METODE PENELITIAN

1. Bahan dan Alat Penelitian

a. Bahan

Asetaminophen standar BPFI, Tramadol HCl standar BPFI. Bahan pelarut

dan fase gerak (methanol, aquabidest) yang digunakan untuk analisis HPLC

digunakan bahan dengan mutu pro HPLC dari E. Merck selanjutnya bahan kimia

lain bila tidak disebutkan digunakan mutu dan produk yang sama.

Tablet yang mengandung asetaminophen 325 mg dan tramadol 37,5 mg

dibeli di apotik dengan nama: Ultracet (Janssen-cilag), Patral (Mahakam Beta

Farma), dan Acetram (Pharos). Sampel tablet untuk aplikasi penetapan kadar

asetaminophen dan tramadol HCl secara simultan diperoleh dalam periode bulan

Januari 2014.

b. Alat

HPLC dari Shimadzu type LC-10AD dengan kolom oktadesisilan (ODS 4,6

x 25 mm), membrane filter berukuran 0,45 µm, ultrasonic, Neraca Analitik O-

Haus Adventurer (d = 0,0001), labu takar, serta alat – alat gelas yang biasa

digunakan pada laboratorium kontrol kualitas.

2. Variabel Penelitian

a. Variabel Bebas

Variabel bebas penelitian ini adalah kadar parasetamol dan tramadol HCl

dalam tablet.

b. Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah peak kromatogram

3. Prosedur Penelitian Optimasi

a. Pembuatan Larutan Baku Parasetamol (325 ppm)

Ditimbang 32,50 g standar Parasetamol secara akurat lalu dilarutkan dalam

fase gerak. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100,0 ml secara kuantitatif

dan ditambahkan fase gerak sampai garis tanda dan dikocok homogen, sehingga

didapatkan larutan parasetamol dengan konsentrasi 325 mg/ml dari Parasetamol.

b. Pembuatan Larutan Baku Tramadol HCl (37,5 ppm)

Ditimbang 3,75 g standar Tramadol HCl secara akurat lalu dilarutkan dalam

fase gerak. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100,0 ml secara kuantitatif

dan ditambahkan fase gerak sampai garis tanda dan dikocok homogen, sehingga

didapatkan larutan Tramadol HCl dengan konsentrasi 37,5 mg/ml dari Tramadol

HCl.

c. Penentuan Kurva Kalibrasi untuk Parasetamol dan Tramadol HCl

Dibuat larutan baku kerja dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl

dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan sebesar 195; 260; 325; 390; dan

455 ppm (60% sampai 140%) untuk Parasetamol serta 22,5; 30; 37,5; 45; dan 52,5

ppm (60% sampai 140%) untuk Tramadol HCl, masing – masing ditambahkan

fase gerak dikocok ± 1 menit. Kemudian ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml

di labu ukur, lalu dikocok. Larutan tersebut dikromatografi selama 10 menit

menggunakan fase gerak dengan laju 1,0 ml/menit. Kurva kalibrasi dilakukan

dengan memplot daerah puncak vs konsentrasi untuk kedua obat tersebut.

d. Optimasi Kondisi Kromatografi

Fase diam C18 ODS Kolom (150 × 4.6mm); fase gerak: Metanol : Aquadest

(30:70 v / v) pada pH 3,4 diatur dengan asam o-fosfat; deteksi pada panjang gelombang

228 nm; volume injeksi 10 µl; suhu kolom pada suhu kamar; laju alir 1,0 ml/menit.

Parameter tes kesesuaian sistem meliputi resolusi, efisiensi kolom yang dilihat dari

angka plat teoritis dan faktor tailing sebagaimana tabel beriku

Tabel Data tes kesesuaian sistem

No. Parameter Kesesuaian Sistem Spesifikasi

1. Resolusi (Rs) > 1.5

2. Angka Plat Teoritis (N) Tidak kurang dari 2000

3. Faktor Tailing (TF) Tidak lebih dari 2

4. Validasi Metode

a. Linearitas

Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan

sebesar 195 – 455 ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang

diperhitungkan sebesar 22,5 – 52,5 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai

10,0 ml di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut

dikromatografi menggunakan HPLC dan dilihat kurva kalibrasi dari standar

Parasetamol dan Tramadol HCl.

b. Presisi

i Ripitabilitas

Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan

sebesar 325 ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang

diperhitungkan sebesar 37,5 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml

di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut

dikromatografi menggunakan HPLC dengan 3 kali pengulangan dan dihitung

kromatogram rata-rata dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl, standar

deviasi (SD) dan koefisien variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan

jika KV tidak lebih dari 2 % (KV < 2 %).

ii Presisi Antara

Dilakukan preparasi larutan Parasetamol dan Tramadol HCl yang sama

sebagaimana item i. Selanjutnya larutan tersebut dikromatografi menggunakan

HPLC pada satu hari yang sama di enam waktu yang berbeda dan dihitung

kromatogram rata-rata dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl, standa

deviasi (SD) dan koefisien variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan

jika KV tidak lebih dari 2 % (KV < 2 %).

iii Reprodusibilitas

Dilakukan preparasi larutan Parasetamol dan Tramadol HCl yang sama

sebagaimana item i. Selanjutnya larutan tersebut dikromatografi menggunakan

HPLC pada dua hari yang berbeda dalam satu minggu dengan analis berbeda,

instrument berbeda pada waktu yang berbeda dan dihitung kromatogram rata-rata

dari standar Parasetamol dan Tramadol HCl, standar deviasi (SD) dan koefisien

variasi (KV). Presisi dikatakan memenuhi persyaratan jika KV tidak lebih dari 2

% (KV < 2 %).

c. Akurasi

Sejumlah 3 seri tablet yang telah digerus ditambahkan parasetamol dan

tramadol HCl pada masing-masing seri sebanyak 80%, 100% dan 120%. Masing-

masing seri dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Kemudian ditambah fase gerak

sampai 10,0 ml di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan

dianalisis menggunakan HPLC dan dihitung % kadar perolehan kembali (%

Recovery) dari data kromatogram yang didapat.

d. Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ)

Dibuat larutan Parasetamol dengan konsentrasi akhir yang diperhitungkan

sebesar 162,5 ppm dan untuk Tramadol HCl dengan konsentrasi akhir yang

diperhitungkan sebesar 18,75 ppm dengan ditambahkan fase gerak sampai 10,0 ml

di dalam labu ukur, dikocok homogen. Selanjutnya larutan tersebut

dikromatografi menggunakan HPLC dan dilihat kromatogram dari standar

Parasetamol dan Tramadol HCl. LOD dikatakan baik bila rasio signal/noise lebih

besar daripada 3 dan LOQ dikatakan baik bila rasio signal/noise lebih besar

daripada 10.