Laboratorio 9: Familia Enterobacteriaceae

Métodos de Identificación Rápida

Biol: 3725L

Objetivos

Conocer los métodos rápidos para la

identificación de bacterias (API 20E,

Enterotubo II, Biolog y Vitek).

Inocular un desconocido en varias

pruebas bioquímicas

Tomar datos de las reacciones bioquímicas

después de 24 horas de inoculación.

Características generales de

la familia Enterobacteriaceae Bacilos (o coco-bacilos)

Gram negativos

No producen esporas

Temperatura óptima entre 32°- 45.5°C.

Anaerobios facultativos.

Algunos producen cápsula.

Algunos fermentan lactosa.

Pueden ser mótiles (flagelo).

Flora normal del intestino de animales de sangre caliente.

Catalasa positivos

Oxidasa negativos

Causantes de enfermedades nosocomiales.

Patógenos humanos más comunes.

Miembros de la

Familia Enterobacteriaceae

Citrobacter sp.

Enterobacter sp.

Escherichia sp.

Klebsiella sp.

Morganella sp.

Proteus sp.

Providencia sp.

Salmonella sp.

Serratia sp.

Shigella sp.

Yersinia sp.

Salmonella typhimurium

Shigella dysenteriae

Salmonella enteritidis

Yersinia pestis

Serratia marcescens Klebsiella

pneumoniae

Los géneros patogénicos más comunes se clasifican en tres grupos

Coliformes: bacilo, Gram -, fermentan lactosa a gas y acido, microbiota normal, pueden ser patógenos oportunistas.

No coliformes oportunistas: no fermentan lactosa.

Patógenos verdaderos

Miembros de la

Familia Enterobacteriaceae

Enfermedades

Gastrointestinales

Tracto urinario

Meningitis

Septicemia

Pneumonia

Modo de Transmición

Alimentos

contaminados

Persona a Persona

Agua contaminada

Contacto con animal

Ruta Oral

Propiedades virulentas de E.coli

Enterohemorrágico

Diarrea en humanos, bovinos, gatos y perros.

Escherichia coli O157:H7

Clasificada de acuerdo a sus antígenos somáticos

(O) y flagelares (H).

Tolerancia acídica (pH bajo)

Tolerante a muchos antibióticos

Escherichia coli O157:H7

Causa principal de colitis hemorrágica o diarrea con presencia de sangre.

Puede progresar a Síndrome Urémico Hemolítico. Afecta riñones

Puede causar Púrpura Trombocitopenia Trombótica Moretones

Disminución de plaquetas (trombocitos)

Trombos (coágulos en los vasos sanguíneos

Métodos rápidos de identificación

de la Familia Enterobacteriaceae

Métodos rápidos de identificación

20 microtubos con sustratos

deshidratados (rehidratación

con suspensión de bacteria)

Se pueden identificar 127

géneros y 550 spp.

diferentes

Bacterias oxidasa-negativo

Gram-negativo de la familia

Enterobacteriaceae y otros

Gram -

API 20E (Analytical Profile Index)

Provee muchos resultados de una sola inoculación.

API 20E

Incubar a 35-37ºC

18-24 hrs

API 20E

Provee lectura de 22 pruebas

bioquímicas

Utilización

Se genera anaerobiosis con aceite

mineral estéril en pruebas cuyas siglas

están subrayadas:

Ej. ADH, LDC, ODC, etc

Las pruebas marcadas con un recuadro

inferior, se deben llenar completamente:

Ej. CIT,VP, etc.

Procedimiento de API 20E

Preparación de la suspensión

Inocule una colonia (2-3mm diámetro) del cultivo puro

de su bacteria en solución salina 0.85%

Asegúrese que la suspensión sea homogénea.

•Luego de hacer la suspensión

inocular los microtúbulos de

API 20E

•Añadir 5 ml de agua en la

bandeja de incubación para

proveer atmósfera húmeda.

Procedimiento de API 20E

Como llenar los microtúbulos

¿Como se lee el API 20E?

Aminoácidos analizados son (en orden) arginina, lisina y

ornitina.

Decarboxilación: reacción alcalina (cambio de color a

rojo)

Carbohidratos analizados son glucosa, manitol, inositol,

sorbitol, ramanosa, sacarosa, melibiosa, amygdalina y

arabinosa.

Fermentación: reacción ácida (cambio de color a

amarillo)

Producción de H2S e hidrólisis de gelatina (cambio a color

negro en todo el microtubo).

Interpretación del API 20E

Apuntar los resultados en la tabla de tabulación (1, 2, o 4 puntos para reacciones +, 0 puntos para reacciones -) .

La prueba de oxidasa debe ser negativa.

Tres pruebas son añadidas a la vez para dar un código de 7 dígitos (profile index number), el cual es interpretado en el manual de códigos.

Desventajas de API 20E

Solo para microorganismos no fastidiosos.

Cepas Gram negativas y oxidasa negativa.

Bacterias de la Fam. Enterobacteriaceae.

De encontrarse Salmonella o Shiguella spp., es necesario llevar a cabo pruebas serológicas para confirmar la identificación.

Ventajas de API 20E Rápido

Eficaz

Permite realizar numerosas pruebas a la vez

API 20E Resultados para diferentes miembros de la Familia

Enterobacteriaceae

Sistema de Enterotubo II

Identificar miembros de la familia

Enterobacteriaceae, fermentadoras de glucosa y

que son oxidasa negativa. (Salmonella, Yersinia,

Escherichia etc.)

Algunas de las pruebas usadas en este sistema

son: Simmon Citrate, Triple Sugar-iron agar,

ureasa entre otros.

Sistema de Enterotubo II Tubo con 12 compartimentos, cada uno

con un medio de cultivo sólido diferente.

15 pruebas estándar preformadas:

Aerobia y anaerobias

Se inocula con una aguja, que se pasa por el centro de los compartimentos

Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC (oscuridad)

Desventajas

Poco preciso

Riesgos de contaminación de las pruebas

Se diagnosticaban erróneamente géneros de bacterias

Sistema Enterotubo II

Lectura

Observar cambios de

color

Identificación:

Estructurar un código de

5 dígitos (Biocode)

Consultar con el manual

ENCISE (Enterobacteriaceae

Numerical Coding and

Identification System for

Enterotube)

Sistemas Computarizados

VITEK

Identificación y/o determinación de reacción antibiótica de

bacterias y levaduras anaerobias (más de 300 especies).

30 pozos con pruebas bioquímicas deshidratadas.

Identificación en 2 a 7 hrs.

La automatización aporta mayor seguridad, suprimiendo las

manipulaciones repetitivas.

Una vez inoculada, queda herméticamente cerrada y por lo

tanto es manipulable sin riesgo de contaminación.

No es necesario añadir ningún reactivo, lo cual evita

cualquier riesgo de olvido o error.

Sistemas Computarizados Inoculador / Sellador

El cual permite la inoculación de las tarjetas en pocos minutos.

Incubador / Lector

Asegura simultáneamente la incubación y la lectura de las tarjetas

para una capacidad que varía de 32 a 480 tarjetas según el modelo.

Ordenador

Efectúa un control permanente de las operaciones en curso,

memoriza los valores, trata e interpreta los resultados.

Impresora

BIOLOG:

Identificación de 1900 bacterias, levaduras y hongos en base a su capacidad enzimática.

Sistema de microplacas de 96 fosas cada una conteniendo una fuente única de carbono, nutrientes básicos y un indicador colorimétrico.

El indicador colorimétrico que utiliza este sistema es una sal de tetrazolium que en su forma oxidada es incolora.

Cuando el organismo es introducido en la gran variedad de sustratos de carbono en la microplaca se produce una huella con un patrón característico.

Los resultados bioquímicos de la muestra son leídos y guardados en segundos automáticamente, eliminando la subjetividad visual de la interpretación.

Sistemas Computarizados

BIOLOG:

Posteriormente son comparados con la extensa base de datos para su identificación final.

Los resultados se interpretan y se registran automáticamente.

Especie identificada se exhibe en un monitor de la pc junto con su patrón de la reacción. También una lista de 10 especies con

los patrones relacionados más cercanos y otra estadística útil.

La tecnología de Biolog es tan sensible que puede detectar cultivos mezclados o contaminados.

Sistemas Computarizados

Práctica

Instrucciones

Escoja una colonia de la placa de MSA o de

MacConkey

Seguir instrucciones del instructor.

Haga las inoculaciones y actividades que le

sugieren los flujogramas.

Incubar a 37ºC/24hrs.

Observar sus resultados y anotarlos.

Recuerden traer su vaso de recolección de

orina para la próxima semana!!

MacConkey

morfología

coco bacilo

Facultativo

+ -

Neisseria

Veillonella

motil Pseudomonas

Alcaligenes

Halobacterium

Flavobacterium + -

Shigella

Klebsiella

Escherichia Enterobacter

Citrobacter Proteus

Providencia Erwinia

Salmonella Morganella

Métodos rápidos de identificación

API 20E

Enterotube

Vitek

Biolog

Lab # 9: Familia Enterobactericeae e identificación

de desconocidos

MSA

morfología

coco bacilo

Catalasa

+ - Staphylococcus 6.5% NaCl

+ Enterococcus - Streptococcus

Esporas

+ - Aeróbico

+ Bacillus - Clostridium

Acid Fast

+ Mycobacterium

-

Regular

Pleomorfo Corynebacterium

Propionibacterium

Arthrobacter

Lactobacillus

Listeria

Kurthia

Fermentación de

carbohidratos

Bile Esculin Agar

M S A

Fermentación del mannitol.

SIM

Sulfide

Indole

Motility

Urease

Recuerden traer su vaso de recolección de

orina para la próxima semana!!