metodi di studio. il primo microscopio ottico un microscopio semplice hooke, 1665
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Metodi di studioMetodi di studio
Il primo microscopio ottico
Un microscopio semplice Hooke, 1665
Il primo microscopio ottico
Un microscopio semplice Hooke, 1665
Un moderno microscopioUn moderno microscopio
Microscopi ottici da esercitazione
Microscopi ottici da esercitazione
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Stativo
Fonte di illuminazione
Fotocamera o telecamera
Oculari
Diaframma di campo
Revolver con obiettivi
Tavolino traslatore
Vite macrometrica e micrometrica
Condensatore
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Anatomia di un microscopio
Microscopia Microscopia OtticaOttica
Microscopia Microscopia OtticaOttica
OSSERVAZIONI A FRESCOOSSERVAZIONI A FRESCO
Microscopia OtticaMicroscopia Ottica
• Prime osservazioniPrime osservazioni
• Il preparato si deteriora
velocemente
• Poco informativePoco informative
• Descrizioni brevi ed inesatte
Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica
Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato
Preparati in campo chiaro
Preparati in campo chiaro
Un batterioCampo chiaro, 1000x
Cellule
Microscopia Otticaa Contrasto di faseMicroscopia Otticaa Contrasto di fase
• Gli oggetti visti in campo chiarocampo chiaro hanno poco poco
contrastocontrasto• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le sfruttare le
lievi differenze di indice di rifrazionelievi differenze di indice di rifrazione del materiale
da osservare rispetto al mezzo circostante• Applicando nel condensatore delle variazioni di fase
alla luce che raggiunge il preparato e applicando
variazioni opposte nell’obiettivo
• I raggi luminosi che sono stati modificati
generano fenomeni di interferenza che rendono
più chiari o più scuri gli oggetti illuminati
Microscopia Ottica a Contrasto di fase
Microscopia Ottica a Contrasto di fase
Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a frescoLe varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio
Un batterio400x
Un lievito(S. cerevisiae)
400x
Una muffa(G. candidum)
400x
Osservazione in campo scuro
Osservazione in campo scuro
Un particolare tipo di condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.Gli oggetti appariranno Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo chiari su uno sfondo scuro.scuro.In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico
Osservazione in campo scuro
Osservazione in campo scuro
Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei
preparati
Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei
preparatiUtilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio
Coloranti vitaliColoranti vitaliLe cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamentoOggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse
Coloranti che richiedono fissazioneColoranti che richiedono fissazioneLe cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule
Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia
Ottica
Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia
Ottica
• AcquisizioneAcquisizione del campione e
taglio in pezzi (1cm3)
• Biopsia, intervento chirurgico, autospia postmortem
• Prelevato rapidamente utilizzando strumenti adatti (bisturi)
• FissaggioFissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e
preservare)• Generalmente per mezzo di aldeidi
reattive (formaldeide)• Cross-link delle macromolecole, in
particolare le proteine• Si ottiene un effetto indurente sui
tessuti "molli"• Deve essere fatto rapidamente per
evitare che gli enzimi persenti
degradino il tessuto
• DisidratazioneDisidratazione del campione
attraverso passaggi in
soluzioni a concentrazione
crescente di etanolo• ParaffinaParaffina (materiale usato per
l'inclusione) non è solubile in H2O
• EliminazioneEliminazione dell'etanolo e
passaggi in xilene• Paraffina non è solubile nemmeno
nell'etanolo
• InclusioneInclusione del campione in
in mezzo appropriato paraffina
o resina• Tessuti sono "molli" e fragili• Diversi passaggi in paraffina calda• La paraffina occupa lo spazio
precedentemente occupato dall'H2O
• La paraffina fredda si indurisce e
permette di sezionare il campione
Sezione non colorata
TaglioTaglio per mezzo di
un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 m
MontaggioMontaggio delle
sezioni su vetrini per microscopia
ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriatoI coloranti sono a base acquosa, per cui si elimina
lo xilene attraverso passaggi in etanolo
Colorazione automatizzata
ColorazioniColorazioni
• ColorazioneColorazione• Con un colore brillante di
certe componenti del tessuto
• Contro colorazioneContro colorazione• Del resto del tessuto con un
colore contrastante
• EmatossilinaEmatossilina• Ha affinità per le molecole
cariche negativamente (DNA,
RNA ed alcune proteine)
• EosinaEosina• Ha affinità per le molecole
cariche positivamente (proteine
del citosol)
Ematossilina/EosinaEmatossilina/Eosina
Perchè questa "slide" è blu Perchè questa "slide" è blu ……
Perchè questa "slide" è blu Perchè questa "slide" è blu ……
• Se una porzione di Se una porzione di tessuto o di una tessuto o di una cellula si colora di cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene , viene detta detta basofilabasofila
• È colorata È colorata
dall'dall'ematossilinaematossilina• Nuclei e ribosomiNuclei e ribosomi
generalmente sono generalmente sono basofilibasofili
• Se una porzione di Se una porzione di tessuto o di una tessuto o di una cellula si colora di cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene , viene detta detta basofilabasofila
• È colorata È colorata
dall'dall'ematossilinaematossilina• Nuclei e ribosomiNuclei e ribosomi
generalmente sono generalmente sono basofilibasofili
… … e questa rossa ?e questa rossa ?… … e questa rossa ?e questa rossa ?
• Se una porzione si colora in rosso rosso /arancio/rosa/arancio/rosa, viene detta acidofilaacidofila o o eosinofilaeosinofila
• È colorata
dall'eosinaeosina• Sono le proteine del proteine del
citosolcitosol
Altre colorazioniAltre colorazioni• PAS PAS (Acido Periodico-Reattivo di (Acido Periodico-Reattivo di
Schiff)Schiff)
• Per sostanze ricche in zuccheri (muco)
• Tricromica o Hazan-Tricromica o Hazan-MalloryMallory• Per i tessuti
connettivi• Le fibre si colorano in
blu• Con E&E sono rosa
Le aree bianche sono lipidi
Adiposo Bianco
• Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black • Per
grasso/lipidi/mielina• I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
• Argento ed oroArgento ed oro• Per fibre delicate e
processi cellulari
• GiemsaGiemsa• Per le cellule del
sangue• Simile ad E&E
Mielina
Cellule nervose
Cellule del sangue
E le aree "bianche"?E le aree "bianche"?
• I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E• Sangue, linfa etc.
• Si riconoscono come ampi spazi bianchi
• Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima
Interpretate il campione !!!
Interpretate il campione !!!
• Dovete pensare in 3 dimensioni3 dimensioni• Sezioni serialiSezioni seriali sono l'ideale per
l'interpretazione e la ricostruzione
Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali
Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali
“Artefatti”“Artefatti”
• ShrinkageShrinkage• Lascia dello
spazio aggiuntivo• Disidratazione e
fissaggio• Fratture al piano Fratture al piano
di tagliodi taglio• Tagli netti e ben
visibili• Lama deteriorata
• Colorante Colorante precipitatoprecipitato• Macchie di colore a
"grano di pepe”
• Tessuto "pinzato"Tessuto "pinzato"• Strumento per
l'excisione deteriorato
• Durante o dopo il sezionamento
• PieghePieghe• Durante il
montaggio
Microscopia Microscopia ElettronicaElettronicaMicroscopia Microscopia ElettronicaElettronica
Microscopia Elettronica a Trasmissione
Microscopia Elettronica a Trasmissione
• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta• Alta risoluzioneAlta risoluzione
• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano attraverso il campione
La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio ottico
Risoluzione Risoluzione dell'occhiodell'occhio: 0.2 mm = 200 µmRisoluzione del MORisoluzione del MO: 200 nm = 2,000 AngstromsRisoluzione del TEM:Risoluzione del TEM: 2 Angstroms1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Angstroms
Pinocitosi
Preparazione di Campioni Biologici per TEM
Preparazione di Campioni Biologici per TEM
• AcquisizioneAcquisizione del campione e
taglio in pezzi (1cm3)
• FissaggioFissaggio del campione con
glutaraldeide e poi tetrossido di
osmio• L’osmio è un metallo pesante che si lega ai
lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)• Coloranti non legano i lipidi, che nelle
sezioni appaiono chiari
DisidratazioneDisidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo
InclusioneInclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina
TaglioTaglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomoultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro)La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mmLo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)
MontaggioMontaggio delle sezioni su di una griglia
Colorazione delle sezioniColorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piombo
VisualizzazioneVisualizzazione al TEMFotografia, sviluppo ed analisi delle immagini
Freeze-fractureFreeze-fracture
• Il tessuto prelevato viene
congelato a -140/150 °C• Con un martelletto viene
provocata la frattura,
secondo le linee di forza
del tessuto• Evaporazione e
deposizione di metalli
pesanti• Eliminazione materia
organica
AutoradiografiaAutoradiografia
Utilizzando isotopi radioattivi si
possono marcare strutture cellulari
ben definite e visualizzarle poi
tramite microscopia ottica od
elettronica
Ottico ElettronicoOttico Elettronico
Microscopia Elettronica a ScansioneMicroscopia Elettronica a Scansione
SEM fa una scansione della superfice del campione
Produce immagini 3-D
Preparazione dei campioni per SEMPreparazione dei
campioni per SEM
• AcquisizioneAcquisizione del campione
• Trattandolo con cura in
modo da non danneggiare la
superficie
• Fissazione e disidratazioneFissazione e disidratazione
• NonNon si include
• Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo• Oro, cromo,
palladio, carbone• Deve essere
elettron-conducente (non elettrondenso)
• Visualizzato al microscopio
• Fotografato• Si possono
analizzare le componenti chimiche tramite raggi X
Microscopia a FluorescenzaMicroscopia a Fluorescenza
• Il campione viene colorato con
anticorpi oppure sostanze
specifiche coniugate con
fluorocromi• La luce utilizzata ha lunghezze
d’onda specifiche per eccitare i
fluorocromi• I fluorocromi emettono
radiazione blu, rossa o verde
Microscopia a FluorescenzaMicroscopia a Fluorescenza
Microscopia Confocale
Microscopia Confocale
• La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda
• Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione
• I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma
• Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine
• La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine
• Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser
QuickTime™ and aMotion JPEG A decompressor
are needed to see this picture.
Metodi analiticiMetodi analitici
Come si analizzano gli organelli o la Come si analizzano gli organelli o la
struttura fine?struttura fine?
Metodiche che permettono
l’isolamento dei componenti cellulari
intatti
Centrifugazione, semplice o Centrifugazione, semplice o
differenzialedifferenziale
Permette l’isolamento sia delle cellule
da un tessuto sia delle singole
componenti cellulari
CentrifugazioneCentrifugazioneCentrifugazioneCentrifugazione
Centrifugazione Centrifugazione differenzialedifferenziale
Centrifugazione Centrifugazione differenzialedifferenziale