Métodos Modernos para Diagnostico de Tuberculosis

Licda. Yanira E. MeléndezLaboratorio Nacional de Referencia2012

Nuevas Técnicas Diagnosticas de la Tuberculosis

• El diagnostico actual se basa en las mismas técnicas bacteriológicas que descubrió Koch hace mas de 100 años.

• Se ha tomado conciencia que para lograr su eliminación es mas importante mejorar los métodos diagnósticos.

QUE ESTAMOS HACIENDO??

• Cultivos en medio Solido: Loweistein Jensen

Ogawa Kudoh

Cultivo por Kudoh en medio Ogawa

Crecimiento en Medio Ogawa

IDENTIFICACION DE LA ESPECIE.

Crecimiento:Medio en el que crece. Tiempo que tarda en crecer,

morfología de la colonia, producción de pigmentos con/sin luz…

Pruebas bioquímicas:Prueba de la niacina, reducción de nitratos,

catalasa, tween 80.

ESTUDIO DE SENSIBILIDAD

• METODOS CONVENCIONALES.Crecimiento de la micobacteria en medios con el

tuberculostàtico correspondiente

Medios sólidos: Método de las proporciones (Resultado del estudio: 2-3 meses desde la recogida

de la muestra)

DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS TRADICIONALES

PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE

EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA

EXAMEN DIRECTO Coloración de KinyounColoración de Ziehl-

Neelsen 24 HORAS

DETECCION DE CRECIMIENTO

Lowestein-JensenOgawa- Kudoh 20-25 DÌAS

IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE

Pbas bioquímicas tradicionales (Niacina, Catalasa, Reducción de

Nitratos etc)

50-55 DIAS

DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS TRADICIONALES

PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE

EL DIA EN QUE SE PROCESA LA MUESTRA

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

Método de las proporciones

múltiples 60 DIAS

DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS RECOMENDADOS POR EL CDC

PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE

EL DIA EN QUE SE PROCESA LA

MUESTRA

EXAMEN DIRECTO Coloración Auramina/Rodamina

24 horas

DETECCION DE CRECIMIENTO

BACTEC, 15 días

IDENTIFICACIÓN DE LA ESPECIE

BACTEC, Sondas de ADN, HPCL

18 días

DIAGNOSTICO DE TBC POR METODOS RECOMENDADOS POR EL CDC

PROCEDIMIENTO TECNICAS TIEMPO PROMEDIO DEL REPORTE DESDE

EL DIA EN QUE SE PROCESA LA

MUESTRA

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD

BACTEC 30 días

Nueva metodología en Laboratorio Nacional de Referencia

Microscopía LED Una nueva alternativa diagnóstica

Qué es la microscopía LED?

Es un tipo de microscopìa fluorescente en la cual la fuente lumínica (halógena o de mercurio) ha sido reemplazada por un diodo emisor deluz

Qué es un diodo?Dispositivo semiconductorde paso de corriente eléctrica en un solo sentido

ZIEHL NEELSEN

Microscopio óptico. 800 – 1000

Bacilos de color rojo sobre fondo Azul y blanco.

AURAMINA O

Microscopio de fluorescencia 200 – 400

Bacilos flourescentes amarillos Y brillantes sobre fondo oscuro

La “Limitación” más importante de la baciloscopìa es su baja sensibilidad.

Muy importante: Obtener buenas muestras

Tiempo de observación

Nuevos métodos de CultivoMedios de cultivo Líquidos: Radiométricos ( BACTEC ): detecta automáticamente crecimiento bacteriano, en caldo Milddlebrook 7H12 midiendo la cantidad de CO2 marcado con Carbono Radioactivo (14CO2)

Sistema BACTEC

Ventajas

*Ahorro de tiempo en la detección del crecimiento(15 a 20 días)*Mayor sensibilidad, tanto para el aislamiento del M. tuberculosis como de otras Micobacterias.*Posibilidad de identificar M. tuberculosis en 4 a 5 días y de realizar PSD a fármacos de primera línea en 3 a 6 días.

Desventajas• Necesita utilizar radioisótopos.• Elevado costo del equipo, reactivo y

mantenimiento.• Uso de jeringas, lo que puede ocasionar

contaminaciones cruzadas entre muestras así como formación de aerosoles.

• Necesita permiso para manipulación y almacenamiento del 14C.

MGIT 960/320

• Basado en el mismo principio, pero el marcador ha sido sustituido por Rutenio que emite fluorescencia detectable a medida que disminuye la tensión parcial de O2, usa tubos con caldo Milddlebrook 7H9

• Tiene una lectura automatizada• Aprobado como Gold Estándar• Buena concordancia con PS en medio sólido y BACTEC 460

MGIT 960/320

VENTAJAS

Mayor sensibilidad. Menor tiempoDESVENTAJAS

Mas costoso. Dependencia del proveedor Mayor preparación de personal

Crecimiento en caldo

Técnicas con Fagos: Se infecta a las Micobacterias con bacteriófagos específicos. Sensibilidad 50% y especificidad del 75% . Puede detectar 100 bacilos en una muestra . Este fago es capaz de replicarse en el interior de la micobacteria provocando lisis en su pared celular y liberación de nueva progenie de fagos

Técnicas con Fagos:

Ventajas y Desventajas

Ventajas• Bajo costo • Detecta 100 bacilos en una muestra• Puede ser utilizado para determinación de

resistencia a Rifampicina directamente de la muestra de expectoración

• Acorta el tiempo 2 días

Desventajas• Mayor frecuencia de contaminaciones

Nuevas Técnicas para Identificación:Test de NAP en Bactec 12B.

Sistema de cultivo

Medio base Mezclaantibiótica

Sistema de detección

Detección de M. tuberculosismedia (rango) en días

Detección de otrasMicobacteriasmedia (rango) en días

Otrascaracterísticas

Bactec 12 B

4 ml de 7H12 más POES

PANTA 14CO2

10(4-30) 13 (3-30) Radiomé-trico

Sigue….

POES :Contiene esterato de polioxietileno , sustancia que favorece el crecimiento.

PANTA : Polimixina B, Anfotericina B, Ac. Nalidixico, Trimetroprima, Azlociclina. Este suplemento al agregarse al medio 12B inhibe el crecimiento de gérmenes contaminantes.

BIOLOGIA MOLECULAR

• ADN: Molécula que tiene toda la información genética de cada individuo

• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

• Descubierta en 1985 por Karry Mullis (USA)

• La enzima ADN polimerasa permite fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente

• Técnica muy sensible y rápida

NUCLEO

CROMOSOMAADN

CELULA

TÉCNICAS MOLECULARES RECIENTESel Enchanced M. tuberculosis Direct Test

(E-MTD; Gen-Probe, San Diego).

• Este ensayo es basado en la transcripción mediada por un sistema de amplificación (TMA). El mycobacterial rRNA.

• EL RNA amplicon producido es detectado en solución usando luminometrico. Esta aprobado solo para muestras respiratorias

GENEXPERT MTB/RIF - Xpert®

• 1- La detección del ADN del complejo MTB en muestras de esputo o sedimento concentrado ya sea de esputo o LBA, BAAR + o BAAR -

• 2- La detección de la mutación del

gen rpoB /región 81bp que esta asociada a la resistencia a la rifampicina en pacientes de alto riesgo

• 3- La prueba MTB/RIF-Xpert® esta indicada en pacientes :

• con sospecha clínica de TBC • pacientes que no han recibido

tratamiento, • pacientes con menos de 7 días de tx.

o pacientes que no han recibido tx en los últimos 60 días

GeneXpert MTB/RIF•1). Primer instrumento de diagnóstico molecular homologado por la FDA

•2). El sistema GeneXpert es el único en combinar una preparación de muestra abordo con PCR en tiempo real

•3). Resultados de muestras no procesadas en aproximadamente 2 horas.

Principios de PCR en tiempo real• 1). Se monitoriza ciclo a ciclo el producto amplificado, a

través de una señal de fluorescencia en el momento en que se está dando la reacción de PCR

• 2). La señal de fluorescencia incrementa en proporción al producto amplificado

• 3). La señal fluorescente será colectada en la fase exponencial de la PCR ciclo a ciclo.

• 4). La medición puede ser graficada en forma logaritmica o lineal.

Correlación de Resultados

Baciloscopia

Cultivo en L J

GeneXpert Metodo de las Proporciones

Positiva Positivo Positivo Sensible/Resistente

Positiva Negativo Positivo No aplica

Negativa Positivo Negativo Sensible /Resistente

Negativa Negativo Positivo No aplica

1 Provenir del sitio de la lesión a investigar

2 Cantidad suficiente

3 Envase adecuado y limpio

4 Identificación

5 Conservación(tiempo deentrega)

6 Transporte

Muestra BiológicaAdecuada

Muestra biológica adecuada +

Técnica correcta

Resultado confiable y útil

• Los cultivos de bacteriología solo captan:

LA PUNTA DEL ICEBERG

La transmisión se da no solo por pacientes infectados,sino que también por pacientes colonizados