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TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE LEGIONELLA

David Tomás Forné[email protected]

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SEMINARIO PREVENCIÓN Y CONTROL DE LEGIONELLAPATERNA, 6 ABRIL 2004

ANÁLISIS DE LEGIONELLA.

Fundamentos de la técnicas analíticas y aplicaciónal control rutinario

D. David Tomás Fornés

Jefe del Laboratorio de Bioensayosainia. Centro Tecnológico



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CONTENIDO.

•Descripción de la bacteria.

•Consideraciones sobre toma de muestra.

•Métodos de análisis convencionales

•Métodos de análisis genéticos

•Tendencias



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DESCRIPCIÓN DE LA BACTERIA.

•Bacilos Gram negativos, 0.5-0.7 µm x 2-20 µm, aeróbios,móviles, requiere una fuente de aminoácidos y hierro.

•Resiste un amplio rango de temperaturas, multiplicándoseentre 20-45ºC. Tª óptima: 35-37ºC.

•Crecimiento intracelular y habitualmente en sedimentos,biofilms, materia orgánica.

•Familia Legionellaceae, 40 especies, 60 serogrupos. L.pneumophila sg 1 supone el 72% de infecciones



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ORIGEN:RESERVORIOSNATURALES

SISTEMASABASTECIMIENTO

INDUSTRIALUSO DOMÉSTICO

SISTEMASABASTECIMIENTO

PÚBLICO



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TOMA DE MUESTRA.

•Muestrear puntos de riesgo (final recorrido, aguasestancadas, presencia de materia orgánica…)

•Especial atención a los biofilms (frotado de conducciones, usode torundas).

•Neutralización del biocida.

•Tomar al menos 2 litros de muestra.

•Mantener en refrigeración (<18ºC, >6ºC ISO 11737; 5+-3ºCAFNOR T90-431) y transportar al laboratorio en 24 horas (nomás de 2 días)



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PREPARACIÓN DE MUESTRA.

Proceder a la concentración (habitualmente 1 litro) antes delos 5 días de toma de muestras. (El concentrado puedemantenerse un máximo de 14 días)

•FILTRACIÓN

•CENTRIFUGACIÓN



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MÉTODOS CONVENCIONALES DE ANÁLISIS(CULTIVO EN PLACA)

•ISO 11731:1998 (Detection and Enumeration of Legionella)

•AFNOR NF T 90-431:2003 (Recherche et dénombrement deLegionella et de Legionella pneumophila)

•AS/NZ 3896:1998.

•CCFR 13.1:1995



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ANÁLISIS MEDIANTE CULTIVO EN PLACA

FUNDAMENTOSCONCENTRACIÓN

SIEMBRA DIRECTA TRATAMIENTO ÁCIDO(pH 2,0 - 5 minutos)

TRATAMIENTO TÉRMICO(50ºC - 30 minutos)

SIEMBRA EN MEDIO SELECTIVO(GVPC/BCYE)

CONFIRMACIÓN

(BCYE/AGAR NUTRITIVO/MICROSCOPÍA/SEROLOGÍA)



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ANÁLISIS MEDIANTE CULTIVO EN PLACA



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ANÁLISIS MEDIANTE TÉCNICAS GENÉTICAS (PCR)

FUNDAMENTOSCONCENTRACIÓN

EXTRACCIÓN ADN

(LISIS TÉRMICA + TAMPÓN LISIS)

AMPLIFICACIÓN GEN DIANA (Iap)( PCR ANIDADA)

ELECTROFORESIS



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ANÁLISIS MEDIANTE TÉCNICAS GENÉTICAS (PCR)

RESULTADOS



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COMPARACIÓN TÉCNICASCARACTERÍSTICA CULTIVO EN PLACA PCR convencional

Plazo resultados 10 días <1 día

Detección Cuantitativa Cualitativa (excp. PCR Real Time)

Estado celular Viables no cultivables No viables (excp. ARNm)

Interpretación Compleja y subjetiva

(pleomorfismos, tinciones,

aglutinación…)

Simple y objetiva

Interferencias Flora acompañante (mohos) Biocidas (Inhiben PCR)

Límite detección

“teórico”

25-50 ufc/L 1 ufc/L

Realización ensayo Laborioso Sencillo (especializado)

Infraestructura lab. Mínima Compleja



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INTERPRETACIÓN RESULTADOSLa Legislación indica la NECESIDAD de realizar los análisis mediantela Norma ISO11731:1998 y tomar medidas a tres niveles:

•Entre 100-1000 ufc/l: revisar programa de muestreo

•Entre 1000-10.000 ufc/l: Limpieza y confirmación

•>10.000 ufc/l: Parar instalación

Incertidumbre técnica analítica con LC95%(AFNOR T90-431)

No contar < 5 colonias: Límite de cuantificación = 250 ufc/litro

•250 ufc/l: recuento variable entre 30-480 ufc/l

•1.000 ufc/l: recuento variable entre 550-1.450 ufc/l

•25.000 ufc/l: recuento variable entre 3.000-47.000 ufc/l



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TENDENCIAS EN LAS TÉCNICAS DE CONTROL DEAGUAS

•Inmunoconcentración

•Técnicas cuantitativas de inmunofluoresencia.

•PCR cuantitativa de células viables.

•Biosensores para monitorizar en linea.

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