PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN PECES CEBRA

PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN PECES CEBRA2015

PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN PECES CEBRA2015PROFESOR: BLGO. ALVAREZ ALVAREZ, FelixCURSO: TOXICOLOGIA AO/SECCION: 3er - TA INTEGRANTES: ALMONACID SARA, RalVILA ARAUCO, ngel PEREYRA BORDA, Mary ZIGA BUSTILLOS, Juver

PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN PECES CEBRA2015

ToxicologaPgina 3

CONTENIDOI. INTRODUCCIN1II. OBJETIVOS1III. GENERALIDADES13.1. PEZ CEBRA13.1.1. Descripcin13.1.2. Dimencines13.1.3. Diferencias sexuales13.1.4. Comportamiento13.1.5. Ambiente y cuidado13.1.6. Alimentacin13.1.7. Reproduccin13.2. MICRONUCLEOS13.2.1. Descripcin13.2.2. Mtodo de medida de inestabilidad gentica: ensayo de microncleos1IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS14.1. MATERIALES14.1.1. Lminas porta y cubreobjetos14.1.2. Tijera14.1.3. Pipetas pasteur14.1.4. Cmara para lminas portaobjetos14.1.5. Peces cebra14.1.6. Microscopio14.1.7. Giemsa al 10%14.2. PROCEDIMIENTO1V. RESULTADOS1VI. DISCUSIN DE RESULTADOS1VII. CONCLUSIONES1VIII. BIBLIOGRAFA1

INTRODUCCIN Los peces pueden actuar como organismos centinela para inferir el nivel de exposicin de poblaciones humanas a sustancias qumicas txicas presentes en los ecosistemas acuticos. En este sentido, la realizacin de bioensayos para determinar los efectos de sustancias contaminantes de origen antropognico o industrial, empleando peces como bioindicadores, proporciona informacin sobre los efectos de contaminantes qumicos en ambientes acuticos, permitiendo un mejor monitoreo de las condiciones ambientales.Los microncleos son fragmentos o cromosomas completos que quedan fuera del ncleo durante la mitosis; mediante su estudio se pueden evaluar los efectos de genotxicos ambientales y ocupacionales. Esta prueba es ampliamente utilizada y es una alternativa eficaz, sencilla y econmica para detectar la perdida de material gentico.En el siguiente informe describir los procedimientos llevados a cabo en una prueba de microncleos en los glbulos rojos del pez cebra, expuestos a etanol al 99%, as como la interpretacin de los resultados encontrados.

OBJETIVOS Evaluar el efecto genotxico inducido por el etanol utilizando al pez cebra como biomonitor Identificar y cuantificar los tipos de microncleos encontrados en la muestra.

GENERALIDADESPEZ CEBRANombre cientfico: Danio RerioDescripcinPertenece a la familia ciprnidos. Distribucin geogrfica Pakistn, regiones orientales de la India. Su hbitat natural ros de las montaas, aguas estancadas, canales y campos de arroz. Forma del cuerpo pequeo, esbelto muy comprimido lateralmente, tiene dos pares de barbillones. Dorso de color entre verde oliva y pardusco, flancos de color azul brillante con cuatro estras longitudinales de un esplndido color dorado, el vientre es de color blanco amarillento. Estriaciones de color azul dorado tambin en la aleta anal, la aleta dorsal es de color amarillo en la base. El ris de color rojo dorado, el oprculo azulado con manchas y estras doradas.

DimencinesTiene de 5 a 6 cm.Diferencias sexualesLas hembras son ms grandes que los machos y de color ms plateado. Estos peces con buenos cuidados pueden llegar a vivir entre 3-5 aos.ComportamientoEs un pez vivaz y pacfico. Se mantiene en cardmenes, por lo que es recomendable mantener entre 6-10 individuos. Son grandes nadadores, suelen permanecer en las capas medias y superiores del agua. La mayor preocupacin, que pueden saltar, por lo tanto hay que cubrir con una tapa de cristal. Forman parejas estables.

Ambiente y cuidadoPez Cebra uno de los peces ms comunes en los acuarios comunitarios. Este es un pez muy conmovedor y sin pretensiones que vive cmodamente en los bancos de varios individuos. Pez Cebra macho constantemente jugando persiguen unos a otros, movindose rpidamente en el acuario. Debido a que estos peces se mueven sin cesar el acuario debe ser elegido ligeramente alargado. Y tambin es mejor plantar en los bordes muchas plantas. Debido a la densa vegetacin del acuario debe estar equipado con una buena iluminacin, dispuestos si es posible a la luz solar. Temperatura 18-25C, no soportan bien las temperaturas superiores, pH de 7-7,5, dureza entre 5-15dGH. Fondo: arena silcea, requiere sustitucin del agua semanal de 10-15%, oxigenacin intensa.

AlimentacinEspecie omnvora, no muy voraz. Acepta todo tipo de alimentos sin ningn problema en escamas o granulado. Antes de procrear es recomendable suministrar un alimento vivo de pequeo tamao.ReproduccinA la madurez sexual Pez Cebra llega a los 3-6 meses, teniendo en cuenta la esperanza de vida de estos peces de 3-5 aos. Pez Cebra son capaces de reproducirse en cualquier poca del ao. Para empezar durante unos das las hembras y los machos se colocan en grandes acuarios (10 litros) con la temperatura del agua de 20 C, preparados especialmente para el desove y se alimentan en abundancia con larvas de mosquito rojo rico en nutrientes o daphnia vivo. Disposicin para hembras en desove se determina por la forma del abdomen, durante la maduracin de los huevos, se convierte en mucho ms gruesa, no slo en la parte delantera, pero tambin en la parte de la aleta anal. Slo para el desove debe elegir pequeos recipientes con fondo de cristal transparente (por ejemplo, frascos de vidrio o acuarios 3-10 litros). La arena en el fondo no es necesaria, para poder observar mejor el desarrollo de los huevos. En la parte inferior del acuario se coloca musgo, presionado cuidadosamente con piedras. El nivel del agua en el rea de desove debe ser de al menos 5-8 cm por encima del musgo. Es mejor poner el acuario cerca de una ventana, donde llega bien la luz natural. Productores (generalmente 2-3 machos y una hembra) se colocan en el rea de desove a la tarde. La temperatura del agua no debe ser demasiado baja. Durante la noche los peces se acostumbran, y a la maana siguiente, cuando el desove est bien iluminada, y las plantas comenzarn a producir activamente el oxgeno, para iniciar el desove. Los peces estn empezando a moverse muy rpido. Los machos persiguen a la hembra, tratando de pegarle en el abdomen, batiendo los huevos y el esperma a la liberacin. Todo el proceso por lo general toma alrededor de una hora. El nmero de huevos desovados de una hembra depende del tamao y el grado de disposicin a desovar, y es de hasta 400 huevos. Despus deben trasplantar a los padres, ya que pueden comer a los huevos. Los huevos generalmente maduran pasados los 30-36 horas a 26-28 C, a temperaturas ms bajas, la maduracin puede durar hasta 7 das. Los alevines unos das se aferran a las plantas o las paredes del acuario, y luego poco a poco comienzan a nadar. En los primeros das los alevines se alimentan con infusorias y luego a medida que crecen, pueden trasladarse a otro acuario ms amplio. La temperatura ptima del agua para el buen desarrollo de los jvenes Peces Cebra es de 26 27 C, con abundante comida. En estas condiciones los peces alcanzan la madurez sexual a los 2,5-3 meses.

MICRONUCLEOSDescripcin Los microncleos son cuerpos citoplasmticos de naturaleza nuclear, se corresponden con material gentico no incorporado correctamente a las clulas hijas durante la divisin celular, reflejan aberraciones cromosmicas y se originan por roturas cromosmicas, por errores durante la replicacin y posterior divisin celular del ADN y/o por la exposicin a agentes genotxicas. Existen factores capaces de influir o modificar el nmero de microncleos presentes en una clula (edad, gnero, vitaminas, tratamientos mdicos, exposicin diaria a agentes genotxicos, etc.).El ensayo citogentico para la deteccin de microncleos (CBMN: cytokinesis-block micronucleus) se basa en la utilizacin de un agente qumico, denominado citocalasina-B capaz de impedir la citocinesis permitiendo la divisin nuclear proporcionando a las clulas un aspecto de clulas binucleadas monodivididas. El recuento de microncleos se realiza sobre 1.000 clulas binucleadas y la muestra de partida puede variar aunque lo ptimo es el uso de linfocitos aislados de sangre perifrica. El ensayo de microncleos est considerado como un ensayo prctico, universalmente validado y accesible tecnolgicamente, til para evaluar la inestabilidad gentica inducida por agentes genotxicos.Mtodo de medida de inestabilidad gentica: ensayo de microncleosDurante la divisin celular el material gentico (ADN) contenido en el ncleo celular se replica y divide equitativamente dando lugar a dos clulas hijas idnticas; este proceso puede producirse de manera errnea debido a errores durante la replicacin y posterior divisin del ADN, a roturas cromosmicas y al efecto de la radiacin y de sustancias genotxicas, producindose prdida cromosmica y haciendo que el reparto del material gentico no sea equitativo. Cuando esto ocurre, el material gentico que se desprende y que, por tanto, queda excluido y no se incorpora correctamente al ncleo de la clula hija, origina un nuevo ncleo de menor tamao que el primario denominado micro-ncleo (MN), visible fcilmente al microscopio ptico7. El material gentico desprendido puede derivar de cromosomas enteros o, ms frecuentemente, de fragmentos cromosmicos acntricos que quedan excluidos de los ncleos de las nuevas clulas durante anafase mittica.El uso de la tcnica de recuento de Manganeso, por ejemplo, como medida de dao cromosmico sobre cultivos de linfocitos humanos, fue propuesta por primera vez por Countryman y Heddle en 1976, cuyo nico requisito era la eleccin de tipos celulares con gran actividad mittica8. Ms tarde, en 1985, el ensayo de genotoxicidad fue mejorado por Fenech y Morley, consiguiendo frenar el proceso de divisin celular cuando la clula slo hubiese sufrido una divisin mittica, para ello desarrollaron la tcnica del bloqueo de la citocinesis (CBMN:cytokinesis-block micronucleus) cuyo fundamento es la utilizacin de un agente qumico denominado citocalasina-B cuya funcin es impedir la citocinesis celular

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOSMATERIALES Lminas porta y cubreobjetosEstos dos objetos se utilizaron para poner la muestra de sangre del pez raya y as poder llevarlo al microscopio.

Tijera Este material nos sirvi para decapitar al pez raya y as poder obtener su sangre.

Pipetas pasteurCon este objeto echamos la giemsa hacia las lminas portaobjetos.

Cmara para lminas portaobjetosEs donde se colocaron las lminas portaobjetos para que puedan estar refrigeradas en etanol.

Peces cebraDe ellos se obtendr la sangre para hacer la prueba de micro ncleos.

MicroscopioObservacin del estado del nucleo del pez cebra.

Giemsa al 10%Utilizado como colorante para poder pintar el ncleo y ser observado.

PROCEDIMIENTODe los peces cebras que se tenan como muestra, se escogi uno para que le corten la cabeza y as poder obtener su sangre arterial.

Ya con el pez decapitado se procedi a hacer el frotis en la lmina portaobjetos para obtener la muestra de sangre.

Luego se hace un frotis con un ngulo aproximado de 60 con otra lamina portaobjetos. Esperar unos 15min para que la muestra se impregne.

Pasado ya el tiempo, la muestra es llevada a una cubeta que contiene etanol, la muestra se deja ah por 8min refrigerada.

Ya transcurrido el tiempo se saca la muestra y se deja secar al ambiente; luego que ya seco se echa el Giemsa.

Ya cuando tomo el color la muestra se lleva al microscopio para su observacin.

RESULTADOSComo resultado, tenemos microncleos del tipo II, los cuales se caracterizan por una deformacin del ncleo, ms no de una fragmentacin.

DISCUSIN DE RESULTADOS Las investigaciones relacionadas con el tema de la genotoxicidad adquieren cada vez mayor importancia a nivel local, nacional y mundial, debido al creciente deterioro del ambiente al que se encuentra expuesto por las diferentes actividades del hombre moderno (Thomann, 1982). El uso de los ensayos de genotoxicidad en el pez Cebra propuesto en esta investigacin, constituye el primer paso que asegure la toma de medidas de bioseguridad apropiadas, y permita realizar los anlisis y la gestin de riesgos a priori en el componente biolgico ante un determinado contaminante del agua (Agencia AUPEC, 1998; Acta Toxicolgica Argentina, 2007; ACGIH. 2010).En el ao 2012 por Resolucin Ministerial N 225-2012- MINAM el Ministerio del Ambiente aprob el nuevo Plan de Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y Lmites Mximos Permisibles (LMP) para el perodo 2012-2013 para el Per, donde se realiza una corporacin o revisin de nuevos ECA priorizados para agua en lo que respecta a los aceites y grasas, cianuro, cloruros, nitratos, nitritos, nitrgeno amoniacal, slidos totales en suspensin, sulfatos, sulfuros, fosfatos, fosforo total, antimonio, arsnico, cadmio, manganeso, mercurio, nquel, termotolerantes y organolpticos. As mismo, incorpora como novedad a la norma, la elaboracin del ECA para agua subterrnea que antes solo exista para aguas superficiales. Para los LMP relacionados al agua, en el sector minero se deber hacer una revisin del LMP de las emisiones de las actividades mineras y metalrgicas. Para el sector industrial se deber elaborar los LMP de los efluentes y emisiones para industria petroqumica intermedia y avanzada; para la industria de la imprenta, para las actividades del subsector industria y para la industria siderrgica. Para el sector agricultura se deber elaborar los LMP de los efluentes de las actividades agroindustriales, tales como camales y plantas de beneficio.Y para el sector vivienda se ha incorporado la elaboracin de LMP de efluentes de plantas desalinizadoras. De este modo, actualmente la legislacin y normatividad peruana actual estn siendo revisadas y actualizadas en sus Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y sus Lmites Mximos Permisibles (LMP) para que estn acorde a los estndares internacionales y se evale primero la seguridad biolgica de todo tipo de producto potencialmente peligroso.Por lo expuesto, la implementacin de la nueva normatividad apunta a muy corto plazo al uso de nuevos bioindicadores ambientales, tanto en animales como en plantas, para la determinacin de los contaminantes del agua en territorio peruano los cuales sern utilizados como una nueva herramienta de biomonitoreo para complementar los nuevos ECAs y LMPs a implementarse transversalmente en los estudios de impacto ambiental en diferentes sectores de inters. Estos bioindicadores debern ser elegidos por su rpida reproduccin en pequeos espacios que permita tener grandes stock de organismos para diversos ensayos y repeticiones, y que no representen varias semanas o meses de anlisis, que sean econmicos en su crianza, y que se posea un amplio conocimiento de su biologa para su facilidad de manejo laboratorial y ser adaptables a diversos laboratorios para lograr su replicacin. A nivel de bioensayos laboratoriales en el Per, se ha recomendado el uso de los siguientes organismos invertebrados: los crustceos Artemia sp. y Daphnia magna, el insecto Chironomus calligraphus y el anlido Paragrellus redivivus. Y el uso de los siguientes organismos vertebrados: el pez Cebra (Danio rerio), la trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y el ratn (Mus musculus). Y en vegetales el uso de la cebolla (Allium cepa), la haba (Phaseolus sp.) y la microalga Chrollela sp.La aplicacin del ensayo de microncleos est siendo utilizada para el monitoreo de la contaminacin de los ambientes acuticos junto con un biocontrol para la deteccin de la genotoxicidad. Teniendo como material biolgico a los eritrocitos nucleados (presencia de ADN nuclear) de la sangre perifrica del pez Cebra (Danio rerio) se detect el dao celular en forma directa por microscopia permitiendo evaluar rpidamente (24 a 72 horas) los efectos nocivos de un contaminante acucola de inters que otros ensayos no pueden hacerlo. Es un primer paso para alertar con el tiempo el padecer mutaciones, alteraciones cromosmicas, desarrollar malformaciones embrionarias o fetales y causar finalmente la mortalidad en un ambiente acutico contaminado con metales pesados.

CONCLUSIONESAl realizar el ensayo en peces cebra sometidos al etanol al 99% se pudo observar que los glbulos rojos sufren daos considerables, puesto que al observar al microscopio con un aumento de 400X se logra diferenciar glbulos rojos con microncleos de diferentes tipos.El ensayo de microncleos es una alternativa al test de aberraciones cromosmicas convencional, en el que se analizan las alteraciones presentes en metafases mitticas y permite detectar aberraciones cromosmicas que responden a alteraciones de tipo estructural (efecto clastognico) o alteraciones numricas (efecto aneugnico) del agente en estudio.Adems, con el ensayo de microncleos se consigue:a) Reducir la dificultad a la hora de realizar el recuento.b) Mejorar la sensibilidad del ensayo, ya que los MN slo se cuentan en clulas que han completado una divisin nuclear.c) Incrementar la potencia estadstica de los estudios al analizar miles de clulas en lugar de cientos de ellas.d) Reducir el coste del ensayo.El ensayo de microncleos es, por tanto, un ensayo prctico, universalmente validado y accesible tecnolgicamente, til para evaluar la inestabilidad gentica inducida por agentes genotxicos.

BIBLIOGRAFA Albert, L.A. (1997). Introduccin a la toxicologa ambiental. Centro Panamericano de Ecologa Humana y Salud, Divisin de Salud y Ambiente, Organizacin Panamericana de la Salud, Organizacin Mundial de la Salud y Secretara de Ecologa. Metepec, Mxico Bez Ramrez, O.A. y F. Prieto Garca. (2004). Bioacumulacin y daos genotxicos en pez cebra (Danio rerio) por arsnico en aguas de Zimapn, Hidalgo, Mxico. Ensayos en cortos plazos. Revista AquaTIC, 21:62-70. Disponible en URL: http://www.revistaaquatic.com Salas, H., Lobos, J., Dos Santos, J., De Ferncola, N. (2001). Seccin 1 Perspectiva. En Organizacin Panamericana de la Salud (Ed.), Manual de evaluacin y manejo de sustancias txicas en aguas superficiales. Lima: Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Ambiente.ToxicologaPgina 1