

31,46

38,22 ± 7,28

66,90

71,74 ± 10,27 WPI, pH 9, WH 2 129,47 45,93 83,54

WPI, pH 9, WH 3 102,04 37,26 64,78


Anhang

303

Tabelle & Abbildung A1: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, WH 1

tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) pH tF (min) pH

0 0,00 15 532,21 70 0 3,00 55 3,11 1 59,01 20 663,86 75 5 3,11 60 3,10 2 111,61 25 793,89 80 10 3,12 65 3,11 3 154,92 30 918,11 85 15 3,12 70 4 193,48 35 1070,57 90 20 3,11 75 5 230,61 40 1207,87 95 25 3,11 80 6 265,84 45 1333,88 100 30 3,11 85 7 300,99 50 1466,68 105 35 3,12 90 8 333,74 55 1593,39 110 40 3,12 95 9 365,29 60 1710,43 115 45 3,11 100 10 395,41 65 1820,68 120 50 3,11 105



0 0,00 15 568,17 70 0 3,01 55 3,16 1 61,05 20 717,40 75 5 3,12 60 3,16 2 112,74 25 861,14 80 10 3,13 65 3,16 3 172,13 30 997,52 85 15 3,13 70 4 200,17 35 1166,08 90 20 3,15 75 5 241,41 40 1283,29 95 25 3,15 80 6 281,02 45 1417,02 100 30 3,15 85 7 317,04 50 1549,81 105 35 3,16 90 8 355,95 55 1667,73 110 40 3,16 95 9 388,79 60 1788,79 115 45 3,16 100 10 425,59 65 1900,35 120 50 3,16 105



0 0,00 15 562,92 68 1940,30 0 3,01 55 3,08 1 59,49 20 708,66 75 5 3,09 60 3,08 2 113,05 25 846,53 80 10 3,09 65 3,08 3 158,32 30 977,92 85 15 3,09 68 3,07 4 200,15 35 1114,03 90 20 3,09 75 5 238,87 40 1246,87 95 25 3,09 80 6 276,06 45 1377,03 100 30 3,09 85 7 313,79 50 1503,89 105 35 3,09 90 8 352,35 55 1629,98 110 40 3,09 95 9 381,13 60 1754,88 115 45 3,09 100 10 414,94 65 1871,03 120 50 3,09 105

R² = 0,986

0 10 20 30 40 50 60 70

3,0

3,2

3,4

0

500

1000

1500

2000

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,983

2,8

3,0

3,2

3,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,984

3,0

3,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

304



0 0,00 15 718,23 70 0 6,05 55 1 58,14 20 911,45 75 5 6,16 60 2 115,22 25 1093,18 80 10 6,20 65 3 168,48 30 1288,26 85 15 6,22 70 4 221,09 35 1463,96 90 20 6,27 75 5 267,34 40 1630,04 95 25 6,30 80 6 319,91 45 1787,07 100 30 6,33 85 7 367,82 48 1880,51 105 35 6,36 90 8 413,41 55 110 40 6,41 95 9 455,82 60 115 45 6,45 100

10 498,35 65 120 48 6,49 105



0 0,00 15 675,91 70 0 6,01 55 1 58,45 20 851,99 75 5 6,12 60 2 113,82 25 1035,83 80 10 6,16 65 3 161,70 30 1211,45 85 15 6,18 70 4 206,14 35 1383,46 90 20 6,18 75 5 249,75 40 1539,16 95 25 6,23 80 6 293,68 45 1696,34 100 30 6,24 85 7 336,96 49 1820,96 105 35 6,26 90 8 382,49 55 110 40 6,31 95 9 432,57 60 115 45 6,35 100

10 465,00 65 120 49 6,40 105



0 0,00 15 702,34 70 0 5,99 55 1 62,50 20 893,35 75 5 6,10 60 2 118,87 25 1067,34 80 10 6,13 65 3 167,56 30 1236,04 85 15 6,12 70 4 212,47 35 1458,78 90 20 6,14 75 5 256,05 40 1659,27 95 25 6,16 80 6 298,60 45 1842,13 100 30 6,22 85 7 339,13 47 1920,86 105 35 6,22 90 8 378,56 55 110 40 6,24 95 9 416,98 60 115 45 6,33 100 10 486,26 65 120 47 6,33 105

R² = 0,988

6,0

6,2

6,4

6,6

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,990

0 10 20 30 40 50

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

0

500

1000

1500

2000

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,995

5,8

6,0

6,2

6,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

305



0 0,00 15 676,13 70 0 7,03 55 1 57,47 20 858,64 75 5 7,06 60 2 111,45 25 1062,5 80 10 7,08 65 3 158,91 30 1249,01 85 15 7,11 70 4 204,24 35 1422,97 90 20 7,17 75 5 247,80 40 1584,01 95 25 7,21 80 6 294,01 45 1730,66 100 30 7,22 85 7 336,34 46 1740,32 105 35 7,27 90 8 388,23 55 110 40 7,31 95 9 434,52 60 115 45 7,40 100 10 478,34 65 120 46 7,40 105



0 0,00 15 729,15 70 0 7,02 55 1 54,96 20 918,40 75 5 7,09 60 2 110,23 25 1095,38 80 10 7,12 65 3 162,54 30 1299,17 85 15 7,14 70 4 210,56 35 1477,03 90 20 7,16 75 5 257,89 40 1635,50 95 25 7,20 80 6 315,64 45 1784,53 100 30 7,20 85 7 365,99 48 1881,67 105 35 7,21 90 8 413,32 55 110 40 7,24 95 9 458,70 60 115 45 7,27 100 10 505,12 65 120 48 7,30 105



0 0,00 15 757,03 70 0 7,02 55 1 56,55 20 945,55 75 5 7,11 60 2 113,72 25 1151,99 80 10 7,08 65 3 169,35 30 1340,01 85 15 7,08 70 4 222,12 35 1519,42 90 20 7,11 75 5 277,14 40 1690,81 95 25 7,08 80 6 330,72 45 1840,44 100 30 7,10 85 7 381,23 50 105 35 7,10 90 8 431,13 55 110 40 7,11 95 9 480,86 60 115 45 7,18 100 10 537,65 65 120 50 105

R² = 0,991

7,0

7,2

7,4

7,6

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,988

7,0

7,2

7,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,986

7,0

7,2

7,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

306



0 0,00 15 681,53 70 0 8,03 55 1 57,32 20 858,11 75 5 8,00 60 2 111,24 25 1047,72 80 10 8,08 65 3 157,80 30 1221,93 85 15 8,05 70 4 202,07 35 1383,02 90 20 8,03 75 5 245,55 40 1530,54 95 25 8,01 80 6 291,41 44 1640,16 100 30 8,02 85 7 335,62 50 105 35 8,02 90 8 379,74 55 110 40 8,00 95 9 422,96 60 115 45 8,02 100 10 474,06 65 120 50 105



0 0,00 15 778,70 70 0 8,01 55 1 59,37 20 979,00 75 5 7,88 60 2 119,21 25 1196,65 80 10 7,79 65 3 170,13 30 1394,87 85 15 7,73 70 4 221,06 35 1575,65 90 20 7,66 75 5 280,52 40 1737,22 95 25 7,58 80 6 338,95 45 1880,52 100 30 7,53 85 7 390,38 50 105 35 7,50 90 8 440,29 55 110 40 7,43 95 9 492,23 60 115 44 7,43 100

10 541,69 65 120 50 105



0 0,00 15 653,55 70 0 8,01 55 1 59,65 20 826,75 75 5 7,95 60 2 117,02 25 987,96 80 10 7,82 65 3 167,42 30 1154,6 85 15 7,70 70 4 213,80 35 1310,22 90 20 7,60 75 5 258,47 40 1464,79 95 25 7,55 80 6 301,71 45 1638,67 100 30 7,46 85 7 344,81 50 1760,66 105 35 7,44 90 8 385,02 55 110 40 7,41 95 9 424,56 60 115 45 7,39 100 10 465,97 65 120 50 7,38 105

R² = 0,988

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,986

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,985

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

307



0 0,00 15 603,82 70 0 11,01 55 1 57,42 20 754,83 75 5 11,04 60 2 108,54 25 934,89 80 10 11,03 65 3 153,06 30 1073,53 85 15 10,98 70 4 197,39 35 1202,7 90 20 10,97 75 5 239,29 40 1318,89 95 25 10,93 80 6 279,01 45 1425,21 100 30 10,93 85 7 314,62 46 1440,4 105 35 10,94 90 8 346,97 55 110 40 10,94 95 9 381,98 60 115 45 10,94 100 10 427,84 65 120 46 10,96 105



0 0,00 15 710,88 70 0 11,00 55 1 60,67 20 869,32 75 5 11,03 60 2 120,33 25 1106,02 80 10 11,07 65 3 172,08 30 1283,92 85 15 11,06 70 4 222,31 35 1451,16 90 20 11,03 75 5 264,92 37 1501,04 95 25 11,05 80 6 307,04 45 100 30 11,03 85 7 346,10 50 105 35 11,05 90 8 388,03 55 110 37 11,03 95 9 453,41 60 115 45 100 10 505,08 65 120 50 105



0 0,00 15 736,69 70 0 10,99 55 1 67,89 20 901,75 75 5 11,00 60 2 132,22 25 1048,66 80 10 11,05 65 3 188,53 30 1238,10 85 15 11,00 70 4 240,06 35 1391,04 90 20 10,99 75 5 286,98 40 1547,79 95 25 10,99 80 6 338,82 45 1683,54 100 30 10,97 85 7 387,35 50 1840,50 105 35 10,96 90 8 434,56 55 110 40 10,96 95 9 477,74 60 115 45 10,96 100 10 532,79 65 120 50 10,97 105

R² = 0,978

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,989

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,974

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 20 40 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

308

Tabelle & Abbildung A16: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Algen (Chlorella vulgaris), pH 3, NaCl, WH 1


0 0,00 15 573,13 70 0 3,01 55 3,26 1 63,81 20 731,91 75 5 3,21 60 3,26 2 120,59 25 889,79 80 10 3,24 65 3,26 3 167,99 30 1037,14 85 15 3,25 70 4 211,58 35 1197,57 90 20 3,25 75 5 250,93 40 1336,84 95 25 3,25 80 6 290,91 45 1463,09 100 30 3,26 85 7 327,77 50 1589,5 105 35 3,26 90 8 363,07 55 1709,13 110 40 3,26 95 9 396,49 60 1820,01 115 45 3,26 100 10 428,56 65 1920,17 120 50 3,26 105

Tabelle & Abbildung A17: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Alge (Chlorella vulgaris), pH 3, NaCl, WH 2


0 0,00 15 510,51 70 1876,14 0 3,00 55 3,34 1 54,96 20 659,79 73 1940,35 5 3,20 60 3,34 2 104,92 25 803,87 80 10 3,24 65 3,35 3 145,23 30 923,82 85 15 3,27 70 3,35 4 181,81 35 1073,12 90 20 3,29 73 3,35 5 215,68 40 1211,06 95 25 3,31 80 6 249,68 45 1322,77 100 30 3,31 85 7 283,11 50 1437,61 105 35 3,33 90 8 315,32 55 1553,21 110 40 3,33 95 9 346,12 60 1662,99 115 45 3,33 100 10 376,24 65 1773,29 120 50 3,34 105



0 0,00 15 514,60 70 1814,44 0 3,00 55 3,13 1 54,97 20 660,24 75 1907,32 5 3,10 60 3,13 2 104,11 25 786,01 77 1940,69 10 3,11 65 3,13 3 145,98 30 906,20 85 15 3,11 70 3,13 4 183,39 35 1020,96 90 20 3,12 75 3,13 5 218,16 40 1150,57 95 25 3,12 77 3,13 6 254,49 45 1277,22 100 30 3,12 85 7 288,25 50 1387,68 105 35 3,13 90 8 319,75 55 1499,34 110 40 3,13 95 9 350,00 60 1611,75 115 45 3,13 100 10 379,47 65 1714,88 120 50 3,13 105

R² = 0,981

2,8

3,0

3,2

3,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,986

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,983

3,0

3,2

3,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70 80

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

309



0 0,00 15 655,79 70 0 6,02 55 6,54 1 56,94 20 828,11 75 5 6,19 59 6,57 2 111,42 25 972,99 80 10 6,27 65 3 156,74 30 1148,11 85 15 6,29 70 4 196,08 35 1282,29 90 20 6,33 75 5 247,54 40 1419,77 95 25 6,35 80 6 301,73 45 1554,37 100 30 6,38 85 7 348,29 50 1677,81 105 35 6,40 90 8 394,28 55 1801,25 110 40 6,42 95 9 436,29 59 1900,19 115 45 6,45 100 10 472,93 65 120 50 6,48 105



0 0,00 15 577,02 70 0 6,02 55 6,27 1 55,41 20 766,11 75 5 6,11 60 6,32 2 109,96 25 914,41 80 10 6,13 65 3 154,93 30 1048,02 85 15 6,14 70 4 196,50 35 1232,29 90 20 6,15 75 5 234,85 40 1381,62 95 25 6,16 80 6 270,85 45 1526,02 100 30 6,18 85 7 305,78 50 1655,6 105 35 6,18 90 8 337,59 55 1794,82 110 40 6,19 95 9 369,38 60 1920,84 115 45 6,21 100 10 399,92 65 120 50 6,24 105



0 0,00 15 733,84 70 0 6,03 55 1 60,98 20 884,23 75 5 6,16 60 2 111,38 25 1051,34 80 10 6,21 65 3 163,83 30 1259,62 85 15 6,24 70 4 207,07 35 1444,11 90 20 6,27 75 5 249,02 40 1603,62 95 25 6,30 80 6 299,59 45 1777,93 100 30 6,31 85 7 356,11 48 1883,35 105 35 6,33 90 8 408,60 55 110 40 6,41 95 9 455,92 60 115 45 6,42 100 10 493,88 65 120 48 6,46 105

R² = 0,977

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,991

6,0

6,2

6,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,990

6,0

6,2

6,4

6,6

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

310



0 0,00 15 558,04 70 0 7,01 55 7,30 1 58,98 20 725,80 75 5 7,10 57 7,32 2 109,62 25 864,13 80 10 7,12 65 3 155,21 30 1037,77 85 15 7,14 70 4 194,82 35 1185,80 90 20 7,16 75 5 233,14 40 1322,62 95 25 7,18 80 6 272,10 45 1449,40 100 30 7,19 85 7 312,45 50 1570,84 105 35 7,20 90 8 348,50 55 1687,90 110 40 7,22 95 9 383,23 57 1740,58 115 45 7,24 100 10 414,47 65 120 50 7,27 105



0 0,00 15 515,08 70 0 7,01 55 7,11 1 55,52 20 671,12 75 5 7,07 60 7,11 2 100,41 25 812,63 80 10 7,08 64 7,12 3 139,01 30 944,78 85 15 7,09 70 4 175,88 35 1098,39 90 20 7,08 75 5 210,86 40 1239,82 95 25 7,08 80 6 246,73 45 1378,64 100 30 7,09 85 7 280,23 50 1514,01 105 35 7,08 90 8 314,04 55 1637,74 110 40 7,08 95 9 345,52 60 1757,49 115 45 7,10 100 10 376,36 64 1841,50 120 50 7,10 105



0 0,00 15 607,31 70 0 7,01 55 1 48,98 20 770,55 75 5 7,07 60 2 96,20 25 918,50 80 10 7,07 65 3 139,76 30 1095,9 85 15 7,07 70 4 179,91 35 1254,55 90 20 7,07 75 5 221,64 40 1407,94 95 25 7,08 80 6 263,97 45 1552,43 100 30 7,05 85 7 306,27 50 1680,82 105 35 7,07 90 8 348,80 55 110 40 7,08 95 9 387,02 60 115 45 7,08 100 10 420,75 65 120 50 7,10 105

R² = 0,986

6,8

7,0

7,2

7,4

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,992

7,0

7,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,991

7,0

7,2

0

500

1000

1500

2000

0 20 40 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

311



0 0,00 15 691,86 70 0 8,02 55 1 58,87 20 824,21 75 5 8,01 60 2 119,92 25 1001,26 80 10 7,96 65 3 166,17 30 1159,17 85 15 7,93 70 4 209,01 35 1302,24 90 20 7,90 75 5 253,08 40 1440,47 95 25 7,89 80 6 295,41 45 1569,00 100 30 7,86 85 7 333,69 50 1600,13 105 35 7,84 90 8 377,90 55 110 40 7,81 95 9 421,65 60 115 45 7,79 100

10 468,10 65 120 46 7,78 105



0 0,00 15 526,58 70 1840,04 0 8,02 55 7,41 1 53,10 20 666,64 75 5 7,98 60 7,38 2 102,93 25 794,05 80 10 7,90 65 7,35 3 145,36 30 920,04 85 15 7,83 68 7,33 4 191,53 35 1047,52 90 20 7,75 75 5 225,48 40 1173,67 95 25 7,70 80 6 263,07 45 1294,93 100 30 7,63 85 7 296,06 50 1413,34 105 35 7,57 90 8 328,11 55 1528,19 110 40 7,52 95 9 359,29 60 1637,13 115 45 7,48 100 10 389,10 65 1751,73 120 50 7,45 105



0 0,00 15 702,82 70 0 8,03 55 1 54,51 20 895,52 75 5 7,97 60 2 110,68 25 1069,23 80 10 7,86 65 3 155,67 30 1269,51 85 15 7,79 70 4 202,84 35 1437,04 90 20 7,72 75 5 246,98 40 1603,45 95 25 7,65 80 6 300,09 45 1746,48 100 30 7,58 85 7 345,01 49 1860,56 105 35 7,53 90 8 395,23 55 110 40 7,47 95 9 443,42 60 115 45 7,44 100 10 488,97 65 120 49 7,41 105

R² = 0,980

7,6

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,984

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,989

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

8,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

312



0 0,00 15 470,84 70 1575,38 0 10,99 55 10,92 1 51,40 20 587,19 75 1664,03 5 11,00 60 10,91 2 99,24 25 694,00 80 1756,35 10 10,99 65 10,90 3 139,28 30 796,68 85 15 10,97 70 10,90 4 175,18 35 895,33 90 20 10,98 75 10,90 5 208,54 40 997,46 95 25 10,97 80 10,89 6 243,87 45 1098,22 100 30 10,95 85 7 270,52 50 1197,5 105 35 10,95 90 8 299,26 55 1295,28 110 40 10,95 95 9 326,84 60 1391,64 115 45 10,94 100 10 352,99 65 1484,18 120 50 10,93 105



0 0,00 15 610,79 70 0 11,00 55 1 57,99 20 767,61 75 5 11,02 60 2 117,40 25 912,43 80 10 11,00 65 3 169,85 30 1045,11 85 15 10,98 70 4 216,66 35 1167,41 90 20 10,97 75 5 262,86 40 1273,32 95 25 10,95 80 6 304,48 45 1378,94 100 30 10,95 85 7 342,50 47 1420,54 105 35 10,94 90 8 379,83 55 110 40 10,93 95 9 419,43 60 115 45 10,93 100

10 456,57 65 120 47 10,92 105



0 0,00 15 616,61 70 0 11,00 55 1 59,07 20 763,27 75 5 11,02 60 2 120,38 25 909,25 80 10 11,01 65 3 172,36 30 1043,63 85 15 10,98 70 4 219,47 35 1156,71 90 20 10,99 75 5 264,60 40 1258,65 95 25 10,95 80 6 305,12 45 1329,75 100 30 10,95 85 7 342,36 46 1381,03 105 35 10,94 90 8 377,86 55 110 40 10,94 95 9 410,37 60 115 45 10,94 100 10 452,39 65 120 46 10,94 105

R² = 0,978

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,960

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,954

10,8

11,0

11,2

0

500

1000

1500

2000

0 10 20 30 40 50

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

313

Tabelle & Abbildung A31: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Molken-Isolat, pH 7, US, WH 1

tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) VPer (ml) tF (min) pH tF (min) pH

0 0,00 22 171,66 44 355,45 66 88 0 6,98 55 2 17,50 24 189,24 46 - 68 90 5 - 60 4 40,13 26 206,44 48 382,51 70 92 10 - 65 6 46,95 28 224,54 50 394,30 72 94 15 7,10 70 8 63,20 30 242,13 52 400,55 74 96 20 7,19 75

10 76,72 32 259,82 54 76 98 25 7,24 80 12 90,84 34 277,20 56 78 100 30 7,36 85 14 104,65 36 298,90 58 80 102 35 7,44 90 16 119,59 38 311,29 60 82 104 40 7,48 95 18 136,32 40 326,06 62 84 106 45 7,50 100 20 153,88 42 341,79 64 86 108 50 7,55 105

Tabelle & Abbildung A32: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Molkenprotein-Isolat, pH 7, US, WH 2


0 0,00 22 112,17 44 213,1 66 290,54 88 362,44 0 7,00 55 7,53 2 18,13 24 121,5 46 217,33 68 297,52 90 368,71 5 7,12 60 7,55 4 29,20 26 130,2 48 225,07 70 303,01 92 374,38 10 7,11 65 7,58 6 38,35 28 139,39 50 232,49 72 311,33 94 380,32 15 7,16 70 7,61 8 48,17 30 147,95 52 240,05 74 317,9 96 386,42 20 7,22 75 7,65

10 57,46 32 157,37 54 247,27 76 324,98 98 392,37 25 7,26 80 7,69 12 66,51 34 164,76 56 255,35 78 331,26 100 400,25 30 7,28 85 7,70 14 74,80 36 173,33 58 261,92 80 337,71 102 35 7,31 90 7,75 16 84,00 38 181,79 60 268,82 82 344,1 104 40 7,38 95 7,78 18 92,10 40 190,42 62 276,62 84 350,54 106 45 7,42 100 7,86 20 101,54 42 202,29 64 283,53 86 357,07 108 50 7,44 105



0 0,00 22 209,41 44 379,17 66 88 0 7,02 55 2 21,20 24 225,18 46 394,18 68 90 5 7,08 60 4 41,68 26 244,57 47 400,08 70 92 10 7,11 65 6 70,85 28 258,81 50 72 94 15 7,18 70 8 80,53 30 275,86 52 74 96 20 7,25 75

10 97,02 32 292,48 54 76 98 25 7,27 80 12 115,48 34 305,28 56 78 100 30 7,30 85 14 138,10 36 322,76 58 80 102 35 7,37 90 16 159,33 38 335,46 60 82 104 40 7,42 95 18 174,45 40 351,64 62 84 106 45 7,46 100 20 190,90 42 364,93 64 86 108 47 7,54 105

R² = 0,998

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,981

6,87,07,27,47,67,88,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,992

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

314



0 0,00 22 157,91 44 245,59 66 306,37 88 367,40 0 7,01 55 7,55 2 23,81 24 167,94 46 251,68 68 311,92 90 372,79 5 7,09 60 7,60 4 39,39 26 176,34 48 256,78 70 320,48 92 378,12 10 7,10 65 7,65 6 56,19 28 188,38 50 262,46 72 322,74 94 383,10 15 7,22 70 7,70 8 70,05 30 198,32 52 268,13 74 328,11 96 389,04 20 7,25 75 7,71

10 82,75 32 208,13 54 273,85 76 335,31 98 393,81 25 7,29 80 7,76 12 96,48 34 213,70 56 280,04 78 340,23 100 398,88 30 7,36 85 7,79 14 109,99 36 221,76 58 284,86 80 346,26 102 35 7,43 90 7,84 16 124,20 38 227,57 60 290,88 82 351,14 104 40 7,49 95 7,86 18 134,45 40 233,58 62 295,08 84 356,04 106 45 7,50 100 7,86 20 146,98 42 240,33 64 300,43 86 361,80 108 50 7,53 105



0 0,00 22 172,16 44 298,50 66 88 0 7,00 55 7,58 2 24,73 24 184,55 46 306,91 68 90 5 7,07 60 7,67 4 41,68 26 198,57 48 314,90 70 92 10 7,13 62 7,74 6 55,17 28 210,28 50 334,13 72 94 15 7,23 70 8 72,43 30 222,16 52 343,78 74 96 20 7,27 75

10 87,10 32 233,85 54 354,45 76 98 25 7,35 80 12 104,25 34 244,51 56 365,15 78 100 30 7,37 85 14 119,26 36 256,25 58 374,35 80 102 35 7,37 90 16 135,44 38 266,45 60 383,93 82 104 40 7,43 95 18 147,18 40 276,99 62 393,32 84 106 45 7,49 100 20 158,73 42 288,29 64 86 108 50 7,54 105



0 0,00 22 114,67 44 210,78 66 299,06 88 386,72 0 7,02 55 7,55 2 15,25 24 124,15 46 219,06 68 307,23 90 395,16 5 7,11 60 7,58 4 27,73 26 133,68 48 227,50 70 315,03 91 400,00 10 7,15 65 7,65 6 40,80 28 142,65 50 236,97 72 322,13 94 15 7,21 70 7,67 8 49,44 30 150,64 52 243,15 74 329,79 96 20 7,28 75 7,70

10 58,18 32 160,04 54 259,17 76 337,41 98 25 7,33 80 7,73 12 68,24 34 168,67 56 251,35 78 344,89 100 30 7,37 85 7,76 14 78,23 36 177,61 58 266,43 80 352,40 102 35 7,41 90 7,80 16 87,14 38 185,57 60 274,91 82 360,02 104 40 7,45 91 7,82 18 95,72 40 193,81 62 283,81 84 366,20 106 45 7,48 100 20 104,69 42 202,24 64 291,08 86 375,58 108 50 7,53 105

R² = 0,863

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,979

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,990

6,87,07,27,47,67,88,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

315

Tabelle & Abbildung A37: Versuchsdaten – Crossflow-Filtration, Molkenprotein-Isolat, pH 7, OUS, WH 1


0 0,00 22 137,05 44 265,80 66 391,18 88 0 6,97 55 7,54 2 15,40 24 149,31 46 - 68 400,48 90 5 - 60 7,58 4 35,35 26 162,61 48 289,30 70 92 10 - 65 7,62 6 39,78 28 173,46 50 300,60 72 94 15 7,09 68 7,64 8 53,13 30 185,51 52 312,47 74 96 20 7,22 75

10 65,97 32 197,10 54 324,12 76 98 25 7,27 80 12 78,49 34 209,37 56 337,69 78 100 30 7,35 85 14 90,50 36 219,72 58 348,00 80 102 35 7,40 90 16 102,03 38 229,22 60 359,05 82 104 40 7,45 95 18 113,19 40 241,33 62 370,24 84 106 45 7,45 100 20 125,41 42 253,92 64 380,87 86 108 50 7,50 105



0 0,00 22 130,9 44 249,82 66 342,15 88 0 6,97 55 7,57 2 16,50 24 141,8 46 254,27 68 350,73 90 5 7,08 60 7,58 4 29,90 26 152,48 48 263,6 70 358,84 92 10 7,11 65 7,64 6 41,13 28 162,59 50 272,88 72 367,45 94 15 7,13 70 7,69 8 53,40 30 172,83 52 281,81 74 375,6 96 20 7,20 75 7,70

10 65,77 32 183,63 54 290,85 76 383,8 98 25 7,25 80 7,81 12 76,63 34 192,78 56 299,73 78 391,58 100 30 7,30 85 14 87,50 36 202,66 58 308,23 80 399,62 102 35 7,32 90 16 98,50 38 212,24 60 316,83 82 104 40 7,36 95 18 109,02 40 222,24 62 325,85 84 106 45 7,40 100 20 119,70 42 236,96 64 334,17 86 108 50 7,44 105



0 0,00 22 165,53 44 286,66 65 400,38 88 0 7,02 55 7,58 2 19,10 24 177,23 46 298,17 68 90 5 7,09 60 7,63 4 35,95 26 190,37 48 309,45 70 92 10 7,13 65 7,69 6 60,03 28 200,13 50 320,06 72 94 15 7,18 70 8 67,73 30 212,18 52 331,4 74 96 20 7,21 75

10 80,84 32 224,18 54 342,05 76 98 25 7,28 80 12 95,52 34 233,64 56 353,78 78 100 30 7,35 85 14 111,58 36 246,43 58 362,88 80 102 35 7,38 90 16 124,90 38 255,57 60 372,99 82 104 40 7,41 95 18 137,48 40 266,29 62 383,25 84 106 45 7,45 100 20 148,92 42 276,28 64 392,41 86 108 50 7,53 105

R² = 0,999

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,989

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,983

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

0

100

200

300

400

500

0 10 20 30 40 50 60 70

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

316



0 0,00 22 117,81 44 213,14 66 304,1 88 386,25 0 7,01 55 7,54 2 16,46 24 126,85 46 223,35 68 312,28 90 393,47 5 7,05 60 7,59 4 27,63 26 135,27 48 230,41 70 317,21 92 10 7,09 65 7,64 6 39,37 28 144,89 50 238,46 72 327,8 94 15 7,18 70 7,69 8 49,54 30 153,79 52 246,91 74 335,69 96 20 7,24 75 7,72

10 58,93 32 163,6 54 255,09 76 346,13 98 25 7,27 80 7,76 12 68,22 34 171,28 56 264,82 78 353,22 100 30 7,31 85 7,79 14 77,62 36 181,95 58 271,92 80 361,75 102 35 7,38 90 7,84 16 87,95 38 189,64 60 280,76 82 368,95 104 40 7,44 95 18 98,39 40 197,54 62 286,87 84 376,25 106 45 7,46 100 20 108,05 42 206,52 64 295,41 86 384,58 108 50 7,49 105



0 0,00 22 94,60 44 179,98 66 267,80 88 341,98 0 7,00 60 7,53 2 13,19 24 102,07 46 187,56 68 275,92 90 347,92 5 7,06 65 7,57 4 21,64 26 110,80 48 194,92 70 282,86 92 354,48 10 7,10 70 7,63 6 30,28 28 117,71 50 209,20 72 290,84 94 360,10 15 7,18 75 7,66 8 38,02 30 126,82 52 216,42 74 296,98 96 366,60 20 7,21 80 7,68

10 45,28 32 134,75 54 224,46 76 304,07 98 372,38 25 7,27 85 7,72 12 53,86 34 142,19 56 232,60 78 310,45 100 378,23 30 7,35 90 7,73 14 62,63 36 150,29 58 239,28 80 316,52 102 384,39 35 7,38 95 7,76 16 72,20 38 157,60 60 246,08 82 323,05 104 390,21 40 7,44 100 7,79 18 79,53 40 164,69 62 253,09 84 329,24 106 396,14 45 7,47 105 7,83 20 86,48 42 172,77 64 260,76 86 335,89 108 50 7,48 106 7,85 55 7,49 115

R² = 0,990

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

R² = 0,994

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100120

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

317



0 0,00 26 99,15 52 196,24 78 277,3 104 365,86 0 7,02 60 7,54 2 12,77 28 105,67 54 189,66 80 284,04 106 371,51 5 7,09 65 7,56 4 21,62 30 112,56 56 202,13 82 289,13 108 377,75 10 7,13 70 7,57 6 30,08 32 119,46 58 210,01 84 296,15 110 383,52 15 7,18 75 7,58 8 37,57 34 126,68 60 217,06 86 306,84 112 389,21 20 7,22 80 7,60

10 44,43 36 133,04 62 224,06 88 314,33 114 394,49 25 7,31 85 7,62 12 51,48 38 139,01 64 230,88 90 321,63 116 30 7,38 90 7,63 14 58,86 40 146,87 66 237,78 92 330,25 118 35 7,42 95 7,66 16 65,75 42 154,69 68 244,39 94 336,03 120 40 7,47 100 7,71 18 72,37 44 161,88 70 251,14 96 341,99 122 45 7,48 105 7,72 20 79,14 46 169,11 72 257,35 98 348,01 124 50 7,50 110 7,73 22 84,56 48 177,25 74 263,86 100 353,89 126 55 7,52 114 7,76

24 92,15 50 182,58 76 270,73 102 359,88 128

R² = 0,998

6,8

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

0

100

200

300

400

500

0 20 40 60 80 100120

pH

Per

mea

tmen

ge [

g]

Zeit [min]

Anhang

318

Dialyse - Versuchsdaten

Tabelle A13: Versuchsdaten – Dialyse von Molkenprotein-Isolat

Probenname WH pH CF (%) tDL (h) VD yEx-vD CS-vD (mg/ml) mvD (mg) mvD MW (mg) VnDL (ml) yEx-nD CS-nD (mg/ml) mnD (mg) mnD MW (mg)

WPI - pH 3 1 3 1 24 -

-

-

-

-

-

0,814 1,078 24,79

24,57 ± 0,29

20 0,917 1,214 24,28

23,46 ± 0,80 WPI - pH 3 2 3 1 24 - 0,796 1,054 24,24 20 0,857 1,135 22,70

WPI - pH 3 3 3 1 24 - 0,810 1,073 24,67 20 0,883 1,169 23,38

WPI - pH 5 1 5 1 24 - 0,666 0,882 20,28

19,85 ± 0,38

20 0,379 0,502 10,04

9,92 ± 0,27 WPI - pH 5 2 5 1 24 - 0,646 0,855 19,67 20 0,363 0,481 9,61

WPI - pH 5 3 5 1 24 - 0,643 0,851 19,58 20 0,382 0,506 10,12

WPI - pH 6 1 6 1 24 - 0,884 1,171 26,92

26,98 ± 0,73

20 0,617 0,817 16,34

16,77 ± 0,38 WPI - pH 6 2 6 1 24 - 0,911 1,206 27,74 20 0,638 0,845 16,90

WPI - pH 6 3 6 1 24 - 0,863 1,143 26,28 20,5 0,629 0,833 17,07

WPI - pH 7,5 1 7,5 1 24 - 0,865 1,145 26,34

26,02 ± 0,49

20 0,618 0,818 16,37

16,39 ± 0,74 WPI - pH 7,5 2 7,5 1 24 - 0,862 1,141 26,25 20 0,647 0,857 17,13

WPI - pH 7,5 3 7,5 1 24 - 0,836 1,107 25,46 20,5 0,577 0,764 15,66

WPI - pH 9 1 9 1 24 - 0,860 1,139 26,19

26,61 ± 0,50

20 0,59 0,781 15,63

15,62 ± 0,57 WPI - pH 9 2 9 1 24 - 0,892 1,181 27,17 20,5 0,596 0,789 16,18

WPI - pH 9 3 9 1 24 - 0,869 1,151 26,47 20 0,568 0,752 15,04

WPI - pH 11 1 11 1 24 - 0,919 1,217 27,99

28,32 ± 1,06

20,5 0,564 0,747 15,31

15,52 ± 0,36 WPI - pH 11 2 11 1 24 - 0,902 1,194 27,47 21 0,551 0,730 15,32

WPI - pH 11 3 11 1 24 - 0,969 1,283 29,51 20 0,602 0,797 15,94

WPI - pH 9 1 9 2 24 - 1,701 2,252 51,80

51,88 ± 0,39

22,5 0,779 1,032 23,21

21,54 ± 1,71 WPI - pH 9 2 9 2 24 - 1,717 2,274 52,29 22,5 0,726 0,961 21,63

WPI - pH 9 3 9 2 24 - 1,692 2,240 51,53 22,5 0,664 0,879 19,78

WPI - pH 11 1 11 2 24 - 1,744 2,309 53,11

53,02 ± 0,13

22,5 0,915 1,212 27,26

27,37 ± 1,04 WPI - pH 11 2 11 2 24 - 1,736 2,299 52,87 22,5 0,955 1,265 28,45

WPI - pH 11 3 11 2 24 - 1,743 2,308 53,08 21 0,949 1,257 26,39

WPI - pH 9 1 9 2 48 - 1,590 2,105 48,42

47,32 ± 1,27

20,5 0,461 0,610 12,51

13,29 ± 0,68 WPI - pH 9 2 9 2 48 - 1,563 2,070 47,60 20 0,512 0,678 13,56

WPI - pH 9 3 9 2 48 - 1,508 1,997 45,93 20 0,521 0,690 13,80

WPI - pH 11 1 11 2 48 - 1,627 2,154 49,55

48,02 ± 1,48

20,5 0,759 1,005 20,60

18,97 ± 1,41 WPI - pH 11 2 11 2 48 - 1,573 2,083 47,91 20,5 0,673 0,891 18,27

WPI - pH 11 3 11 2 48 - 1,530 2,026 46,60 20,5 0,665 0,881 18,05

WPI - pH 9 1 9 4 24 1:5 0,584 3,867 92,80

92,53 ± 0,24

22,5 1,898 2,513 56,55

53,14 ± 2,97 WPI - pH 9 2 9 4 24 1:5 0,582 3,853 92,48 23 1,678 2,222 51,10

WPI - pH 9 3 9 4 24 1:5 0,581 3,847 92,32 23 1,700 2,251 51,77

WPI - pH 11 1 11 4 24 1:5 0,63 4,171 100,11

99,42 ± 0,72

23 1,525 2,019 46,44

47,85 ± 1,22 WPI - pH 11 2 11 4 24 1:5 0,621 4,111 98,68 23,5 1,561 2,067 48,57

WPI - pH 11 3 11 4 24 1:5 0,626 4,145 99,47 24,5 1,496 1,981 48,53

Legende: WH, Wiederholung. CF, Feed-Konzentration. tDL, Dauer der Dialyse. VD, Verdünnungsfaktor. yEx-vD, Extinktion Feed vor Dialyse. CS-vD, Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Feeds. mvD, absolute Proteinmenge Feed. MW, arithmetischer Mittelwert. VnDL, Retentat Volumen nach Dialyse.yEx-nD, Extinktion Retentat nach Dilayse.CS-nD, Spektralphotometrisch ermittelte Konzentration des Retentats nach Dialyse. mnD, absolute Proteinmenge Retentat nach Dilayse.

Anhang

319

Hydrolyse - Versuchsdaten

Tabelle A14: Versuchsdaten – Hydrolyse der Alge (Chlorella vulgaris)

Probenname WH pH tEVtSV (min) tD (h) TOH (°C) DH (%) DH MW (%)

HCl 18 h + Pancreatin 45 min 1 8 45 18 40 10,25

10,29 ± 0,97 HCl 18 h + Pancreatin 45 min 2 8 45 18 40 9,34



12,76 ± 1,12 HCl 48 h + Pancreatin 45 min 2 8 45 48 40 11,68


Rohament 18 h + Pancreatin 45 min 1 8 45 18 40 16,49

15,32 ± 1,19 Rohament 18 h + Pancreatin 45 min 2 8 45 18 40 14,10







Rohament 72 h + Pancreatin 45 min 3 8 45 72 40 -3,93*

HCl 18 h + Pronase 45 min 1 8 45 18 40 14,77

17,04 ± 2,83 HCl 18 h + Pronase 45 min 2 8 45 18 40 16,13

HCl 18 h + Pronase 45 min 3 8 45 18 40 20,21

HCl 48 h + Pronase 45 min 1 8 45 48 40 15,32

18,16 ± 2,59 HCl 48 h + Pronase 45 min 2 8 45 48 40 20,41

HCl 48 h + Pronase 45 min 3 8 45 48 40 18,73

Rohament 18 h + Pronase 45 min 1 8 45 18 40 11,63

14,63 ± 2,73 Rohament 18 h + Pronase 45 min 2 8 45 18 40 16,96







Rohament 72 h + Pronase 45 min 3 8 45 72 40 0,10*

Legende: WH, Wiederholung. tE, Dauer der Enzymeinwirkung. TEV/tSV, Dauer der Vorbehandlung. TOH, Temperaturoptimum des Enzyms der Hydrolyse. DH, Hydrolysegrad. * Ausschluss eines Messwerts aufgrund fehlerhafter Temperaturführung während des Vorbehandlungsprozesses.

Anhang

320

Sensorik - Versuchsdaten

Tabelle A15: Versuchsdaten – Überprüfung auf Geschmacksblindheit

Teilnehmer GSA Anzahl Proben

erkannt nicht

erkannt Teilnehmer GSA

Anzahl Proben

erkannt nicht

erkannt

0

süß 3 2 1

12

süß 3 3 0

sauer 1 1 0 sauer 1 1 0

salzig 1 1 0 salzig 1 1 0

bitter 3 0 3 bitter 3 3 0

umami 2 0 2 umami 2 2 0

1

süß 3 3 0

13

süß 3 3 0





2

süß 3 3 0

14

süß 3 3 0





3

süß 3 3 0

15

süß 3 3 0





4

süß 3 3 0

16

süß 3 3 0





5

süß 3 3 0

17

süß 3 3 0





6

süß 3 2 1

18

süß 3 3 0





7

süß 3 3 0

19

süß 3 3 0





8

süß 3 3 0

20

süß 3 3 0





9

süß 3 3 0

21

süß 3 3 0





10

süß 3 3 0

22

süß 3 3 0





11

süß 3 3 0

23

süß 3 3 0





Legende: GSA, Geschmacksausprägung.

Anhang

321

Tabelle A16: Versuchsdaten – Prüfung zur Wahrnehmung eines Reizes

Teilnehmer GSA WH 1 WH 2 WH 3 Teilnehmer GSA WH 1 WH 2 WH 3

0

süß 1 1

12

süß 1 1 1

sauer 1 0 sauer 0 1 1

salzig 1 1 salzig 1 1 1

bitter 0 0 bitter 1 1 1

umami 0 1 umami 1 0 1

1

süß 1 1 1

13

süß 1 1 1





2

süß 1 1 1

14

süß 1 1 1





3

süß 1 1 1

15

süß 1 0 1





4

süß 1 1 1

16

süß 1 1 1





5

süß 1 1 0

17

süß 1 1 0





6

süß 1 0 1

18

süß 1 1 1





7

süß 1 1 1

19

süß 1 0 0





8

süß 1 1 0

20

süß 1 1 0





9

süß 1 1 1

21

süß 1 1 1





10

süß 1 1 1

22

süß 1 1 1





11

süß 1 1 1

23

süß 1 1 1





Legende: GSA, Geschmacksausprägung. WH, Wiederholung. 1, „ja, Reiz erkannt“. 2, „nein, Reiz nicht erkannt“.

Anhang

322

Tabelle A17: Versuchsdaten – Ermittlung der Reiz- & Erkennungsschwelle

WH 1 WH 2 WH 3 Teilnehmer GSA H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1

0

süß 1 1 2 3 3 4 5 6 7 0 0 0 0 1 2 2 3 4

sauer 1 1 1 2 3 4 5 6 7 0 0 0 1 2 3 3 4 4

salzig 2 2 3 3 3 4 5 6 7 1 1 1 1 1 1 1 2 3

bitter 1 1 1 2 3 3 4 5 5 0 0 2 2 2 2 2 3 3

umami 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 3 3 3

1

süß 1 2 2 2 2 3 3 4 5 0 0 0 0 0 2 3 4 5 0 0 1 1 1 2 3 4 5

sauer 2 2 3 4 5 6 7 8 9 0 0 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 4 5 5 6 7 8

salzig 1 2 3 3 4 5 6 7 8 0 2 2 2 3 4 5 6 7 0 2 3 4 5 6 7 8 9

bitter 1 1 2 2 3 3 3 4 5 1 2 3 3 3 4 5 5 6 0 2 2 3 4 4 5 6 7

umami 1 1 1 1 2 3 4 5 6 0 0 0 1 2 3 4 5 6 0 0 0 0 2 3 4 5 6

2

süß 1 2 3 3 4 4 5 6 6 0 1 1 2 3 4 4 5 6 0 0 0 0 0 0 0 2 2

sauer 1 1 1 2 2 3 3 4 5 0 1 1 2 3 4 5 5 6 2 3 4 5 6 6 7 8 9

salzig 0 1 1 2 3 4 4 5 6 1 1 1 2 2 3 4 4 5 0 2 2 3 3 4 5 5 6

bitter 1 2 2 3 4 4 4 5 5 1 2 3 3 4 4 4 5 6 0 1 2 3 3 4 5 6 7

umami 0 2 3 4 4 5 6 7 9 1 2 3 4 4 5 6 6 7 0 1 2 3 4 5 5 6 7

3

süß 0 0 0 0 1 1 2 3 4 0 0 0 0 0 2 3 3 4 0 1 1 2 3 4 5 6 6

sauer 0 1 1 2 3 4 5 6 7 0 0 0 2 2 3 4 5 6 0 2 3 4 4 5 5 6 6

salzig 0 0 1 1 2 3 4 5 6 0 0 0 1 1 2 2 3 4 0 0 1 2 2 3 4 5 6

bitter 0 1 2 3 4 4 5 6 7 0 2 3 4 4 4 5 6 6 1 2 2 3 3 4 5 6 6

umami 0 1 2 3 3 4 4 5 5 0 2 3 3 4 4 5 5 6 0 2 3 4 4 5 5 5 6

4

süß 0 0 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 0 0 0 1 2 3 0 0 1 1 1 2 3 4 5

sauer 0 0 0 1 2 3 3 4 4 0 0 0 1 2 3 4 4 4 0 2 2 3 4 4 5 5 6

salzig 0 0 1 1 2 2 2 3 4 0 0 1 1 2 2 3 3 4 0 0 1 2 2 3 3 4 5

bitter 0 0 0 0 1 1 1 2 2 0 0 0 1 2 2 2 3 4 0 0 0 0 1 1 2 2 3

umami 0 0 0 1 2 2 3 4 5 0 0 0 1 2 3 3 4 5 0 0 1 2 2 3 4 4 5

5

süß 0 0 1 1 1 1 2 3 4 0 0 0 2 2 3 4 4 5 0 1 1 1 2 2 2 3 4

sauer 0 0 2 2 3 4 5 6 7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9

salzig 0 0 1 2 2 3 4 5 6 0 1 1 2 3 4 5 6 7 1 1 1 2 3 4 5 6 7

bitter 1 1 2 2 2 3 3 4 4 0 0 1 2 3 4 4 5 6 0 0 2 2 3 4 5 6 7

umami 1 2 3 4 5 6 6 7 8 0 2 2 3 4 5 6 7 8 0 2 3 4 5 6 7 8 9

6

süß 0 1 1 1 1 1 1 2 3 0 1 1 1 1 1 1 1 2 0 0 1 1 1 1 1 2 3

sauer 0 1 1 2 3 4 5 6 7 1 1 2 3 4 5 5 5 6 0 2 2 3 3 3 4 4 4

salzig 0 2 2 2 3 4 4 4 5 0 2 2 3 4 5 6 7 8 0 1 1 1 1 2 3 4 5

bitter 0 0 0 1 1 1 1 1 2 0 0 0 2 2 3 4 4 4 0 0 0 0 1 1 1 1 2

umami 0 0 0 1 1 1 1 1 2 0 0 0 0 1 1 2 2 3 0 0 1 1 1 1 1 1 2

7

süß 0 0 2 2 2 3 3 4 4 0 0 1 2 2 2 3 4 5 1 1 1 2 2 3 4 5 6

sauer 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 3 3 4 5 6 7 7

salzig 0 1 2 2 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 2 3 4 5 6 7 8 9

bitter 1 1 2 2 3 3 4 5 6 2 3 4 5 5 6 7 8 9 0 2 3 4 5 6 7 8 9

umami 1 2 3 4 4 5 6 7 8 0 0 2 3 4 5 6 7 8 0 0 2 3 4 5 6 7 8

Anhang

323

Tabelle A18: Versuchsdaten – Ermittlung der Reiz- & Erkennungsschwelle – Fortsetzung

WH 1 WH 2 WH 3

Teilnehmer GSA H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1

8

süß 0 0 1 1 1 2 2 3 4 0 1 1 2 2 2 2 3 4 0 0 1 2 2 2 2 3 4

sauer 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0 0 2 3 4 5 6 6 0 2 3 4 5 6 7 8 9

salzig 0 0 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 1 2 3 3 4 5 0 0 0 0 0 2 2 3 4

bitter 0 0 1 2 2 3 3 3 4 0 0 1 1 1 2 2 3 3 0 1 2 2 3 4 5 6 7

umami 0 0 0 0 1 2 2 2 3 0 0 1 1 2 2 2 3 4 0 0 0 0 0 1 2 3 4

9

süß 0 0 2 2 2 3 4 5 6 0 0 0 0 0 2 3 4 5 0 0 1 1 2 3 3 4 5

sauer 2 2 3 4 5 5 5 6 7 0 0 2 3 4 4 4 5 6 0 2 2 3 4 4 5 5 5

salzig 0 1 2 3 4 5 5 6 7 0 0 0 0 2 3 4 4 5 0 0 0 1 1 2 3 4 5

bitter 2 2 3 3 3 3 4 5 5 0 2 3 3 4 4 5 5 6 0 2 3 3 3 3 3 4 5

umami 0 0 2 3 3 4 5 5 6 0 2 2 3 4 4 5 5 6 0 2 2 2 3 3 4 5 6

10

süß 0 0 1 1 1 2 2 3 4 0 1 1 1 1 2 3 4 5 0 1 1 2 3 3 3 4 5

sauer 0 1 1 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9

salzig 1 1 1 1 2 3 4 5 6 0 1 1 1 2 3 4 5 6 0 1 1 1 1 1 2 3 4

bitter 1 1 1 2 2 2 2 3 4 1 1 1 1 2 3 4 5 6 0 1 1 1 1 1 2 3 4

umami 0 1 1 1 2 3 4 5 6 0 0 1 1 2 3 4 5 6 0 0 0 0 1 1 1 2 3

11

süß 0 1 1 1 1 2 2 3 4 0 0 0 0 0 0 2 2 3 1 1 1 1 1 1 2 3 4

sauer 1 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 2 3 4 5 5 6 7 1 2 3 3 4 5 6 6 6

salzig 1 1 1 2 3 4 4 5 6 0 0 0 0 2 3 4 5 6 1 1 1 2 2 3 3 4 5

bitter 2 3 4 4 5 6 7 8 9 0 0 0 0 2 2 3 4 5 1 1 2 3 3 3 4 5 5

umami 2 3 4 5 6 7 7 8 9 0 2 2 2 2 2 2 2 3 0 2 2 3 4 5 5 6 7

12

süß 0 0 1 1 1 2 3 4 5 0 0 0 0 0 2 2 3 4 0 0 0 0 0 1 2 3 4

sauer 0 0 1 2 3 3 4 5 6 0 0 0 2 3 4 5 6 7 0 2 3 4 4 5 5 6 6

salzig 0 1 2 3 3 4 4 5 6 0 1 1 2 2 3 4 5 6 0 1 2 2 2 3 3 4 5

bitter 0 0 0 0 0 0 1 2 3 1 1 2 2 2 3 4 5 6 0 1 2 2 3 3 3 4 5

umami 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 0 0 0 0 0 1 1 2 0 0 0 0 1 2 2 2 3

13

süß 0 0 1 1 1 1 2 3 4 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 0 1 1 1 1 2 3 4

sauer 0 1 1 2 3 4 5 5 6 0 1 2 3 4 5 6 6 7 0 2 3 3 4 5 6 7 8

salzig 0 1 1 1 2 3 4 4 5 0 0 1 1 1 1 1 1 2 0 1 1 1 1 2 3 4 5

bitter 0 1 1 2 3 3 3 4 4 1 2 3 3 3 3 4 4 4 0 0 0 2 3 3 3 4 5

umami 0 0 0 1 1 1 1 2 3 0 0 0 0 1 1 2 3 3 0 0 1 1 1 2 3 3 4

14

süß 0 0 0 0 1 1 2 3 4 0 0 0 1 1 1 1 2 3 0 0 1 1 1 1 1 2 3

sauer 0 0 1 2 3 4 5 6 6 0 1 1 2 3 4 5 6 7 0 2 3 4 5 6 7 8 9

salzig 0 0 0 0 1 1 2 3 4 0 0 0 0 1 1 2 3 4 0 1 1 1 1 1 2 3 4

bitter 0 1 1 2 3 4 5 6 7 0 0 1 1 1 1 2 2 3 0 0 1 2 2 2 3 4 5

umami 0 0 0 2 3 3 3 4 5 0 0 0 2 2 3 4 5 6 0 0 0 2 3 3 3 4 4

15

süß 0 0 0 1 1 2 2 3 4 0 0 0 0 0 1 1 2 3 0 0 2 2 2 2 3 4 5

sauer 0 0 0 1 1 2 3 4 4 0 0 0 2 3 4 5 5 6 2 3 4 4 5 5 6 7 7

salzig 0 1 1 2 3 3 4 4 5 0 0 1 2 2 3 3 4 5 0 0 0 2 3 3 4 5 6

bitter 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 2 2 1 2 2 3 3 3 4 4 4

umami 0 0 1 1 1 2 2 3 4 0 0 0 1 2 2 2 3 3 0 0 0 0 0 2 2 3 3

Anhang

324

Tabelle A19: Versuchsdaten – Ermittlung der Reiz- & Erkennungsschwelle – Fortsetzung

WH 1 WH 2 WH 3

Teilnehmer GSA H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1 H2O D8 D7 D6 D5 D4 D3 D2 D1

16

süß 0 0 0 0 1 2 2 3 4 0 0 0 0 2 2 2 3 4 0 0 0 1 1 1 2 3 4

sauer 0 0 2 2 3 3 4 4 5 0 0 2 2 3 4 5 6 7 0 2 2 3 4 5 5 5 6

salzig 0 2 2 2 3 3 3 4 5 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 2 2 3 4

bitter 0 0 0 0 0 0 2 2 2 0 0 0 2 2 3 3 3 3 0 2 3 3 4 4 4 4 5

umami 0 0 0 0 2 2 3 3 4 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 2 2 3 4

17

süß 0 0 0 0 2 2 3 3 4 0 0 0 0 2 3 3 4 5 0 0 0 2 2 2 3 3 4

sauer 0 0 2 3 4 4 5 6 6 0 0 0 2 3 4 5 6 7 2 3 3 4 5 5 6 7 8

salzig 0 0 0 2 3 3 4 5 6 0 0 0 0 2 3 4 5 6 1 2 2 2 3 3 4 5 6

bitter 0 2 2 2 2 3 3 3 4 0 0 0 0 2 2 3 3 4 0 2 2 3 4 5 6 7 8

umami 0 0 2 2 3 4 5 6 7 0 0 2 3 4 5 5 6 7 0 0 0 0 1 2 3 4 5

18

süß 1 1 1 1 1 1 2 3 4 0 0 1 1 1 1 1 2 3 1 1 1 1 1 1 2 3 4

sauer 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 2 3 3 4 4 5 0 2 2 3 3 3 4 4 6

salzig 0 2 2 3 3 4 5 5 6 0 1 1 2 2 3 3 4 5 0 0 1 2 3 3 4 4 5

bitter 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 1 2 2 0 1 2 3 3 3 4 5 5

umami 0 1 1 2 2 3 4 5 5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 3 3 3 4 5 5

19

süß 0 1 1 2 2 2 2 3 4 0 0 1 1 2 3 3 4 5 0 1 1 1 1 1 1 2 3

sauer 0 0 1 1 2 3 4 4 4 0 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 2 3 4 4 4 5 5

salzig 0 1 2 2 3 3 3 4 4 0 2 2 3 4 4 5 5 6 0 2 2 2 3 3 4 4 4

bitter 0 1 1 2 3 3 3 4 5 1 1 2 3 4 4 5 5 6 0 2 2 3 4 4 4 5 5

umami 0 2 2 2 2 3 4 4 4 0 0 1 2 2 3 4 4 5 0 0 1 1 2 3 4 4 5

20

süß 0 0 0 1 1 2 3 3 4 0 1 1 2 2 2 2 3 4 0 1 1 1 2 2 2 3 3

sauer 0 0 1 2 2 3 3 4 4 0 2 2 3 3 3 4 4 4 0 2 3 3 4 4 4 5 5

salzig 1 1 1 1 1 2 2 3 4 0 1 2 2 3 3 4 5 6 0 1 1 1 2 3 4 4 5

bitter 0 2 3 3 3 3 4 5 5 0 1 2 2 2 3 3 4 5 0 0 1 2 2 3 4 5 5

umami 1 1 2 2 3 3 4 4 5 0 0 0 0 2 2 3 4 5 1 1 1 2 3 3 4 4 5

21

süß 0 1 1 1 1 1 2 3 4 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 1 1 1 2 2 3 3

sauer 0 0 0 2 3 4 4 5 5 0 0 1 2 3 3 4 4 5 0 2 3 3 4 4 4 5 5

salzig 0 0 1 1 2 3 3 3 4 0 1 2 2 2 2 2 3 3 0 1 1 1 2 3 3 4 4

bitter 0 1 1 2 3 3 4 5 5 0 1 2 2 3 3 4 4 4 0 1 2 3 3 4 4 5 6

umami 0 1 1 2 2 3 3 4 4 1 1 1 1 2 2 3 4 5 0 0 0 1 1 1 2 3 4

22

süß 0 0 0 0 2 3 3 4 5 0 1 1 1 1 1 1 1 2 0 0 0 1 1 1 2 3 4

sauer 1 1 1 2 3 4 5 5 6 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 2 3 4 5 6 7 8 9

salzig 0 1 1 1 1 2 3 4 5 0 1 1 1 2 3 4 5 6 0 0 1 2 2 3 4 5 6

bitter 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 8

umami 1 1 1 2 2 3 4 5 5 0 1 1 1 2 3 4 5 6 0 0 0 0 0 1 2 3 4

23

süß 1 1 1 1 1 1 1 2 3 0 1 1 2 2 2 3 4 5 0 0 0 1 1 2 3 4 5

sauer 0 0 0 1 2 3 4 5 6 1 1 2 3 4 5 6 7 7 1 2 3 4 4 5 5 6 7

salzig 0 0 1 2 3 4 5 6 7 0 0 1 2 2 3 4 5 6 1 1 2 3 3 4 5 5 6

bitter 0 0 0 0 2 3 4 5 6 0 0 0 0 1 1 1 2 3 0 0 1 2 2 2 3 3 4

umami 1 1 1 1 1 2 3 4 5 0 0 1 2 2 3 4 4 5 0 1 2 2 2 3 4 5 6

Anhang

325

Tabelle A20: Versuchsdaten – Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines

Reizes

WH 1 WH 2 WH 3 Teilnehmer GSA D7 D5 D3 D1 D7 D5 D3 D1 D7 D5 D3 D1

0

süß

sauer

salzig

bitter

umami

1

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0

sauer 1,0 2,0 3,5 3,5 3,0 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,5 3,5

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 2,0 1,0 4,0 3,0 2,0 4,0 3,0 1,0 3,0 2,0 1,0 4,0

umami 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

2

süß 1,0 2,0 3,0 4,0 3,0 1,5 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 3,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,5 4,0 2,5 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 3,0 4,0 2,0

umami 1,0 2,0 3,5 3,5 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

3

süß 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 3,0 1,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 4,0 3,0 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 4,0 3,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 3,5 3,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

4

süß 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 2,5 2,5 1,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 2,0 1,0 4,0 3,0 1,0 3,5 3,5 2,0 1,0 3,0 2,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

5

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 4,0 3,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,5 3,0 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 4,0 2,0 1,0 3,0 2,0 4,0 1,0 3,0 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 3,0 2,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 3,0 1,0 2,0 4,0

6

süß 3,0 1,0 2,0 4,0 1,5 3,0 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 4,0 2,0 3,0 3,0 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 3,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 3,0 2,0 1,0 4,0 3,0 4,0 2,0 1,0 2,0 1,0 4,0 3,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

7

süß 3,0 1,0 2,0 4,0 1,5 3,0 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 2,0 3,0 1,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 4,0 3,0

salzig 1,0 3,0 2,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 3,0 1,0 2,0 4,0 4,0 3,0 2,0 1,0 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 4,0 2,0 3,0 1,0 3,0 2,0 4,0

8

süß 3,0 1,5 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,5 2,5 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,5 2,5 4,0 2,5 4,0 1,0 2,5 1,0 3,0 2,0 4,0

umami 1,5 4,0 1,5 3,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

9

süß 3,0 2,0 1,0 4,0 1,0 2,0 4,0 3,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,5 3,5 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0

salzig 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 2,0 3,0 4,0 1,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 3,0 4,0 1,0 2,0 2,5 1,0 2,5 4,0

umami 1,0 2,0 3,5 3,5 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0

10

süß 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 2,5 1,0 2,5 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0

salzig 1,0 2,5 2,5 4,0 3,0 1,5 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 3,0 1,0 2,0 4,0 2,5 2,5 1,0 4,0 3,0 2,0 4,0 1,0

umami 1,0 2,5 4,0 2,5 1,0 2,5 2,5 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

11

süß 1,0 2,0 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

sauer 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 4,0 3,0

salzig 1,5 3,0 1,5 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,5 3,0 1,5 4,0 1,0 2,5 4,0 2,5 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Legende: GSA, Geschmacksausprägung. WH, Wiederholung.

Anhang

326

Tabelle A21: Versuchsdaten – Prüfung zur Unterscheidung von Intensitätsstufen eines Reizes – Fortsetzung

WH 1 WH 2 WH 3

Teilnehmer GSA D7 D5 D3 D1 D7 D5 D3 D1 D7 D5 D3 D1

12

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,5 3,5 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,5 4,0 2,5 2,5 1,0 2,5 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

umami 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 4,0 3,0 2,0 1,0 3,0 4,0

13

süß 3,0 1,5 1,5 4,0 2,5 1,0 2,5 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 3,0 1,0 4,0 2,0 2,5 1,0 4,0 2,5

umami 1,0 2,5 2,5 4,0 1,5 4,0 3,0 1,5 1,0 2,0 3,0 4,0

14

süß 3,0 1,5 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 4,0 3,0 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

15

süß 2,0 1,0 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0

sauer 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 4,0 3,0 1,0 3,0 3,0 3,0 1,0 3,0 2,0 4,0

umami 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 3,0 1,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

16

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 3,0 1,5 1,5 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,5 3,0 1,5 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 3,0 1,5 4,0 1,5 3,5 1,5 3,5 1,5

umami 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0

17

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

sauer 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,5 1,5 4,0 3,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,5 2,5 4,0 3,0 1,0 2,0 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

18

süß 1,0 2,5 2,5 4,0 3,0 1,5 1,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 2,5 1,0 2,5 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,5 3,0 1,5 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

umami 1,5 1,5 3,5 3,5 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

19

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

20

süß 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 4,0 3,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0

21

süß 2,0 2,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

sauer 2,5 1,0 2,5 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,5 4,0 2,5 1,0 2,0 3,0 4,0

umami 1,0 2,0 4,0 3,0 1,5 1,5 3,5 3,5 1,0 2,0 3,0 4,0

22

süß 2,0 2,0 2,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

sauer 1,0 2,5 2,5 4,0 3,0 1,0 2,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,5 1,5 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,5 1,5 3,0 4,0

umami 2,0 1,0 4,0 3,0 1,0 3,0 4,0 2,0 1,0 2,0 3,0 4,0

23

süß 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 4,0 3,0 2,0 1,0 3,0 4,0

sauer 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 1,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

salzig 1,5 1,5 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0

bitter 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,5 2,5 4,0 1,0 3,0 2,0 4,0

umami 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 2,0 3,0 4,0 2,0 2,0 2,0 4,0

Legende: GSA, Geschmacksausprägung. WH, Wiederholung.

Anhang

327

Tabelle A22: Versuchsdaten – Schulung zur Anwendung der Skale

Intensität "schwach" "mittel "stark" Teilnehmer WH 1 WH 2 WH 3 WH 1 WH 2 WH 3 WH 1 WH 2 WH 3

0

1 2 4 3 3 6 4 7 2 7

2 1 3 2 4 4 4 7 6 6

3 3 3 3 4 4 4 6 5 5

4 1 4 3 3 3 5 7 5 6

5 3 4 2 4 3 4 6 7 6

6 4 2 2 2 4 4 5 6 5

7 4 2 2 2 4 4 5 6 6

8 3 3 2 6 2 4 7 5 6

9 3 2 3 4 4 5 5 6 6

10 1 3 4 3 2 3 6 5 5

11 2 3 3 3 5 4 7 4 5

12 2 1 2 3 2 5 6 5 6

13 1 1 1 2 2 4 3 6 6

14 1 3 2 3 2 3 5 6 6

15 3 2 1 2 4 4 5 6 6

16 1 2 3 1 5 4

17 1 2 2 3 3 4 5 6 6

18 1 3 2 3 1 5 6 5 6

19 2 2 3 3 4 6 6 6 4

20 1 1 2 2 4 4 6 6 5

21 1 2 2 3 4 4 4 5 7

22 3 2 2 4 3 3 5 5 4

23 1 4 4 4 2 5 5 6 6

Legende: WH, Wiederholung.

Anhang

328

Tabelle A23: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Molkenprotein-Isolat

Teilnehmer 1

GSA süß sauer salzig bitter umami

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 2 0 1 2 3 5 0 0 0 4 5

Per. 2 1 0 1 0 0 6 0 3 4 3 0 6 0 6

"bitter" 0 0 0 1 1 1 3 2 0 5 7 6 0 0 0

Per. + "bitter" 2 0 0 2 0 1 7 3 2 6 0 0 7 6 6

Teilnehmer 2


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 0 0 2 0 0 2 1 1 0 2 2 0 1 0

Per. 2 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 2 0 0

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 2 3 0 0

Per. + "bitter" 0 1 0 0 0 1 0 0 0 3 2 2 2 0 2

Teilnehmer 3


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 2 1 0 0 0 2 1 1 1 0 0 4 3 1

Per. 0 2 1 0 0 0 1 2 0 0 1 0 4 1 2

"bitter" 0 0 0 0 0 0 2 1 1 5 4 1 0 0 0

Per. + "bitter" 1 2 0 0 1 0 3 1 1 3 1 1 1 0 0

Teilnehmer 4


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 1 1 0 0 0 0 1 0 2 1 2 0 0 1

Per. 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 2 1 0 2 0

"bitter" 0 0 0 0 0 1 0 0 0 3 2 3 0 0 1

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 1 2 1 1 2

Teilnehmer 5


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 4 1 3 0 0 0 2 1 2 3 0 0 5 2 2

Per. 1 1 0 0 1 1 4 4 2 0 0 0 5 2 1

"bitter" 0 1 0 1 0 1 1 0 0 3 3 3 3 0 0

Per. + "bitter" 0 3 4 0 0 0 4 1 0 4 1 2 2 2 1

Teilnehmer 6


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 3 3

Per. 0 0 2 0 0 0 3 3 0 1 1 1 0 2 3

"bitter" 0 0 0 0 0 2 0 0 0 3 5 3 1 0 0

Per. + "bitter" 0 0 2 0 0 2 3 2 0 4 5 2 0 3 4

Teilnehmer 7


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 3 0 3 1 1 5 4 5 4 2 0 3 5

Per. 3 6 3 2 1 2 5 3 5 4 2 2 6 4 6

"bitter" 0 1 1 1 3 0 2 4 2 5 6 6 1 2 2

Per. + "bitter" 4 5 4 4 2 1 6 3 2 5 2 4 6 3 3

Legende: GSA, Geschmacksausprägung. WH, Wiederholung. Ret., Retentat. Per., Permeat.

Anhang

329

Tabelle A24: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Molkenprotein-Isolat – Fortsetzung

Teilnehmer 8


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 0 2 3 0 0 1 2 5 6

Per. 0 2 0 0 2 0 2 1 2 0 0 0 2 4 7

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 6 3 0 0 1

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 2 3 4 0 2 2 4 4 7

Teilnehmer 9


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 3 2 0 2 2 2 0 0 3 0 0 0 0 4

Per. 0 3 1 0 0 0 2 2 1 3 0 0 0 0 3

"bitter" 0 1 0 5 1 3 0 0 0 2 4 4 0 0 0

Per. + "bitter" 1 2 1 0 0 0 0 2 1 1 0 4 1 0 4

Teilnehmer 10


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 3 2 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

Per. 2 0 3 0 1 0 0 3 0 1 1 0 0 1 0

"bitter" 0 0 0 1 0 3 0 0 0 4 4 2 2 1 0

Per. + "bitter" 2 2 3 1 1 1 2 0 0 0 2 0 0 0 0

Teilnehmer 11


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 0 0 0 0 0 0 0 2 1 1 1 1 0 2

Per. 1 2 2 0 3 1 0 4 1 1 1 0 1 0 0

"bitter" 2 2 2 2 2 2 1 1 1 4 1 3 2 0 2

Per. + "bitter" 1 1 1 0 0 1 0 2 2 0 3 3 1 2 3

Teilnehmer 12


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 4 0 1 3 0 0 4 2 1 1 3 1 1 4 5

Per. 2 0 1 1 1 2 3 1 1 1 3 1 4 6 5

"bitter" 2 0 0 1 0 1 3 1 0 5 6 5 3 1 3

Per. + "bitter" 1 0 0 3 0 0 3 3 2 5 7 4 5 6 6

Teilnehmer 13


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 1 0 2 0 1 0 1 1 4

Per. 0 1 0 0 0 0 1 2 0 1 0 0 2 1 2

"bitter" 0 0 0 1 1 1 0 0 0 4 3 3 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 3 4 3 2

Teilnehmer 14


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 3 0 2 2

Per. 0 0 0 0 1 0 0 2 1 0 0 0 3 4 2

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4 3 0 1 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 3 5 3 3


Anhang

330


Teilnehmer 15


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0

Per. 0 0 0 1 0 1 0 3 1 0 0 0 0 0 0

"bitter" 0 0 0 0 1 0 0 0 0 2 3 5 0 0 2

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 2 2 3 0 1 3 1 0 0 0

Teilnehmer 16


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 0 1 0 0 2 0 1 1 2 2 0 0 3

Per. 0 0 0 0 2 0 1 0 1 2 0 0 0 2 2

"bitter" 0 0 0 0 0 1 0 0 0 2 0 1 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 2 2 0 2 3

Teilnehmer 17


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 0 0 2 0 0 3 1 0 0 0 0 0 0 1

Per. 0 0 0 0 0 0 2 3 1 3 0 0 0 3 1

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 3 2 1 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 0 1 0 2 3 1 3 1 2

Teilnehmer 18


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 4 4 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0

Per. 0 4 4 1 0 1 3 2 2 0 0 1 2 0 0

"bitter" 0 0 0 0 3 1 1 5 0 4 4 3 5 2 4

Per. + "bitter" 1 0 0 3 3 2 1 5 2 4 5 5 1 6 4

Teilnehmer 19


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2 0 0

Per. 0 2 0 0 0 0 2 2 1 0 0 0 2 1 1

"bitter" 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 3 0 0 0

Per. + "bitter" 1 2 0 0 0 0 3 1 1 3 4 3 1 0 1

Teilnehmer 20


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 2 3 2

Per. 0 1 0 0 1 0 1 2 1 0 0 0 2 2 2

"bitter" 0 1 1 1 0 0 0 0 1 3 3 2 1 2 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 1 0 0 2 1 2 1 2 2 2 3

Teilnehmer 21


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 1 2 0 0 0 0 0 0 0 3 0 2 0 0

Per. 0 4 1 0 0 0 1 5 2 2 0 2 0 0 0

"bitter" 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 5 5 0 0 0

Per. + "bitter" 0 3 0 0 0 0 3 5 5 3 5 6 0 0 0


Anhang

331


Teilnehmer 22


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0

Per. 0 0 0 0 0 0 1 2 1 0 0 0 0 2 0

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 2 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 1 0 0 2 0

Teilnehmer 23


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 2 2 0 3 0 3 3 0 3 0 1 5 5 6

Per. 1 3 2 2 4 4 2 5 2 0 1 0 4 5 4

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 3 0 2 6 5 5 2 0

Per. + "bitter" 0 1 0 1 3 3 4 5 5 3 1 1 4 5 5


Anhang

332

Tabelle A27: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Alge (Chlorella vulgaris)

Teilnehmer 1


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 7 2 0 0 0 0 3 0 1 4 5 2 0 3 5

Per. 0 0 1 0 1 0 7 4 2 4 0 0 4 7 5

"bitter" 0 1 0 1 0 1 0 0 0 7 5 4 1 2 3

Per. + "bitter" 0 0 0 2 0 0 4 5 2 5 2 1 4 4 6

Teilnehmer 2


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 1 0 2 0 1 2 0 0 0 0 2 0 0 0

Per. 1 0 2 0 0 2 2 1 0 0 1 1 1 1 0

"bitter" 0 0 0 0 0 1 0 0 1 3 2 3 1 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 1 3 0 1 2 0 1 1 1 3

Teilnehmer 3


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 3 2 2 1 0 0 2 1 1 0 0 0 2 2 0

Per. 1 0 1 1 1 0 4 1 0 1 1 0 2 2 0

"bitter" 1 0 0 0 1 1 2 2 1 5 3 3 0 0 0

Per. + "bitter" 2 0 1 1 1 0 3 2 2 3 4 0 0 0 0

Teilnehmer 4


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 2 1 1 1

Per. 0 0 0 0 0 0 3 0 2 1 2 0 2 2 1

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 3 2 1 2 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 1 1 1 1 3 1 3 1 2 2

Teilnehmer 5


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 3 0 0 0 3 0 1 0 0 0 2 2 2

Per. 3 2 0 0 0 0 6 0 3 0 0 0 0 2 3

"bitter" 0 0 1 0 0 0 0 0 0 5 3 5 0 2 0

Per. + "bitter" 0 1 1 0 0 0 5 1 3 1 0 0 2 2 1

Teilnehmer 6


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 1 0 0 0 4 2 3 1 1 1 3 2 2

Per. 0 1 1 0 0 2 5 1 0 2 0 1 1 3 2

"bitter" 0 0 0 2 0 0 0 0 0 3 3 2 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 3 0 0 0 5 1 2 2 2 4 0 3 5

Teilnehmer 7


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 7 4 2 1 2 1 3 6 4 4 2 3 0 5 6

Per. 2 4 4 6 1 2 5 3 5 3 1 4 3 3 3

"bitter" 0 0 1 1 1 1 0 5 2 7 2 6 1 2 2

Per. + "bitter" 2 2 4 5 1 1 3 6 2 6 5 3 3 5 6


Anhang

333

Tabelle A28: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Alge (Chlorella vulgaris) - Fortsetzung

Teilnehmer 8


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 0 0 0 0 1 1 3 0 0 0 3 4 5

Per. 0 0 0 0 0 0 0 3 4 0 0 0 6 6 6

"bitter" 0 0 0 0 0 2 1 0 1 5 4 3 1 0 3

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 3 2 4 1 2 4 6 5 7

Teilnehmer 9


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 1 0 0 0 0 3 1 1 0 0 0 2 3 3

Per. 0 3 2 0 0 0 3 0 0 0 0 0 2 3 4

"bitter" 0 1 0 2 1 2 0 0 0 2 0 1 0 0 0

Per. + "bitter" 2 0 2 1 2 0 1 2 2 0 0 0 2 4 4

Teilnehmer 10


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 3 2 1 0 1 0 3 1 1 0 0 0 0 0 3

Per. 2 3 2 1 0 3 5 1 0 1 0 0 1 0 1

"bitter" 0 1 0 0 0 0 1 0 0 5 3 4 0 1 1

Per. + "bitter" 0 2 2 4 0 2 3 0 0 1 0 1 0 2 1

Teilnehmer 11


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 2 0 2 0 2 4 1 1 0 1 1 3 2 0

Per. 1 3 2 3 2 1 5 0 0 0 1 0 4 1 1

"bitter" 0 1 1 0 1 0 1 1 1 5 2 3 2 1 0

Per. + "bitter" 0 2 2 3 0 2 6 0 3 3 3 2 2 3 1

Teilnehmer 12


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 0 0 3 0 0 4 2 0 4 1 1 6 4 3

Per. 0 1 1 1 0 1 3 3 2 3 1 1 4 5 6

"bitter" 0 0 0 1 0 0 3 2 0 4 5 3 2 3 1

Per. + "bitter" 0 1 0 0 0 0 3 1 2 4 6 5 6 3 7

Teilnehmer 13


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 2 2 1

Per. 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 2 2

"bitter" 0 0 0 2 1 1 0 0 0 1 2 4 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 2 1 3 2 1 0 2 1 4

Teilnehmer 14


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 4 4 4

Per. 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 3

"bitter" 1 0 0 0 0 0 0 0 0 4 1 1 0 0 4

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 2 4 2 2 4 3 5


Anhang

334

Tabelle A29: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Alge (Chlorella vulgaris) – Fortsetzung

Teilnehmer 15


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Per. 0 1 1 2 0 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0

"bitter" 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0

Per. + "bitter" 1 1 1 0 0 0 0 1 0 4 0 2 0 0 0

Teilnehmer 16


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 3 0 0 3 1 2 1 2 2

Per. 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 2 1 0 2 3

"bitter" 0 0 0 1 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 1 0 1 1 1 2 2 3 0 0 1 3

Teilnehmer 17


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 3 2 1 1 1 0 2 1 1

Per. 0 0 1 0 0 0 2 3 0 3 0 0 5 2 3

"bitter" 0 0 0 1 0 0 0 1 0 5 3 3 0 0 1

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 2 1 3 3 0 0 4 2 3

Teilnehmer 18


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 3 0 3 2 1 1 0 2 0 1 1 1 0 1 0

Per. 2 0 3 0 2 1 1 3 4 1 0 1 0 0 0

"bitter" 0 0 0 1 3 3 0 0 2 3 4 4 4 2 5

Per. + "bitter" 0 1 1 2 1 2 1 0 5 4 3 4 4 2 2

Teilnehmer 19


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 2

Per. 1 0 0 0 0 0 2 4 2 0 0 0 2 2 1

"bitter" 0 0 0 1 0 0 0 0 0 4 4 3 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 3 0 2 1 1

Teilnehmer 20


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 1 0 1 0 1 1 1 2 2 0 1 0 4 3

Per. 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 3 4

"bitter" 0 0 0 2 1 1 0 0 0 2 3 3 0 1 0

Per. + "bitter" 0 0 1 0 0 0 1 1 2 1 3 1 2 3 2

Teilnehmer 21


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 1 1 1 0 0 3 0 2 0 0 0 1 0 0 0

Per. 2 3 1 0 0 0 2 0 3 0 0 3 0 1 0

"bitter" 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 2 6 0 0 0

Per. + "bitter" 0 1 0 0 0 3 4 4 3 1 0 5 2 0 0


Anhang

335

Tabelle A30: Versuchsdaten – Sensorische Bewertung der Fraktionen – Alge (Chlorella vulgaris) – Fortsetzung

Teilnehmer 22


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1

Per. 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0

"bitter" 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

Per. + "bitter" 0 0 0 0 0 0 1 2 1 0 0 0 1 2 1

Teilnehmer 23


WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

WH 1

WH 2

WH 3

Ret. 2 1 0 3 0 0 0 2 3 1 1 0 4 5 6

Per. 2 0 3 3 1 3 4 5 6 0 0 0 4 4 4

"bitter" 2 0 0 0 0 0 0 2 3 5 4 5 4 2 0

Per. + "bitter" 2 0 2 0 2 0 6 5 4 2 2 2 5 3 6

Publikationsliste

336

Publikationsliste

Teile dieser Arbeit wurde bereits veröffentlicht:

Vorträge :

Friedrich, Markus (2015): Erzeugung von Peptidfraktionen per Cross-Flow Diafiltration. „Tag

der Forschung“ des Fachbereich „Lebensmitteltechnologie“ der Hochschule Fulda, Fulda,

04.11.2015.