métodos de trabalho em bioquímica vegetal e tecnologia de

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MÉTODOS DE TRABALHO EM

BIOQUÍMICA VEGETAL

E TECNOLOGIA DE ENZIMAS

Coordenador:

Prof. Dr. Fernando Broetto

IBB/UNESP – Campus de Botucatu

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MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS

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© 2014 Editora UNESP

Cultura Acadêmica

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Métodos de trabalho em bioquímica vegetal e tecnologia de enzimas [recurso eletrônico] / coordenador: Fernando Broetto.- Botucatu: IBB, Cultura Acadêmica, 2014.

Recurso digital

Formato: PDF

Requisitos do sistema: Adobe Acrobat Reader

Modo de acesso: World Wide Web

ISBN 978-85-7983-550-6

1. Células e tecidos vegetais. 2. Enzimas. 3. Plantas - Metabolismo. 4. Proteínas - Metabolismo. 5. Bioquímica. 6. Química vegetal. 7. Instituto de Biociências de Botucatu. 8. Cultura Acadêmica. I. Título. II. Broetto, Fernando.

CDD 581.4

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SUMÁRIO

Capítulo 1: Preparo de Tampões e Métodos para Coleta, Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais. ..................................Djanira Rodrigues Negrão, Sthefany Rodrigues Fernandes Viana e Fernando BroettoIntrodução / Preparo de Tampões / Métodos para Coleta / Coleta de folhas ou outros órgãos vegetais/ Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para extração / Obtenção do extrato bruto / Uso de antioxidantes / Centrifugação / Preparo de Soluções / Referências Bibliográficas.

Capítulo 2: Aminoácidos e Proteínas: estrutura química, função e propriedades. ...........................................................................................Thalita Cristina Marques Cervezan, Aline Cristina Rabonato, Enrique Alonso Zuñiga, Fernando Broetto, Juan Plutarco Munguía-LópezAminoácidos / Propriedades Químicas e Elétricas / Curva de Titulação de um Aminoácido / Prática: Titulação de um aminoácido / Procedimento prático / Proteínas / Prática: Determinação de proteínas solúveis totais em tecido vegetal / Referências Bibliográficas

Capítulo 3: Atividade de lipoxigenases. .....................................................................Érica Amanda de Barros, Amanda Cristina Esteves Amaro, Fernando BroettoIntrodução / Material Utilizado / Preparo de Soluções / Procedimento / Resultado e Discussão / Referências

Bibliográficas.

Capítulo 4: Enzimas antioxidativas em pós-colheita de vegetais. .............................Thalita Cristina Marques Cervezan, Mariana da Silva Caldeira, Fernando Broetto Introdução / Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para

extração / Extração enzimática / Análises / Preparo de Reagentes / Resultado / Referências Bibliográficas. Capítulo 5: Enzimas antioxidativas em tecidos vegetais. ..........................................Marcos de Oliveira Bettini, Renata Bruna dos Santos Coscolin, Dayanne Fabrício Bressan, Edilson Ramos Gomes, Fernando BroettoIntrodução / Material e Método / Processamento do material vegetal para obtenção do extrato bruto / Atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) / Atividade da enzima Catalase (CAT; EC 1.11.1.6) / Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) / Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) / Peroxidação de Lipídeos / Referências Bibliográficas.

Capítulo 6: Atividade da enzima Nitrato Redutase. ...................................................Amanda Cristina Esteves Amaro, Érica Amanda de Barros, Marco Antonio Castillo Campohermoso, Fernando BroettoIntrodução / Material e Método / Preparo das soluções / Teste enzimático / Curva padrão de nitrito (NO2) /

Referências Bibliográficas.

Capítulo 7: Análise de proteínas por Eletroforese Nativa. ........................................Mariana da Silva Caldeira, Marcos de Oliveira Bettini, Dayanne Fabrício Bressan, Fernando Broetto Introdução / Procedimentos / Extração de proteínas / Eletroforese / Preparo do sistema / Preparo do gel / Preparo da amostra / Corrida do gel / Atividade das enzimas / Superóxido Dismutase – SOD / Catalase -CAT / Reagentes / Utilizados no preparo dos géis / Utilizados para extração e atividade protéica / Soluções / Gel de separação / Gel de empilhamento / Tampão de reservatório / Tampão de extração / Tampão

fosfato / Tampão de coloração para SOD / Tampão de coloração para CAT / Referências Bibliográficas

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Capítulo 8: Atividade da Invertase de Levedura: valores da constante de Michaelis-Menten (Km) e velocidade máxima (Vm). ..............................................................Sthefany Rodrigues Fernandes Viana, Djanira Rodrigues Negrão, Fernando BroettoIntrodução / Invertase de Levedura / Reação a ser estudada / Determinação de Km e Vm da Invertase de

Levedura / Referências Bibliográficas.

Capítulo 9: Soluções Tampão: Conceito e Preparação. .........................................José Pedro Serra Valente, Fernando BroettoIntrodução / Cálculo do pH de uma Solução Tampão / Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora (Cf) / Prática: Preparação da Solução Tampão / Parte Experimental / Limitações da Equação de Henderson- Hasselbalch com Base nas Concentrações Nominais (Analíticas) / Referências Bibliográficas

Capítulo 10: Espectrofotometria Quantitativa na Região do UV-Vis (180 - 800 nm). José Pedro Serra Valente, Fernando BroettoIntrodução / Banda de Absorção da Molécula e Absorbância Máxima (ëmax.). / Processo de Absorção de Radiação UV-Vis da Molécula (m) / Princípios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - VIS / Lei de Lambert / Lei de Beer / Junção das duas leis / Aspectos Práticos / Requesitos para Quantificação do Analito / Validade da Curva de Referência / Determinação da Concentração do Analito na Amostra / Procedimento Básico para Operação do Espectrofotômetro / Procedimento para Tratamento dos Dados Experimentais / Construção da curva de referência e determinação da concentração desconhecida de um analito / Espectrofotômetro / Esquema do espectrofotômetro / Limitações da Lei de Beer (distorções da

linearidade/erros) / Regra Práticas para Diminuir os Desvios da Lei de Beer / Referências Bibliográficas Capítulo 11: Proteólise enzimática da carne. ........................................................Luis Artur Loyola Chardulo, Jessica Moraes Malheiros, Victor Augusto Domingos Dias, Ana Paula Costa Rodrigues Ferraz, Fernando BroettoIntrodução / Procedimentos e Extração Proteica / Preparo da amostra / Extração das proteínas / Análises / Cálculo / Preparo de Reagentes / Resultado / Referências Bibliográficas.

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MÉTODOS DE TRABALHO EM BIOQUÍMICA

VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS

Os trabalhos de laboratório, muitas vezes solitário ou em equipe, requerem planejamento e disciplina visando análises precisas e confiáveis. Para análises bioquímicas em tecidos vegetais, por exemplo, faz-se necessário uma gama de procedimentos que vão desde a coleta e processamento, até a melhor maneira de armazenar os extratos e por fim a análise da atividade enzimática ou teor de compostos e macromoléculas de interesse biológico. Este livro foi proposto como desafio para os alunos da disciplina Tecnologia de Enzimas (FCA/UNESP- Campus de Botucatu), como parte de suas atividades acadêmicas. Desafio aceito, o texto foi organizado em capítulos, os quais descrevem diferentes temas e suas metodologias utilizadas em aulas práticas. Esperamos que o texto possa servir de apoio àqueles que necessitem iniciar ou dar continuidade a trabalhos que envolvam análises bioquímicas em tecidos vegetais.

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Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05

Capítulo 1

Preparo de Tampões e Métodos para Coleta, Procedimentos e Extração de Enzimas em

Tecidos Vegetais

Djanira Rodrigues Negrão

Sthefany Rodrigues Fernandes Viana

Fernando Broetto

Introdução

O estudo de enzimas é fundamental em bioquímica e fisiologia vegetal, visto que praticamente, todas as respostas da planta envolvem processos metabólicos, os quais são regulados por diversos complexos enzimáticos. Dada a sua importância, a natureza da estrutura das enzimas e a forma do sítio ativo podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanças conformacionais na estrutura protéica. Isso torna a atividade enzimática dependente do meio ambiente, notadamente do pH e da temperatura.

A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para a qual sua atividade é máxima, e a velocidade da reação diminui à medida que o valor do pH se afasta desse valor ótimo, que é característico para cada enzima, mas com frequência, está próximo do pH neutro. A influência do pH sobre a catálise enzimática só pode ser compreendida à partir da análise dos grupos dissociáveis presentes nos grupos radicais dos aminoácidos.

Assim, para realizar análises enzimáticas de qualquer natureza, i.e. tecidos vegetais, animais ou de microrganismos, normalmente utiliza-se vários reagentes e, dentre esses, o uso de uma solução tampão é um recurso altamente necessário. Um tampão é uma mistura de substâncias químicas que torna possível o extrato enzimático resistir a variações de pH, porém, cada tampão tolera uma variação de pH dentro de uma faixa particular.

1. Preparo de Tampões

Uma solução tampão é a mistura de um ácido fraco e seu sal correspondente, como por exemplo, o ácido acético e o acetato de sódio. Por definição, os ácidos são compostos capazes de dissociar-

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se, liberando H+; já ácidos fracos são compostos em que a dissociação não é completa, restando em solução também uma porcentagem do ácido não dissociado, existindo, portanto, um equilíbrio químico, que pode ser descrito:

Por exemplo, um tampão de ácido acético-acetato de sódio é efetivo entre a faixa de pH 3,5 a 5,5 mas tem pouca capacidade tamponante em pH 7,0. Portanto, esse tampão seria inadequado para a maioria dos microrganismos. Um tampão comumente utilizado pelos pesquisadores é a mistura de um ácido fraco, o fosfato monopotássico (KH2PO4), e seu sal, o fosfato dipotássico (K2HPO4). Esta mistura tem uma forte capacidade tamponante entre pH 6 a 8.

Na prática, quando misturamos as quantidades calculadas do ácido e da base conjugados para preparar um tampão, o pH resultante não é exatamente o esperado. A principal razão dessa discrepância é que o pH é governado pelas atividades do ácido e da base conjugados, e não por suas concentrações. Por esse motivo, após preparar o tampão com as quantidades calculadas, em geral faz-se necessário um pequeno ajuste no pH (pela adição de uma solução básica ou ácida diluídas) para obter o pH desejado.

É importante saber que diferentes soluções contêm diferentes quantidades ou concentrações de compostos dissolvidos. Em bioquímica, geralmente utiliza-se o peso molecular de um composto para expressar a concentração, nesse caso, da solução tampão, lembrando que o peso molecular é a soma dos pesos atômicos de todos os átomos na molécula de um composto.

2. Métodos para Coleta

2.1 Coleta de folhas e outros órgãos vegetais

O material vegetal como, por exemplo, as folhas, deverão ser coletadas no terço médio da planta com uso de estilete. Para a pesquisa com proteínas é recomendável padronizar o local de coleta nas plantas, além de atentar-se ao melhor período do dia para a mesma. Em seguida, o material deve ser acondicionado em tubos tipo Falcon (25 ou 50 mL), microtubos tipo eppendorf ou em envelope de papel alumínio, devidamente identificados (tipo de material vegetal, data da coleta, responsável, etc.).

Após a coleta, o material deve ser rapidamente congelado, a fim de preservar a integridade das moléculas protéicas, em nitrogênio líquido (-196º C). Caso o congelamento ocorra nos tubos do tipo Falcon, retirar o excesso de nitrogênio líquido antes de fechar o recipiente. Outra forma de preservar o material vegetal pode ser feita na forma de discos foliares, com auxílio de um cortador de diâmetro definido. Esses discos podem ser acondicionados em tubos eppendorf (com um pequeno furo na tampa que evita que a mesma estoure devido à pressão do nitrogênio) e depois colocados no nitrogênio líquido para congelamento rápido. O armazenamento das amostras deverá ser feito em ultrafreezer (-80º C), para preservar maximamente a integridade molecular.

É importante ter muito cuidado no transporte e manuseio do nitrogênio líquido. Para tanto, seu

HA ↔ A + H+

Métodos de Trabalho em Bioquímica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.

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transporte é feito em tambor criogênico para evitar acidentes. É aconselhável utilizar luvas e óculos de proteção; para o manuseio do material congelado usam-se pinças e nunca descartar o nitrogênio líquido na tubulação.

3. Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais

3.1 Preparo da amostra para extração

Primeiramente, antes de realizar as extrações, é recomendável que as soluções tampão necessárias para todos os processos de extração sejam previamente preparadas.

A grande maioria das soluções tampão devem ser armazenadas em geladeira, identificados com o nome do tampão, molaridade, pH e a data de preparação. Para maior segurança das análises, recomenda-se utilizar soluções recém-preparadas, além de usar reagentes dentro da data de validade.

Para evitar eventuais alterações bioquímicas no material vegetal a ser analisado, recomenda-se que os utensílios usados (graal, pistilo, pinças) durante as extrações enzimáticas fiquem mantidos em gelo (4 ºC ) durante todo o processo.

O material congelado deve ser macerado em graal na presença de nitrogênio líquido, até a obtenção de um “pó fino”, o qual deve ser armazenado em freezer (-80ºC), devidamente identificado, para a preservação da atividade bioquímica do tecido moído até o momento das análises. Para análises isotópicas, que exigem maior pulverização do material, geralmente as amostras são preparadas em moinho criogênico.

3.2 Obtenção do extrato bruto

Em geral, a quantidade de material vegetal fresco necessário para realizar uma extração é de 300 mg, pesados em balança digital. As amostras do tecido moído e congelado devem ser maceradas na presença de uma solução tampão, onde a concentração molar e pH variam coforme o objetivo da extração. Como mencionado, a função da solução tampão é de estabilizar o pH do meio, para expressão da atividade enzimática.

Ao macerar o tecido vegetal é recomendável colocar, pelo menos, a metade da quantidade da solução tampão necessária para a extração; após a maceração transferir o extrato para o tubo Falcon (devidamente pesado) e a quantidade restante de tampão poderá ser utilizado para lavar o graal, permitindo assim que praticamente todo o material pesado seja analisado.

Eventualmente, dependendo da natureza do tecido vegetal, como os mais fibrosos (raízes, cascas), uma pequena porção de areia lavada (ponta de uma espátula) pode ser utilizada para facilitar a maceração, na presença da solução tampão.

Após a obtenção do extrato bruto, o próximo passo é obter o extrato enzimático. Para tanto, amostras do extrato bruto são acondicionadas em tubos Falcon, juntamente com a solução de extração e/ou outros reagentes necessários para tal e então levados à centrífuga.


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3.3 Uso de antioxidantes

Algumas espécies vegetais geram compostos fenólicos, no ato das macerações, o que poderá interferir substancialmente na atividade enzimática ou outra determinação bioquímica, principalmente aquelas baseadas em métodos óticos. Deste modo, é importante que a oxidação seja controlada pelo uso de antioxidantes, suplementares às soluções tampão. Como exemplos, citam-se o uso do polímero não reativo, o PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) e também o ácido ascórbico, dentre outros.

3.4 Centrifugação

A força centrífuga é um recurso básico na pesquisa em bioquímica vegetal, para separar componentes de densidades diferentes. O processo de centrifugação deve separar as partículas sólidas (pellets) dos compostos solúveis, os quais devem conter o composto ou a proteína de interesse.

Antes de ligar a centrífuga, é necessário fazer o balanceamento dos tubos com as amostras, de modo que fiquem em pares ao encaixá-los nos orifícios do rotor. A centrifugação deve ter velocidade (expressa em g ou rpm) e temperatura controladas, além do tempo de rotação, conforme o protocolo adotado. Geralmente, as extrações são conduzidas a 4 ºC, com velocidade entre 10 e 12.000 x g. Existem ainda ultracentrifugações (acima de 50.000 x g) utilizadas para separações diferenciais ou em gradiente.

Após a centrifugação, o sobrenadante (fase líquida) deve ser recolhido com pipeta automática ou de Pasteur, acondicionado em tubo eppendorf e armazenado em ultrafreezer, até o momento das análises em espectrofotômetro.

4. Preparo de Soluções

Exemplos de preparo de soluções tampão comumente utilizadas em processos de extração enzimática.

A) Solução tampão Fosfato de Potássio 50 mM, com pH 7,8 (1 L):Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4, PM = 136,09 g L).

1 M à 136,09 g L X = 6,8045 g L-1

50 .10-3 M à XFosfato de potássio bibásico (K2HPO4, PM = 174,18).

1 M à 174,18 g L X = 8,7090 g L-1

50 .10-3 M à XDissolver os reagentes em 500 mL de água destilada, aferir o pH desejado e somente depois

completar para o volume final de um litro com água destilada.

B) Solução tampão de NaOH (PM = 40) a 0,05 M (600 mL).


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Podemos obter através de duas formas: Obter o número de moles:

Litros x M à 0,6 x 0,05 = 0,03 moles de NaOH. Número de moles x PM à 0,03 x 40 = 1,2 g. Utilizar os cálculos pela regra de três:

40 (PM) à 1 M x = 0,05 x 40/1 = 2 g L-1 x à 0,05 M ou 1,2 g em 0,6 L C) Expressar a concentração da solução de NaOH (0,05 M, 600 mL) em porcentagem peso volume (% p/v):

% p/v = peso em gramas de um soluto por 100 mL de solução, ou seja: 2,0 g.L-1 = 0,2 g.100 mL-1 = 0,2% (p/v).

D) Solução extratora para polifenoloxidades a 0,2 M, com pH 6,7 (1 litro):KH2PO4 monobásico (solução ácida), PM = 136,09 g (pH 5)

1 molar à 139,09 g x = 27,218 g 0,2 m à x Para preparar 100 mL:

27,218 g à 1000 mL x = 2,72 gx’ à 100 mL

5. Referências Bibliográficas

PASSOS, L.P. Métodos analíticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel Pacheco: EMBRAPA-CNPGL, 1996, 223p.

SKOOG, D.A. et al. Fundamentos de química analítica. 8ª ed. São Paulo: Cengage Learning, 2010, 999p.

TORRES, B.B. Elementos de enzimologia. In: BORZANI, W. et. al. (Coords.) Biotecnologia industrial. v. 1. Edgar Blücher, 2001, 151-176 p.


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Capítulo 2

Aminoácidos e Proteínas: estrutura química, função e propriedades

Thalita Cristina Marques Cervezan

Aline Cristina Rabonato

Enrique Alonso Zuñiga

Juan Plutarco Munguía-López

Fernando Broetto

1. Aminoácidos

O aminoácido é uma molécula orgânica composta por átomos de carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio e, em alguns casos, o enxofre. Os aminoácidos são formados pela junção do grupo amina (NH2), grupo carboxílico (COOH), hidrogênio, carbono α e um radical característico de cada aminoácido (Figura 1).

Figura 1. Estrutura molecular de um aminoácido simples

Através de ligações peptídicas sequenciadas de vinte aminoácidos, as proteínas são formadas. Esses vinte aminoácidos principais possuem características estruturais em comum, pois há a presença de um carbono central α, quase sempre assimétrico, ligados a um grupo carboxila, um grupamento amina e um átomo de hidrogênio.


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O radical representado esquematicamente por “R” é o responsável pela diferenciação entre os aminoácidos e por suas características – polaridade e grau de ionização em solução aquosa. Quanto à polaridade do radical “R” pode-se classificar em apolar, polar não carregado e polar carregado dividido em duas subclasses: carregado positivamente e carregado negativamente.

Os aminoácidos com ramificação apolar possuem o radical “R” geralmente formado exclusivamente por carbono e hidrogênio – grupamento alquila. São oito e caracterizados como hidrofóbicos: Alanina (CH3–CH(NH2)–COOH); Valina (CH3–CH (CH3)–CH(NH2)–COOH); Leucina (CH3(CH2)3–CH2–CH(NH2)–COOH); Isoleucina (CH3–CH2–CH(CH3)–CH(NH2)–COOH); Prolina (–CH2–CH2–CH2 - ligando o grupo amino ao carbono α); Fenilalanina (C6H5–CH2–CH(NH2)–COOH); Triptofano (R aromático - CH(NH2)–COOH); Metionina (CH3–S–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).

Os aminoácidos com ramificação polar não carregado apresentam o radical “R” contendo hidroxilas, sulfidrilas e grupamentos amida. São sete e caracterizados como hidrofílicos: Glicina (H–CH(NH2)–COOH); Serina (OH–CH2–CH(NH2)–COOH); Treonina (OH–CH(CH3)–CH(NH2)–COOH); Cisteína (SH–CH2–CH(NH2)–COOH); Tirosina (OH–C6H4–CH2–CH(NH2)–COOH); Asparagina (NH2–CO–CH2–CH(NH2)COOH); Glutamina (NH2–CO–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).

Os aminoácidos com radical “R” polar carregado são divididos em duas subclasses: “R” carregado positivamente e “R” carregado negativamente. O radical “R” carregado positivamente são aminoácidos diamino e monocarboxílicos, sendo três: Lisina (NH3–CH2–CH2–CH2–CH2–CH(NH3)–COOH); Arginina (HN=C(NH2)–NH–CH2–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH); Histidina (H–(C3H2N2)–CH2–CH(NH2)–COOH). Os aminoácidos com ramificação “R” carregado negativamente são aminoácidos monoamino e dicarboxilicos, sendo dois: Ácido Aspártico (HCOO–CH2–CH(NH2)–COOH); Ácido Glutâmico (HCOO–CH2–CH2–CH(NH2)–COOH).

2. Propriedades Químicas e Elétricas

Todos os aminoácidos são anfóteros, isto é, contêm em sua estrutura pelo menos um grupo ácido (carboxilico) e um grupo básico (α-amino) funcionais que, em solução aquosa, comportam-se como ácido e como base.

Os aminoácidos podem também conter outros grupos facilmente ionizáveis em sua molécula, tais como: grupamentos amino-carboxilíco, p-hidroxifenil, sulfidrilas, guanidino e imidazol. A estrutura básica da cadeia polipetidíca implica na união do grupo carboxílico de um aminoácido com o grupo α-amino de um aminoácido adjacente. O caráter iônico dos polipeptídeos se deve principalmente a estes grupos ionizáveis adicionais aos grupos terminais α-amino e carboxílicos.

Outra propriedade física dos aminoácidos é o alto ponto de fusão, principalmente em sua fração carboxílica. Esta é uma característica de compostos cuja rede de moléculas no estado cristalino é estabilizada por forças eletrolíticas de atração entre grupos de cargas opostas. Estes fatos, bem como outros pontos de evidência levam a conclusão de que os aminoácidos ocorrem em soluções como íons dipolares e não como moléculas dissociadas.

Quando um aminoácido é dissolvido em água, pode se comportar como ácido (doador de


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prótons) ou como base (receptor de prótons). Como ácido: H2N

+ - CH2–COO- ßà H+ + H2N–CH2–COO-

Como base: H2N+ - CH2–COO- + H+ ßà H3N– CH2–COO-

O grupamento carboxila ioniza-se em solução aquosa liberando próton, e adquirindo carga negativa. Por sua vez, o grupamento amina ioniza-se em solução aquosa aceitando próton e adquirindo carga positiva. Este comportamento depende do pH do meio aquoso em que o aminoácido se encontra.

Em meio ácido, os aminoácidos tendem a aceitar prótons, comportando-se como base e adquirindo carga positiva, pois, ionizam em seu radical amina. Em meio básico, os aminoácidos tendem a doar prótons, comportando-se como ácidos e adquirindo carga negativa, ionizam-se em seu radical carboxila.

Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácidos podem existir em duas formas: eletricamente neutra e ionizada. Ao dizer que o aminoácido está eletricamente neutro, significa que o grupo amina está desprotonado (-NH2) e o grupo carboxila protonado (-COOH). Em sua forma ionizada, o grupo amina se encontra protonado (-NH3

+) e o ácido carboxílico desprotonado (-COO-), denominando-se esta forma de zwitteríon - molécula globalmente neutra em termos de carga elétrica, mas possui cargas locais devido à presença de grupos ionizados.

O valor de pH onde as cargas elétricas do aminoácido de igualam e se anulam chama-se ponto issoelétrico, ou pH isoelétrico (pI). O ponto isoelétrico é quando o pH em que a carga líquida da molécula é igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminoácidos e proteínas apresentam carga líquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os aminoácidos e proteínas encontram-se com carga líquida negativa.

3. Curva de Titulação de um Aminoácido

Ao titular um aminoácido é possível determinar o efeito do pH sobre a sua estrutura devido aos processos de desprotonação. Além disso, pode-se determinar a reatividade das cadeias laterais dos aminoácidos e a concentração de uma solução através de uma solução padrão de concentração conhecida. Ao titularmos um aminoácido monoamino e monocarboxilico, temos o seguinte comportamento.

Ponto 1: Aminoácido totalmente protonadoPonto 2: [+NH3CHRCOO-]Ponto 3: Ponto isoelétrico = íon dipolar ou zwitterion (molécula neutra)Ponto 4: [NH2CHRCOO-]Ponto 5: Aminoácido totalmente desprotonado


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3.1 Prática: Titulação de um aminoácido

3.1.1 Procedimento prático

O procedimento prático estudado nesse capítulo irá verificar o comportamento de um aminoácido essencial em contato com um ácido ou uma base. No aminoácido em questão será determinado os valores de pK’ e do pI, aplicando-se a equação de Handerson-Haselbach.

Cálculos envolvidos:pH = pK’ + log [doador prótons] / [receptor de prótons]O pI de um aminoácido pode ser calculado pela seguinte equação:pI = (pKa1 + pKa2) / 2

Materiais e Reagentes- Potenciômetro; Bureta de 25 mL; Agitador magnético; Pipetas; Béquer; Soluções: NaOH 0,1 mol L-1; glicina 0,1 mol L-1; fenolftaleína 5% m/v.

Procedimento:Efetua-se a titulação do aminoácido: Volume de 10 mL da solução de glicina 0,1M é transferido

para um Becker de 100 mL; Adiciona-se 10 mL de HCl 0,1 mol L-1 e 3 gotas de fenolftaleína 5% m/v. Após homogeneização e com o auxílio de uma bureta, titular a solução com NaOH 0,1 mol L-1, anotando-se o valor de pH aferido no potenciômetro, a cada acréscimo de 1 mL da solução alcalina. Acrescentar NaOH até que ocorra a viragem completa do corante e o valor de pH não sofra mais alteração significativa. Distribuir os valores conforme o gráfico (Figura 2) a seguir: (x=mL de NaOH adicionados; Y=pH)

Figura 2. Gráfico obtido pela titulação de glicina 0,1M com NaOH 0,1M

pKa1

pKa2

pI


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Resultados e Discussão:pK1 = (1,95+4,15) à pK1 = 3,05 2pK2 = (8,45+11,63) à pK2 = 10,04 2pI = (3,05+10,04) à pI = 6,55 2

O primeiro pH aferido após a adição do NaOH foi de 1,95 (íons protonados), permanecendo com certa constância até 4,15. À medida que se tem NaOH adicionado, o pH aumenta até o momento em que o grupo carboxila (COOH-) perde seu próton.

Na alteração do pH 4,15 para 8,45 há a formação de um ponto de inflexão, no qual ocorre a remoção completa do próton do grupo amina e inicia-se a remoção do próton do grupo amino (NH3

+). Ao final da titulação, com pH de 11,63, tem-se calculado o segundo ponto pK’. O ponto isoelétrico (pI) calculado pela média aritmética dos valores de pKa obtidos foi de 6,55.

Ao serem comparados com os dados da Tabela 1, com os valores obtidos pela titulação, percebe que o perfil encontrado do aminoácido analisado se assemelha com os dados de glicina já tabelados.

4. Proteínas

As proteínas são as moléculas mais abundantes e funcionais, presentes em praticamente todos os processos vitais. Apresentam uma incrível diversidade de funções, embora todas compartilhem a característica estrutural comum de serem constituídos por aminoácidos.

Quando as proteínas são aquecidas em um meio aquoso, ácido ou básico, as ligações amida sofrem hidrólise liberando os aminoácidos constituintes, cuja identificação implica no conhecimento de suas propriedades físico-químicas. A hidrólise também pode ser realizada através de leveduras que utilizam enzimas para a quebra de molécula. A invertase é comumente usada para quebrar a molécula de sacarose do substrato para absorver a molécula de glicose e frutose que são menores e transformá-las em etanol.

Invertase é encontrada em um grande número de tecido de plantas e são frequentes os relatos que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como raízes e tubérculos de batata, chicória, cenoura e beterraba, a atividade da invertase é baixa em tecidos normais. Entretanto, quando esses tecidos são cortados em discos e lavados em água estéril ou tampão, há um grande aumento na sua atividade.

A análise da atividade da invertase contribui significativamente para a formulação de hipóteses relativas à cinética da interação entre a enzima e seu substrato. Dos dados obtidos da cinética da invertase Michaelis e Mentem propuseram que uma molécula enzimática reage com seu substrato para formar o complexo enzima-substrato.


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4.1 Prática: Determinação de proteínas solúveis totais em tecido vegetal

O método a ser utilizado emprega um corante, Coomassie Brilliant Blue G-250, o qual sendo carregado negativamente liga-se com cargas positivas da cadeia polipeptídica. O corante apresenta em dois picos de absorção: vermelho (Amax.= 465nm) e azul (Amax.= 595 nm). Apesar da predominância da forma vermelha de absorção, a mesma converte-se para a forma azul, quando o corante reage com a proteína. A reação é altamente reproduzível e rápida, completando-se em cerca de dois minutos com estabilidade de cor por até uma hora. No entanto, as leituras devem ser efetuadas após 15 minutos de incubação.

A) ENSAIO Obtenção do extrato*Macerar 500 mg de tecido em 2 mL de tampão fosfato 0, 1 M, pH 6.7Centrifugar por 10 min (4° C) a 5000 rpm e coletar o sobrenadante (extrato bruto); Pipetar três alíquotas de 100 µL (triplicata) de extrato* + 5 mL do reativo de Bradford (agitar);

Ler a absorbância em 595 nm após 15 minutos. Comparar a leitura obtida em espectrofotômetro com o padrão (BSA), através da equação da

reta.Determinar poucas amostras de cada vez para que as leituras não demorem. Utilizar preferencialmente cubetas de vidro ou plástico (metacrilato) e não de quartzo para

evitar a adesão do complexo corante-proteína nas mesmas.

B) PREPARO DAS SOLUÇÕES Comassie Brilliant Blue G-250 Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol 95%; Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% e misturar bem em becker; Diluir até 1 litro em balão volumétrico; Filtrar 2 vezes após completa dissolução e armazenar em frasco escuro em geladeira.Albumina de Soro Bovino - BSA (1 mg ml-1) Dissolver 0,88 g de NaCl (PM = 58,45) em 100 mL de H2O para sol. salina 0,15 M; Dissolver 100 mg de proteína em 100 mL de solução salina 0,15 M Armazenar em freezer.


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C) CURVA PADRÃO Preparar uma solução estoque de BSA (Albumina de Soro Bovino) em concentração final de 1

mg mL-1. Ver procedimento no item B.

Identificação Componentes do ensaio

Tubo No Concentração µg BSA µL H2O µL Comassie brilliant blue (mL) 1 0 0 100 5.0 2 10 10 90 5.0 3 20 20 80 5.0 4 30 30 70 5.0 5 40 40 60 5.0 6 50 50 50 5.0 7 60 60 40 5.0 8 70 70 30 5.09 80 80 20 5.010 90 90 10 5.011 100 100 0 5.0

A figura abaixo representa uma curva padrão típica, obtida a partir de BSA:

Figura 3. Curva padrão – BSA.


Hayashi, F. Y.; César, M. C. - Relatório 1: Titulação de Aminoácidos. Bioquímica Fundamental- ZAB0361. UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Ali-mentos, Departamento de Ciências Básicas, Pirassununga – SP, Maio/2011.

Recife, J. S. - Bioquímica Vegetal. Engenharia Agrícola e Ambiental – EAA1, Egídio Bezerra Neto, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Abril/2010.

Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254, 1976.


19

Capítulo 3

Atividade de lipoxigenases

Érica Amanda de Barros

Amanda Cristina Esteves Amaro

Fernando Broetto

Introdução

As lipoxigenases (LOX) são isoenzimas que estão amplamente distribuídas em plantas e animais superiores. Elas catalisam a adição do oxigênio molecular ao sistema pentadieno dos ácidos graxos poliinsaturados, formando hidroperóxidos dos ácidos graxos correspondentes que se decompõem em ácidos, aldeídos e cetonas de cadeia curta, (AXELROD et al., 1981; LEONI et al., 1985; MACK et al., 1987; VICK; ZIMMERMAN, 1987; BUNKER et al., 1995).

Durante um processo de estresse, ocorrem danos físicos às células vegetais, em razão disso, as lipoxigenases (linoleato: oxigênio oxido-redutase - EC 1.13.11.12) utilizam ácido linolênico (C18:3) ou ácido linoléico (C18:2) como substrato, tranformando-o em hidroperóxidos do ácido graxo, que são rapidamente metabolizados para formar vários produtos.

Dentre esses, estão a traumatina, envolvida na resposta a ferimentos e na indução da divisão celular e formação de calos (SIEDOW, 1991), o ácido jasmônico, associado à ativação de genes que codificam para a síntese de proteínas de reserva e inibidores de proteases (MELAN et al., 1993), os aldeídos voláteis e oxiácidos, que causam efeito inibitório sobre o crescimento de fungos patogênicos (VAUGHN; GARDNER, 1993), insetos e protozoários (CROFT et al., 1993). Esses aldeídos possivelmente agem também como um sinal químico na atração do inimigo natural do herbívoro para a planta danificada (PARÉ; TUMLINSON, 1997).

Foram isoladas quatro isoenzimas, as lipoxigenases L-1, L-2, L-3a e L-3b. Estas isoenzimas diferem entre si em vários aspectos da ação catalítica, tais como pH ótimo de ação, especificidade para substrato, região-especificidade, produtos primários e secundários formados e valor de Km. As isoenzimas L-3a e L-3b são muito similares em suas propriedades e, para fins analíticos, podem ser consideradas idênticas e caracterizadas como L-3 (AXELROD et al., 1981).

As lipoxigenases são proteínas globulares, solúveis em solução salina e consistem em uma cadeia polipeptídica simples, de peso molecular (Tabela 1) em torno de 100 Kda (HILDEBRAND; HYMOWITZ, 1981; AXELROD et al., 1981). São dioxigenases, contendo um mol de ferro em um grupamento não-heme, por mol de proteína, portanto são denominadas metaloproteínas


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(VLIEGENTHRT et al., 1979). O ferro II oxida-se em ferro III, então é retirado um átomo de hidrogênio da cadeia carbônica do ácido graxo e este átomo de hidrogênio se oxida a próton. O radical pentadieno ligado a enzima é convertido em um dieno conjugado que capta o oxigênio. Ocorre então a liberação de hidroperóxido, iniciando assim uma reação em cadeia (MORETTO; FETT, 1998).

As LOX estão presentes em grande variedade de tecidos animais, como aves, peixes e mamíferos (GERMAN; KINSELLA, 1985; GROSSSMAN et al., 1988; HSIEH et al., 1988), e estão envolvidas no passo inicial da biossíntese do ácido araquidônico e de compostos ativos fisiologicamente, como leucotrienos e lipoxinas (NAVARATNAM et al., 1988; KULKARNI; COOK, 1988). Também em tecidos vegetais, tais como folhas (alfafa), sementes (cevada, abóbora, oliveira, girassol, milho, soja), frutos (maçã, tomate), tubérculos (batata). NIELSEN et al. (2003), detectaram e analisaram compostos de aroma, decorrentes da ação da LOX em alho cortado não branqueado. PÉREZ et al. (1999) verificaram LOX em morangos. Dentre as plantas, a semente de soja é a fonte mais rica das enzimas representando cerca de 2% do total de proteínas contidas no grão (AXELROD, 1981).

Os ácidos graxos dos grãos de soja são: os saturados (~15%) palmítico e esteárico; o monoinsaturado oléico (~24%), e os poliinsaturados, linoléico (~54%) e linolênico (~7%). Portanto, a soja constitui-se num dos produtos mais susceptíveis a ocorrência da oxidação dos ácidos graxos (WILSON, 1987).

Os sabores descritos como amargo, adstringente e rançoso, resultantes principalmente da ação da enzima lipoxigenase limitam o consumo dessa leguminosa. Nos grãos de soja íntegros (secos), o substrato não está exposto à ação dessa enzima. A reação só ocorre quando os grãos se quebram e absorvem água (MORAIS; SILVA, 1996).

A atividade da LOX tem sido associada à diminuição da qualidade de vários produtos, e desperta o interesse de muitos cientistas, devido ao seu papel na gênese de compostos voláteis e na formação de radicais livres responsáveis por atacar moléculas de vitaminas, compostos fenólicos e proteínas (DONNELLY; ROBINSON, et al., 1995).

1. Material utilizado

Pistilo e graal; Tubos Falcon; Pipeta automática; Eppendorf; Cubeta de quartzo; Espectrofotômetro; Balança analítica; Grãos de soja cultivares: BRS-213, BRS-258 e Embrapa 48.

2. Preparo de Soluções

Tampão Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0; Solução-estoque de linoleato de sódio 10 mM; Tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5.


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3. Procedimento

Para extrair a enzima dos grãos macerou-se 20 mg da amostra com 2 mL de tampão Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0, a solução macerada foi transferida para tubos falcon e centrifugada a 5.500 rpm por 10 minutos, à 4 °C. O sobrenadante (extrato enzimático) obtido da centrifugação foi pipetado para eppendorf.

A atividade de lipoxigenases (LOX) sobre o ácido linoléico foi determinada segundo o método descrito por Axelrod et al. (1981), o qual se baseia no aumento da absorbância a 234 nm, resultante da formação de um sistema de duplas ligações conjugadas no hidroperóxido formado.

A solução-estoque de linoleato de sódio 10 mM foi preparada adicionando a um erlenmeyer envolvido por papel alumínio, contendo aproximadamente 10 mL de água deionizada, previamente fervida, 78 μL de ácido linoléico (~99%) e 90 μL de Tween 20 (SIGMA). Em seguida, homogeneizou-se a solução, succionando com auxílio de uma pipeta automática e tomando-se o cuidado para não formar bolhas. Para o clareamento da solução, foram adicionadas gotas de solução de hidróxido de sódio 0,5 N. Após o clareamento, a solução foi transferida para um balão volumétrico de 25 mL coberto por papel-alumínio, após a aferição do volume. A solução-estoque de linoleato de sódio foi armazenada em tubos eppendorf, envolvidos em papel alumínio e armazenados em freezer a – 20ºC.

Para as análises das atividades de LOX, adicionou-se 10 μL de extrato enzimático e 40 μL da solução-estoque de linoleato de sódio (substrato) em 500 μL de tampão fosfato 50,0 mM, pH 6,5. A velocidade da reação foi determinada de 20 em 20 segundos, a 234 nm, por um período de 60 segundos. Sob as mesmas condições, procedeu-se com o branco, que consistiu apenas da mesma quantidade de substrato e tampão.

Os resultados foram expressos em mol/min/mg de proteína a partir da expressão:

Velocidade da reação: ∆E x VE x FD x VC ε

∆E = variação da absorbância a 234 nm;

VE= volume do extrato enzimático;

FD= fator de diluição;

VC= volume utilizado na cubeta;

ε = 25000 M-1 cm-1 (coef. de extinção molar dos hidroperóxidos do ácido linoléico a 234 nm).Atividade específica é o número de unidades de enzima por miligrama de proteína (LEHNINGER,

1995). Assim, os valores de atividade específica foram obtidos dividindo-se os valores de atividade pela concentração de proteínas em que a velocidade da reação/ mg de proteína presente na amostra.

A quantificação do teor de proteína no extrato enzimático foi realizada pelo método de BRADFORD (1976), onde a concentração de proteína solúvel presente nos extratos foi determinada em triplicata, com albumina de soro bovino (BSA) como proteína padrão. A curva padrão foi obtida através de uma solução de BSA em concentração final de 1mg mL-1.


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4. Resultado e Discussão

Os resultados médios obtidos para os três cultivares de grãos irradiados diferiram significativamente dos resultados encontrados para os grãos in natura (Controle) em relação à atividade de LOX, provando que as dosagens de irradiação utilizadas nos grãos induziram queda da atividade da lipoxigenase.

Era esperado que os resultados da atividade de LOX do cultivar BRS-213 fossem menores quando comparados aos resultados encontrados para as cultivares BRS-258 e Embrapa 48, pois a BRS-213 é um cultivar modificado, livre da LOX, demonstrando valores médios distantes entre eles. Porém, o cultivar BRS-213 não é livre totalmente de lipoxigenases, apresentando ainda uma atividade residual.

Tabela 1. Atividade específica de lipoxigenases-LOX (nmol. min.-1mg de proteína-1) em três cultivares de soja (Controle) e em grãos irradiados.

Médias seguidas de letras diferentes na coluna indicam diferença significativa pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. *kGy= unidade de dose de irradiação ionizante.

Em relação ao controle, os resultados médios encontrados para os cultivares BRS-258 e Embrapa 48 foram próximos. Os valores obtidos para o cultivar BRS-258 irradiado a 10 kGy demonstrou diferença significativa dos valores expressos para as outras dosagens e o controle. Já o cultivar 48 não apresentou diferença entre as dosagens de 5,0 e 10,0 kGy, e ambas diferiram da dosagem 2,5 kGy e do controle. Portanto, pode-se afirmar para os cultivares BRS-258 e EMBRAPA 48 que quanto maior a dosagem de irradiação maior será a inativação das enzimas lipoxigenases.


AXELROD, B.; CHEESBROUGH, T.M.; LAAKSO, S. Lipoxygenase from soybeans. Methods in enzymology, New York. v.71, p.441-451, 1981.

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BUNKER, T.W.; KOETJE, D.S.; STEPHENSON, L.C.; CREELMAN, R.A.; MULLET, J.E.; GRIMES, H.D. Sink limitation induces the expression of multiple soybean lipoxygenase mRNAs

Dosagem (*kGy)

Atividade de LOX

Cultivares

BRS-213 BRS-258 EMB-48

Controle 0,0125a 1,6883c 1,5068c

2,5 0,0261b 0,9911b 0,8565b

5 0,0170a 0,9613b 0,4696a

10 0,0234b 0,3327a 0,2826a


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while the endogenous jasmonic acid level remains low. Plant Cell, 7:1319-1331, 1995.CROFT, K.P.C.; JÜNTTER, F.; SLUSARENKO, A.J. Volatiles products of the lipoxygenase

pathway envolved from Phaseolus vulgaris (L) leaves inoculated with Pseudomonas syringae pv phaseolicola. Plant Physiol, 101:13-24, 1993.

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Capítulo 4

Enzimas antioxidativas em pós-colheita de vegetais

Thalita Cristina Marques Cervezan

Mariana da Silva Caldeira

Fernando Broetto

Introdução

Após a colheita de frutas e hortaliças inicia-se uma série de processos bioquímicos degradativos que aceleram a senescência, causando perdas de grande parte da produção. Muitas dessas perdas podem ser atribuídas à ação de enzimas durante a pós-colheita (ZANATTA et al., 2006). Existem numerosas enzimas oxidativas que promovem alterações nos alimentos. A maioria das reações metabólicas em frutos e hortaliças é catalisada por enzimas (CHITARRA e CHITARRA, 1990).

Entre elas a polifenoloxidase (PPO), é encontrada praticamente em todos os tecidos vegetais, resultando na formação de pigmentos escuros, proporcionando mudanças indesejáveis nas características sensoriais dos produtos. A polifenoloxidase aparentemente se torna envolvida no metabolismo quando há ruptura da célula e vacúolos com mistura dos seus conteúdos. Isso ocorre durante a senescência quando a integridade da célula é rompida, ativando a PPO latente (PIMENTA, 2001).

O escurecimento desses alimentos durante o processamento e armazenamento provoca uma diminuição na qualidade do produto devido á mudança de cor, aroma e sabor, além das propriedades nutricionais. Essas mudanças são causadas por compostos fenólicos, que são muito encontrados nos vegetais, sendo os maiores responsáveis pela atividade antioxidante.

O grau de escurecimento nos vegetais está relacionada à divergência na concentração destes compostos fenólicos, além da quantidade de oxigênio, substâncias redutoras, íons metálicos, pH, temperatura e atividade de diferentes enzimas oxidativas, especialmente a polifenoloxidase e a peroxidase. O escurecimento enzimático é causado pela produção de polifenólicos complexos, uma reação catalisada primariamente pela PPO, produzindo as quinonas reativas.

As polifenoloxidades (PPO ou POF) são enzimas que promovem a oxidação enzimática de compostos fenólicos, produzindo, inicialmente, quinona que rapidamente condensa, formando pigmentos insolúveis e escuros, denominados melanina. Essas enzimas podem reagir não-


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enzimaticamente com aminoácidos, proteínas ou outros compostos. As polifenoloxidases (PFOs), assim como peroxidases (POX), SOD e outras oxidases, são

enzimas que oxidam substratos orgânicos. Porém, PFOs se diferenciam das demais por catalisarem uma reação de oxidação dependente de oxigênio de monofenóis. A polifenoloxidase geralmente é elevada em tecidos infectados e tem grande importância para as plantas, com envolvimento nos mecanismos de defesa ou na senescência. Em extratos de plantas, a atividade da peroxidase tem sido encontrada na forma solúvel e também ionicamente ligada à parede celular. Além disso, há um aumento em sua solubilidade durante o período de maturação e, consequentemente, um aumento na atividade dessa enzima no pós-climatério.

Figura 1. Mecanismo geral de reação da polifenoloxidase. Fonte: BELITZ e GROSCH (1997).

1. Procedimentos e Extração de Enzimas em Tecidos Vegetais

1.1 Preparo da amostra para extração

A coleta do material vegetal fresco deve seguir recomendações de coleta citadas no Capítulo 1 deste livro. Após a coleta, a amostra macerada em nitrogênio líquido deve ser quantificada, cerca de 500 mg, e ter seu peso devidamente anotado.


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1.2 Extração enzimática

Após quantificação, a amostra será colocada em tubo para centrífuga contendo 5 mL da solução tampão fosfato de potássio pH 6,7 e, posteriormente, acondicionada em centrífuga refrigerada. A centrifugação deverá ser feita a 10.000 rpm por 5 min na temperatura de 0 - 4ºC.

Ao término da centrifugação, deve-se retirar o sobrenadante e armazena-los em vidros pequenos sobre refrigeração.

2. Análises

As análises serão realizadas em espectrofotômetro a 395 nm. Para tanto, prepara-se três tubos de ensaio. O primeiro tubo será o branco da solução, o que irá conter apenas 0,3 mL de solução tampão e 1,85 mL de catecol 0,1M. O segundo tubo será o branco da amostra, que conterá 0,3 mL da amostra e 1,85 mL de água deionizada. Para finalizar, o terceiro tubo receberá 0,3 mL da amostra e 1,85 mL de catecol 0,1 M.

As leituras obtidas pelo equipamento serão anotadas para a determinação da enzima de polifenoloxidades.

Cálculo

Para a determinação da enzima de polifenoloxidades, será necessário usar a seguinte fórmula:

POF = (Leitura/30) x 1000 Peso da amostra

Onde:- 30 é tempo reação- Leitura: a leitura indicada na fórmula é a subtração da “leitura amostra” com a “leitura do branco da amostra”. O resultado “x” obtido deverá ser subtraído da “leitura do branco da solução”, determinando assim o “y”. Veja o exemplo abaixo:

Leitura amostra – Leitura do branco da amostra = xX – leitura do branco da solução = y

- Peso da amostra: deverá ser determinado conforme o esquema abaixo:500 mg à 5 mLX à 1 mL da amostraX= 0,1Unidade: µmol catecol transformado . min-1 g-1 massa fresca


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3. Preparo de Reagentes

A) Solução extratora: Tampão Fosfato de Potássio 0,2 M, com pH 6,7:Cada enzima tem um pH em que a sua atividade é ótima, no caso das POF esse valor é 6,7. Para

o preparo do tampão é necessário fazer as soluções:

Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4, PM = 136,09). 1,0 M à 136,09 g (pH 5) 0,2 M à x x = 27,218 g para 1 L de água deionizada ou 2,21 g para 100 mL de água

Fosfato de potássio bibásico (K2HPO4, PM = 174,18). 1,0 M à 174,18 g (pH 9) 0,2 M à xx = 34,83 g para 1,0 L de água deionizada ou 3,483 g para 100 mL de água

Para ajustar a solução a um pH mais ácido, coloca-se a solução ácida sobre a solução básica, ajustando assim, o pH para ácido. Para ajustar a solução a um pH mais básico, coloca-se a solução básica sobre a solução ácida, ajustando assim, o pH para básico. Para ajustar o pH a 6,7, coloca-se a solução básica em béquer e acerta o pH com a solução ácida até chegar ao valor 6,7.

B) Preparar solução de Catecol a 0,1MDeve-se misturar Catecol com Solução tampão de fosfato de potássio pH 6,7

Catecol:

1,0 M à 110 g

0,1M à x

X = 11g para 1,0 L de solução tampão

Para preparar 50 mL:

11 g à 1000 mL

x à 50 mL

x = 0,55 g para 50 mL de solução tampão

C) Solução de Ácido perclórico (HClO4) 2N

Calcular:

C1 x V1 = C2 x V2

2N x 100 mL = 12,1N x X

X= 165,29 mL


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165,29 mL à 1000 mL

Y à 100 mL

Y= 16,53 mL para 100 mL de água deionizada

4. Resultado

Para compreender melhor a aplicabilidade do processo da enzima polifenoloxidases em pós-colheita, descreve-se roteiro para sua determinação em goiaba e brócolis.

Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 500 mg de cada amostra e extraídas com tampão de extração.

Após realizar as leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotômetro, foi efetuado o cálculo para determinar o teor da enzima.

Tabela 1. Experimento prático sobre a determinação de enzimas antioxidantes em pós- colheita de vegetais

Essa prática é um exemplo simples para demonstrar através do calculo a atividade da enzima polifenoloxidase. É perceptível a diferença entre as amostra analisadas demonstrando haver maior atividade nos Brócolis em relação à Goiaba.


CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. B. Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia e manuseio. Lavras: ESAL/ FAEPE, 1990. 320 p.

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Leituras em AbsorbânciaAmostras Branco Branco da amostra Amostra POF

Goiaba 0 0,014 0,050 12,00Brócolis 0 0,099 0,206 35,67


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Capítulo 5

Enzimas antioxidativas em tecidos vegetais

Marcos de Oliveira Bettini

Renata Bruna dos Santos Coscolin

Dayanne Fabrício Bressan

Edilson Ramos Gomes

Fernando Broetto

Introdução

O estresse oxidativo em vegetais pode ser definido como o desequilíbrio entre a formação e a remoção de agentes oxidantes, decorrente da geração excessiva de espécies reativas de oxigênio (ERO). Segundo Mittler (2002), os agentes oxidantes das ERO são resultantes de uma redução parcial do oxigênio molecular, podendo estes estar forma de oxigênio singleto 1O2, radical hidroxila OH°-, ânion superóxido O2 °

- e peróxido de hidrogênio H2O2 (Figura 1) (SCANDALIOS, 2005; RESENDE et al., 2003; MITTLER, 2002).

Fatores como a deficiência hídrica, variações de luminosidade e temperatura, salinidade, injúrias provocadas por patógenos, uso de herbicidas, entre outros, podem intensificar a formação dessas espécies aumentando sua concentração no meio celular. O principal ponto de produção das ERO durante as situações de estresse são as organelas com alta atividade de oxidação metabólica isto devido ao intenso fluxo de elétrons, exemplo: cloroplastos e mitocôndrias, sendo que nos cloroplastos a formação das ERO esta relacionada aos eventos fotossintéticos.

Os radicais superóxidos são os primeiros a serem formados, os quais não conseguem atravessar as membranas biológicas ficando confinados no compartimento onde foram gerados. Em seguida, haverá a formação da espécie peróxido de hidrogênio que tem a capacidade de atravessar as biomembranas e se distribuir a partir do local de sua produção (BREUSEGEM et al., 2001). A última e mais reativa espécie a ser formada é o radical hidroxila (OH.). Esse radical é formado pela redução do H2O2

por íons metálicos (Fe2+ e Cu2+) e tem grande afinidade por moléculas biológicas em seu sítio de produção, também apresenta uma meia-vida curta, pois reage rapidamente com moléculas biológicas sequestrando um átomo de hidrogênio (BREUSEGEM et al. , 2001; NORDBERG e ARNER, 2001). Portanto todas essas espécies destacam-se pela grande reatividade com biomoléculas que, por consequência, provocam a lipoperoxidação das membranas celulares (BREUSEGEM et al.,


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2001), bem como a oxidação de proteínas e quebra na cadeia do DNA (ARGUIRRE et al. , 2005 ; HAMID et al. , 2002).

Um dos mecanismos que a célula dispõe para dismutar radicais livres produzidos em condição de DH é a ativação de enzimas antioxidativas, dentre elas a superóxido dismutase (SOD, E.C. 1.15.1.1), a ascorbato peroxidase (APX, E.C. 1.11.1.11), a catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6), peroxidase (POX E.C 1.11.1.7) (MITTLER, 2002).

A enzima superóxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) são metaloproteínas que catalisam a dismutação de radicais superóxido a peróxido de hidrogênio e oxigênio. Podem ser detctadas três classes de SOD diferenciadas de acordo com o metal presente em seu sítio ativo como cofator: cobre/zinco (Cu/Zn SOD), ferro (Fe-SOD) e manganês (Mn-SOD) e localizadas em diferentes compartimentos celulares (SCANDALIOS, 2005).

Outra enzima importante no sistema de resposta antioxidativa em plantas é a catalase (CAT; EC 1.11.1.6), a qual decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) gerado nos peroxissomos durante a fotorrespiração (GERBLING et al., 1984), bem como o produto de reação da SOD.

Entre as enzimas degradantes de H2O2, é a única que não consome equivalentes redutores da célula e que possui um mecanismo muito eficiente para a remoção do peróxido formado em condição de estresse (SCANDALIOS, 2005).

Essa enzima tem sido descrita como susceptível a fotoinibição e degradação, após sua inativação por luz, a atividade da catalase é fortemente dependente de uma nova síntese da enzima, como relatado por Hertwig et al. (1992).

Figura 1. Produção de radicais livres em células.

1. Material e Método

1.1 Processamento do material vegetal para obtenção do extrato bruto.

Processar as amostras para obtenção do extrato (Figura 1), que será obtido através da ressuspensão do material vegetal (300 mg) em 2,0 mL de tampão fosfato de potássio 0.1 M, pH 6.8, suplementado com 200 mg de PVPP. Após centrifugação por 10 min. a 10.000 x g, o sobrenadante será coletado e armazenado em freezer a - 80° C.

Ânion superóxido Radical hidroxila Peróxido de hidrogênio


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Figura 1. Procedimento de seleção e maceração do material vegetal

1.2 Atividade da enzima Superóxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1)

A determinação da atividade da SOD considera a capacidade da enzima em inibir a fotorredução do NBT (Azul de nitrotetrazólio cloreto). A atividade será determinada pela adição de 50 mL de extrato bruto a uma solução contendo 13 mM de metionina, 75 mM de NBT, 100 nM de EDTA e 2 mM de riboflavina em tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,8.

A reação será iniciada pela iluminação dos tubos, em câmara composta por tubos fluorescentes (15 W), a 25° C. Após 5 minutos de incubação, o final da catálise será determinado pela interrupção da luz (GIANNOPOLITIS e RIES, 1977). O composto azul formado (formazana) pela fotoredução do NBT será determinado pela leitura em espectrofotômetro a 560 nm.

Os tubos considerados branco para a análise recebem os mesmos reagentes, porém são mantidos cobertos com papel alumínio, portanto, abrigados da luz. Uma unidade de SOD é definida como a atividade da enzima necessária para a inibição de 50 % da fotorredução do NBT. Para o cálculo da atividade específica da enzima, considera-se a porcentagem de inibição obtida, o volume da amostra e a concentração de proteína na amostra (mg mL-1).

• Preparo da solução tampão (Fosfato de potássio 50 mM pH 7,8)Para 1 L de tampão preparar os reagentes e proceder a mistura, controlando-se o pH em

potenciômetro:

KH2PO4 (monobásico, PM = 136,09) = 6,8045 g L

K2HPO4 (bibásico, PM = 174,18) = 8,7090 g L

Após a obtenção do tampão no pH 7,8, o volume deve ser ajustado para 1 L com água destilada.

• Preparo da solução para determinação da SOD (Solução de trabalho)Para 120 mL de tampão fosfato 50 mM pH7,8 adicionar:

13 mM de Metionina (PM = 149,2) 232,8 mg

75 mM de NBT (PM = 817,6) 7,2 mg


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100 nM EDTA (PM=380,2): Dissolver 10 mg de EDTA em 0,5 L de água dest. Para a solução, pipetar 228 mL

2 mM de Riboflavina (diluir por último e manter no escuro PM = 376,4)

Dissolver 10 mg em 500 mL de água destilada 4,48 mL

Obs.: A solução será preparada em Erleinmayer coberto com papel alumínio, para evitar fotoredução.

• Análise:Pipetar 50 mL de extrato bruto (amostra)

Pipetar 2,950 mL da sol. de trabalho

1º Tubo em branco - receberá a sol. de trabalho + amostra; deverá estar coberto com papel alumínio; será utilizado para zerar o espectrofotômetro.

2º Tubo 100% de fotoredução (Controle) - receberá somente a solução de trabalho; deverá receber luz e será utilizado para determinar a fotoredução total do NBT.

3º Tubo da amostra – receberá a solução de trabalho mais a amostra. Dependendo da atividade da SOD, na amostra, se determinará a taxa de inibição da fotoredução do NBT.

Após incubação sob luz por 5 min., as absorbâncias serão determinadas a 560 nm.

Ex. para o cálculo: Os tubos sem amostra (controle) apresentam uma taxa de absorbância média de 0,280 e o tubo com a amostra, uma absorbância em torno de 0,120. utilizando-se a fórmula , tem-se:

Neste ex., tem-se= [(0,280 – 0,120) / 0,280] x 100 = 57,14% de inibição da fotoredução.

Considerando-se que 50 % de inibição de fotoredução representa 1 unidade de SOD, neste exemplo teríamos (por regra de três) 1,14 U de SOD.

1 Unidade (U) de SOD é definida como a quantidade de enzima requerida para inibir 50 % da fotoredução do NBT.

Atividade Específica da SOD = U = % de inibição x volume da amostra mL mg de proteína 50 % x concentração de proteína mg mL

INIBIÇÃOXCONTROLE

AMOSTRACONTROLE%100 =

−


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1.3 Atividade da enzima Catalase (CAT; EC 1.11.1.6)

A catalase uma hemoproteína (possui o grupo heme) altamente específica, transforma o peróxido de hidrogênio em água:

Possui o mais alto número de turnover (Kcat) conhecido em enzimas: uma molécula pode catalisar a decomposição de até 40.000.000 moléculas de peróxido de hidrogênio por segundo.

A atividade da enzima catalase será determinada em espectrofotômetro (240 nm) pelo monitoramento da variação da absorção do peróxido de hidrogênio, conforme Peixoto et al. (1999). Para o teste, 50 mL de extrato bruto serão adicionados a 950 mL de um tampão fosfato de potássio 50 mM, pH7,0 suplementado com peróxido de hidrogênio a uma concentração final de 12.5 mM. A variação da absorção (DE) será calculada em um intervalo de 80 s, sendo a atividade da enzima calculada utilizando-se um coeficiente de extinção molar e = 39,4 mM-1 cm-1. A atividade específica (µKat µg Prot-1) da catalase, levou em consideração a concentração de proteína solúvel no teste.

Teste enzimático:

• 50 mL de extrato bruto• 950 mL of tampão fosfato 50 mM, pH 7.0 (suplementado com 12.5 mM de H2O2 (53.75 mL de H2O2 (30%) en 100 mL de tampão).

1.4 Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7)

A peroxidase é uma enzima que possui uma variedade de isoformas e que utiliza diferentes redutores, se caracteriza também por localizar-se em diferentes compartimentos celulares e por sua importante função relacionada à biossíntese da parede celular. Utilizam H

2O

2 ao invés de O

2 como

agente oxidante:NADH + H

+ + H

2O

2 à NAD

+ + 2H

2O

NADH peroxidase

A atividade da enzima será determinada através da diluição (1:25) de 100 mL de extrato bruto e adicionados a 4,9 mL de solução tampão fosfato de potássio 25 mM, pH 6,8 contendo 20 mM de Pyrogallol e 20 mM H2O2. Após incubação por 1 min a reação deve ser paralisada com 0,5 mL de H2SO4 e a leitura da absorbância feita a 420 nM; A atividade específica (µKat µg Prot-1) da enzima é calculada usando-se coeficiente de extinção molar de 2,47 mM-1 cm-1 (PEIXOTO et al., 1999).


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1.5 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11)

Para a análise da atividade da enzima APX, inicialmente prepara-se uma solução de trabalho contendo uma alíquota de 100 mL de extrato bruto com 2,9 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 6,0 (volume final de 3,0 mL). A esta solução acrescenta-se ascorbato e peróxido de hidrogênio, em concentração final de 0.8 e 1,0 mM, respectivamente. A determinação da variação da extinção (-), é efetuada a 290 nm, sendo que a atividade específica da enzima (µKat µg Prot-1) deve ser calculada a partir de um coeficiente de extinção molar de 2,8 mM-1 cm-1 (KOSHIBA, 1993).

1.6 Peroxidação de Lipídeos

Homogeneizar 200 mg de folhas em 4 mL de tampão TCA (1% w/v); Filtrar o homogenato em cheesecloth (4X) ou 2X papel de filtro; centrifugar por 15 min a 12.000 x g; Pipetar 1 mL do sobrenadante + 3 mL de ácido tiobarbitúrico 0,5 % (w/v) em TCA 20% (w/v); Incubar a 95° C por 60 min em dubnoff; Transferir os tubos para banho de gelo (para parar a reação); Centrifugar novamente os tubos a 9.000 x g por 10 min; Ler os valores de absorbância a 532 nm e 660 nm (para subtrair, isolando-se interferentes).

A atividade será calculada, utilizando-se um e = 155 mM-1 cm-1


BROETTO, F.; LÜTTGE, U.; RATAJCZAK, R. Influence of light intensity and salt-treatment on mode of photosynthesis and enzymes of the antioxidativo response system of Mesembryanthemum crystallinum. Functional Plant Biology, v.29, p.13-23, 2002.

GIANNOPOLITIS, C.N., RIES, S.K.; Superóxido dismutases. I. occurrence in higher plants. Plant Phys., 59:309-314, 1977.

JENKS, M. A., HASEGAWA, P. A.; Plant Abiotic Stress. Oxford: Blackwell, 270 p., 2005. KOSHIBA, T. Cytosolic ascorbate peroxidase in seedlings and leaves of maize (Zea mays). Plant

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moleculares. Seminário e projeto de dissertação de mestrado no curso de melhoramento genético de plantas. UFRPE. Recife, 2010

PEIXOTO,.H.P.P..; CAMBRAIA, J.; SANT´ANA, R.; MOSQUIM, P.R.; MOREIRA, A.M.; Aluminium effects on lipid peroxidation and the activities of enzymes of oxidative metabolism in sorghum. Rev. Bras. Fis. Vegetal, 11 (3):137-43, 1999.

SOARES, A. M. S., MACHADO, O. L. T. Defesa de plantas: Sinalização química e espécies reativas de oxigênio. Revista Tropica – Ciencias Agrarias e Biologicas. V.1, n. 1, p. 9, 2007.

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Capítulo 6

Atividade da Nitrato Redutase

Amanda Cristina Esteves Amaro

Érica Amanda de Barros

Marco Antonio Castillo Campohermoso

Fernando Broetto

Introdução

O nitrogênio está entre os principais elementos minerais, pois vem logo depois do C, O e H como componente de biomassa. A energia e a estrutura molecular necessária para a incorporação do nitrogênio provêm do metabolismo dos carboidratos, o qual depende da fotossíntese, e essa, por sua vez, depende dos compostos contendo nitrogênio, como, por exemplo, a clorofila, criando, assim, um ciclo de interdependência (LARCHER, 2006).

A assimilação de nitrogênio é o segundo maior processo metabólico nas plantas superiores, sendo superado apenas pela fixação fotossintética do CO2. As plantas absorvem o nitrogênio do solo nas formas de nitrato e amônio, sendo que o nitrato é a principal forma de nitrogênio inorgânico disponível para as plantas, e sua absorção depende do pH na rizosfera, sendo que, sob pH baixo, a absorção de nitrato é mais prejudicada que a de amônio (BUCHANAN et al., 2000).

No citoplasma das células, depois de o nitrato (NO3) ser absorvido pelas raízes das plantas, o primeiro passo é a sua redução para nitrito (NO2), reação essa catalisada pela enzima nitrato redutase (NR) (LARCHER, 2006).

A forma mais comum da enzima nitrato redutase usa, durante a redução de nitrato para nitrito, o NADH como doador de elétrons. No entanto, em tecidos não clorofilados pode utilizar tanto o NADH, quanto o NADPH (YANG e MIDMORE, 2005).

NO3 + NADH + H+ NO2 + NAD+ + H2O

(Nitrato) (Nitrato Redutase) (Nitrito)

A enzima nitrato redutase (NR) é formada por duas subunidades idênticas com três grupos prostéticos cada (flavina adenina dinucleotídeo – FAD, heme e complexo formado por molibdênio, mais uma molécula orgânica chamada pterina) presente no citoplasma (TAIZ e ZEIGER, 2009).


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Depois da redução do nitrato para nitrito, ele é transportado rapidamente do citosol para o interior dos cloroplastos (em tecidos clorofilados) e plastídeos (em tecidos aclorofilados), onde será reduzido à amônia pela enzima nitrito redutase (NiR), usando ferredoxina reduzida como doadora de elétrons; esse transporte deve ser rápido, pois o nitrito é um íon altamente reativo e potencialmente tóxico para a célula. A ferredoxina reduzida é proveniente do transporte de elétrons da fotossíntese nos cloroplastos e do NADPH formado na rota da oxidação das pentose-fosfato nos tecidos aclorofilados (YANG e MIDMORE, 2005; TAIZ e ZEIGER, 2009).

Em seguida, esse amônio é incorporado em moléculas orgânicas, como aminoácidos e nucleotídeos, por meio da ação conjunta das enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase (GOGAT) (LARCHER, 2006).

A nitrato redutase é rapidamente produzida, de acordo com as necessidades da planta, sendo que o nitrato, a luz e os carboidratos interferem na tradução e transcrição (TAIZ e ZEIGER, 2009).

A atividade da nitrato redutase muda de acordo com a fase da vida da planta; assim, possui sua maior atividade em órgãos de crescimento, durante a fase jovem, pois estes requerem grande quantidade de nitrato. A citocinina também estimula a produção de nitrato redutase, além de ser regulada pelas alternâncias entre luz e escuro (LARCHER, 2006).

As alterações diárias na fotossíntese interferem na expressão e atividade da nitrato redutase, variando de acordo com o dia e com a noite, sendo que, geralmente, possui um pico de produção no final da noite e nas primeiras horas do dia. Para um grande número de espécies, mesmo se elas forem colocadas em condições de luz constante, as oscilações circadianas da atividade da nitrato redutase permanecerão por aproximadamente 24 horas, indicando que esse ritmo é endógeno (YANG e MIDMORE, 2005).

1. Material e MétodoFosfato de potássio dibásico (K2HPO4) PM 174,18; Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) PM 136,09; N-propanol, também conhecido como álcool iso-propílico ou iso-propanol ou 2-propanol PM

60,10; N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride PM 259,17; Ácido Clorídrico (HCl); Sulfanilamida PM 172,21; Nitrito de sódio NaNO2.

1.1 Preparo das soluções

Tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0

• Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) PM = 174,18g


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1 mol L-1 ----------------- 174,18g

0,1 mol L-1 -------------- X

X = 17,418g em 1 L de H2O destilada

• Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) PM = 136,09g1 mol L-1 ----------------- 136,09g

0,1 mol L-1 -------------- X

X = 13,609 g em 1 L de H2O destilada

KH2PO4

K2HPO4

N-propanol (1%)

Para preparar 50 mL de solução:

Pipetar 500 µL de N-propanol em um balão e completar para 50 mL com água destilada.

Tampão de extração

2,527 g de KNO3

2,5 mL da solução de N-propanol

Dissolver no tampão fosfato de potássio até atingir 250 mL em balão volumétrico.

Solução N-Naftil 0,02%

Dissolver 10 mg de N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride em água destilada completando o volume final para 50 mL.

Solução de sulfanilamida 1% (Massa/Volume) em HCl 1,5N

• HCl 1,5NComo: densidade=1,19 g mL-1 (T=37%) PM: 36,48

Então: em 1 mL de solução de HCl: 1,19 X 0,37 = 0,4403 g de HCl em mL do reagente.

NHCl = 0,4403/36,48 = 0,01207

M = 0,01207/ 1,0 X 10-3 L = 12,07 Molar

Acrescentar a solução de KH2PO4 à solução de K2HPO4até atingir pH final de 7,0. Completar o vol. para 1 L


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Portanto para preparar 1,0L de uma solução a 1,5N

N1 x V1 = N2 x V2

12,07 x V1 = 1,5 x 1,0

V1 = 0,1242 L de HCl

Colocar 0,1242 L de HCl em balão volumétrico e completar para 1L com água destilada

Para preparar 100 mL de solução de sulfanilamida:

Acrescente 12,4 mL de HCl em 87,6 mL de água destilada

Dissolva 2 g de sulfanilamida

Cuidado:

Soluções concentradas de ácido clorídrico (HCl) são corrosivas e podem causar queimaduras graves. O vapor é extremamente irritante para a pele, olhos e sistema respiratório. O preparo dessa solução deve ser feita dentro de uma capela ventilada; Ao diluir ácidos, sempre adicione o ácido à água, e não o contrário.

1.2 Teste enzimático

Cortar 200 mg de segmentos foliares, com auxílio de um estilete ou tesoura (Obs.: as plantas deverão estar iluminadas pelo menos por 2 horas, para a correta ativação da NR);

Colocar os segmentos em tubos de ensaio, acrescentar 10 mL do tampão de extração e tampar com a rolha especial para infiltração à vácuo (Figura 1);

Incubar à vácuo: 3 ciclos de duração de 2 minutos, com intervalo de 1 minuto entre eles. Para verificar se esta ocorrendo a correta infiltração verifique se há formação de bolhas na beirada das folhas. Além disso, não deixe que as folhas se depositem no fundo, dê pequenas batidas no fundo para que elas subam.

Incubar em banho-maria a 30°C, com agitação e no escuro por 1 hora;Coletar 1 mL da solução dos tubos de ensaio e transferir para tubos de ensaio limpos;Acrescentar 1 mL da solução de sulfanilamida e 1 mL da solução de N-NaftilIncubar em banho-maria a 30°C, com agitação e no escuro por 15 minutos;Ler em espectofotômetro a 540 nm.


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Figura 1. A) Infiltração à vácuo; B) Detalhe da formação de bolhas na beirada das folhas, indicando que esta ocorrendo a infiltração

Branco do espectrofotômetro: Deve ser feito o mesmo procedimento da amostra, no entanto o tampão de extração deve ser substituído pelo mesmo tampão sem adição de KNO3.

Dicas:

- Os segmentos foliares devem ser cortados com auxílio de uma tesoura ou gilete, sendo que os segmentos devem ser os menores e mais finos possíveis.

- Para deixar os tubos de ensaio no escuro tampe o banho-maria com sua tampa própria ou com auxílio de papel alumínio.

- Não lave as vidrarias com detergente, pois esses podem conter nitrito e, assim, alterar os seus resultados. O ideal é ferver as vidrarias antes de utilizá-las.

1.3 Curva padrão de nitrito (NO2)

Solução estoque de 10 mM NaNO2

69 mg de nitrito de sódio (NaNO2)Dissolver em água destilada até atingir o volume de 100 mL.

Solução de Nitrito para a curva padrãoPipetar 1,25 mL (ou 1250 µL) da solução estoque de NaNO2 e completar com água destilada para um volume final de 500 mL.


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Em seguida proceder a incubação exatamente como apresentado na Técnica (item 1.2) a partir da primeira incubação em banho–maria. Com os resultados das leituras de concentração de nitrito, organizar os dados em planilha, para calcular a atividade da NR nos segmentos foliares, com unidade final em nM NO2 h

-1 g-1 MF.


JAWORSKI, E.G. Nitrate reductase assay in intact plant tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. v.43, p.1274-1279, 1971.

Tubo Volume da solução de nitrito (mL)

Volume de água destilada (mL)

Concentração final de NO2 (nmol)

0 0 10 01 1 9 252 2 8 503 4 6 1004 6 4 1505 8 2 2006 10 0 250


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Capítulo 7

Análise de proteínas por Eletroforese Nativa

Mariana da Silva Caldeira

Marcos de Oliveira Bettini

Dayanne Fabrício Bressan

Fernando Broetto

Introdução

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial (Figura 1). Esta técnica é normalmente utilizada para separar proteínas, moléculas de DNA e moléculas de RNA. As moléculas são separadas de acordo com a massa molecular, carga e conformação.

Figura 1. Esquema do sistema de eletroforese

O gel (suporte para a migração eletroforética) pode ser de acetato de celulose, gel de agarose, gel de poliacrilamida, entre outros. Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilmente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.

Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED catalisa a liberação de radicais livres de persulfato SO4

- que, por sua vez, iniciam a polimerização (ALFENAS e BRUNE, 1998). A acrilamida é uma


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molécula linear, enquanto a Bis-acrilamida tem forma de “T”. Ao misturar-se essas duas moléculas, tem-se a formação de uma “rede” onde diferentes relações entre as concentrações dessas moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação.

De acordo com Esteves (2012) existem variantes da técnica de eletroforese, que podem ser divididas em: eletroforese nativa (em que as proteínas migram de acordo com os três fatores mencionados anteriormente: carga, massa molecular e conformação), zimografia (em que as condições de corrida e de detecção permitem que se detecte uma determinada atividade enzimática) e eletroforese em condições desnaturantes (mais conhecida por SDS-PAGE, em que as proteínas são desnaturadas previamente, sendo separadas apenas de acordo com a sua massa molecular).

Na eletroforese nativa, utilizada mais comumente para isoenzimas, existe o sistema contínuo e o sistema descontínuo. No sistema contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão usado na preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. A escolha da solução-tampão e de seu valor de pH depende da estabilidade e solubilidade da proteína em estudo.

Por outro lado, existe uma versão em que não somente usam-se tampões diferentes para o gel e para o tanque, mas também um sistema de duas fases é usado, compreendendo um gel principal ou de resolução e um gel empilhador de poros pequenos, onde a amostra proteica é aplicada. Esse é conhecido como sistema descontínuo. Sob eletroforese, as moléculas migram da parte mais porosa (gel empilhador) para a menos porosa (gel separador). Consequentemente, as moléculas de proteína concentram-se numa faixa estreita e compacta entre o gel empilhador e o separador, produzindo melhor resolução que no sistema contínuo, pelo empilhamento no gel empilhador, rendendo elevada concentração das proteínas em análise.

Muitos tampões de gel diferentes e concentrações diferentes têm sido delineados para ambos os sistemas, contínuos e descontínuos.

Neste capítulo será explanada a metodologia de eletroforese nativa em sistema descontínuo das enzimas SOD (Superóxido dismutase) e Catalase extraídas de tecidos vegetais.

A SOD tem a função de catalisar a dismutação do superóxido em oxigénio e peróxido de hidrogénio, sendo assim, uma importante defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigénio. Já a catalase tem a função de catalisar a decomposição do peróxido de hidrogênio, que é altamente tóxico para as células.

1. Procedimentos

1.1 Extração de proteínas

A coleta do material vegetal deve seguir recomendações de coleta citadas no Capítulo 1 deste livro.

Após a coleta, prosseguir com os seguintes passos (Figura 2):

A) Homogeneizar 1 g de tecido vegetal em 2,5 mL de tampão de extração em um almofariz a 4oC;B) Peletizar o material não solúvel por centrifugação por 5 min a 12000 xg;


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C) Separar o sobrenadante em novo eppendorf e determinar a concentração de proteína bruta (Bradford, 1976);D) Congelar o sobrenadante imediatamente em nitrogênio líquido a fim de preservar a integridade das moléculas e posteriormente armazenadas em ultrafreezer a 75oC.

Figura 2. Esquema da obtenção do extrato proteico

1.2 Eletroforese

1.2.1 Preparo do sistema

Todos os componentes da cuba devem estar limpos antes de serem utilizados a fim de evitar qualquer alteração em função de contaminantes ou resíduos de análises anteriores. As placas de vidros, borrachas de vedação e pentes devem ser limpos com solução detergente, lavados com água destilada e posteriormente limpos com etanol. Depois de devidamente higienizado, o sistema deve ser tocado apenas com luvas.

Para a montagem do sistema vertical, deve-se posicionar os dois espaçadores (1 mm) entre as placas de vidro e encaixá-los no suporte de forma que o encaixe seja perfeito para completa vedação com a borracha. Esta montagem deve ser perfeita para que não ocorra vazamento do gel e risco de perda da amostra (Figura 3).

+

Suporte com vedação de borracha Cuba

Espaçadores

Pentes

Placas de vidro Figura 3. Componentes de uma cuba de eletrosforese


44

1.2.2 Preparo do gel

A concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos componentes que se deseja analisar. Segundo Alfenas e Brune (1998), usam-se géis na faixa de 7,5 a 10%. Para variar a concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, basta alterar o volume da solução-estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água; as quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas. Preparadas as soluções com TEMED e persulfato, deve-se aplicar imediatamente ao sistema pois a geleificação se processa em poucos minutos.

O preparo do gel se processa da seguinte maneira:

A) Com o auxílio de uma pipeta ou seringa aplicar a solução do gel separador no espaço entre as placas de vidro até a altura de mais ou menos 1,5 cm abaixo da extremidade inferior do pente;

B) Imediatamente após, aplicar um pequeno volume de isobutanol (ou etanol 70%) sobre o gel para garantir a uniformidade da superfície deste;

C) Após a polimerização do gel (cerca de 20 min) observa-se uma separação nítida entre o gel e o isobutanol, que deve ser removido por decantação e uso de papel-filtro;

D) Aseguir, inserir o gel empilhador e, imediatamente, o pente. Evitar ao máximo a formação de bolhas.

E) Esperar cerca de 20 min para que o gel se polimerize completamente e retirar o pente cuidadosamente para não romper os poços. Obs: caso a utilização do gel seja posteriormente, deve-se cobrir o suporte com o gel com um saco plástico e manter em geladeira.

1.2.3 Preparo da amostra

Realizada a extração de proteínas, conforme descrito no item 1.1 deste capítulo, misturar 2 volumes do extrato proteico (proteína solúvel) com 1 volume de glicerol (com azul de bromofenol).

1.2.4 Corrida do gel

A) Remover o pente do gel da amostra com as duas mãos, puxando-o firmemente para cima, evitando danificar os poços;

B) Montar o suporte com o gel na cuba de corrida;C) Encher a cuba com tampão do reservatório;D) Remover possíveis bolhas de ar na base do gel;E) Pipetar cerca de 15 µL de amostra em cada poço utilizando-se uma seringa Hamilton ou

pipeta com ponteira estrangulada (todos os poços devem ser cheios com amostra ou com solução tampão);

F) Para determinação da massa molecular aparente das proteínas pipetar padrões de massa


45

molecular conhecida no último poço de corrida. Um marcador bastante utilizado para massa molecular de proteínas é o LMW-Marker-Kit, da

BioRad, pode-se utilizar por exemplo 5 µL de Marker-Kit mais 170 µL de tampão Laemmli.A corrida indicada é de 180 mA, com voltagem constante, a 4 oC durante 90 min

(aproximadamente) (Figura 4).

Figura 4. Esquema da corrida das amostras em gel a 4 oC

1.3 Atividade das enzimas

1.3.1 Superóxido Dismutase – SOD E.C. 1.15.1.1

Para analisar a SOD, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo (Figura 5):A) Incubar o gel de poliacrilamida poroi 30 min em 50 mL de solução corante no escuro;B) Após o incubamento no escuro, incubar na presença de luz até que as bandas de atividade

fiquem claramente visíveis;C) Parar a reação pela lavagem dos géis em água bidestiladaD) Para inibir a Cu/Zn-SOD adicionar solução de KCN 3 mM (10 mg de KCN em 50 mL da

solução corante) ou ainda para inibir também Fe-SOD, adicionar 24,3 µL 35% H2O2 (concentração final de 5 mM) em 50 mL da solução corante. Na presença de H2O2, além das bandas de SOD, as bandas de atividade de catalase também se tornam visíveis.

Figura 5. Esquema de revelação da SOD

1.3.2 Catalase -CAT

Para analisar a CAT, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo:

A) Lavar o gel por 10 min, sob agitação, descartar a água;B) Lavar novamente por 5 minutos, sob agitação e descartar a água (realizar essa etapa duas


46

vezes);C) Incubar o gel por 5 min em solução de 0,03 % (v/v) de H2O2 sob agitação. Para preparar a

solução de peróxido de hidrogênio, pipetar 0,1 mL de H2O2 (30 vol) w misturar em 99,9 mL de água bidestilada.

D) Lavar novamente o gel com água bidestilada;E) Incubar o gel na solução corante (tampão de coloração para CAT) até que as manchas

fiquem visíveis (aproximadamente 2 min) e parar a reação com lavagem em água bidestilada.

2. Reagentes

2.1 Utilizados no preparo dos géis

Na tabela a seguir (Tabela 1) estão os reagentes utilizados para o preparo dos géis de eletroforeseTabela 1. Reagentes necessários no preparo dos géis de eletroforese

Substância Massa molecular (g mol)Persulfato de amônia (APS), pA 228,20Azul de bromofenol 691,94Ditiotreitol (DL-) (DTT) 154,24Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10GlicinA, p.A. 75,07Kaleidoscope Prestained Standards -LMW-Marker-Kit -Mercaptoetanol (β-) 78,13TEMED, electr 116,21Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17Tris [Tris(hidroximetil)aminometano] 121,14


47

2.2 Utilizados para extração e atividade protéica

Na tabela a seguir (Tabela 2) estão os reagentes utilizados para extração e atividade protéica.

Tabela 2. Reagentes necessários no preparo das soluções de extração e revelação

Substância Massa molecular (g mol)Azul de bromofenol 691,94Di-potássio hidrogenofosfato (K2HPO4) x 3H2O 228,23DL-Ditiotreitol (DTT) 154,24EDTA (Ácido Etilenodiamina Tetracético) 380,2EGTA[etilenoglicol-bis-(β-aminoetiléter)N ,N ,N’,N’-ácido tetraacético] 380,4

Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10Peróxido de hidrogênio (H2O2), 35% (v/v) 34,02Sulfato de magnésio (MgSO4) x 7 H2O 246,48NBT (Azul de nitro tetrazólio), grade II 817,6Cianeto de potássio (KCN), pA 65,12Potássio dihidrogenofosfato (KH2PO4), pA 136,09Riboflavina (vitamin B12) (C17H20N4O8) 376,4TEMED, electr 116,21Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17

3. Soluções

3.1 Gel de separação

Solução para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 3):

Tabela 3. Protocolo utilizado para gel de separação em três diferentes concentrações.

Solução μL para 10% T μL para 12,5% T μL para 15% T

Água bidestilada 5352 4265 3185

Lower Tris (1) 3280 3280 3280

Sol. Acrilamida 4333 5420 6500

TEMED 10 10 10Start: APS (2) 25 25 25

(1) Lower Tris: 1,5M Tris, pH 8,8 – manter em temperatura ambiente.


48

Para 100 mL de solução, dissolver 18,17g de Tris em 75 mL de água bidestilada, ajustar para pH 8,8 com HCl concentrado e completar para 100 mL com água bidestilada.

(2) Persulfato de amônia (APS) – 50% (p/v) - armazenar a solução a 4oC. Dissolver 5 g de APS em 10 mL de água bidestilada. Esta solução pode ser utilizada por várias semanas.

Atenção: Durante o manuseio com acrilamida usar luvas, pois seus monômeros e derivados são altamente tóxicos, podem causar câncer e/ou destruir tecidos nervosos.

3.2 Gel de empilhamento

Solução para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 4)

Tabela 4. Protocolo utilizado para preparo do gel de empilhamento

(1) Upper Tris: 0,5M Tris, pH 6,8 – manter em temperatura ambiente

Para 100 mL de solução dissolver 6,06 g de Tris em 75 mL de água bidestilada, ajustar para pH 6,8 com HCl 2 N e completar para 100 mL com água bidestilada.(2) Persulfato de amônia (APS) – 50% (p/v) - armazenar a solução a 4oC

3.3 Tampão de reservatório

Tris glicina, 4X concentrada:

0, 1 M Tris base.................................................12,11 g

0,77 M glicina....................................................57,80 g

Dissolver em água bidestilada, completar para 1L e conservar a 4 oC. Antes do uso diluir a solução a 1:4. Para soluções 10X concentrada, diluir a 1:10. Não é necessário ajustar o pH pois na diluição o pH cairá para aproximadamente 8.9.

Solução μL para 5% TÁgua bidestilada 2882Upper Tris (1) 1250Sol. Acrilamida 833TEMED 10Start: APS(2) 20


49

3.4 Tampão de extração

Para 100 mL:

100 mM Tricina.................................................1,79 g

3 mM MgSO4.....................................................74 mg

3 mM EGTA.......................................................114 mg

*Para espécies oleaginosas ou resinosas deve-se adicionar 0,5 (p/v) PVPP (=0,05 g).

Dissolver em 75 mL de água bidestilada, ajustar o pH 8,0 com Tris e completar o volume para 100 mL. No momento em que for utilizar adicionar 1 mM de DTT (= 15 mg).

3.5 Tampão fosfato

Para obtenção do tampão fosfato 50 mM, pH 7,8, misturar as soluções 6,81 g KH2PO4 e 11,41 g L K2HPO4 em 1 L e água bidestilada e ajustar o pH.

3.6 Tampão de coloração para SOD

Para 200 mL:

10 mM EDTA....................................................760 mg

28 mM TEMED..................................................651 µg

30 µM riboflavina..............................................2,3 mg

245 µM NBT.......................................................40 mg

Dissolver em 200 mL de tampão fosfato e manter no escuro.

3.7 Tampão de coloração para CAT

Solução de 2% de FeCl3 e 2% de K3Fe(CN)6.

Solução de 2% de FeCl3: 0,5 g em 25 ml de água bidestilada

Solução de 2% de K3Fe(CN)6: 0,5 g em 25 mL de água bidestilada.

Misturar as soluções no momento em que for utilizá-la e completar para 200mL com água bidestilada.


50


ALFENAS, A.C.; BRUNE, W. Eletroforese em gel de poliacrilamida. In: Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins: fundamentos e aplicações em plantas e microrganismos. Editado por Acelino Couto Alfenas. Viçosa: UFV, 1998, 574p.

BEAUCHAMP, C.. FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase: improved assays and na assays applicacle to acrylamide gels. Analytical Biochemistry. 44, p. 276-287, 1971.

ESTEVES, A.C. Análise de proteínas por eletroforese. Disponível em: <http://molar.crb.ucp.pt/cursos/>. Acesso em 15 mar 2012.

LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins of the head of bacteriophage T4. Nature: London, 227, p. 680-685, 1970.

MISZALSKI, Z.; SLEAK, I.; NIEWIADOMSKA, E.; BISCZEK, R.; LUTTGE, U.; RATAJCZAK, R. Subcellular localization and stress responses of superoxide dismutase isoforms from leaves in the C3-CAM Intermediate halophyte Mesembryanthemum crystallinum L., accepted.

VOET, D.; VOET, J.G.; Bioquímica. Artmed, Porto Alegre. 3.ed. 2006.


51

Capítulo 8

Atividade da Invertase de Levedura: valores da constante de Michaelis-Menten

(Km) e velocidade máxima (Vm)

Sthefany Rodrigues Fernandes Viana Djanira Rodrigues Negrão

Fernando Broetto

Introdução

A análise da atividade da invertase contribui significativamente para formulação de hipóteses relativas a cinética da interação entre uma enzima e seu substrato (GRACIDA-RODRÍGUEZ, 2005). Dos dados obtidos da cinética da invertase Michaelis e Menten propuseram que uma molécula enzimática reage com seu substrato para formar o complexo enzima-substrato.

Invertase é encontrada em um grande número de tecidos de plantas e são freqüentes os relatos que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como raízes e tubérculos de batata, chicória, cenoura e beterraba, a atividade da invertase é baixa em tecidos normais (não injuriados). Entretanto, quando esses tecidos são cortados em discos e lavados em água estéril ou tampão, há um grande aumento na sua atividade. As leveduras utilizam a invertase para quebrar a molécula de sacarose do meio para absorver a molécula de glicose e frutose que são menores e transformá-las em etanol (Figura 1). Nas leveduras a invertase é uma exoenzima.

Figura 1. Reação da invertase


52

O objetivo deste experimento é levar o aluno a aprender uma técnica de medida da atividade da enzima e utilizando os dados obtidos calcular dois parâmetros da cinética enzimática que são a constante de Michaelis e a Velocidade Máxima da reação, parâmetros estes que ajudaram Michaelis e Menten a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reações enzimáticas.

1. Invertase de Levedura

1.1. Reação a ser estudada

Sacarose + água glicose + frutose

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

1.2. Determinação de Km e Vm da Invertase de Levedura

Para compreender a cinética da invertase, esse capítulo abordará a técnica experimental de medida da atividade da enzima utilizando os dados obtidos para calcular dois parâmetros da cinética enzimática. Estes parâmetros são a constante de Michaelis e a Velocidade Máxima da reação, que ajudaram “Michaelis e Menten” a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reações enzimáticas.

A determinação dos parâmetros constante de Michaelis e velocidade máxima é feita medindo a atividade da enzima em várias concentrações do substrato. Este experimento é também denominado efeito da concentração do substrato na velocidade da reação.

ProcedimentoA saber:

Sacarose + Água + Invertase à Glicose + FrutoseC12H22O11 + H2O à C6H12O6 + C6H12O6

Para a determinação de Km e Vm da invertase de levedura é necessário pipetar, em tubos de ensaio, os volumes das soluções como indica a Tabela 1. Assim que os tubos atingirem a temperatura 37ºC em banho-maria, acrescenta-se a solução enzimática manter em incubação por 15 min. Após esse tempo, cada tubo receberá 1 mL de reativo Somogy o qual interromperá a reação enzimática. Em seguida, após os tubos serem fervidos durante 10 min, deve-se resfria-los em água corrente e adicionar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar e completar o volume a 10 mL com água destilada. Ler a absorbância a 530 nm no espectrofotômetro e transformar as leituras em quantidades de açúcar redutor formado por 15 minutos da reação, consultando a curva de calibração previamente estabelecida.


53

Tabela 1. Volumes estipulados a serem acondicionados em tubos de ensaioTubo Sacarose

(mL)H20 (mL)

Sol. Enzima (mL)

Ban

ho M

aria

a 3

7ºC

por

15

min

utos

Sol. Somogy (mL)

Ban

ho M

aria

a 1

00ºC

por

10

min

utos

Sol. Nelson(mL)

0 0,0 1,0 0,2 1 11 0,2 0,8 0,2 1 12 0,4 0,6 0,2 1 13 0,6 0,4 0,2 1 14 0,8 0,2 0,2 1 15 1,0 0,0 0,2 1 1

Dados: Concentração de Sacarose 0,01 mol/L

Resultados:Para a determinação das análises enzimáticas segundo Lineweaver-Burk, deve-se utilizar a

seguinte fórmula:Equação de Lineweaver-Burk: 1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax onde,

Y = a x + b Equação de Michaelis-Menten, sendo:

Vo=Vmax . [S]

Km + [S]

Após obtenção dos dados (Tabela 2), deve-se construir um gráfico, colocando no eixo das abscissas o inverso da concentração do substrato (1/S) e no eixo das ordenadas o inverso da velocidade da reação (1/V) que é igual à quantidade de açúcar redutor formado durante os 15 minutos. Os valores de R² obtidos no gráfico representam uniformidade nas concentrações, portanto, quanto mais aproximado de 1, melhor os resultados.

Tabela 2. Valores de absorbância após hidrólise da sacarose.

mL Sacarose Leituras 0 0,00020 0,05440 0,08460 0,11180 0,157100 0,186


54

Figura 1. Gráfico representativo das leituras após a inversão da sacarose

Conforme os dados apresentados na Figura 1 e Tabela 2, pode-se calcular os valores de Vmax e o Km, usando a equação de Lineweaver-Burk. Desde modo, substituindo os valores obtidos no gráfico, obtêm-se:

Dados: Y = ax + b à Y= 0,0018x + 0,0082Sabendo-se que:

1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]Então:

1/Vo = 0,0018 . 1/[S] + 0,0082Portanto:

1/Vo = 0,0082 à Vmax = 121,95 g L.hLogo,

Km/Vmax = 0,0018 à Km = 121,95 . 0,0018 à Km = 0,220 g/L

Tabela 3. Obtenção da reta-padrão da glicoseTubo Glicose mL H20 mL µg glicose

Ban

ho m

aria

a 1

00ºC

por

20

min

- es

fria

r

Nelson H20 mL Leituras (ƛ)

0 1,0 0,0 100 1 7 0,4741 0,8 0,2 80 1 7 0,3652 0,6 0,4 60 1 7 0,2913 0,4 0,6 40 1 7 0,1744 0,2 0,8 20 1 7 0,0745 0,0 1,0 0 1 7 0,000


55

Figura 2. Gráfico representativo das leituras da glicose (reta padrão)

Calculando os valores de Vmax e Km, conforme a equação de Lineweaver-Burk. Substituindo os valores obtidos e descritos na Figura 2, tem-se: Dados: Y = ax + b à Y= 0,0048x + 0,0103Sabendo-se que:

1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]Então:

1/Vo = 0,0048 . 1/[S] + 0,0103Portanto:

1/Vo = 0,0103 à Vmax = 97,09 g/L.hLogo,

Km/Vmax = 0,0048 à Km = 97,09 . 0,0048 à Km = 0,466 g/L

A concentração de glicose pode ser calcular através da fórmula Y=ax+b, onde x é expresso em µg glicose ou pelos dados:

100 mg glicose em 100 mL à 1mg/mL100 mL da solução em 100 ml à 10 mg/mL

Portanto: 100 ml de solução ------ 10 mg 1 mL -------------------------- x X= 0,1 mg ou 100 µg


GRACIDA-RODRÍGUEZ, J.; FAVELA-TORRES, E.; PRADO-BARRAGÁN, A.; HUERTAOCHOA, S. SAUCEDO-CASTAÑEDA, G. Invertases. In: PANDEY, A.; WEBB, C.;SOCCOL, C.R.; LARROCHE, C. (Ed.) Enzyme Technology. New Delhi: Asiatech Publishers, 2005. p. 449-464.


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Capítulo 9

Soluções Tampão: Conceito e PreparaçãoJosé Pedro Serra Valente

Fernando Broetto

Introdução

A principal finalidade de uma solução tampão, ou simplesmente um tampão, é controlar o pH de uma solução. Secundariamente os tampões podem ser utilizados para controlar a força-iônica de um meio, estabilizar a estrutura do ácido nucléico, controlar a atividade etc.

Neste texto vamos considerar o principal uso. Assim, podemos dizer que um tampão é uma solução que não varia significativamente de pH com a adição de pequenas quantidades de ácidos, bases ou por efeito de diluição (adição de água) ou da concentração (evaporação do solvente água).

As soluções tampão também são chamadas de:

“Soluções reguladoras de pH”

“Soluções estabilizadoras de pH”

“Soluções que contém acidez e alcalinidade de reserva”

Exemplo:

Comparação entre a variação do pH da água e do sangue após a adição de 0,01 mol de HCl e 0,01 mol de NaOH?

0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH

1 Litro de água pura

1 Litro de água pura

pH=7 à pH=2 pH=7 à pH=12

à à


57

A acidez é alterada rapidamente em cinco ordens de grandeza.

0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH

1 Litro de sangue

1 Litro de sangue

pH=7,4 à pH@7,3 pH=7,4àpH@7,5

O pH praticamente se mantém estável.

O sangue possui um sistema tampão que estabiliza o pH quando é aumentado a concentração do ácido ou base.

Isto ocorre devido ao sistema H2CO3/HCO3- (ácido carbônico/ bicarbonato) e HPO4

2-/H2PO4-/

(monohidrogenofosfato/ dihidrogenofosfato) existente no sangue. O H2CO3 é um ácido fraco e o HCO3

- é sua base conjugada, o mesmo ocorre para o sistema fosfato, o HPO42- é uma base fraca (mais

forte que o H2PO4-) e o H2PO4

- é seu ácido conjugado. Um par conjugado são duas espécies químicas cuja diferença é um hidrogênio.

A classificação como ácido ou base depende da constante de equilíbrio, pKa ou pKb. Em um par conjugado quem tem menor pKa é ácido e quem tem maior pKa é básico.

Tampão é a tradução da palavra Buffer do inglês que significa amortecer, pára-choque, isto porque a solução “amortece” a variação do pH.

Quando é adicionado um ácido em um meio, o pH tende a cair, mas imediatamente volta a condição inicial pelo restabelecimento do equilíbrio, como se fosse um impacto amortecido por um colchão ou mola.

APLICAÇÃO

A) Química:

Muitas reações químicas são favorecidas ou são mais quantitativas em um pH especifico ou faixa estreita. Desta maneira quando é necessário manter o pH constante é adicionado na solução de interesse um pequeno volume de tampão com o pH estabelecido, favorecendo, assim, a reação química desejada.

à à


58

As soluções tampão também são utilizadas para calibração de pHmetros, eletroforese, cromatografia líquida, cromatografia de íons etc.

B) Bioquímica:

Os sistemas biológicos são dependentes de reações bioquímicas que ocorrem em pH constante ou em faixa muito estreita. Assim, muitos sistemas biológicos possuem naturalmente um sistema tampão, permitindo que ocorram as reações bioquímicas necessárias para a manutenção da vida e/ou saúde. Por exemplo, o sangue possui um pH entre 7,35 e 7,45, nessa faixa consome o ácido láctico que é produzido nos exercícios e que deve ser eliminado rapidamente para que o pH das células do corpo não caia e produza a morte das células. Quando o dióxido de carbono é dissolvido no sangue aumenta a acidez e diminui a capacidade do sangue de transportar oxigênio. Em condições em que é introduzido pouco ácido ou base, os sistemas H2CO3/HCO3

-, H2PO4-/HPO4

2-e algumas proteínas,

presente no sangue, mantém o pH do sangue na faixa desejada. Uma alta introdução de ácido no sangue pode causar acidose ou mesmo a morte celular, e uma alta introdução de base pode causar alcalose ou morte celular.

As enzimas só são ativas em faixas de pH muito estreita. Em outros pHs pode ocorrer diminuição ou perda total da atividade da enzima com a desnaturação.

Soluções tampões são utilizadas para estabilizar ácidos nucleicos e complexos proteínas - ácidos nucleicos, meios de cultura como fermentações etc.

pH E MECANISMO DO FUNCIONAMENTO DO TAMPÃO

Os tampões são geralmente preparados misturando um ácido fraco e um sal da base conjugada ou uma base fraca e um sal do ácido conjugado, para obter uma solução com pH definido.

Vamos considerar um ácido fraco (um próton ligado a um ânion A-):

HA H+ + A- (equilíbrio químico em meio aquoso)

Muito pouco pouco

e um sal solúvel (eletrólito forte) com o ânion igual ao do ácido, ligado a um cátion (C+) em meio aquoso:

CA C+ + A- (não existe equilíbrio químico)

Nada muito muito

A equação de equilíbrio do ácido é:

Kc = [H+] [A-] (Constante de Dissociação)

[HA]


59

Quando o interesse é o pH podemos rearranjar a equação:

[H+] = Kc[HA]

[A -]

Multiplicando ambos os lados por p = -log, temos:

pH = pKa + log [Ácido] (equação de Henderson-Hasselbalch)

[Sal]

Considera-se que a concentração total do ânion A- seja igual ao do sal visto que a contribuição do íon comum pelo ácido é desprezível:

Esta equação, denominada de Henderson-Hasselbalch, fornece o pH através do pKa e razão das concentrações de um par conjugado ácido – base, do sistema tampão considerado.

Mecanismo do tampão:

Exemplo: Tampão ácido de acético 0,2 mol/L

HAc : Na+Ac- Onde, Ac- = Acetato

0,1 mol/L 0,1 mol/L H+ ou OH-

Na mistura, em meio aquoso, temos muito Ac- e HAc, pouco H+ e o Na+ que é inerte, não participa das reações apenas participa do equilíbrio elétrico do meio.

Adicionando H+ nessa mistura:

O excesso de Ac- (básico) reagirá com o H+ adicionado formando o ácido não ionizado, mantendo o pH constante.

Ac- + H+ HAc

HAc Ac- + H+

muito pouco pouco

Na+Ac- Ac- + Na+

nada muito muito


60

A base Ac- está relativamente em grande concentração e não é significativa a alteração da sua concentração ao consumir o H+.

Adicionando OH- na mistura:

Os íons OH- reagem com os íons H+ formando H2O.

OH- + H+ + H2O

O equilíbrio é restabelecido com o HAc não dissociado liberando H+ para repor o H+ consumido, mantendo o pH constante.

HAc Ac- + H+

Isto significa que a solução possui acidez de reserva, o HAc dissocia mantendo a concentração inicial de H+ praticamente constante.

O deslocamento do equilíbrio para o lado contrário ao da espécie adicionada é explicado pelo princípio de Le Chatelier.

A solução tampão deve consumir a maioria dos íons H+ ou OH- adicionados caso contrário o pH será alterado significativamente.

1. Cálculo do PH de uma Solução Tampão

A) Tampão Ácido (ácido fraco ou sal do ácido e sal da base conjugada)

O pH de uma solução tampão depende do pKa e razão entre as concentrações do ácido e sal que contém a base conjugada do ácido. A equação de Henderson-Hasselbalch para um tampão ácido é:

B) Tampão básico (base fraca e sal do ácido conjugado)

O pH do tampão básico é determinado subtraindo o pOH de 14. O pOH é determinado somando o pKb (pKb=14-pKa) e a razão entre as concentrações da base fraca e sal que contém conjugado o ácido conjugado da base. A equação de Henderson-Hasselbalch para o tampão básico é:

Sendo,

Ca=concentração nominal de ácido fraco ou sal do ácido em mol/L

Cb=concentração nominal da base fraca em mol/L

Cs= concentração nominal do sal que fornece o ácido ou base conjugada em mol/L


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2. Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora (Cf)

Capacidade tamponante ou freadora é a capacidade do sistema tampão em consumir íons H+ ou OH-, acrescentados na solução, resistindo a variação de pH. Esta capacidade é limitada e é uma medida da eficiência do tampão.

1) A CT é maior quando a relação das concentrações do par conjugado é igual a unidade:

Além de ser mais eficiente, é mais fácil de escolher o pH, pois é igual ao pKa:

quando Cs = Ca

pH = pKa + log 1 Como o log de 1 é zero, o

pH = pKa

Quando a concentração do tampão é alta e o pH = pKa a capacidade tamponante é máxima. 2) Quando a razão de

está entre 10 e 0,1 a CT é satisfatória.

Isto implica: pH = pKa ± 1

Isso significa que concentração do sal pode ser dez vezes maior ou menor que a do ácido. Na prática quando o valor for superior a um, ou inferior a um não temos uma solução tampão.

3) A princípio a CT de uma solução tampão aumenta com as concentrações efetivas dos seus componentes.

Na prática, em geral, as concentrações em que os tampões funcionam bem estão entre 0,050 e 0,200 mol/L (50 e 200 mmol/L).

A escolha da concentração do tampão depende da estimativa do consumo de H+ ou OH-. Se no meio será adicionado muito H+ ou OH- escolher uma concentração maior, se pouco uma concentração menor.

Se no meio tamponado não for acrescentado significativamente H+ ou OH-, utilizar uma concentração entre 50 a 100 mmol.

Se for necessário um meio com uma força-iônica grande, escolher uma concentração do tampão maior ou adicionar um sal inerte como NaCl, KCl, Na2SO4 etc.

Se é esperado diminuir o pH durante o experimento deve-se escolher um tampão com pKa um


62

pouco abaixo do pH de trabalho e inversamente se o pH for aumentar. Na preparação de uma solução tampão deve-se sempre procurar um ácido que tenha pKa igual

ou próximo ao pH desejado, isso favorece a capacidade tamponante, aumenta a capacidade de neutralizar H+ e OH-.

Concentração de uma solução tampão:

É a soma da concentração do ácido (ou base) e sal (ácido conjugado ou base conjugada), em mol/L.

Exemplo: Tampão acetato 0,1 mol/LEsta concentração pode corresponder a várias proporções da razão , de acordo com o pH

estabelecido, por exemplo: ácido acético 0,05 mol/L + acetato de sódio 0,05 mol/L = 0,1 mol/L;ácido acético 0,06 mol/L + acetato de sódio 0,04 mol/L = 0,1 mol/L etc.

No preparo de uma solução tampão devemos sempre estabelecer a concentração desejada. A concentração do tampão é importante para avaliar a capacidade tamponante e força-iônica.

3. Prática: Preparação da Solução Tampão

O melhor procedimento para obtenção de uma solução tampão é seguir o procedimento dado pelo protocolo experimental.

Em uma situação nova ou falta de um protocolo de procedimento existem vários métodos para a preparação de um sistema tampão. Os dois métodos principais são:

A) Quando existe no laboratório os dois reagentes, o ácido (ou base) e o sal do conjugadoApós definir a concentração da solução tampão e a proporção dos componentes da mistura,

para obter o pH desejado, pesar o ácido (ou base) e o sal separadamente, dissolver os mesmos em água e completar o volume desejado em um balão volumétrico.

Exemplo:Como preparar um litro de tampão de fosfato com pH = 7,5 e concentração 0,2 mol/L?

Consultando uma tabela de pKa encontramos: H3PO4

pKa1 =2,15 pKb=11,85H2PO4

- pKa2 =7,21 pKb=6,79HPO4

2- pKa3=12,67 pKb=1,33

O H2PO4- é básico em relação ao conjugado H3PO4 e ácido em relação ao conjugado HPO4

2-.Para fazer o tampão deve-se se escolher o ácido com pKa mais próximo do pH desejado, o

H2PO4- pKa2 =7,21, e o conjugado básico em relação ao ácido, o H2PO4

- pKa=12,67. Os ânions derivados do ácido fosfórico são encontrados como sais de sódio ou potássio. Esses

cátions são inertes na maioria das situações.


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Como o pH desejado não é igual ao pKa devemos ajustar a proporção das concentrações da base H2PO4

- e o seu conjugado HPO4-, na equação de Henderson-Hasselbalch para tampão básico.

pKb = 6,8 HPO4

2- + H+ H2PO4-

Base Ácido (sal)

1ª. opção de cálculo:

Podemos substituir Cb e Cs por:

[HPO42-] = concentração mol/L da base

[H2PO4-] = concentração mol/L do sal do ácido conjugado

0,2-[Sal] = 1,95[Sal] (vide dados)0,2=2,95[Sal]

[Sal]=0,068 mol/L de KH2PO4 (ácido conjugado)

Massa do sal?

1 litro da solução tem 0,068 mol de KH2PO4

m = n . Mm = 0,068mol . 136,1 g/molm = 9,26 g de KH2PO4

Massa da base ?

[Base]= 0,2 – [Sal][Base] = 0,2-0,068[Base] = 0,132 mol/L de K2HPO4

1 litro da solução tem 0,132 mol de K2HPO4

m= 0,132 g/mol.174,2 g/molm = 23,0 g de K2HPO4

Dados:

Volume do tampão = 1 litro pH = 7,5pKb = 6,8

Concentração do tampão:[Base] + [Sal] = 0,2 [Base]= 0,2 – [Sal]

Massa molar (M):M(K2HPO4)=136,1 g/molM(KH2PO4)=174,29 g/mol


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2ª. opção de cálculo:

Podemos chegar ao mesmo resultado prático utilizando o pKa e a equação do tampão ácido:

pKa2 = 7,2H2PO4

- HPO42- + H+

Ácido (sal) base

como [Sal] + [Ácido] = 02 [Sal] = 0,2 - [Ácido] temos:

0,2-[Ácido] = 1,95[Ácido] (vide dados em 1ª. opção)0,2=2,95[Ácido][Ácido] = 0,068 mol/L = 9,26 g de KH2PO4/L (na realidade o sal do ácido)[Sal] = 0,2 – 0,068 = 0,132 mol/L = 23,0 g de K2H PO4/L (na realidade a base)

Os dois componentes são adicionados na forma do sais contendo os conjugados. Estamos chamando de sal a base (maior pKa).

4. Parte Experimental

Dissolver 23,0 g de K2HPO4 e 9,26 g de KH2PO4 em cerca de 900 mL de água, medir o pH e corrigir se necessário com um ácido forte (Por exemplo, HCl) ou base forte (por exemplo, NaOH), finalmente completar o volume para 1000 mL em um balão volumétrico.

A) Quando existe só um dos reagentes

Se houver só o ácido (ou base) este é dissolvido ou diluído em um pouco de água e em seguida é adicionado uma quantidade (calculada) de base forte (ou ácido forte) para obter o pH desejado.


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Se houver só o sal (base conjugada), adicionar a quantidade de ácido forte necessária para obter o pH desejado.

Exemplo 1:

Como preparar 1000 mL de uma solução tampão Tris com pH 8,1 e concentração 0,1 mol/L, tendo apenas a base Tris.

Para isso temos que ter HCl 1,0 mol/L para adicionar na base Tris e gerar o sal do conjugado.

O Tris (trishidroximetilaminometano) tem massa molar igual a 121,14 g/mol, pKa=8,1(25oC) (básico, pKb=5,9).

Tris-Base + HCl Tris–ácido

Para saber o volume de HCl 1,0 mol/L é necessário adicionar na base Tris para obter o tampão com pH 8,1 devemos utilizar a equação de Henderson-Hasselbalch para tampão básico:

Isto significa que a concentração do [Sal] tem que ser igual a da [base], então metade da base deve ser convertida em sal, para que ambas concentrações sejam iguais (0,05 mol/L).

Na reação do Tris-Base com o HCl a proporção é de 1:1.

Como deve ser convertido 0,05 mol de Tris-Base para Tris-ácido é necessário 0,05 mol de HCl. Se em 1000 mL de HCl 1 mol/l temos 1 mol de HCl, em 50 mL teremos 0,05 mol de HCl.

Preparo

Devemos dissolver 0,1 mol da Tris-Base (cristalino) que corresponde a 12,1 g (0,1 mol x 121 g/mol) em 900 ml de água e a seguir adicionamos 50 mL de HCl 1,0 mol/L. Medir o pH, se necessário ajustar com HCl ou NaOH.


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Alternativamente podemos dissolver 12,1 g da base cristalina em 900 mL de água e titular com HCl 1,0 mol/L até pH = 8,1, finalmente completar o volume para 1000 mL.

Comercialmente é encontrado o Tris-Base (mais comum) e o Tris–HCl (tris cloridrato de Tris, pKa=8,06 e Massa Molar 157,6 g/mol), que é titulado com NaOH ou KOH para obter o sal. O Tris é muito dependente da temperatura, a 20oC o pKa=8,3.

Exemplo 2:

Preparo de um tampão a partir de uma solução estoque

O Tris é vendido também na forma de solução estoque.

Como preparar 25,00 mL de um tampão Tris com pH 7,8 e concentração 100 mmol (0,100 mol/L) a partir de uma solução estoque 2000 mmol (2,000 mol/L) e HCl 1 mol/L (pKa=8,1).

Dados: Tris-Básico pKa = 8,1

Concentração da solução estoque do Tris-Basico = 2,000 mol/LConcentração do tampão: [Tris-Base] + [Tris-HCl] = 0,100 mol/L =>[Tris-Base] = 0,100 - [Tris-HCl]

Volume para preparar = 25,00 mLInicialmente deve-se diluir a solução estoque:

C1V1 = C2V2 (lei da diluição) 2,000 mol/L . V1 = 0,100 mmol/L . 25,00 mL V1 = 1,25 mL

Assim deve-se transferir 1,25 mL da solução estoque para um balão volumétrico de 25,00 mL com um pouco de água. Em seguida adicionar o volume calculado de HCl 1,0 mol/L para obter o tampão e completar o volume para 25,0 mL com água em balão volumétrico.

Cálculo:


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A equação de Henderson- Hasselbalch para tampão BÁSICO :

Substituindo [Tris-Base] pela concentração fornecida nos dados:[Tris-HCl] = 2(0,100-[Tris-HCl]) [Tris-HCl] = 0,200 - 2[Tris-HCl])

3[Tris-HCl]=0,200 [Tris-HCl] = 0,0667 mol/LEntão [Tris-Base] = 0,100 –0,0667 = 0,0333 mmol/L

Se em 1000,0 mL há 0,0667 mol de Tris-HCl, em 25,00 mL temos 0,00167 mol.

A proporção de Tris-Base com HCl para formar Tris-HCl é de 1:1, então para formar 0,00167 mol (1,67 mmol) de Tris-HCl são necessários 0,0167 mol de HCl.

1000,0 mL do HCl possui 1,0 mol de HCl, então em 1,67 mL deste ácido há 0,00167 mol de HCl. Assim, se deve acrescentar 1,67 mL de HCl 1,0 mol/L no balão volumétrico com 1,25 mL

da solução estoque de Tris-Base, adicionar outros reagentes como MgCl2 e EDTA, se a metodologia determinar, e completar o volume para 25,00 mL com água ultrapura, para obter a solução tampão desejada.

Medir o pH e ajustar com ácido forte ou base forte se necessário, antes de completar o volume para 25,00 mL.

INTERNET

Na internet há um site da University of Liverpool (Liverpool L69 3BX United Kingdom) com uma calculadora on line que fornece receitas para preparação das principais soluções tampão:

http://www.liv.ac.uk/buffers/buffercalc.html

Para obter a receita de preparação do tampão é necessário informar:

a) Tipo de tampão (acetato, fosfato, tris etc.)b) Volume desejadoc) pH desejadod) Concentração do tampão d) Temperatura de preparoe) Temperatura de usof) Se for necessário controlar a força iônica, qual a força-iônica desejada (em mmol/L). Tem opção de escolha do sal a ser utilizado para controle da força-iônica (NaCl, KCl, Na2SO4 etc)

Alguns cuidados na preparação e armazenamento da soluções tampão:


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Em geral as soluções tampão são estáveis e mantém o pH constante por um longo período, para isso é necessários alguns cuidados:

É recomendado utilizar água ultrapura com resistividade 18,2 MΏ-cm (0,055 µS/cm), a 25oC. Esta água tem um pH neutro na saída do sistema de purificação (sem gás carbônico), mas ela é rapidamente contaminada pelo CO2 do ar até um pH~5,5. A água destilada é obtida com CO2 e no contato com o ar ocorre aumento da contaminação. Caso só se tenha água destilada comum, eliminar o gás carbônico em um destilador, com o condensador na vertical, e fechar rapidamente o frasco de armazenamento após a separação da água para minimizar novas entradas.

Após o uso da solução tampão, fechar rapidamente o frasco para evitar a entrada de contaminantes da atmosfera. O gás carbônico é o principal contaminante atmosférico dos tampões básicos e a amônia dos tampões ácidos.

Um tampão ácido deve ser armazenado em frasco de vidro. Não armazenar tampão básico em frascos de vidro comum, impurezas do vidro como sílica

podem dissolver contaminando o tampão.A contaminação microbiana pode acontecer em pHs próximos de 7. Para evitar a contaminação

é recomendado a esterilização, refrigeração ou aumento da força-iônica, por exemplo, utilizar uma concentração de 500 mmol/L para um tampão de fosfato.

Alguns íons existentes na solução tamponada podem interagir com componentes do tampão. Ex. Ca2+ com o fosfato precipita, Cu2+ com a amina do Tris se ligam fortemente.

Sais de potássio são mais prontamente solúveis em algumas soluções orgânicas. Tomar cuidado no armazenamento dos reagentes, por exemplo, os sais anidros são

mais higroscópicos que os hidratados, assim a hidratação pode causar erro na pesagem e consequentemente na proporção ácido e base.

A melhor maneira de evitar alteração na força-iônica de um tampão é utilizar as quantidades fornecidas pela razão dos componentes na equação de Henderson-Hasselbalch. No preparo do tampão, o volume gasto para ajustar o pH, antes de completar o volume final, deve corresponder no máximo a cerca de 10% do volume final (a ser preparado). Nesta condição o volume de ácido ou base gasto para o ajuste do pH são pequenos e não causam mudanças significativas na força-iônica.

5. Limitações da Equação de Henderson- Hasselbalch com Base nas

Concentrações Nominais (Analíticas)

Quando se faz uma solução tampão com base nas concentrações calculadas na equação Henderson- Hasselbalch é utilizado um eletrólito forte (sal), assim à força-iônica é significativa e o pH obtido difere ligeiramente do esperado. Isto acontece porque a concentração real (atividade


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iônica) do tampão é menor que a concentração nominal (analítica). Assim as equações de equilíbrio deveriam ser expressas em termos de atividade iônica (a) e não da concentração nominal. Dessa forma, o pH de uma solução feita com base nas concentrações analíticas possui um pH ligeiramente diferente do esperado e deve ser ajustado no final do preparo da solução tampão. Os cálculos feitos através das equações de equilíbrio químico em termos de concentração só são exatos para soluções ideais (concentrações muito baixas) em que as partículas estão afastadas uma da outra não havendo interações entre elas.

Uma solução feita com um eletrólito forte (sal solúvel) produz uma força-iônica significativa causando a formação de aglomerados iônicos, diminuindo a concentração efetiva (real). Cada aglomerado iônico age como se fosse uma partícula individual, assim a soma de aglomerados e partículas é chamada de atividade iônica (concentração efetiva/ real) menor que a concentração nominal ou analítica. Concentração analítica é a concentração encontrada em uma análise química através de reações químicas, ou seja, quantifica todos os íons adicionados em um meio.


Alcard, J.C. e Mattiazzo Prezotto, M.E. Equilíbrio Químico: Atividade Iônica. Dep. Química, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba-SP, 1990.

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Capítulo 10Espectrofotometria Quantitativa na Região do

UV-Vis (180 - 800 nm)

José Pedro Serra Valente

Fernando Broetto

Introdução

Espectrofotometria é um método de análise química baseado na absorção de fótons (energia) correspondente aos comprimentos de onda (λ) (ou freqüência) da região do Ultravioleta e do Visível, por espécies químicas.

As espécies químicas (átomos, moléculas, íons e radicais) absorvem energia quantizada (fótons).

Equação de Planck/Einsten

E = energia do fóton

h = constante de Planck

c = velocidade da luz (constante)

λ = comprimento de onda

ν = frequência

• A energia do fóton varia com o λ ou ν.• Fóton é uma partícula de energia da

radiação eletromagnética.• Radiação monocromática é um fluxo

(feixe) de fótons com o mesmo λ e mesma energia.

Figura 1. O fornecimento de fótons com energia mínima igual à diferença entre dois níveis de energia


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causa a absorção e transição de um elétron no estado fundamental para excitado.Quando a solução da espécie química é colorida ela absorve fótons de luz visível (400-780 ou

800 nm) é quando incolor pode absorver fótons de luz ultravioleta (180-400 nm). Embora a energia de transição eletrônica seja a principal energia que participa do processo,

outros tipos de energia estão envolvidos. Energia da Molécula:

ET = Ee + Er + Ev

ET = energia total da molécula

Ee = energia eletrônica

Energia devida à transição de elétrons de valência, do estado fundamental

para um nível ou subnível de energia superior (excitado)

Ev = energia vibracional de átomos na molécula

Energia devida ao aumento das vibrações dos átomos da molécula entre os

subníveis vibracionais.

Er= energia rotacional da molécula

Energia devida ao aumento das rotações das moléculas na transição entre os

subníveis rotacionais.

Figura 2. Movimentos que ocorrem na molécula quando recebe fótons com energia correspondente a frequência do movimento.

Estas energias variam aproximadamente de acordo com os valores a seguir:

Er < Ev < Ee


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1 : 50 : 1000

Como se nota a energia eletrônica (de transição nos níveis energéticos) é mais importante.

1. Banda de Absorção da Molécula e Absorbância Máxima (λmax.).

Figura 3. O comprimento de onda associado ao pico da banda corresponde ao máximo de absorbância da molécula.

Quando uma amostra contendo determinada molécula é varrida por um espectro de radiação (faixa de comprimentos de ondas variando continuamente) e é registrada simultaneamente a energia absorvida (absorbância) temos um gráfico como acima, denominado de banda ou espectro de absorção. O pico de absorbância fornece o comprimento de onda que é mais absorvido pela molécula.

No espectro de absorção nota-se que a molécula absorve vários comprimentos de ondas com intensidade diferente, um deles é máximo (λmax.). Isto é devido à existência de diferentes níveis e subníveis na molécula (vibracional, rotacional e eletrônico). Sendo que o (λmax.) inclui a transição eletrônica principal (preferencial).

Os espectros de banda também são utilizados para a análise qualitativa de grupos funcionais de moléculas orgânicas. As bandas obtidas nas amostras são comparadas com as bandas obtidas com padrões.

Figura 4. Transições eletrônicas quantizadas possíveis pela absorção de fótons com energia igual a diferença entre os níveis e subníveis.

Entre dois níveis ou subníveis de energia existe uma zona proibida onde os elétrons não podem


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permanecer, apenas podem atravessar.

As regiões onde os elétrons podem permanecer são denominadas de níveis e subníveis de energia e possuem energia definida. Quanto mais distante do núcleo estiver do nível e subnível, maior é a energia do elétron. Estas diferenças de energia entre níveis e subníveis são características de cada espécie química.

Um elétron para ir de um nível ou subnível a outro deve receber fótons com energia no mínimo igual à diferença entre os níveis e subníveis. Um elétron ao receber energia não é livre para permanecer onde esta, sofre transição. Após a transição o elétron dissipa a energia e volta ao estado inicial (fundamental). O estado excitado é transiente, tem um tempo de vida curto e decai para o estado fundamental por emissão de fótons, em nanosegundos.

A energia necessária para a transição de um estado fundamental para um estado excitado é específica para cada espécie química, assim cada molécula absorve de maneira particular.

2. Processo de Absorção de Radiação UV-Vis da Molécula (m)Todas as moléculas orgânicas são capazes de absorver radiação eletromagnética porque todas

contêm elétrons de valência que podem ser excitados a níveis de energia mais altos. O processo ocorre em duas etapas:

1) Excitação por absorção de fótons

M + hν → M*

O tempo de vida da espécie química excitada é de 1–10 ns (nano segundo). Após ocorre um processo de relaxação em que o excesso de energia é dissipado e a molécula volta para estado fundamental.

2) Relaxação

a) Ocorre por liberação de calor: M* → M + calor

b) Decomposição de M* (reação fotoquímica/ fotólise)

M* → A + B (ocorre em condições mais energéticas)

c) Reemissão de radiação por fluorescência ou florescência


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Estado fundamental e

absorção de luz

Ef = E3 – E1

Estado excitado e emissão de calor

Ef = E3-E2

Emissão de luz fluorescente ou fosforescente

Ef = E2-E1

Figura 6. Transição eletrônica com absorção e emissão de radiação

Se os fótons absorvidos tivessem a Ef = E2-E1 a volta para o estado fundamental se daria apenas com emissão de calor.

A quantificação da energia absorvida por uma espécie química permite determinar a concentração do analito1 em uma amostra. A técnica que permite isso é chamada de espectrofotometria e o equipamento de espectrofotômetro.

3. Princípios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - Vis

A espectrofotometria quantitativa é baseada na medida da absorbância (A) ou transmitância (T) de um feixe de luz monocromática, após passar por uma amostra contendo um analito. A concentração do analito é proporcional a absorbância de acordo com a lei de Lambert-Beer.

Figura 7. Absorção de radiação monocromática (fótons com o mesmo λ)

pelo analito na amostra.

Quando uma parte da luz incidente é absorvida (It < Io)

Absorbância: A = Io/It

Transmitância: T = It/Io


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Io : Intensidade do feixe de luz incidente

It ; Intensidade de feixe de luz transmitido

Quando um feixe de radiação monocromática com λmax atravessa uma solução que contenha uma espécie absorvente (centros absorventes) uma parte da energia radiante é absorvida enquanto a outra é transmitida pelo meio.

3.1 Lei de Lambert

Esta lei diz que a absorbância de uma radiação monocromática por um analito é proporcional ao comprimento do caminho óptico na solução.

A = α1 b

A = absorbância (sem unidade)

b = comprimento de caminho óptico (cm) (espessura da cubeta, em geral 1 cm)

α1 = constante de proporcionalidade, característica de cada solução

3.2 Lei de Beer

Esta lei diz que a absorbância da luz monocromática por uma solução, com solvente transparente, é proporcional a concentração do analito.

A = α2 C

C = concentração em mol L-1 ou g L-1

α2 = constante de proporcionalidade, característica de cada solução

3.3 Junção das duas Leis

Lei de Lambert–Beer

Juntando a lei de Lambert e lei de Beer temos:

A = α1 b . α2 C α1 α2 = ε ou α1 α2 = a

A = ε b C ou A = a b C

A = Absorbância

T = transmitância

C = concentração do analito absorvente em mol.L-1 ou g L-1


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ε (epsilon) = absortividade molar (cm-1.mol-1.L) (característico do analito absorvente) =

capacidade da molécula em absorver energia com determinado λ e solvente

(utilizado para C em mol L-1)

a = absortividade (cm-1.g-1.L) (característico do analito absorvente) = capacidade da

molécula em absorver energia com determinado λ e solvente (utilizado para C

em g L-1)

Outras considerações

A = -log T

T = Pt/Po ou T(%) = P/Po x 100

Po = potência do feixe de radiação incidente (quantidade de energia de um feixe de energia monocromada transportada de uma fonte por segundo)

Pt = potência do feixe de radiação transmitida após atravessar a solução do analito

Embora as medidas experimentais sejam realizadas em função da potência radiante de uma fonte é mais comum encontrar o termo intensidade de radiação para definir a transmitância:

T = It/Io

Io = Intensidade do feixe incidente

It = Intensidade do feixe transmitido

Potência radiante e intensidade da radiação não correspondem à mesma coisa, mas estão relacionadas entre si. A intensidade de radiação, I, é definida como a razão entre a potência radiante e a área irradiada. Intensidade (Io) é o número de fótons incidente.

Quando um feixe de radiação passa por uma substância absorvente, a intensidade da radiação incidente (Io) será menor que da radiação emergente.

A intensidade do feixe de radiação (monocromática) transmitida decresce exponencialmente com o aumento da espessura da cubeta, T = It/Io = 10 –ε b C:

Outras formas de expressar a lei:


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T = 10 –ε b C

log T = log 10 –ε b C

log T = -C ε b

-log T = C ε b

log 1/T = C ε b

log Io/It = absorbância (A) = C ε b

4. Aspectos Práticos

Resumo da lei de Lambert-Beer

A = -log T = ε b C ou

A = -log T = a b C

A = -log T

ε b = k (inclinação/slope)

a b = k

A = kC

C = A/k

C = (A-cL )/ ca (Equação da reta – recomendado)

A= absorbância de luz monocromática pelo analito (sem unidade)

T= transmitância da luz monocromática

ε = absortividade molar do analito (capacidade da espécie química absorver λ/constante)

(unidade: cm-1 mol-1 L).

a = absortividade do analito (unidade: cm-1 g-1 L).

b = comprimento do caminho óptico (espessura da

cubeta/geralmente 1 cm)

C = concentração do analito (mol L-1ou g L-1) (equação da reta da curva de calibração)

cL = Coeficiente linear da reta (intercepto y)(equação da reta da curva de calibração)

ca = Coefciente angular da reta (regreção linear da curva de calibração)

k = inclinação da reta (curva de calibração)


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5. Requesitos para Quantificação do Analito:

1) Para utilizar a faixa do visível é necessário que o analito em solução seja colorido (absorva luz visível). Geralmente é necessário fazer um pré-tratamento químico na amostra. Por exemplo, para determinar a concentração total de um elemento ou íon, em geral é feito uma digestão com ácidos e oxidantes, para liberar o analito em uma forma definida (igual ao da forma utilizada na solução de referencia utilizada para fazer a curva de calibração) e reagir com reagentes que formarão uma espécie química colorida (centro absorvente), proporcional a concentração do analito.

2) Conhecer o λmax (comprimento de onda com máxima absorbância pelo analito). Este é o melhor comprimento de onda, dentro do espectro de absorção, porque permite a detecção de concentrações mais baixas do analito. Este λmax é obtido no desenvolvimento da metodologia da análise e pode ser checado facilmente fazendo uma varredura do espectro na amostra.

3) Fazer uma solução estoque do analito e fazer diluições da solução estoque de acordo com a metodologia.

4) Fazer a reação do analito com reagentes para obter uma solução da espécie química que absorva luz monocromática proporcional a concentração do analito.

5) Fazer um “branco” com água destilada e os reagentes utilizados nos padrões.5) Fazer as medidas de absorbâncias para obter a curva de calibração (referência).6) Construir a curva de referência (A vs. C) para determinação de concentrações

desconhecidas de analitos em amostras.

6. Validade da Curva de Referência

A curva de referência será válida enquanto não for alterado algum acessórios do aparelho e forem utilizados os mesmos reagentes utilizados para fazer a curva de calibração.

Quando houver alguma modificação ou em caso de alguma suspeita pode-se utilizar uma solução com concentração exatamente conhecida (padrão) como amostra e checar o resultado na curva. Se o erro não for aceitável deve-se fazer outra curva de referência.

O ideal é sempre correr um padrão junto com as amostras quando for realizar medidas, alguns reagentes são instáveis e podem ocorrer alterações ou contaminação.

7. Determinação da Concentração do Analito na Amostra:

1) Fazer o pré-tratamento químico da amostra de acordo com a metodologia.2) Processar as reações para obter o analito colorido na solução da amostra, para determinação no visível. Se a amostra for incolor, usa-se a luz no UV. Muitas substâncias orgânicas absorvem na região


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ultravioleta e nestes casos o pré-tratamento só envolve eliminação de interferentes3) Fazer um “branco” com água destilada e os reagentes4) A radiação incidente pode sofrer reflexão, refração e espalhamento no sistema cubeta-amostra, sendo, portanto, contabilizada como energia absorvente. O branco desconta este erro, desde que seja utilizado sempre à mesma cubeta ou cubetas diferentes de alta qualidade, de preferência da mesma marca e lote. 5) Ajustar o espectrofotômetro e medir a absorbância.6) Calcular a concentração do analito na amostra

8.Procedimento Básico para Operação do Espectrofotometro

1) Ajustar o comprimento de onda para o descrito no protocolo de análise. 2) Ligar o espectrofotômetro e esperar o tempo para estabilização.3) Zerar o espectrofotômetro.4) Colocar a cubeta do branco no suporte e zerar novamente o aparelho em zero de absorbância ou 100% de transmitância.5) Retirar o branco e colocar outra cubeta com a amostra de referência ou desconhecida, ler a absorbância.6) Se o espectrofotômetro tiver suporte para várias cubetas (carrossel) colocar o branco e completar o carrossel com as cubetas das amostras ou padrões.7) Se o espectrofotômetro for de duplo feixe, a cubeta do branco não é alternada com a cubeta das amostras. As leituras do branco e amostras são sempre feitas simultaneamente. O feixe monocromático da luz é dividido em dois antes dois feixes, um vai para o branco e o outro para a amostra.

Observações

1. O branco, dependendo do protocolo de análise, pode ser a cubeta só com o solvente, geralmente a água, ou com o solvente e reagentes, conforme utilizado para amostras. 2. O objetivo do branco é descontar os erros devido à absorção da radiação pela cubeta, solvente, reagentes e impurezas dos reagentes.

9. Procedimento para Tratamento dos Dados Experimentais:

9.1 Construção da curva de referência e determinação da concentração desconhecida de um analito.

Método 1 (grosseiro): dois procedimentos

Colocar (plotar) as concentrações dos padrões, C (abscissa) e absorbâncias, A (coordenada)


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em um papel milimétrico para obter a curva de calibração, C vs. A.

a) O resultado da concentração da amostra desconhecia é obtido por interpolação na curva de referência.

b) Calcular a inclinação da reta (k) k = εb => A = k C

O resultado (C) é obtido dividindo A/k

Figura 8. A curva de referência descreve a relação linear entre a absorbância e a concentração, em uma faixa de concentração onde a lei de Lambert-Beer é obedecida.

Método 2: determinação da equação da reta (método estatístico/recomendado)

Sabe-se que a equação da reta é calculada pela expressão:

ax + b – y = 0,

y = ax + b

onde,

x = concentração (C)

y = absorbância (A)

a = coeficiente angular da reta (slope)

b = coeficiente linear da reta (intercept y)

Equação da reta:

A = aC + b < = > C = (A - b)/a

Cd = (Ad – intercept)/Slope

Cd = Concentração desconhecida

Ad = Absorbância da amostra com concentração desconhecida


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Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva de calibração a partir de um conjunto de medidas experimentais pode ser obtida através da regressão linear

Cálculo de a e b pelo método dos mínimos quadrados

a = [n(∑CA) - (∑C)(∑A)]/ [n(∑C2 ) - (∑C)2 ] (coeficiente angular)

b = [(∑A)(∑C2)-(∑C)(∑C.A)]/[n(∑C2)-(∑C)2] (coeficiente linear)

n = número de medidas (incluindo o branco)

A = Absorbância

C = concentração

n = número de medidas

Além dos coeficientes de regressão a e b, pode-se calcular o coeficiente de correlação (r) que permite obter uma estimativa da qualidade da curva obtida. Quanto mais próximo de um, melhor é a qualidade da curva. Uma curva boa deve ter pelo menos três noves após a vírgula.

Cálculo do coeficiente de correlação (r):

r = [n(∑C A) – (∑C) (∑A)]/ √{ [n(∑C2)-( ∑C)2][n(∑A2) – (∑A)2]}

10. Espectrofotômetro

O equipamento utilizado, um espectrofotômetro, é relativamente barato pela sua versatilidade. Possibilita a quantificação de um grande número de analitos, possui boa sensibilidade e é de fácil manuseio. Possivelmente o espectrofotômetro é o aparelho para análise química mais utilizado no mundo. Em geral os espectrofotômetros possuem:

1) Fonte radiaçãoPara radiação no visível a fonte mais utilizada é uma lâmpada incandescente com filamento de

tungstênio (350-2500 nm), é utilizado também tungstênio-halogênio fornecendo também λ>350 nm (tempo de vida de 10.000 horas).

Para radiação UV são utilizadas lâmpadas fluorescentes de hidrogênio, deutério e hélio que emitem radiação entre 180 e 370 nm (tempo de vida de 1.000 horas). Dependendo do espectrofotômetro pode-se ter:

1 lâmpada (360-1000 nm): para determinações no espectro do visível

2 lâmpadas (190-1100 nm): para determinações no UV-Vis

2 lâmpadas (175-3300 nm): para determinações no UV-Vis e Infravermelho

O feixe da radiação é direcionado para a face de um prisma ou para uma rede de difração, através de um sistema colimador, para decompor a luz e separação da luz monocromática.


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(a) (b)

Figura 9 . Representação de uma rede de difração (a) e um prisma (b)

2) Monocromador:

O monocromador é um sistema utilizado para dispersar a luz e selecionar um feixe de comprimentos de ondas estreito, idealmente só com um comprimento de onda (radiação monocromática). O monocromador é constituído por um sistema colimador, ou seja, um tubo que recebe a luz da fonte e através de uma fenda de entrada, cuja largura é ajustável, conduz a luz para lentes convergentes para aperfeiçoar o paralelismo da radiação. A luz colimada é incidida em um prisma ou rede de difração para ser decomposta. Após a luz ser fracionada, a rede de difração ou prisma é girado para sair a luz monocromática por uma fenda em direção a cubeta contendo a amostra. Para espectrofotômetros de duplo feixe há um jogo de espelhos que divide o feixe da luz monocromática em dois, um vai para a cubeta da amostra e o outro para a amostra.

3) Compartimento de cubetas:

As cubetas são utilizadas para colocar as amostras contendo o analito. Em geral se utiliza cubetas com um caminho óptico de 1 cm. Alguns protocolos de análise recomendam cubetas de até 10 cm de caminho óptico para aumentar a sensibilidade da determinação. O aumento da sensibilidade é proporcional a espessura da cubeta (lei de Lambert). Para isso é necessário trocar o adaptador de cubetas para a espessura desejada.

As cubetas devem ser transparentes a radiação e podem ser de:

Vidro ou plástico para o visível. No caso de plástico o solvente da amostra não deve atacar o plástico.

Cubetas de quartzo para o UV e Visível. Nas medidas com radiação UV só utilizar cubeta de quartzo.

Quando o espectrofotômetro também faz medicas de infra-vermelho (IR) utilizar cubetas de quartzo livre de OH medidas no IR próximo.As cubetas devem estar sempre bem limpas e sem marca dos dedos.


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4) Detector:

O detector mede a intensidade da luz transmitida após a radiação passar pela cubeta com a amostra e é medida em uma célula fotoelétrica ou fotmultiplicador e amplificador (galvanômetro).

10.1 Esquema do Espectrofotômetro:

Figura 10. Esquema básico de um espectrofotômetro

Espectrofotometro de duplo feixe

Os espectrofotômetros podem ser de um feixe ou de duplo feixe. Nos de duplo feixe a radiação antes de atingir a amostra é desdobrada em dois feixes, um vai para a cubeta com a amostra e o outro para a cubeta do branco. As medidas são realizadas simultaneamente e a absorção do branco é descontada da amostra automaticamente.


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Figura 11. Esquema de um espectrofotômetro UV-Vis de dois feixes.

Os espectrofotômetros mais modernos após a calibração fornecem a curva de calibração, coeficiente de correlação, equação da reta e os resultados das absorbâncias e concentrações.

11. Limitações da Lei de Beer (Distorções da linearidade/erros)

Quando a reta não passa pela origem e foge da linearidade está ocorrendo desvios da Lei de Beer.

Os fatores que causam os desvios são chamados de desvios reais, químicos e instrumentais.

a) Desvios Reais

A lei de Beer considera que os centros absorventes (espécies químicas) não interagem entre si, isso só acontece para soluções ideais, muito diluídas. Quando a solução é concentrada (desvios reais), ocorrem interações entre as moléculas ou íons, com formação de aglomerados, e a atividade do analito torna-se menor que a concentração analítica, reduzindo a absorção de luz. O índice de refração também é a afetado em concentrações altas. Assim, a Lei de Beer só é válida para soluções diluídas (<0,01 mol/L).

O solvente não deve absorver a radiação utilizada para análise do analito.

b) Desvios químicos

Surgem quando parcialmente um analito se dissocia, associa, forma complexo, polimerização, solvólise ou reage com o solvente para dar um produto que tem um espectro de absorção diferente do analito na forma principal (desvios aparentes), pois a Lei de Beer estabelece que a absorbância é diretamente proporcional à concentração real da espécie absorvente, mas não necessariamente concentração total de um componente (soma do analito em todas as formas químicas),


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Um equilíbrio químico é afetado pela diluição, o grau de dissociação depende da concentração. Assim, quando o analito está envolvido em um equilíbrio químico e no preparo da amostra para análise ocorrem diluições com os reagentes e o solvente, para ajustar a concentração dentro da linearidade da lei de Beer, é alterdao a concentração inicial do analito. Por exemplo, o grau de ionização de um ácido fraco varia com a diluição. Quando a diluição for pequena, isso pode ser solucionado com uso de um tampão.

c) Desvios Instrumental

São desvios causados pela qualidade e limitações dos aparelhos (desvios aparentes), como por exemplo, instabilidade da fonte, não linearidade do detector, introdução de radiação policromática, limites para conseguir isolar faixas espectrais muito estreitas etc.

A lei só é válida para radiação monocromática, ou seja, para um único comprimento de onda (λ), na prática é impossível de obter.

12. Regra Práticas para Diminuir os Desvios da Lei de BeerUma concentração alta do analito na amostra é principal causa dos desvios da lei. A

absorbância aumenta proporcionalmente com a concentração, mas a partir de um ponto esta proporcionalidade deixa de existir e a reta começa subir exponencialmente, conforme a figura 9.

A lei de Beer é somente valida dentro do limite de linearidade.

Figura 9. Desvio da lei de Beer para concentrações elevadas

Para evitar este desvio (diminuir o erro) deve-se trabalhar em uma faixa em que a absorbância fique entre 0 e 1.

Se a absorbância da amostra foi alta, diluir a amostra e repetir a análise.No UV muitas moléculas orgânicas, que não absorvem no visível (incolor) absorvem na

mesma banda (intervalo do espectro de absorção), ou seja pode ocorrer sobreposição


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de parte das bandas, assim é necessário fazer um pré-tratamento químico para eliminar o possível interferente do analito (espécie química de interesse).

Só utilizar cubetas de alta qualidade.Só utilizar cubeta de quartzo no UV. Cubetas de vidro absorvem luz UV.


Ohweiler, O. A., Química Analítica Quantitativa, vol. 3, Livros Técnicos Científicos SA, Rio de Ja-neiro, (1974).

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Capítulo 11Proteólise enzimática da carne

Luis Artur Loyola Chardulo

Jessica Moraes Malheiros

Victor Augusto Domingos Dias

Ana Paula Costa Rodrigues Ferraz

Fernando Broetto

Introdução

A sequência de eventos bioquímicos que influenciam o músculo no período ante e postmortem são de suma importância para o entendimento da qualidade da carne. Após o abate dos animais ocorre o rigor mortis, conhecido também por rigidez cadavérica, convertendo assim o músculo em carne e dando início a degradações enzimáticas e desnaturação protéica que variam de acordo com os procedimentos de conservação utilizados, tornando menos rígida à carcaça.

A maciez da carne é o resultado de diferentes fatores, tais como a quantidade e solubilidade do tecido conjuntivo, o encurtamento do sarcômero durante o desenvolvimento do rigor e postmortem e a proteólise das proteínas miofibrilares (Koohmaraie & Geesink, 2006).

O amaciamento da carne ocorre devido a alterações ultra-estruturais, que enfraquecem a integridade das fibras musculares no tecido muscular. Uma indicação da degradação das proteínas miofibrilares musculares sob condições de pos mortem pode ser alcançado através da determinação do grau de fragmentação de miofibrilas que define o comprimento médio destas, sabendo que quanto menor são as miofibrilas maior a maciez.

As medidas da degradação das proteínas musculares no postmortem têm sido realizadas através de diferentes técnicas, dentro das quais se destacam a eletroforese, a determinação dos aminoácidos livres e a fragmentação das miofibrilas. Quanto aos métodos utilizados para se calcular o índice de fragmentação miofibrilar (MFI), podemos citar dois. A primeira técnica descoberta requer homogeneização do músculo e verificação das miofibrilas pela análise microscópica, e a segunda, atualmente mais utilizada, também requer homogeneização do músculo seguido da determinação total de proteína e medida da turvação das amostras ajustadas para uma concentração comum de proteína (Hopkins et al., 2000). Este método reflete o grau de proteólise, indicado através da ruptura e quebra de ligações miofibrilares na banda I (Taylor


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et al., 1995). Ultimamente a determinação do método do MFI é frequentemente utilizada por

pesquisadores de diversos países. A metodologia empregada e o processamento das amostras nem sempre são os mesmos, encontrando assim alterações impactantes nos valores observados entre os diferentes estudos. De acordo com as diferenças na metodologia podemos citar a utilização de amostras frescas e congeladas, a velocidade e o tempo de homogeneização, o tipo de homogeneizadores e fatores utilizados para os cálculos do índice.

Na determinação do MFI normalmente são utilizadas amostras de carne fresca (Koohmaraie, 1990), mas é importante ressaltar que muitas vezes a única opção viável quando há um grande número de amostras coletadas é o congelamento destas, para posterior realização das análises. Sendo o tempo entre o descongelamento e a homogeneização muito curto, não sendo suficiente para ocorrer alterações na proteólise (Hopkins et al., 2000). Diversos autores optam pela opção da utilização de amostras congeladas em seus trabalhos (Culler et al., 1978; Mc Donagh, 1998). Em resultados observados por Hopkins et al. (2000), com amostras frescas e submetidas ao congelamento, indicaram que a velocidade de homogeneização interfere nos valores de índice de fragmentação miofibrilar, de tal modo que a velocidade de homogeneização a 15.000 rpm acaba com as possíveis diferenças entre o uso de amostras frescas e congeladas.

A duração do tempo de homogeneização é demonstrada em vários estudos como interferente nos valores observados através de espectrofotômetro a 540 nm, sabendo-se que os valores de MFI são baseados na quantidade de refração de luz que ocorre na suspensão de miofibrilas. Quando os valores aumentam existe um correspondente aumento do número de partículas em decorrência da fragmentação da estrutura miofibrilar pela atuação de enzimas proteolíticas (Veeramuthu; Sams, 1999). Utilizando o método de turvação na análise de MFI, Olson et al. (1976) demonstrou que as amostras necessitam de pelo menos 60 segundos de homogeneização, a fim de fornecer resultados viáveis. Portanto, é de suma importância pesquisar as diferentes metodologias e as condições de cada experimento para melhor adequação do método a ser empregado.

O MFI tem sido amplamente adotado como método de avaliação indireta da extensão da atividade proteolítica, pois reflete o tamanho das miofibrilas, prediz mais de 50% da variação da maciez da carne (Hopkins et al., 2000), demonstrando uma alta correlação com índices de maciez aferidos pela Força de Cisalhamento utilizando o equipamento Warner Bratzler Shear

Force e análise sensorial realizadas por “panelistas treinados” (Kriese et al., 2007; Culler et al., 1978). Assim as miofibrilas mais curtas resultam em elevações do MFI e diminuição dos valores obtidos pelo shear force, evidenciando consequentemente maior maciez (Moller et al., 1973). Segundo Culler et al. (1978), valores do índice de fragmentação de 60 ou acima de 60 para o músculo Longissimus dorsi denota-se uma carne muito macia, valores de 50 uma carne macia e valores abaixo de 50 uma carne pouco macia.

Para músculos que não são grandes o suficiente para se determinar valores de shear force ou análise sensorial, este índice torna-se bastante preciso e viável sendo utilizado na análise de proteólise muscular como indicador de maciez da carne (Veiseth et al., 2001).


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1. Procedimentos e Extração Protéica

1.1 Preparo da amostra

A coleta das amostras para realização da análise deve ser de 3 g do músculo em questão, livre de gordura e tecido conjuntivo, embaladas em papel alumínio e devidamente identificadas. Após a separação das alíquotas a análise pode ser realizada com as amostras estando frescas ou congeladas.

1.2 Extração das proteínas

As amostras devem ser colocadas em tubos de centrífuga, para homogeneização em Ultra

turrax com haste de cisalhamento (Marconi - MA102/E) a 18000 rpm em 30 mL de tampão de índice de fragmentação miofibrilar (TMFI) à 2°C (100mM KCl, 20mM de fosfato de potássio pH 7, 1mM EDTA, 1mM MgCl2 e 1mM NaN3, em pH 7,0) duas vezes por 30 segundos com mesmo intervalo em gelo. Após a homogeneização as amostras deverão ser centrifugadas a 1000 x g por 17 minutos à 2°C e o sobrenadante será descartado. O pellet deverá ser ressuspendido em 30 mL de TMFI à 2ºC e homogeneizado com bastão de vidro.

As amostras serão centrifugadas a 1000 x g por 17 minutos à 2°C e o sobrenadante será novamente descartado. O pellet será então ressuspendido em 8 mL de TMFI à 2°C e submetido ao Vortex até a amostra tornar-se bastante homogênea para ser filtrada em filtro de polietileno com malha de 1 mm aproximadamente. Ao filtrado serão adicionados 7 mL de TMFI à 2°C para a lavagem do tubo de centrífuga e auxiliar na filtragem.

Ao término da filtragem as amostras devem ser armazenadas em tubos falcon (15 mL) sobre refrigeração.

2. Análises

2.1 Determinação da proteína

As análises serão realizadas em espectrofotômetro. Para isso, será necessário o preparo de três tubos de ensaio. O primeiro tubo será o branco da amostra para a calibração do equipamento, contendo apenas 1,0 mL de solução tampão e 4,0 mL de reagente/reativo de Biureto. Os outros dois tubos irão conter 0,75 mL de solução tampão, 0,25 mL de amostra e 4,0 mL de reagente/reativo de Biureto (O reagente de Biureto deve ser colocado por último e com o menor intervalo de tempo possível entre as amostras, pois é um reagente de cor e assim que entra em contato com as proteínas se inicia a reação).


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Os tubos de ensaio devem ser agitados após a adição do Biureto para que a reação ocorra de maneira homogênea e colocados em local escuro por 30 minutos. Realiza-se a leitura de absorbância em espectrofotômetro a 540 nm. As leituras obtidas pelo equipamento serão anotadas para a determinação da quantidade de proteína e fornecimento dos valores de tampão e amostra que devem ser utilizados para realização da segunda leitura.

2.2 Determinação do índice de fragmentação miofibrilar

As análises também serão realizadas através de leituras em espectrofotômetro. Para isso, será necessário o preparo de dois tubos de ensaio, onde se deve adicionar quantidades apropriadas de amostras e de solução tampão (TMFI), para que a concentração da solução seja de 0,5 mg proteína/mL de solução, num total de 4 mL de solução.

Para zerar o equipamento utilizar a solução tampão (TMFI), submeter os tubos de ensaio com amostra e TMFI ao Vortex para homogeneizar e realizar a leitura da absorbância no comprimento de onda de 540 nm em espectrofotômetro.

Cálculo

Para a determinação do índice de fragmentação miofibrilar (MFI), será necessário usar a seguinte expressão:

MFI = 200 x absorbância

3. Preparo de Reagentes

A) Solução extratora: Tampão de MFI (TMFI) com pH 7,0:Para o preparo do tampão é necessário fazer a solução utilizando água destilada com

temperatura de 2-4°C:100 mM Cloreto de Potássio (KCl); 20 mM Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4); 20 mM Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4); 1 mM Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA); 1 mM Cloreto de Magnésio (MgCl2⋅6H2O); 1 mM Ázida sódica (NaN3).

KCl............14,91 g KH2PO4......2,72 g K2HPO4......3,50 g EDTA..........0,76 g MgCl2..........0,41 g NaN3...........0,13 g

Pesar os reagentes e dissolver em aproximadamente 700 mL de água destilada. Acertar


91

o pH para 7,0 utilizando solução de NaOH (Hidróxido de sódio - base) ou HCl (Ácido clorídrico - ácido). Após o ajuste do pH, transferir para um balão volumétrico de 2,0 L e completar o volume com água destilada. Armazenar em recipiente de vidro sob refrigeração.

B) Solução reagente/reativo de Biureto

Deve-se dissolver 1,5 g de Sulfato de cobre (CuSO4⋅5H2O) e 6 g de Tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O) em 500 mL de água destilada. Preparar 300 mL de solução de NaOH a 10% e transferir ambas as soluções para um balão volumétrico de 1,0 L e completar com água destilada. Armazenar a solução em vidro âmbar.

4. Resultado

Para melhor compreensão da utilização do índice de fragmentação miofibrilar em cortes cárneos, apresenta-se abaixo um roteiro para a determinação em animal da raça Nelore (Bos

indicus), animal Piemontês (Bos taurus), Frango e Cordeiro. Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 3 g de músculo de

cada amostra livre de tecido adiposo e conectivo, foram extraídas as proteínas com o tampão de extração (TMFI).

Após a realização das leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotômetro utilizando o comprimento de onda de 540 nm, foi efetuado o cálculo para determinar o teor de proteína e o valor encontrado de índice de fragmentação miofibrilar (MFI).

Tabela 1. Experimento prático sobre a determinação de índice de fragmentação miofibrilar (MFI)

Leituras em Absorbância

AmostrasLeitura

Proteína[Proteína] Volume

AmostraVolume Tampão

Leitura MFI

MFI - 200

Nelore 0,339 25,84 0,08 3,92 0,254 50,80PiemontêsCordeiroFrango

0,3480,3280,391

26,5724,9530,06

0,08 0,080,07

3,923,923,93

0,3760,3830,342

75,2076,6068,40

Essa prática é um exemplo simples para demonstrar através do cálculo o Índice de fragmentação miofibrilar (MFI), sendo perceptível a diferença entre as amostra analisadas.


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métodos de trabalho em bioquímica vegetal e tecnologia de

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