métodos bioinformáticos para el estudio de interacciones...
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Métodos bioinformáticos para el estudio deMétodos bioinformáticos para el estudio deinteracciones proteína-ligandointeracciones proteína-ligando El problema del plegamiento El problema del plegamiento
Universidad Nacional Autónoma de México
Rogelio Rodríguez-Sotres
Facultad de Química
Las proteínas son heteropolímerosLas proteínas son heteropolímerosasimétricos y no son monótonosasimétricos y no son monótonos
Rodríguez-Sotres (2004) Educación Química 16(1): 56-62.Rodríguez-Sotres (2004) Educación Química 16(1): 56-62.
Sólo
20
mon
ómer
osSó
lo 2
0 m
onóm
eros
apolarapolarneutroneutro
polarpolarácidoácidobásicobásico
Unidos por enlaces equivalentesUnidos por enlaces equivalentes
Con restricción conformacionalCon restricción conformacional
Por lo que adoptan estructurasPor lo que adoptan estructurastridimensionales definidas*tridimensionales definidas*
Rodríguez-Sotres (2004) Educación Química 16(1): 56-62.Rodríguez-Sotres (2004) Educación Química 16(1): 56-62.*existen excepciones*existen excepciones
La estructura 3D de una proteínaLa estructura 3D de una proteínaEs esencial para entender cabalmente la función
Es determinante de su ubicación en la célula Es importante para determinar la interacción con otras
componentes de la célula como: otras proteínas ácidos nucleicos lípidos carbohidratos iones otros muchos ligandos, incluyendo diversos fármacos
Si la función es conocida y bien estudiada Y la estructura está determinada
puede establecerse la relación estructura-actividad.
La estructura 3D de una proteínaLa estructura 3D de una proteínaEs esencial para entender cabalmente la funciónConocer la estructura no basta para conocer la
función. No es posible predecir la función con la información de la
estructura sólamente.
La función puede explorarse mediante estrategiasde genómica funcional:
Ubicación intracelular y patrones de expresión Mutantes nulas Transgénicos sobreexpresoras Proteínas de fusión con reporteros.
La estructura 3D de una proteína esLa estructura 3D de una proteína esinformación muy valiosa, pero...información muy valiosa, pero...La determinación experimental es muy laboriosa y
con limitaciones (rayos X, NMR), por tanto: Contamos con 100 veces más secuencias que entradas
en el PDB.
??
??
Los proyectos de Genómica estructural buscan determinarLos proyectos de Genómica estructural buscan determinarestructuras representativas de todas las familias de plegamiento deestructuras representativas de todas las familias de plegamiento delas proteínas, aún si su función es deconocida.las proteínas, aún si su función es deconocida.
La genómica estructuralLa genómica estructural
Se considera que hay un número restringido depatrones de plegamiento
Se busca determinar la estructura de unconjunto representativo de todas los patronesde plegamiento posibles.
En este caso, la determinación de la estructurase realiza, aún si la función no se conoce.
Se asume que conocidos todos los patronesestables, la demás proteínas podríanmodelarse por comparación.
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
1 k v 5 A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - M S K P Q P I A A A N W K C N G S Q Q S L S E L I D L F N S - - - T S I N H D V Q C V V A S T F V H L A M T K E R L S H - - - - P K F V I A A Q N A I A K S - G A1 n e y A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A R T F F V G G N F K L N G S K Q S I K E I V E R L N T - - - A S I P E N V E V V I C P P A T Y L D Y S V S L V K K - - - - P Q V T V G A Q N A Y L K A S G A1 r 2 r A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A P S R K F F V G G N W K M N G R K K N L G E L I T T L N A - - - A K V P A D T E V V C A P P T A Y I D F A R Q K L D - - - - - P K I A V A A Q N C Y K V T N G A1 t p h 1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - A P - R K F F V G G N W K M N G D K K S L G E L I H T L N G - - - A K L S A D T E V V C G A P S I Y L D F A R Q K L D - - - - - A K I G V A A Q N C Y K V P K G A1 m o 0 A M S Y Y H H H H H H L E S T S L Y K A G L T R K F F V G G N W K M N G D Y A S V D G I V T F L N A - - - S A D N S S V D V V V A P P A P Y L A Y A K S K L K - - - - - A G V L V A A Q N C Y K V P K G A1 m 6 j A - - - - - - - - - - - - - - - - - - - M G A G K F V V G G N W K C N G T L A S I E T L T K G V A A S V D A E L A K K V E V I V G V P F I Y I P K V Q Q I L A G E A N G A N I L V S A E N A W T K S - G AC o n s e n s u s N K N G A N G A
1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
1 k v 5 A F T G E V S L P I L K D F G V N W I V L G H S E R R A Y Y G E T N E I V A D K V A A A V A S G F M V I A C I G E T L Q E R E S G R T A V V V L T Q I A A I A K K L K K A D W A K V V I A Y E P V W A I G1 n e y A F T G E N S V D Q I K D V G A K Y V I L G H S E R R S Y F H E D D K F I A D K T K F A L G Q G V G V I L C I G E T L E E K K A G K T L D V V E R Q L N A V L E E V K - - D F T N V V V A Y E P V X A I G1 r 2 r A F T G E I S P G M I K D C G A T W V V L G H S E R R H V F G E S D E L I G Q K V A H A L S E G L G V I A C I G E K L D E R E A G I T E K V V F E Q T K V I A D N V K - - D W S K V V L A Y E P V W A I G1 t p h 1 F T G E I S P A M I K D I G A A W V I L G H S E R R H V F G E S D E L I G Q K V A H A L A E G L G V I A C I G E K L D E R E A G I T E K V V F E Q T K A I A D N V K - - D W S K V V L A Y E P V W A I G1 m o 0 A F T G E I S P A M I K D L G L E W V I L G H S E R R H V F G E S D A L I A E K T V H A L E A G I K V V F C I G E K L E E R E A G H T K D V N F R Q L Q A I V D K G V - - S W E N I V I A Y E P V W A I G1 m 6 j A Y T G E V H V G M L V D C Q V P Y V I L G H S E R R Q I F H E S N E Q V A E K V K V A I D A G L K V I A C I G E T E A Q R I A N Q T E E V V A A Q L K A I N N A I S K E A W K N I I L A Y E P V W A I GC o n s e n s u s T G E D L G H S E R R E K A G V C I G E T V Q A Y E P V A I G
2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0 2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | .
1 k v 5 A T G K V A T P Q Q A Q E A H A L I S S W V S S K I G A D V A G E L R I L Y G G S V N G K N A R T L Y Q Q R D V N G F L V G G A S L K P - E F V D I I K A T Q - - - - - - - -1 n e y A T G L A A T P E D A Q D I H A S I R K F L A S K L G D K A A S E L R I L Y G G S A N G S N A V T F K D K A D V D G F L V G G A S L K P - E F V D I I N S R N - - - - - - - -1 r 2 r A T G K T A T P Q Q A Q E V H E K L R G W L K S N V S D A V A Q S T R I I Y G G S V T G A T C K E L A S Q P D V D G F L V G G A S L K P - E F V D I I N A K Q - - - - - - - -1 t p h 1 T G K T A T P Q Q A Q E V H E K L R G W L K T H V S D A V A Q S T R I I Y G G S V T G G N C K E L A S Q H D V D G F L V G G A S L K P - E F V D I I N A K H - - - - - - - -1 m o 0 A T G K T A S G E Q A Q E V H E W I R A F L K E K V S P A V A D A T R I I Y G G S V T A D N A A E L G K K P D I D G F L V G G A S L K P - D F V K I I N A R S T A L S C T C W1 m 6 j A T G K T A T P D Q A Q E V H Q Y I R K W M T E N I S K E V A E A T R I Q Y G G S V N P A N C N E L A K K A D I D G F L V G G A S L D A A K F K T I I N S V S E K L - - - - -C o n s e n s u s T G A A Q H A R I Y G G S D G F L V G G A S L F I I
La conservación en las secuencias de aminoácidos La conservación en las secuencias de aminoácidos
Obedece a lanecesidad demantener:
Estructura
Función
rutas deplegamiento
Flexibilidadconformacional
Todas estas presiones evolutivas actúan juntasTodas estas presiones evolutivas actúan juntasen la selección natural.en la selección natural.Saber que cambios obedecen a necesidadesSaber que cambios obedecen a necesidadesestructurales es muy difícil.estructurales es muy difícil.
¿Cómo se pliega una proteína?¿Cómo se pliega una proteína?
Las proteínas se sintetizan añadiendo aminoácidos uno auno al estremo carboxilo
La mayoría, de alguna manera, durante este proceso ( odespués) adquieren su plegamiento estable.
Ese proceso dura apenas de 1 a 0.01s
Algunas proteínas no adquieren un plegamiento establepor si mismas (plegamiento asistido-> chaperonasmoleculares)
Otras cambian su plegamiento contínuamente(Intrínsecamente desordenadas).
La complejidad...La complejidad...A nivel de secuencia:
Hay 10.2×1012 secuencias de péptidos de 10 aa’s. Sinconsiderar las repeticiones, sólo 1 de cada 9’103secuencias posibles se han observado (NCBI-RefSeq1.1×1010 aa [09/09/13]).
Las secuencias naturales poseen elevada redundancia,así que: ¡no cubren toda la diversidad posible!
A nivel estructural: Restringiendo a 3-conformaciones/aa, una proteína de
100 aa tendría 3×10130 confórmeros Los plegamientos observados (PDB) se agrupan en
menos de 1000 categorías.
La naturaleza no ha tenido oportunidad de explorartodas las secuencias y formas teóricamente posiblespara las proteínas... Nosotros conocemos aún menos!
La paradoja de Cyrus Levinthal*La paradoja de Cyrus Levinthal* Asumimos:
cada aa’ tiene 3 conformaciones (conf.)
la proteína promedio es de 100 aa’s
la molécula visita 1 conformación cada 10-13s, es decir:10 billones de conf./s = 3.154 × 1020 conf./año.
Tendremos
3 conf. (100 aa’s) = 5.15 × 1047 conf.
(5.15 × 1047 conf.)/(3.154 × 1020 conf./año) =1.63 × 1021 Millones de años (Mi.a)
Edad del universo: 12’500 Mi.a = 1.25 × 103 Mi.a ¡Si la proteína que comenzó a explorar conformaciones al inicio del universo, aún estaría
probando!
*vease:*vease: Clark, A. C. (2008) Arch biochem biophys 469, 1-3Clark, A. C. (2008) Arch biochem biophys 469, 1-3
Las proteínas tiene rutas preferenciales deLas proteínas tiene rutas preferenciales deplegameintoplegameinto
De la imposibilidad de explorar todo el espacio conformacional.se sigue:
Nunca se explora toda conformación posible
Algunas conformaciones deben ser accesibles
La ruta de plegamiento ocurre explorando un conjunto limitado deconformaciones accesibles
Encontrar los mecanismos claves que determinan el plegamientorequiere inspeccionar varías vía de plegamiento.
¿Cómo estudiar estas vías de plegameinto de una proteína?
Las proteínas tiene rutas preferenciales deLas proteínas tiene rutas preferenciales deplegameintoplegameinto
Estudiar las conformaciones se necesita la determinación deestructura, pero los métodos conocidos están limitados a:
tiempos largos de toma de datos
conformaciones estables
La ruta de plegamiento toma apenas 0.01 a 1 s.
Es decir, no tenemos buenos métodos para estudiar los detallesestructurales de los intermediarios en la ruta de plegameinto
¿Cómo predecir el plegamiento? ¿Cómo predecir el plegamiento?
Conocer la vía de plegamiento es muy difícil,pues no tenemos buenas técnicas.
¿Qué alternativa existe para modelar laestructura tridimensional de una proteína?
Las bases del modeladoLas bases del modelado
El modelado de la estructura se basa en dospremisas:
Toda la información para determinar el plegamientofinal está en la secuencia de aminoácidos
La estructura nativa es un mínimo energético
Al desconocer la ruta de plegamiento, encontrar elmínimo requiere un muestreo energético del espacioconformacional
Calcular la energía requiere resolver la ecuación deSchrödinger, que sólo se ha podido en forma exactaresolver para el sistema de:
un átomo de hidrógeno (1p+ + 1e-)
Química ComputacionalQuímica Computacional En la química computacional se busca cal-
cular las propiedades de átomos y molécu-las usando teoría
Química ComputacionalQuímica Computacional Los cálculos requiren lidiar con las propie-
dades cuantizadas de la energía a escalasatómicas...
Sir, this gift arrivedSir, this gift arrivedfrom Wernerfrom WernerHeisenberg. Heisenberg. It’s for youIt’s for you
Thanks James, I’llThanks James, I’llopen it, when I find outopen it, when I find outif its contents are deadif its contents are dead
or alive... This fellow and his or alive... This fellow and his freaky uncertainties!freaky uncertainties!
mmm...mmm...I suspect of aI suspect of a
hidden CAT inside hidden CAT inside
Es decir, se require resolver la ecuación de SchrödingerEs decir, se require resolver la ecuación de Schrödinger
Well, that Well, that makes it formakes it forthe H atom...the H atom...But I still But I still ignore if ignore if
Heisenberg’sHeisenberg’shidden CAT washidden CAT wasalive or dead...alive or dead...probably dead probably dead by now anywayby now anywayEsta ecuación se resuelveEsta ecuación se resuelve
en forma exacta para unen forma exacta para unsistema de... sistema de...
¡2 partículas!¡2 partículas!
pervertum magister est naturapervertum magister est natura
Bien por tí ¡ya resolviste el hidrógeno! Bien por tí ¡ya resolviste el hidrógeno! Sigue con algo leve... mmm... que talSigue con algo leve... mmm... que tal
La RNAasa: CLa RNAasa: C575575HH907907NN171171OO192192SS1212
y que sean sólo 100 y que sean sólo 100 conformaciones.conformaciones.
What?What?
E. ShrödingerE. Shrödinger
the monkey isthe monkey isout of its mind!out of its mind!
I’d better go back to I’d better go back to the CAT’s the CAT’s problemproblem
En todos los otros casos se require simplificar y aproximar.En todos los otros casos se require simplificar y aproximar.Entre mayor el problema menos confiable la aproximación...Entre mayor el problema menos confiable la aproximación...
PROBLEMAS ENORMESPROBLEMAS ENORMES:: Energías simplificadasEnergías simplificadas
ÁtomoÁtomo11
ÁtomoÁtomo
2 2 ∂+∂+
longitud de enlace
longitud de enlace
ÁtomoÁtomo
4 4 ∂-∂-
Átomo 3Átomo 3
radioradio
ángulo ángulo de de
enlaceenlaceÁtomo 5Átomo 5
++
atra
cción
atra
cción
E total = E covalente + E no covalenteE total = E covalente + E no covalente
E covalente = E l.e. + E a. e.+ E a.t.E covalente = E l.e. + E a. e.+ E a.t.
E no covalente = E coulomb + E VdWE no covalente = E coulomb + E VdW
repulsión
repulsión
VdWVdW
Campos de fuerza de la Mecánica MolecularCampos de fuerza de la Mecánica Molecular
--Ignora los efectos--Ignora los efectoscuánticos y electrónicoscuánticos y electrónicos
--Tiene un importante--Tiene un importanteerror sistemáticoerror sistemático
++Es rápida de calcular++Es rápida de calcular
++Los parámetros++Los parámetrosse pueden ajustarse pueden ajustarsegún se requierasegún se requiera
Campos de fuerzas popularesCampos de fuerzas populares
AMBER: (variantes amber99, amber99SB,GAFF).
CHARMM (charmm27).
GROMOS (gromos87, 96, 53a6)
OPLS
Programas de MM/MDProgramas de MM/MD
AMBER
GROMACS
NAMD
TINKER
EjemploEjemplo
Descargue Swiss PDB viewer
Portal http://spdbv.vital-it.ch/
Siga las instrucciones de instalación
abra el programa
Elija una estructura del depósito de Swiss model
Portal: http://swissmodel.expasy.org/repository/ repository query: “Palabra de búsqueda” elija un resultado descargue y descomprima el modelo (casi al final de la
página) Abralo en Swiss PDB viewer
File/open PDB file... elija el archivo PDB
Tools/compute/energy (Forcefield)... palomita a todo...OK
Analice el resultado, busque energías extremas
Ejemplo...Ejemplo...
Analice el resultado: busque energías extremas
encuentre el sitio con peor energética (más alta)
pique sobre la línea y vea en la estructura el residuoseleccionado
Pase al panel de control (si no está abierto:wind/control panel)
elija el residuo en cuestión+ 2 antes y 2 después
tools/fix selected sidechains/simulated anealing
experiments:3 ... OK
calcule de nuevo la energía y compare los reportes
Métodos de modeladoMétodos de modelado
A pesar de ser un problema NP-completo (muydifícil), se han logrado aproximaciones al problema:Ab initio. Usamos los principios de la física y de la
química (o aproximaciones a los mismos) parapredecir la conformación estable de la proteína(estado de baja energía).
Comparativo. Usamos datos de estructuras 3Dconocidas (moldes) que “en teoría” tengan unplegamiento “comparable” a de la secuencia deaminoácidos que se desea modelar ( secuenciaobjetivo).
Métodos de modelado Métodos de modelado ab initioab initio::
El éxito es limitado y se requiere alguna forma deconfirmación del resultado (de preferenciaexperimental).
Aplicando principios de la mecánica cuánticaSoluciones completas, sólo en péptidos pequeñosMétodos “divide and conquer” y “kernels” se
require un modelo aproximado para empezar. Aproximaciones de mecánica molecular y
simulaciones de dinámica molecular.son más rápidos, pero tienen un error implícito
que hace incierto el resultado.para plegar completamente una proteína pequeña
se requieren miles de horas de CPU.hay diferentes campos de fuerzas - ¿cuál usar?
Modelado comparativo: Modelado comparativo: ¿Cómo saber que nuestra secuencia¿Cómo saber que nuestra secuenciaobjetivo tiene una estructura comparable a un cierto molde 3D?objetivo tiene una estructura comparable a un cierto molde 3D?
A) Datos espectroscópicos
i.e. se require información experimental, no siempre disponible
B) El molde y el objetivo son proteínas homólogas(modelado por homología), por tanto, su plegamiento separece en medida de su similitud en secuencia.
esto no siempre es cierto: proteínas homólogas pueden tener plegamientos distintos proteínas heterólogas pueden tener plegamientos semejantes
entre menos similitud exista la correlación estructural es másdébil... ¿en qué nivel de similitud un molde ya no es útil?
El problema del enhebrado (threading)El problema del enhebrado (threading)
Modelado por enhebrado es el alinear losátomos de una secuencia de aminoácidos a lasposiciones atómicas de un motivo deplegamiento tridimensional de una proteína. el motivo molde puede ser experimental o teórico.el problema es NP-completo (muy difícil).¿cómo saber a que posición del motivo
corresponde cada aminoácido?¿qué hacer si la longitud de la secuencia objetivo
es más larga o más corta que el molde?
Métodos bioinformáticos para el estudio deMétodos bioinformáticos para el estudio deinteracciones proteína-ligandointeracciones proteína-ligando
modelado estructuralmodelado estructural
Universidad Nacional Autónoma de México
Rogelio Rodríguez-Sotres
Facultad de Química
Alineamiento de secuenciaAlineamiento de secuencia
Una manera de atacar el problema deenhebrado es aprovechar la similitud desecuencia...¿cómo lograr la mejor correspondencia?
de nuevo el problema es NP-completo (muy difícil) ¿hasta que punto la concordancia de propiedades de
dos aminoácidos es suficiente para hacerlosequivalentes en la estructura?
¿cómo garantizar que al realizar dicho alineamiento setendrá la mejor concordancia de contactos vecinos anivel tridimensional?
Evaluación de la CalidadEvaluación de la Calidad
¿Está el modelo realmente en un mínimoenergético?
¿es posible mejorar el modelo (reducir suenergía)?
¿qué tanto se desvía esta conformación es laque encontramos en la naturaleza (la cual esdesconocida)?
¿es posible aproximarnos a la estructura nativasin saber cual es?
Una limitación mayor:Una limitación mayor: ¿Cómo saber si el modelo sirve sin recurrir ¿Cómo saber si el modelo sirve sin recurrira datos experimentales (X-ray, NMR)?a datos experimentales (X-ray, NMR)?
Concursos CASP: critical assesment of the structure ofproteins
La estructura es conocida pero sólo por los jueces
Los concursantes someten sus propuestas pueden ser máquinas (servidores) pueden ser grupos humanos
Los jueces evalúan la calidad de las propuestas
Programas de evaluación de calidad
Consistencia estructural
Relevancia biológica
Hasta la fecha no ha sidoHasta la fecha no ha sidoposible encontrar las clavesposible encontrar las claves
del plegamiento de lasdel plegamiento de lasproteínasproteínas
????
-¡10 -¡10 Å RMSD de objetivo !Å RMSD de objetivo !¡Castigado!¡Castigado!
-pero si seguí sus indicaciones y-pero si seguí sus indicaciones ytrabajé ... 35000 evaluaciones detrabajé ... 35000 evaluaciones deenergía son muchasenergía son muchas
ProfesorProfesor Dr. CaspDr. Casp
Estudiante Estudiante Mr. Concur SanteMr. Concur Sante
Métodos de evaluación de la calidad:Métodos de evaluación de la calidad: Consistencia Consistenciaestructuralestructural
Desviación de los valores canónicos encaracterísticas estructurales
Contactos faborables/desfaborables entrevecinos en el espacio alejados en secuencia
Métodos de evaluación de la calidad:Métodos de evaluación de la calidad: Consistencia Consistenciaestructuralestructural
Desviación de los valores canónicos en:distancia de enlaceángulos de enlaceángulos de torsión (dihedrales).
Vecinos en el espacio alejados en secuencia
Métodos de evaluación de la calidad:Métodos de evaluación de la calidad: Consistencia Consistenciaestructuralestructural
Desviación de los valores canónicos
Vecinos en el espacio alejados en secuenciaimpedimentos estéricosrepulsión/atracción electrostática
fuerzas de dispersión (contactos de Var der Walls) puentes de hidrógeno puentes salinos
efectos entrópicos libertad conformacional efecto hidrofóbico
Métodos de evaluación de la calidadMétodos de evaluación de la calidadRelevancia BiológicaRelevancia Biológica
¿Realmente representa el modelo generado lamanera en que la secuencia objetivo se pliegaen los sistemas biológicos?
¿Cómo contestar a esta pregunta sidesconozco la estructura final?Se puede contestar a esta pregunta si encuentro
alguna característica en las proteínas conestructura conocida, que permita establecer unacorrespondencia clara entre las coordenadasatómicas de la estructura y su secuencia.
Si tal característica existe, puede evaluarse en losmodelos
La búsqueda de un algoritmo para elLa búsqueda de un algoritmo para elplegamientoplegamiento
esqueleto coordenadas atómicas 3D
Secuenciaalgoritmo inverso
algoritmo directo
La mayoría de los intentos se han enfocado en la búsqueda de unalgoritmo directo, pero es posible encontrar un algoritmo inverso
desde la estructura hacia la secuencia y más importante ...
¿Qué podemos aprender de ello?
Coordenadas 3DCoordenadas 3D
1 secuencia1 secuencia
algunas secuenciasalgunas secuencias
muchas secuenciasmuchas secuencias
Correspondencia biunívoca,Correspondencia biunívoca,información precisainformación precisa
degeneración* bajadegeneración* bajainformación valiosainformación valiosa
degeneración* elevadadegeneración* elevadainformación escazainformación escaza
¿cómo es la correspondencia estructura secuencia?¿cómo es la correspondencia estructura secuencia?
(*) se refiera a la degeneración del código de información(*) se refiera a la degeneración del código de información
Propiedades esperadas para un algoritmo inversoPropiedades esperadas para un algoritmo inverso
Se han observado plegamientos muysemejantes con secuencias diferentes, estoindica que el algoritmo debe ser degenerado.
Pero hay una conservación significativa en lassecuencias de proteínas con el mismoplegamiento, la degeneración debe sermoderada.
Algoritmo Rd.HMM*Algoritmo Rd.HMM*
Rosetta design (Rd)‡ ( David Baker, University of Washington, Department of Biochemistry ).Asigna residuos al esqueleto en gran concordancia con las estructuras delPDB)
((‡‡)) Kuhlman et al. Kuhlman et al. (2003). Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy (2003). Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy Science 302, 1364-8.Science 302, 1364-8.((‡‡) ) Misura et al.Misura et al. (2006). Physically realistic homology models built with ROSETTA can be more accurate than their (2006). Physically realistic homology models built with ROSETTA can be more accurate than theirtemplates templates Proc Natl Acad Sci U S A 103, 5361-5366. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 5361-5366. ((‡‡) ) Rothlisberger et al.Rothlisberger et al. (2008) Kemp elimination catalysts by computational enzyme design. (2008) Kemp elimination catalysts by computational enzyme design. Nature 28(836):online-Nature 28(836):online-10.1038/nature0687910.1038/nature06879((‡‡) ) Jiang et al.Jiang et al. (2008) De Novo Computational Design of Retro-Aldol Enzymes. (2008) De Novo Computational Design of Retro-Aldol Enzymes. Science 319(5868):1387-1391Science 319(5868):1387-1391
††Martínez-Castilla, L. P. and Rodríguez-Sotres, R. (2010) Plos one 5, e12483Martínez-Castilla, L. P. and Rodríguez-Sotres, R. (2010) Plos one 5, e12483
y “HMMer” y “HMMer” (Sean R. Eddy, Washington University*)(Sean R. Eddy, Washington University*)
ProcesoProceso Markoviano:Markoviano:es una cadena aleatoria de estados enes una cadena aleatoria de estados enla que los estados futuros dependenla que los estados futuros dependensólo del estado presentesólo del estado presente
Trasiciones de estado en un ModeloTrasiciones de estado en un ModeloMarkovianoMarkoviano Oculto Ocultox —x — estados (ocultos)estados (ocultos)y —y — salida (observable)salida (observable)aaijij — — probabilidades de las transicionesprobabilidades de las transiciones
(ocultas)(ocultas)b — frecuencias de emisión (observables)b — frecuencias de emisión (observables)
HMM=ModeloHMM=Modelo MarkovianoMarkoviano oculto:oculto: Modelo estadístico de un Modelo estadístico de un procesoproceso MarkovianoMarkoviano con parámetros con parámetrosdesconocidosdesconocidos
(*) (*) Eddy SR(2004) Nature Biotech. 22:1315.Eddy SR(2004) Nature Biotech. 22:1315.
El programa HMMER construye un modelo Markoviano ocultoEl programa HMMER construye un modelo Markoviano ocultode un alineamiento...de un alineamiento...
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
1 e 9 g 2 0 0 1 0 . p d b N F T V A K V G A P G A E N F A T A V R L N G F P V S A H H D I P L H Y D E N N N K F L T V I E I P K G Q Q A D L R I M L W Y Q L D P I M P A R Q N G Q L R F E K K V A D A E G A E T N F G A L P E T H1 e 9 g 4 0 0 2 2 . p d b N F T V A I V G A E N A E N F A T A V R L N G F P V S A H H D I P L H Y D E N N N L F L V V I E I P K G Q Q A D K R I I L W Q P L D P I R I A R Q N G Q L R F R K K V A D H E G A D S N E G A L P E T H1 e 9 g 3 0 0 0 5 . p d b N F T V D K V G A P G A E N F R T A V R L N G F P V S A H H D I D A H Y D E N N N I F K T V I E R P K G Q Q A D K R I L L W E P G D P I G I A R E N G Q L R F E K K V A D Q E G A N S N E G A L P E T H1 e 9 g 3 0 0 2 9 . p d b N F T V I K V G A P G A E N F R T M V A L N G F P V S A H H A I P A H A D E N N N I F K T V I E I P K G Q Q A D K R I L L W E P G D P I G I A R Q N G Q L R F E K K V A D Q E G S N S N R G A L P R T L1 e 9 g 2 0 0 0 5 . p d b N Y T V E K I G A P G A E N F R T H V R L N G F P V S A H H D I D A H Y D E N N N K F K T V I E I P K G Q Q A D K R I L L W E P G D P I G I A R Q N G Q L R F D K K V A D Q E G A N T N F G A L P E T L1 e 9 g 6 0 0 1 3 . p d b N F T V E K I G A P G A E N F A T H V R L N G F P V S A H H D I D A H Y D E N N N E F K V V I E I P K G Q Q A D L T I A L W Y P G D P I T P S R Q N G Q L R F R K K V A D A E G S T S N T G A L P E T H1 e 9 g 6 0 0 2 5 . p d b N F T V E I I G A P G A E N F A T H V R L N G F P V S A H H D I D A F A D K N N N I F K V V I E R P K G Q Q A D K S I A L W Y V G D P I T I R R Q N G Q L R F D K K V L D A V G D T S N S G S L P R T H1 e 9 g 2 0 0 5 8 . p d b N F T T A E I G A P G A E Q Y A T H V R L N G F P V S A H H D I P A H Y D E N N H K F L T V I T I P K G Q Q A D L Q I I L W Q V G D P I R P A R Q N G Q L R F E K K V A D H E G S D S N R G H L P E T H1 e 9 g 6 0 0 1 5 . p d b N F T V A K I G A E G A E N F L T H V R L N G F P V S A H H D I P A H Y D E N N N L F L T V I E I P K G Q Q A D K A I L L W Y P G D P I G I R R R N G Q L R F E K K V A D H E G S D S N R G A L P E T H1 e 9 g 6 0 0 7 9 . p d b N F T T E E I G A K G A E N Y A T H V R L N G F P V S A H H D I P A H Y D E N N K L F L T V I E I P K G Q Q A D L R I M L W Y P G D P I M P A R E N G Q L R F E K K V A D H E G M D V N W G A L P E T HC o n s e n s u s N T G A A E T V L N G F P V S A H H I D N N F V I P K G Q Q A D I L W D P I R N G Q L R F K K V D G N G L P T
1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0. . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . |
1 e 9 g 2 0 0 1 0 . p d b L K S N R V H N N T N A P G A G V A I L V S V H S N R V G E T G K V T V V I A L G I T F L I E N G Y A S P V V H A V E V E A P L A N L L T S A S D I Q I F H P G Q L E N D L K F Y W T K E I A E G Q P P1 e 9 g 4 0 0 2 2 . p d b L K S N E V H D E T N S P G S G E A I R V S V H S N D V G Y T G A V I V T E A L G I T H L I R N G Y S D P V V H A V R V E D D L S S L L T S A N D I Q I F H P G Q L E N D L K F H W T E E I A E G Q P P1 e 9 g 3 0 0 0 5 . p d b N K S N E V V N Q T N S P G D G T A S H V E V H S N E V G E T G R V E T V K A T G V T H E E N N G Y D D D N V H A I R T D A P L A D L V T S A N D N Q I F F P G Q E N N D K K F H I T R E I A H G Q P P1 e 9 g 3 0 0 2 9 . p d b L K S N E V W N N T N A P G S G T A I H V S V H S N R V G E T G K V T E V K A T G I T L L E E N G Y A S P V V H A I E V E A P L A D L V T S A N D N Q I F F P G Q E E N D L K F F W T K E I A E G Q P P1 e 9 g 2 0 0 0 5 . p d b N K S N E V D D Q T N S P G N G T A S L V S V H S N R V G E T G A V I V V I A T G T T H L I R N G Y N A D I I H A I E V K A P L A N L V T S A N D V R I F F P G Q E D N D K K F W I T K E I A E G Q P P1 e 9 g 6 0 0 1 3 . p d b L K S N E V H D N T N S P G S G T A I L V S V L S N R V G E T G A V I V T R L T G V M L L I R N G Y S A P V L F A I E V K A P L A D L V T S A D D V K I F F P G A L D N A K K F W I T S E I A E G Q P P1 e 9 g 6 0 0 2 5 . p d b L K S N E V H D E T N S P G S G T A I N V S V H S N R V G Y T G A V I K T K A T G I T H L T R N G Y S N P V V H A I E V K A P L A D L V T S A N D N Q I F F P G Q E N N D K K F Y I T S E I A E G Q P P1 e 9 g 2 0 0 5 8 . p d b L K S N E V H D N T N A P G S G T A I H V S V H S N L V G Y T G A V I V V I A T G I T F E I R N G Y S H P V V H A I S T T A P L S S L V T S A N D V Q I F F P G Q E N N D K K H H I T H E I A E G Q P P1 e 9 g 6 0 0 1 5 . p d b M K S N E V H D Q N N S P G A G Q A A H V S V H S N L V G E T G A V I V V Y A T G V T H E I R N G Y S H D V V H A I S T T A P L A N L V T S S S D N R I F F P G Q E D N D K K H H I T H E I A E G H P P1 e 9 g 6 0 0 7 9 . p d b L K S N E V V D N T N A P G S G T A I N V A V V S N L V G E T G A V I V V Y A T G I I L L I R N G Y A D P V V I A I S T T A P L S S L V T S A N D I Q I F F P G L L E N I L K H H I T E E I A H G H P PC o n s e n s u s K S N V N P G G A V V S N V G T G V G N G Y A L L T S D I F P G N K T E I A G P P
HMMERHMMER HMMHMM
Comparación deComparación denuevas secuenciasnuevas secuenciascontra el modelocontra el modelo
ProbabilidadProbabilidadyy
CalificaciónCalificaciónde pertenenciade pertenencia
Discriminación:Discriminación:¿Pertenece o no¿Pertenece o noal grupo?al grupo?
Y permite buscar secuencias queY permite buscar secuencias queprobablemente pertenecen al modeloprobablemente pertenecen al modelo
El agoritmo (Rd·Hmm)El agoritmo (Rd·Hmm)
Coordenadas atómicas (esqueleto fijo)Coordenadas atómicas (esqueleto fijo)
Quitar los aa's nativos yQuitar los aa's nativos yponer aa's al azarponer aa's al azar
(intermediario inestable)(intermediario inestable)
Reconstruir múltiples estructuras,Reconstruir múltiples estructuras,permitiendo libre elección de aa'spermitiendo libre elección de aa's
Extraer las secuencias,Extraer las secuencias,alinearlas y generar un HMMalinearlas y generar un HMM
Buscar la Base de DatosBuscar la Base de Datos
1mo0f_0147.pdb DNPG-KYS-A-KIILDRGSYYVVLGDNEEIYRYGKSRDEAA-KEK-KH-A1mo0f_0147.pdb DNPG-KYS-A-KIILDRGSYYVVLGDNEEIYRYGKSRDEAA-KEK-KH-A1mo06_0121.pdb DFPG-KYS-A-KLILDDGSYYVALGDNEEVYRYGKSRDEAA-KEK-LH-A1mo06_0121.pdb DFPG-KYS-A-KLILDDGSYYVALGDNEEVYRYGKSRDEAA-KEK-LH-A1mo0f_0068.pdb DFPG-QYS-A-KIILDRGMYYVILGHNELVYRYGQSRDDVA-KEV-LH-A1mo0f_0068.pdb DFPG-QYS-A-KIILDRGMYYVILGHNELVYRYGQSRDDVA-KEV-LH-A1mo06_0135.pdb DFPG-QYS-A-KLIIDDGSWYVILGHNELVYRYGVSRDEAA-KET-LH-A1mo06_0135.pdb DFPG-QYS-A-KLIIDDGSWYVILGHNELVYRYGVSRDEAA-KET-LH-A1mo0f_0135.pdb DFPG-QYS-A-KIIIDRGMWYVVLGLNELVYRYGVSRDEAA-KET-KH-A1mo0f_0135.pdb DFPG-QYS-A-KIIIDRGMWYVVLGLNELVYRYGVSRDEAA-KET-KH-A
ROSETTA DESIGNROSETTA DESIGN
HMMerHMMer ??
AlineamientoAlineamiento
nrnr
Dado un plegamiento, Dado un plegamiento, ROSETTA designROSETTA design asigna cadenas laterales de entre una lista asigna cadenas laterales de entre una listade aa's permitidos para cada posiciónde aa's permitidos para cada posición
EjemplosEjemplos
Apirasa humana (pdbid 1S1D, 1S18)Apirasa humana (pdbid 1S1D, 1S18) Rd·Hmm de 13 intermediarios X 77 reconstrucciones = 1001 secuencias.
hmmsearch - search a sequence database with a profile HMMHMMER 2.3.2 (Oct 2003)Sequence database: NCBI-nr Total sequences searched: 5878462Query HMM: cpx_1S1D_a-O [HMM was calibrated; E-values empirical estimates]Scores for complete sequences (score includes all domains): : 110 hitsSequence Description Score E-value N -------- ----------- ----- ------- ---gi|47168960|pdb|1S18|A Chain A, Structu 334.4 1.3e-94 1gi|112491029|pdb|2H2N|A Chain A, Crystal 334.4 1.3e-94 1gi|20270339|ref|NP_620148.1| calcium activate 334.4 1.3e-94 1gi|22218108|gb|AAM94564.1|AF328554_1 soluble calcium- 334.4 1.3e-94 1gi|114670750|ref|XP_523734.2| PREDICTED: calci 333.8 1.9e-94 1gi|112491033|pdb|2H2U|A Chain A, Crystal 333.8 1.9e-94 1...gi|74764847|sp|O96559|APY_CIMLE Apyrase precurso 135.8 7.5e-35 1gi|119609954|gb|EAW89548.1| calcium activate 130.4 3.3e-33 1gi|77696457|gb|ABB00907.1| 35.3 kDa salivar 120.9 2.4e-30 1...gi|10443907|gb|AAG17637.1|AF261768_1 salivary apyrase 109.6 5.9e-27 1gi|61817259|gb|AAX56357.1| 35.5 kDa salivar 106.2 6.1e-26 1gi|4928274|gb|AAD33513.1|AF131933_1 putative apyrase 103.4 4.5e-25 1...gi|67465798|ref|XP_649057.1| apyrase [Entamoe 33.5 1.3e-05 1gi|67472519|ref|XP_652062.1| apyrase [Entamoe 5.4 0.0025 1gi|165900885|gb|EDR27110.1| Apyrase precurso 0.7 0.0062 1gi|71280063|ref|YP_271339.1| response regulat -55.1 2.3e+02 1...gi|119358104|ref|YP_912748.1| lipase, class 3 -55.7 2.5e+02 1gi|163799550|ref|ZP_02193457.1| AMP-dependent sy -55.8 2.6e+02 1gi|31455467|dbj|BAC77359.1| putative NFkB ac -55.8 2.6e+02 1...
primer hit
primer hit
NCBI-nr: las 5 secuencias más cercanas >gi|47168960|pdb|1S18| Structure And Protein Design Of Human Apyrase ...>gi|112491029|pdb|2H2N|A Crystal Structure Of Human Soluble Calcium-Activated Nucleotidase >gi|20270339|ref|NP_620148.1| calcium activated nucleotidase 1 [Homo sapiens]...>gi|22218108|gb|AAM94564.1|AF328554_1 soluble calcium-activated nucleotidase 1 [Homo sapiens]>gi|114670750|ref|XP_523734.2| PREDICTED: calcium activated nucleotidase 1 isoform 4
[Pan troglodytes]gi|114670752|ref|XP_001158629.1| ...
Última secuencia recuperada con significancia estadísticagi|165900885|gb|EDR27110.1| Apyrase precurso 0.7 0.0062 1
Probando el algoritmo Rd·hmm con modelos sometidosProbando el algoritmo Rd·hmm con modelos sometidosal concurso CAPSal concurso CAPS
Se tomaron modelos de los concursos CASP (2006 &2007, si la estructura llegó al PDB)
Se eligieron modelos buenos y malos según loscriterios de calidad del CASP. Sus Rd·hmm recupera:
su secuencia con un log(E) << -10, para modelosmuy buenos.
su secuencia con un E significativo, pero no tanpequeño, para modelos intermedios
Nada, o a veces, el molde empleado para hacer elmodelo, en los modelos erróneos.
Comparar modelosComparar modelos
Veamos el resultadoVeamos el resultado
ResultsResults
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 1 pdb|2GZX|A TatD-dnase 7.7e-53 1 pdb|2GZX|A TatD-dnase 7.7e-53 127 pdb|1J6O|A TatD-dnase 5.1e-26 127 pdb|1J6O|A TatD-dnase 5.1e-26
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 2 pdb|1J6O|A TatD-dnase 4.9e-49 2 pdb|1J6O|A TatD-dnase 4.9e-49 37 pdb|2GZX|A TatD-dnase 7.7e-43 37 pdb|2GZX|A TatD-dnase 7.7e-43
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 23 pdb|2GZX|A TatD-dnase 1.0e-08 23 pdb|2GZX|A TatD-dnase 1.0e-08 53 pdb|1J6O|A TatD-dnase 6.7e-07 53 pdb|1J6O|A TatD-dnase 6.7e-07
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 1 ref|ZP_01313406.1| TatD-related dnase 2 1 ref|ZP_01313406.1| TatD-related dnase 2 5 pdb|1J6O|A TatD-dnase 44 5 pdb|1J6O|A TatD-dnase 44
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 1 ref|ZP_00143920.1| SEC-IND. PROT TATD 0.77 1 ref|ZP_00143920.1| SEC-IND. PROT TATD 0.77 3 ref|YP_591104.1| TatD-related dnase 2.8 3 ref|YP_591104.1| TatD-related dnase 2.8
hit# ID Description E-value hit# ID Description E-value 1 ref|NP_743856.1| 2-pyrone-4,6-dicarb.Hdr 19 1 ref|NP_743856.1| 2-pyrone-4,6-dicarb.Hdr 19 2 2FFI|A 2-pyrone-4,6-dica 37 2 2FFI|A 2-pyrone-4,6-dica 37
PoorPoor WrongWrong
CrystalCrystal CloseClose
WideWide NarrowNarrow
1J601J602GZX2GZX
T0315_pT0315_p
El modelo cercano es intermedio entreEl modelo cercano es intermedio entrelos cristales 1J60 y 2GZXlos cristales 1J60 y 2GZX
El modelo cercano es intermedio entreEl modelo cercano es intermedio entrelos cristales 1J60 y 2GZXlos cristales 1J60 y 2GZX
El modelo incorrecto y su “pariente” estructuralEl modelo incorrecto y su “pariente” estructuraldistante 2FFIdistante 2FFI
Secuencias no relacionadas, peroSecuencias no relacionadas, peroestructuras 3-D ...estructuras 3-D ...