microbiologia urbino 2010

Graziella CalugiDipartimento di Microbiologia clinica

Sezione Biologia Molecolare USI Group

Roma

Microbiologia Clinica Tecniche di biologia molecolare e applicazioni diagnostiche


La Microbiologia è la scienza che si occupa dello studio dei microrganismi

Alcuni microrganismi sono in grado di moltiplicarsi in seno ai tessuti di organismi pluricellulari provocando processi morbosi (microrganismi patogeni).

La Microbiologia Medica è la scienza che studia i microrganismi patogeni per l’uomo


I microrganismi infettivi per l’uomo si dividono in 4 gruppi:

Virus Virologia Batteri Batteriologia Parassiti: Parassitologia

Funghi Micologia


Quali sono le motivazioni che hanno determinato l’insorgenza della infettivologia molecolare?


Il fattore tempo:○ I virus si coltivano trasfettando linee cellulari note○ I Batteri si coltivano con terreni di coltura appropriati

ma……..

○ Diagnostica Infettivologica in soggetti Immuno-compromessi

○ Diagnostica Infettivologica Prenatale○ Diagnostica di infezioni polmonari da Micobatteri


Il fattore Colture cellulari:

○ Non tutti i virus attualmente sono coltivabili in vitro

Virus Epatite C

○ Alcuni Batteri non crescono nei terreni di coltura abiotici Clamidie


Dati sierologici:

○ In un processo infettivo la diagnostica sierologica è di fondamentale importanza e fornisce risultati che devono

essere integrati con i dati molecolari

ma……..

○ Talvolta in soggetti immuno-compromessi l’assenza di anticorpi sierici comprovanti l’infezione, non assicura l’assenza dell’agente infettivo

○ Talvolta, in condizioni fisiologiche particolari, quali donne in stato interessante, o soggetti con trapianto di midollo non più in condizioni di immuno-depressione i dati sierologici possono fornire dati di positività anticorpale aspecifici.


Dati sierologici:○ In taluni processi infettivi, mucosa-specifici ( Micoplasmi, Clamidie, Virus HPV) l’organismo infettato non

necessariamente sviluppa una risposta immune evidenziabile.

○ In casi di infezioni prenatali, i dati sierologici materni sono di fondamentale importanza nel monitorare e/o diagnosticare un’infezione, ma solamente la ricerca molecolare del genoma dell’agente infettante nel liquido amniotico può diagnosticare la presenza e/o l’assenza di infezione fetale

○ In casi di infezione peri-natale, i dati sierologici sono importanti ma non sufficienti per stabilire se, ad esempio una madre infetta dal virus dell’HIV possa aver trasmesso il virus al neonato.


In un processo infettivo, ogni organismo ha un ciclo replicativo con

Caratteristiche specifiche Tropismo organo e tissutale specifico Risposta immune specifica Processo morboso con sintomatologia clinica specifica

Essendo a conoscenza della storia clinica del paziente e della sintomatologia clinica, per la comprensione di un eventuale processo infettivo, si devono coniugare dati clinici sierologici e molecolari, considerando gli eventuali limiti delle tecniche di medicina di laboratorio


Le tecniche di biologia molecolare applicata alla microbiologia clinica si basano principalmente sull’identificazione e/o sulla quantificazione di regioni genomiche altamente

conservate dell’agente infettante.

Le fasi analitiche prevedono:

• Estrazione dell’Acido Nucleico (Dna, Rna)

• Amplificazione di regioni genomiche conservate (PCR end-point o real-time)

• Rivelazione e/o quantizzazione dell’amplificato

• Caratterizzazione dell’amplificato (sequenziamento, Blot dell’amplificato )


Scopo del lavoro Messa a punto di un protocollo analitico multi-integrato per la caratterizzazione delle infezioni HPV a rischio di progressione

Protocollo analitico multi-integratoScreening citologico “LBC”

Test immuno-citochimico per P16INK4a

Test molecolare HPV DNA con genotipizzazione

Test molecolare HPV RNA

1 campione

Approccio analitico multi-integrato nella diagnostica della infezione da HPV

PAPILLOMAVIRUS UMANO (HPV)

Virus nudi a simmetria icosaedrica di piccole Virus nudi a simmetria icosaedrica di piccole dimensioni (55nm);dimensioni (55nm);2 proteine strutturali:2 proteine strutturali:L1 proteina capsidica maggiore, peso molecolare di 55 L1 proteina capsidica maggiore, peso molecolare di 55 kDa; rappresenta l’80% delle proteine capsidichekDa; rappresenta l’80% delle proteine capsidicheL2 proteina capsidica minore, peso molecolare di 70 L2 proteina capsidica minore, peso molecolare di 70 kDa; rappresenta il restante 20% delle proteine kDa; rappresenta il restante 20% delle proteine capsidichecapsidiche

GenomaGenoma::DNA circolare doppio filamento di circa 8000 bp;DNA circolare doppio filamento di circa 8000 bp;8 sequenze geniche: Early (E1, E2, E4, E5, E6, E7) e 8 sequenze geniche: Early (E1, E2, E4, E5, E6, E7) e Late (L1, L2)Late (L1, L2)LCR (regione non codificante)LCR (regione non codificante)


De Villier et al. Virology 2004

Famiglia: Famiglia: Papillomaviridae;Papillomaviridae;Supergruppi o “generi”: Supergruppi o “generi”: indicati con una lettera indicati con una lettera grecagrecaGruppi o “specie”: Gruppi o “specie”: raggruppano tipi distinti raggruppano tipi distinti a livello genomico, ma a livello genomico, ma simili nelle proprietà simili nelle proprietà biologiche.biologiche.Alpha-papillomavirus: Alpha-papillomavirus: tropismo anogenitale, si tropismo anogenitale, si distinguono in base al distinguono in base al loro potere oncogeno in loro potere oncogeno in High Risk (HR) e Low High Risk (HR) e Low Risk (LR)Risk (LR)

FILOGENESI HPV


Non-coding regionRegulation of viral geneexpression and replication

LCR E6 E7

Alter cell cycle control by

p53 degradation

pRb inactivation

E1

P97

E2

E4

E5

L2

L17900/1

ori

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Viral capsid proteins

Induces trasformation, proliferation, DNA synthesis

Virus assembly and release

Viral DNA replication

Viral transcription

Benedetto et al. Res Adv Virol 2007; 2:1-13

E6 E7

L1

L2

E1

E2E4

E5

P97

REPLICAZIONE VIRALEInibizione trascrizione di E6/E7

Trasformazione eimmortalizzazione

Replicazione DNA

Cheratinocita basale normale

Infezione

DNA viralenel nucleo della cellula infetta

come episoma

Strato basale

Replicazione accelerata di DNA virale in cellule

più differenziate

Strato corneo

Assemblaggio virale

Episoma

Caduta delle cellule epiteliali che contengono il virus

URR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2

Integrazione

Fattori cellulari

STORIA NATURALE DELL’INFEZIONE LR HPV Infezione di breve tempo autolimitante

HR HPVInfezione persistente

Infezione via trauma

Cellula basale

regressione

Settimane/mesi

Risposta immunitaria

L-SILHPV DNA replicazioneBassa espressione di E6 ed E7

H-SILNo HPV DNA replicazioneAlta espressione di E6 ed E7

Carcinoma

Anni

Anni

Mesi/Anni

Replicazione Cellulare

E2F

E2FE2F

E2F

E2F

PRB

Apoptosi e Riparazione del danno cellulareDanno genico

P53

E7 E6

ONCOGENESI VIRALE

persistent HPV infection

ONCOGENESI VIRALE

HSIL P16 +

Cell cycle progression

Promoter p16 IN4aPromoter p16 IN4a

Steps Analitici dello screening molecolare dell’HPV

Fase estrazione Acidi Nucleici

• Valutazione della idoneità del campione biologico

• Acquisizione dati clinici del campione in esame

• Estrazione degli Acidi nucleici: DNA e/o RNA



Amplificazione dell’ appropriato Amplificazione dell’ appropriato target molecolare target molecolare

Target molecolare DNA: geni “Late”Target molecolare DNA: geni “Late”in particolare il gene L1in particolare il gene L1





Protocollo di PCR:Buffer salino MgCl2

dNTPsPrimers L1 specifici: Manos, Gp5+-6+, CP, SPFEnzima Taq di amplificazioneDNA estratto





““Detection” dell’ appropriato target Detection” dell’ appropriato target molecolare molecolare

Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%Corsa elettroforetica su gel di Agarosio al 2%

““Detection” della presenza o assenza del target Detection” della presenza o assenza del target

+ Polo elettrico -



Caratterizzazione genotipica del virotipo infettante

• Gli amplificati positivi per il target virale, vengono sottoposti al test di genotipizzazione allo scopo di caratterizzare il virotipo HPV infettante

•Il test di genotipizzazione prevede una reazione di PCR di sequenza secondo il metodo classico di “sanger”



Corsa elettroforetica capillare della PCR di sequenza

Il prodotto di PCR di sequenza migra per elettroforesi capillare su sequenziatore automatico.



Confronto dei dati di sequenza con database NCBI

Il dato di sequenza viene confrontato con le sequenze di riferimentodepositate in un database internazione (NCBI) per ottenere il virotipo infettante

>

gb|EU056615.1| Human papillomavirus type 6type 6 isolate 965 major capsid protein L1 gene, partial cdsLength=394 Score = 484 bits (262), Expect = 1e-133 Identities = 326/364 (89%), Gaps = 4/364 (1%) Strand=Plus/Minus 5 CCTCCCAAAAC-NAGNGTTCTTATAGGGATCTGGNTTTTCCGTTNCAGGNGTGTGCTTTT 63 ||||||||||| || |||||||||||||||||| |||||| || |||| ||| ||||||||||||||||| || |||||||||||||||||| |||||| || |||| ||| |||||||| |||| ||| |||||||||| ||| ||||||393 CCTCCCAAAACTAAG-GTTCTTATAGGGATCTGGCTTTTCCTTTTCAGGAGTGGGCTTTT 335


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide&list_uids=159159539&dopt=GenBank&RID=3CE7XBM1015&log$=nuclalign&blast_rank=1


Gli steps analitici seguiti ad oggi, però non ci forniscono Gli steps analitici seguiti ad oggi, però non ci forniscono dati sulla potenzialità oncogena del virus infettante:dati sulla potenzialità oncogena del virus infettante:

Casi di infezioni Abortive (donne giovani)Casi di infezioni Abortive (donne giovani) Casi di coinfezioni “High-Low Risk”, in cui il dato di Casi di coinfezioni “High-Low Risk”, in cui il dato di

sequenza è rappresentativo del virotipo maggiormente sequenza è rappresentativo del virotipo maggiormente rappresentato (es. Low Risk)rappresentato (es. Low Risk)

Casi clinici H-SIL, CIN con capside virale destrutturato Casi clinici H-SIL, CIN con capside virale destrutturato (falsi negativi HPV-DNA)(falsi negativi HPV-DNA)



Amplificazione dei trascritti E6-E7 Amplificazione dei trascritti E6-E7 negli HPV “high risk” mediante Real-negli HPV “high risk” mediante Real-

Time con metodologia NASBATime con metodologia NASBA


HPV RNA

• Estrazione RNA (1ml) Biglie di silice magnetica estrattore semi-automatico

mini-Mag, Biomerieux

•Amplificazione NucliSENS EasyQ HPV 1.1 Real-time con metodica NASBA, e sonde “scorpions”

per trascritti E6-E7 dei virotipi HR 16, 18, 31, 33, 45.

E’ presente anche un controllo interno “Gene U1A”


HPV RNAHPV U1A-16

C-

C+

HPV 18-31

C-

C+

HPV 45-33

C-

C+


Conclusioni: Le tecniche di Biologia Molecolare applicate alla branca

della Microbiologia Medica sono oramai necessarie nella identificazione, sorveglianza e caratterizzazione di un agente infettivo, risultando così indispensabili nel monitoraggio clinico dell’infezione

Non bisogna però mai dimenticare che, i dati molecolari da soli non sono sufficienti per caratterizzare e monitorare i fenomeni morbosi.

Nella medicina di laboratorio è quindi necessario un approccio integrato tra metodiche classiche e d’avanguardia allo scopo di offrire al paziente un dato certo di infezione e un buona sorveglianza clinica dell’infezione


Grazie per l’attenzione…….

SPERANDO DI NON AVERVI ANNOIATI….

Un saluto.... Graziella Calugi


microbiologia urbino 2010

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