Microbiología General Seminario Nro 4Seminario Nro. 4

Aislamiento e identificaciónAislamiento e identificaciónAislamiento e identificación Aislamiento e identificación de Microorganismosde Microorganismos

¿P é i l i i ?• ¿Para qué aislar microorganismos ?

é• ¿Para qué identificar un microorganismo ?

• Caracterización vs. Identificación

1. Pruebas bioquímicas Identificación presuntiva

2. Pruebas Moleculares Identificación final

Aislamiento e identificación de microorganismos

ProcedenciaProcedencia

Características

Tratamiento inicial

Expectativas

Tratamiento inicial

Siembra

Ai l i tMétodos Aislamiento

Identificaciónconvencionales

Métodos molecularesmoleculares

Tratamiento Enriquecimiento Tratamiento inicial (selectivo o no)

Calentamiento

Filt ióFiltración

Homogeneización, etc

Si b

Selección de medios de cultivo

InóculoSiembra Inóculo

Observación microscópica

AislamientoAgotamiento por estrías, dils

seriadas, etc

SubcultivoSubcultivo

MacroscópicosCriterios de pureza

Microscópicos

Cultivo puro

Identificación

MuestrasMuestrasMuestrasMuestras

Microorganismos ColiformesAgua Microorganismos

indicadores P. aeruginosa

Alimentos

Detección de B. cereus en leche en polvo, miel, arroz

Detección de S. aureus en alimentosAlimentos Detección de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda

Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentadosproductos fermentados

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Selección de esporasCalentamiento

EnriquecimientoEnriquecimientoAgotamiento por estrías

Mossel

Colonias aisladas

Man (-), Lecitinasa (+)

RepiqueTinciones

Cultivo puro

Morfología de las colonias

Forma y tamaño de las coloniasIrregular, puntiformeg p

Bordesliso rugosoliso, rugoso.

ElevaciónC l d b d liConvexo, elevado, umbonado, liso.

ColorPigmento, opaca, translucida, brillante.

TexturaTextura Mojada, mucosa, seca.

Bacillus subtilis

Proteus vulgarisKlebsiella pneumoniae

Forma de la colonia y tamaño: irregularBordes: onduladoElevación: umbonadaColor: Blanca crema

Típico movimiento sobre la caja de petri

Textura : seca

Pruebas bioquímicasPruebas bioquímicas para la identificación depara la identificación de

bacterias

Catalasa

Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasacatalasa.

H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reaccionesno enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática deno enzimáticas de reducción de flavoproteínas o por acción enzimática deradicales superóxido.

Micrococcaceae, Staphylococcus catalasa (+)Streptococcaceae, Streptococcus Enterococcus catalasa (-)

2H2O2 2H2O+ O2Catalasa + +

-

Oxidasa

Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromocitocromo oxidasaoxidasa cc(respiración). Oxidasa negativaoxidasa positiva.

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donorhacia el aceptor final de la respiración (oxígeno). En este test un donor deelectrones artificial (phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo

doxidasa.

oxidasa (+)oxidasa (+)

Pseudomonas

oxidasa (-)

E. coli

Neisseria

I M Vi C

IIndolRojo de MMetilo

VV h P kVVohes ProskauerCCitratoCCitrato

Indol

Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar el indol de la molécula de triptofano

Triptofano Indol + ácido piruvico + amoniotriptofanasa

Triptofano Indol + ácido piruvico + amonio

Indol + p-dimetletilenamino-benzaldehido Rosindol (Rojo)HCl

Alcohol isoamilicoAlcohol isoamilico

Reactivo de Kovacs

Indol

El triptofano se adiciona al medio en una concentración 1%.Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

Rojo de metilo – Voges Proskauer

Glucosa Piruvato LactatoLactato

SuccinatoSuccinatoCO2

Acetil-CoA Etanol

A t tA t t

SuccinatoSuccinato

+Formiato CO2

AcetatoAcetato

H2

+

2.3Butanodiol2.3Butanodiol + CO2

Glucosa Piruvato

2EtanolEtanolLactatoSuccinatoAcetatoCO2 + H2

Voges-Proskauer (VP) Daniel Voges Bernhard Proskauer

Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3-butanediol como resultado de la degradación de glucosa.

Glucosa Piruvato Acetoina 2.3-butanediolO2+

α - naphtol

+

40% KOH

Barritt's A Barritt's B Diacetilo + Creatina (Rojo)

Alcohol

Barritt s A Barritt s B Diacetilo + Creatina (Rojo)

α - naphtolen etanol absoluto

KOH 40%

Rojo de metilo

Rojo de metilo (MR) Para identificar bacterias que producen fermentación mixta de la glucosa y liberan ácidosácidos establesestables.

Este medio de cultivo incluye, peptona, glucosa, y buffer fosfato. El indicador de pH j d til di i lti id 48 h P d b j d 4 4 l i di drojo de metilo se adiciona a un cultivo crecido 48 hs. Por debajo de 4.4, el indicador

cambia a rojo (positivo).Amarillo con pH por encima de 6.0 (negativo)

Citrato

Determinar si un microorganismo es capaz de utilizar Citrato comoúnica fuente de carbono.

Ci d S di A id i i A id l i COCitrato permeasa

Citrato de Sodio Acido piruvico + Acido oxalacetico + CO2

p

Citrasa

Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3

(liberado luego de usar el citrato)(Alcalino --> pH)

Citrato

Agar Citrato de Simmon: Es un medio

definidodefinido que contiene Citrato de Sodio

como única fuente carbonada y amonio

como única fuente de nitrógeno Un MOcomo única fuente de nitrógeno. Un MO

que utiliza citrato como fte de C también

utiliza las sales de amonio como su únicautiliza las sales de amonio como su única

fte de N dando como resultado amoníaco

que alcalinizan el medio. El indicador de

pH , azul de bromofenol, cambia de

verde a pH neutro (6.9) a azul a pH

mayores que 7.6.

TTree SSugar IIron Agar (TSI)

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosay/o sacarosa, y para producir sulfuro de Hidrogeno.Se usa para distinguir entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae, Qued á d f l d á d d f lademás son capaces de fermentar glucosa y producir ácidos como producto final.

Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)Azúcar Productos ácidos pH (Amarillo)

Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)

Fermentación (medio ácidomedio ácido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)

SH2 + iones férricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Fermentación Utilización de Las peptonasp p

Producción de gas

Producción de SH2

Resultados (Tubo/Base) Símbolo Interpretación

Rojo/Amarillo K/A Solo fermenta la Glucosa, y luego utiliza las peptonasj utiliza las peptonas

Amarillo/Amarillo A/A Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa

Rojo/Rojo K/K No hay fermentación, Solo se l lRojo/Rojo K/K utilizan las Peptonas

Rojo/sin cambio K/NCNo hay fermentación, Solo se utilizan las Peptonas aeróbicamente

Amarillo/Amarillo con disrupción del agar A/A,G

Fermenta la glucosa y la lactosa y o la Sacarosa con producción de gas

Rojo/Amarillo con disrupción del Solo fermenta la Glucosa conagar K/A,G Solo fermenta la Glucosa, con producción de gas

Rojo/Amarillo con disrupción del agar y PP negro K/A,G, H2S Solo fermenta la glucosa con

producción de gas y H2S

Rojo/Amarillo y PP negro K/A, H2S Solo fermenta la glucosa y produce H2S

Amarillo/Amarillo y PP negro A/A, H2SFermentación de glucosa, lactosa y / o Sacarosa con producción de H2S

Sin cambio/ Sin cambio NC/NC No hay crecimiento

Fermentación de carbohidratos (Caldo - rojo fenol)(Caldo - rojo fenol)

Se adiciona un azúcar al medio: Lactosa, sacarosa, glucosa, etc.

Propósito: Se usa para determinar fermentación de ciertos azúcares yproducción de gases. Se usa para identificar bacterias entéricas Gramnegativasnegativas.

1- Control sin inocular

2 A ill Utili ió d l ú d ió d á id2- Amarillo: Utilización del azúcar, producción de ácidosin gas.

3- Amarillo y producción de gas.

4- Fermentación negativa. Oscurecimiento del mediode cultivo producto de utilización de peptonas yliberación de amonio.

Fermentación de glucosa Fermentación de lactosaFermentación de sacarosa

orgamismos

1 Control Negative

resultados

Fermentación de glucosa

organismos resultados

1 Control Negative

Fermentación de lactosa

organismos resultados

1. Control Negative

Fermentación de sacarosa

1. Control Negative

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Acid, Gas

1. Control Negative

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Negative

. Co t o Negat ve

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Acid, Gas

4 P i N ti 4. P. aeruginosa Negative

5. E. coli Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative

5. E. coli Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative

5. E. coli Negative

Reducción de nitrato

Muestra la capacidad de un m.o de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2) u otroscomponentes del nitrógeno como (N2), usando la enzima nitratonitrato ReductasaReductasa.

NO3 + 2 H + 2e- NO2 + H2Onitrato reductasa

Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso porrespiración anaerobia o por denitrificación. El medio de cultivo contiene nitrato depotasio como sustratopotasio como sustrato.

NO NH NNO2 NH3 N2

Reducción de nitrato

Acido Sulfanilico + NN dimetil-1-naftalenamina + inoes nitratoinoes nitrato

(Reactivo A) (Reactivo B)

+ inoes nitratoinoes nitrato

Sulfobenzeno azo-NN dimelethylen-1-naptalenamino(rojo)

Si l d l ti A BSi luego de agregar los reactivos A y B no aparececoloración se agrega Zn.El Zn es capaz de formar un complejo coloreado con elNitrato. Por lo tanto si no aparece coloración este fueputilizado y entonces el MO es capaz de reducir el Nitrato

- +

Prueba de decarboxilación de aminoácidos

Muestra la capacidad de un microorganismo para decarboxilar un aminoácido para formar una amina, con al consiguiente alcalinidad.

Indicador de pH: púrpura de bromocresolIndicador de pH: púrpura de bromocresol.Se coloca aceite mineral para crear un ambiente de anaerobiosis para promover lafermentación. Se necesita un ambiente ácido porque la enzima solo funciona enestas condiciones.

Aceite mineralAceite mineral

Arginina Ornitina Lisina Control( - ) ( + ) ( + )

Prueba de fenilalanina-desaminasa

óSe utiliza para identificar acción de la enzima phenilalaninaphenilalanina--deaminasadeaminasa. Usadopara distinguir Morganella, Providencia, y Proteus (Positivos) de otros grupos comoEnterobacteriaceae (negativos).

El medio contiene el aminoácido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) ylibera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por ladi ió d t id t (Cl F i l 10%) U bi d l l dadición de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%). Un cambio de color al verde

indica una reacción positiva.

Negativo PositivoNegativo Positivo

Prueba de ureasa

Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasaureasa

Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3

ureasa

1. No inoculado

2. Proteus vulgaris: Positivo

3. Escherichia coli: Negativo

Prueba de hidrólisis de caseina

D t i l id d d d i i t ili dDeterminar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla caseína

S aureus (-)S. aureus (-)

E. Coli (-)

B ill btilli ( )Bacillus subtillis (+)

Prueba de licuefacción de Gelatina

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipoDeterminar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preotelítico (gelatinasasgelatinasas) que licuan gelatina

Proteína + H O PolipéptidosProteína + H2O Polipéptidos

Polipéptidos + H2O Aminoácidos individualesGelatinasas

-

+

Prueba de hidrólisis de Almidón

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón mediante enzimas del tipo amilasasamilasas

ilAlmidón dextrinas + maltosa + glucosa

α-amilasa

polisacáridos disacárido monosacáridoH2O

Lugol

(-) (+)( ) ( )

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Selección de esporasCalentamiento

EnriquecimientoEnriquecimientoAgotamiento por estrías

Mossel

Colonias aisladas

Man (-), Lecitinasa (+)

Identificación y caracterización

RepiqueTinciones

Catalasa

Fermentación de azúcares

Cultivo puroHemólisis

Detección de genes de virulencia (toxinas-PCRvirulencia (toxinas PCR hblA, B, C, D.)

Tests Multipruebas

API 50 CH

Se utiliza para Bacterias del ácido lácticoPatrón de fermentación de 49 fuentes de carbono

API 20 E

Contiene 20 pruebas para la identificación de bacterias Entéricas

API Staph Para StaphilococcusAPI Staph Para Staphilococcus

API 20NE Para bacterias gram no entéricasAPI 20NE Para bacterias gram - no entéricas