metode de ggstudiu a genelor

8/18/2019 Metode de ggStudiu a Genelor

http://slidepdf.com/reader/full/metode-de-ggstudiu-a-genelor 1/55

Metode deanaliză a genelor



Expresia genelor

ADN

ARNm

Proteină

Caracter 5’-ATTGCAAGATTACCATGT-’ Catena codogenă !netranscrisă"

’-TAACGTTCTAATGGTACA-5’ Catena anticodogenă !transcrisă"

Transcripţie

5’-A##GCAAGA##ACCA#G#-’ ARNm

Translaţie

$e% & Ala & Arg & $e% & Pro & C's polipeptid

Maturizare

Caracter (enotipic normal



Expresia genelor

ADNm%t

ARNmm%t

Proteinăan

Caracter an

5’-ATTACAAGATTACCATGT-’ m%ta)ie G*+A’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’

Transcripţie

5’-A##ACAAGA##ACCA#G#-’ ARNmm%t

Translaţie

$e% & T,r & Arg & $e% & Pro & C's polipeptidan

Caracter (enotipic anormal



Analiza genelor

ec.en)iere

PCR

o%t,ern-/lot

0i/ridare in situ

ADN ProteineARN

Nort,ern-/lot

RT&PCR

0i/ridare in situ

1estern-/lot

ec.en)iere

Analiza (%nc)iei

Analiza,istoc,imică



2/)inerea 3R & (ragmentelor de restric)ie prinac)i%nea speci(ică a ER !enzimelor de restric)ie"



RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z



M

-

4

6 7/

8 7/

9 7/

* 7/

: 7/

: 7/

6 7/

9 7/

5 7/

:;5 7/

:;5 7/

6 7/

9 7/

5 7/



Etapele te,nicii PCR

• Denat%rarea ADN la <9oC

A= Pregătirea amestec%l%i c% toate componentele reactant

• Răcirea p>nă la temperat%ra de renat%rare a primerilor • Elongarea catenelor ADN la ?:oC

@= Repetarea a%tomată a proced%rilor de denat%rare-renat%rare-elongare de 6-5 ori

C= Analiza prod%ilor PCR - electro(oreza

- colorarea - interpretarea rez%ltatelor



Extragerea ADN Pregătireacomponentelor pentr%

PCR

Ampli(icarea

ADN-)intă

Electro(oreza

prod%ilor PCR

Colorarea i

.iz%alizarea prod%ilorPCR

Bnterpretarea

rez%ltatelor



Identificarea inserţiilor / deleţiilor



Identificarea mutaţiilor punctiforme



Identificarea agenţilor infecţioşi



Stabilirea paternităţii filiaţiei!



Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

"ependenţa cantităţii de produse amplificate de concentraţia #"$ genomic utili%ată &n P'R(S)a utili%at #"$ &n cantitate de* + – ,-. g- 0 – ,-0. g- 1 – ,-+ g- 2 – ,-,0 g

'oncentraţiile critice ale substanţelor pentru in3ibarea acti4ităţii 5a6)polimera%ei

Substanţa 'oncentraţia critică

SDS >0.005% (m/v)

Fenol >0.2% (v/v)

Etanol >1% (v/v)

Isopropanol >1% (v/v)

CH3COOa >5 m!

aCl >25 m!

ED"# >0.5 m!



Optimizarea condiţiilor dedesfăşurare a PCR

'aracteristica primerilor utili%aţi &n P'R

7ena Sec4enţa Lungimea- ba%e 8 79' 5m- o'

#': 5$C"&&#&#CC#C"CCC#"CC"""C"3$ 2' 5' 5

5$&#"&"&&CC#"C#C#""C&"C#&#"3$ 25 ' 5

#5+ R 5$C"&&C"CC""&C"&&"&"&&3$ 20 *5 5

5$&&&C##&C&"#"#""""C"&&"&3$ 23 ' 55

$;S 5+##&&C#&&#&#C#&"&&#"&&#3+ 22 55 5,

5+CCC#&"C##"CCC"""&&"&C"C#3+ 2' 5' 5

"ependenţa cantităţii produselor P'R de temperatura de renaturare a primerilor(<n condiţiile P'R s)a utili%at* + – to' optimală ).o'= 0 – to' optimală= 1 – to' optimală 9.o'(



Optimizarea condiţiilor de desfăşurare a PCR

"ependenţa cantităţii produselor P'R de concentraţia ionilor >g09(

'oncentraţia utili%ată de >g'l0* + – 0-.m>= 0 – .m>(

"ependenţa cantităţii de #"$ amplificat de numărul de cicluri P'R(+ – 1, cicluri= 0 – 1. cicluri= 3 – 40 cicluri.



Analiza polimorfismului I/D pentru ena AC!

#nali%a electroforetică &n gel de agaro%ă de 08 a produselor P'R re%ultatedin amplificarea #"$ uman cu primeri corespun%ători genei #':(

> – marc3er al lungimii= + – genotip I/"= 0 – genotip "/"= 1 – genotip I/I(

I

D



Analiza polimorfismului "/T pentru ena #O$

! 1 2 3

Re%ultatele amplificării #"$ uman cu primeri corespun%ători genei $;S(> – marc3er al lungimii= + – genotip 7/7= 0 – genotip 5/5= 1 – genotip 7/5(

G

T



Analiza polimorfismului A/C pentru ena AT% R

Re%ultatele amplificării #"$ uman cu primeri corespun%ătorigenei #5+ R digerate cu a?utorul en%imei "de I(

> – marc3er al lungimii= + – genotip #/#= 0 – genotip #/'

A

C



Te&nica Real'time'PCR



ARM$'PCR



5e3nica Sout3ern)blot

:@tragerea #"$ Restriţia #"$ :lectrofore%a #"$

"enaturarea şitransferul #"$pe membrane

#utoradiografiaAibridare cu sonda

Bi%uali%area şiinterpretarea

re%ultatelor



R()Ps şi analiza enotipului

!lectroforeza (R a * persoane A+, şi C

Alela #ormală cu * $R Alela mutantă cu - $R+ mutaţie .n $R-

@ !Nm"

C !mm"

A !NN"



5e3nica $ort3ern)blot

:@tragerea #R$ :lectrofore%a #R$

5ransferul #R$pe membrane

#utoradiografiaAibridare cu sonda

Bi%uali%area şiinterpretarea

re%ultatelor



Bdenti(icarea ni.el%l%ide expresie i a .arianteide splicing



5’-ATTACAAGATTACCATGT-’ catena codogenă’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’ catena anticodogenă matriţă0

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTAC-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACAA-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACAAG-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACAAGA-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACAAGATT-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACA-’

’-TAATGTTCTAATGGTACA-5’5’-ATTACAAGAT-’

A; T; C; T & ddNTP !:’;’-ddNTP"

pentru stoparea sintezei

5’-ATTA -- primer marcat P*-

pentru AD#'polimerază

A; T; C; T & dNTP !:’-dNTP"pentru sinteza noilor catene

5’-ATTACA-’



5’-ATTACAA-’

5’-ATTACAAG-’

5’-ATTACAAGA-’

5’-ATTACAAGATT-’

5 -ATTACA-

5’-ATTACAAGAT-’

5’-ATTACAAGATTA-’

5’-ATTACAAGATTACCA-’

5’-ATTACAAGATTACCAT-’

5’-ATTACAAGATTACCATG-’

5’-ATTACAAGATTACCATGT-’

1

'A T C G

5’-ATTAC-’

5’-ATTACAAGATTAC-’

5’-ATTACAAGATTACC-’ 5’-ATTACAAGATTACCATGT-’

#

5

7

'



'



1

10 23 TAAATGGCTA4444444*3'0

Metoda a%tomată



Metoda a%tomată



0i/ridarea in situ c%%tilizarea preparatelor

de cromozomi meta(azici

0i/ridarea in situ c%%tilizarea preparatelor

c% n%clei inter(azici

0i/ridarea in situ pentr%depistarea sec.en)elor ADN

Aib id i it



Aibridareain situ

cuutili%area probei sens stCnga!şi antisens dreapta!

Aibridarea in situ pentru depistareasec4enţelor #R$

#nali%a3istoc3imică –identificarea

proteinelor &n ţesut

metode de ggstudiu a genelor

Documents