MICROBIOLOGIE ALIMENTARĂ

CONTROLUL MICROBIOLOGIC AL

ALIMENTELOR

Curs: Conf. Dr. Mihai MAREȘ Laborator: Conf. Dr. Mihai MAREȘ

Dr. Ramona MORARU

Microbiologia alimentară

• Permite realizarea diferitelor analize și a

controalelor indispensabile pentru:

• determinarea calității/siguranței produselor

alimentare

• dar și calitatea igienei mediului de producție și

distribuție

Domeniul de interes al

microbiologiei

alimentare

Controlul calității microbiologice - a alimentelor,

limitat la controlul produsului finit prin raportare la o normă

de calitate microbiologică (igienică).

-- realizat printr-un ansamblu de activități ce urmăresc controlul materiilor prime brute,

în curs de transformare sau a alimentului finit,

-- al respectării normelor de fabricație prin identificarea principalelor puncte critice ale

sistemului de producție/distribuție, (activitatea HACCP – controlul procesului tehnologic de

producție trebuie să permită determinarea punctelor critice).

Microbiologie alimentară

• Metodele de analiză aplicate trebuie să fie rapide, fiabile, reproductibile și simple pe cât

posibil (să implice costuri scăzute).

• Acestea trebuie să consiste în studierea sau determinarea principalilor germeni

microbieni întâlniți în alimentele de consum, absența sau prezența în cazul celor

patogeni sau responsabili de boli infecțioase, numărul germenilor cu risc mai scăzut,

contaminanți sau din flora normala a materiilor prime din compoziție

• Trebuie garantata securitatea consumatorului prin detecția microorganismelor

periculoase sau a eventualilor metaboliți toxici sau a toxinelor bacteriene și

asigurarea unui produs de bună calitate (inclusiv printr-o bună conservare).

• Planul sanitar cuprinde lista bacteriilor ”periculoase” responsabile de îmbolnăviri

după consumul alimentelor contaminate, ce are tendința de a se mări: Salmonella,

Shigella, Staphylococcus aureus enterotoxigenic și Clostridium perfringens la care s-au

adăugat Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli enteropatogenică sau

alte bacterii din genurile Streptococcus, Listeria, Campylobacter, Yersinia, Brucella etc.

RISCURILE ÎN LABORATOARELE DE MICROBIOLOGIE

• Riscul manipulării microorganismelor a căror identitate și patogenitate sunt necunoscute

• Tehnicianul trebuie să cunoască:

• - germenii manipulați sau cercetați;

• - căile de acces ale acestui germen în organism;

• - cele mai bune metode de manipulare pentru diminuarea acestui risc.

• Microorganismele sunt clasificate în 4 grupe după riscul potențial pe care îl exprimă

• Grupa 1. cuprinde microorganisme puțin periculoase pentru microbiolog și mediul de lucru;

• Grupa 2. corespunde germenilor cu riscuri moderate pentru manipulator și limitate la spațiul

de lucru;

• Grupa 3. este constituită de microorganisme cu înalt risc pentru manipulator și risc moderat

pentru spațiul de lucru;

• Grupa 4. corespunde microorganismelor foarte periculoase pentru manipulator și mediul

acestuia.

• Căile de pătrundere a germenilor sunt:

• - bucală (ingestie) : pipetare, apropierea de gură a degetelor sau a obiectelor

contaminate (țigări, stilou, alimente etc.) – manipulare aseptică incorectă.

• - pe cale respiratorie (trahee,pulmoni) de către aerosoli (particule lichide sau nu în

suspensie în aer) – aceștia pot fi generați de omogenizare, centrifugare etc.

• - prin contact cutanat (Brucella, Staphylococcus sau Pseudomonas) sau la nivelul

mucoaselor sau organelor precum ochii.

• - prin penetrare subcutanata accidentală (prin înțepătură sau existența unei plăgi).

C. LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE

• SE REALIZEAZĂ ANALIZELE DE RUTINĂ (controlul calitativ conform unei norme,

evaluarea calității materiilor prime), dar care să permită evaluarea operațiunilor de

transformare sau de preparare

• Cercetarea și depistarea eventualelor puncte critice (HACCP), evaluarea eficacității

tratamentelor antimicrobiene de conservare, ambalaj și igienă etc.

• Microorganismele regăsite aparțin în majoritate grupelor 1, 2 și 3

• Laboratorul trebuie să fie compus din 3 părți principale:

• - laboratorul propriu-zis sau unde se vor realiza analizele

• - sala de preparare a mediilor de cultură

• - sala cu mașina de spălat materialele din sticlă și plastic utilizate pentru analize și unde se

depozitează materialul curat și steril. Această încăpere poate constitui o singură cameră

împreună cu cea de preparare a mediilor.

Dotările laboratoarelor de analize:

- un spațiu suficient cu o circulație limitată, cu două sau trei încăperi;

- pereții, plafonul și podeaua uniforme dar fără pericol de alunecare, să nu rețină

umezeala, ușor de curățat și dezinfectat;

- să fie luminate natural sau lumină artificială de bună calitate. Ferestrele culisate

cu montură din aluminium echipate cu draperii rulante;

- mese de lucru netede și rezistente;

- lămpi U.V. dispuse pe plafon și echipate cu temporizator în sala de lucru.

• A se reține că buna funcționare a

laboratorului necesită, în special la

nivelul manipulărilor, un personal

calificat!

• Regulile de igienă strictă și bună creștere

trebuie să fie respectate!

D. MATERIALE ȘI ECHIPAMENTE DIN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

• Frecvența și diversitatea studiilor cantitative și calitative necesită:

• 1 . Sisteme de sterilizare / dezinfectare și zone sterile

• a) Autoclavul vertical sau orizontal pentru sterilizarea cu vapori a mediilor

de cultură, a deșeurilor și a materialelor contaminate. Sterilizarea se

realizează în general la 115 sau 121°C timp de 10-30 de minute.

• b) Etuva Pasteur permite sterilizarea uscată a materialului din sticlă sau din

metal și trebuie să atingă o temperatură de 170 - 180°C.

• c) Sistemele de micro sau ultrafiltrare prin membrane se utilizează pentru medii de

cultură, lichide ce nu se pot autoclava sau pentru analiza lichidelor (ex. apa).

• d) Lămpi U.V. prevăzute cu temporizator, instalate în încăperi precum și în hote.

Personalul trebuie să se protejeze!

• e) Recipiente cu hipoclorit de sodiu. Mediul contaminat, după citire, se

depozitează în saci speciali care se autoclavează.

• f) zonele de lucru sunt situate în apropiata protecție a becurilor Bunsen sau în

hota cu flux laminar care după funcționare protejează fie produsul, fie operatorul,

fie ambii. Hotele cu flux laminar sunt clasate în 3 categorii după funcționare.

D. MATERIALE ȘI ECHIPAMENTE DIN LABORATORUL DE

MICROBIOLOGIE

D . 2 . Materiale folosite pentru incubare și prepararea mediilor de

cultură

• Termostate ce pot fi reglate la temperaturi între 25 și 55º C.

• Pahare anaerobe și echipament necesar pentru controlul atmosferei (catalizator, generator

de hidrogen sau de dioxid de carbon, indicator albastru de metilen) pentru studiul germenilor

strict anaerobi.

• Bains-marie pentru reconstituirea mediului de cultură (100º C) și menținerea în stare lichidă

(45 - 47 °C).

• Un cuptor cu microunde pentru reducerea tratamentelor termice a mediilor.

• Balanțe (de la 1 -2 kg la 1/10 g și de la 200 g la 1/10 mg) indispensabile pentru

prepararea mediilor și a eșantioanelor.

• Eprubete de sticlă de 16 x 160 sau 18 x 180 mm, tuburi de hemoliză de unică folosință

și de recipiente cu volume variabile ce pot fi sterilizate (flacoane Erlenmeyer, )

• Pipete sterile de unică folosință și sisteme de pipetaj automatic.

• Magneți pentru agitarea mediului la încălzire și un repartitor volumetric pentru prepararea și

distribuirea mediului de cultură.

D . 3 . PREPARAREA EȘANTIOANELOR ȘI A CULTURILOR

MICROBIENE

• Eșantioanele sunt aduse în ambalajul de origine (produsele finite), în flacoane sau recipiente sterile

(produse la vrac sau prelevate);

• - flacoane, sticle, cutii tetrapack sau instrumente de prelevare a alimentelor solide (tampoane

exsudat faringian, pipete harpon etc);

• Prima etapă de tratament al eșantioanelor, după prelevare:

• - distribuirea în părți egale în recipiente;

• - omogenizare (punerea în suspensie omogenă a microorganismelor)– mojar cu pistil, stomacher;

• - centrifugare în tuburi cu capac la 3 până la 4000 g (va permite decantarea microorganismelor

din lichide în scurt timp)

• - Vortex-area permite omogenizarea suspensiei bacteriene în momentul diluțiilor seriate.

•

• Materiale consumabile:

• - plăci Petri de policarbonat de diametru 90 mm;

• - tuburi de hemoliză;

• - pipete sterile gradate (1 și 10 ml) sau de pipete automate (de 0,1 sau

• 1 ml) pentru vârfuri de polipropilen;

• - pipete Pasteur;

• - pahare de sticlă;

• - anse din platină etc.;

• - un aparat pentru numărătoarea coloniilor;

• - echipament de filtrare.

D . 4 . Microscopie

• Echipamente de microscopie:

• - microscopul cu accesoriile sale;

• - lame și lamele;

• - coloranți și reactivi diverși;

• Ocularele x10 sunt cele mai comune iar microscopul să dispună de obiective x10, x 40 și x100 la

imersie;

• - microscopul adaptat cu epifluorescență – tehnicile de imuno-microbiologie

• Reactivii coloranți cei mai utilizați sunt cei folosiți pentru colorația GRAM (violet de gențiană,

lügol, etanol, fucsină) sau pentru colorații simple (albastru de metilen).

E . TEHNICI GENERALE

• Calitatea produsului alimentar depinde de controlul florei prezente prin mijloace:

• - fizice: temperatură, pH, Wa (water activity);

• - chimice: aditivi cu efecte antimicrobiene;

• - regulile de bună fabricație (ghiduri de microbiologie – GLP ”good laboratory practice”): igiena

aparatelor și a personalului lucrător, calitatea și prospețimea materiilor prime, respectarea

normelor și specificațiilor microbiologice,

• Calitatea, dpdv igienic, depinde în special de natura și cantitatea microbiotei bacteriene

din produs!

• 1) studiul cantitativ al microbiotei bacteriene – determinarea proprietăților comune:

bacteriile aerobe mezofile ce cresc pe mediu geloză nutritivă, determinarea levurilor și a fungilor

filamentoși și a anaerobilor sulfito-reducători.

• - determinarea bacteriilor de origine fecaloidă sau telurică;

• - identificarea unui grup de bacterii ce corespunde unei contaminări determinate: coliformi

termotoleranți și/sau enterococi, stafilococi ce evidențiază contaminarea de origine cutanată

etc.

• 2) cercetarea orientată pe identificarea bacteriilor patogene: Salmonella,

Staphylococcus, Shigella, Mycobacterium, Listeria, Brucella, Campylobacter, Yersinia , etc.

Metoda necesită utilizarea metodelor specifice de selectivitate.

• Analizele realizate în mod normal sunt determinarea coliformilor sau a microbiotei totale.

• Microbiologul trebuie să facă diferența între noțiunea cantitativă și calitativă a microbiotei

normale a produsului sau a materiilor prime (microoganisme obișnuite) și o microbiotă

contaminantă definită prin riscul pe care îl presupune unei anumite categorii de consumatori.

E.1. Prelevarea probelor

• Eșantioanele sunt separate în 5 probe de 100g, prelevate steril și identificate.

• Din alimentele solide se recoltează de pe suprafață și din profunzime, iar din lichide după

omogenizare.

• În cazurile de TIA, microbiologul va identifica germenii de risc (patogeni, toxigeni) și toxinele

acestora la suprafața produsului.

• Eșantionarea - se face reprezentativ pentru a identifica prezența germenilor patogeni sau a

toxinelor distribuite omogen în aliment sau atunci când comercializarea produsului depinde de

calitatea microbiologică în relație cu normele impuse de legislație.

• Principiul metodelor de eșantionare după International Commission on Microbiological

Specifications for Foods: un eșantion are rezultate nesatisfăcătoare dacă conține microorganisme

periculoase sau germeni în număr superior unei limite, de unde pot deveni cu potențial de risc.

• În metodă simbolul ”m” reprezintă ce permite repartizarea eșantioanelor în 2 grupe: cele acceptabile

(valori ≤ m) și inacceptabile (valori ≥ m). Pentru unele microorganisme periculoase „m” poate fi egal

cu 0.

• Când un microorganism dat este tolerat într-un aliment 3 categorii de eșantioane sunt definite:

• - categoria 1 (acceptabilă fără rezerve)

• - categria 2 (acceptabilă dar cu restricții)

• - categoria 3 (inacceptabilă).

”m” separă 1 categorie de a 2-a categorie și ”M” a 2-a de a 3-a

• Germenii sunt clasați în funcție de riscul pe care îl exercită asupra

consumatorului:

• - germeni cu risc sever (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S.

paratyphi,Shigella dysenteriae, Vibrio parahaemolyticus , Brucella

melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type C, virusul

hepatitei A).

• - germeni cu risc scăzut, dar cu putere mare de difuzare (Staphylococul

• enterotoxinogen,Salmonella typhimurium și alte serotipuri, Shigella spp.,

Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli enteropatogenică, Streptococul

beta hemolitic).

• - germeni cu risc scăzut, dar fără putere de difuzare (Bacillus cereus,

Brucella abortus,Clostridium perfringens,Salmonella arizonae, Francisella

tularensis,Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa ,

Campylobacter jejuni , etc...).

• Conservele trebuie să îndeplinească condițiile la probele de verificare a

stabilității / sterilității:

• - se incubează 5 eșantioane la 37°C timp de 7 zile (sau la 30°C timp de

10 zile) și la 55°C timp de 7 zile. Dacă după expirarea timpului se observă

bombarea sau deteriorarea, se va face frotiu (pH-ul nu trebuie să

depășească 0,5 între probele incubate și cele martor).

• Prin microscopie (după etalarea unui volum de 10 μl de produs fixat și

colorat cu albastru de metilen) se observă în 20 de câmpuri , plecând de la

cutia incubată (n) și la cea martor (n1), n / n1 trebuie sa fie inferior la 100 .

• 3) metoda de eșantionare pentru identificarea unui număr scăzut de

microorganisme

• Se poate determina numărul eșantioanelor de analizat dintr-un lot în funcție de

gradul de siguranță cercetată:

• n = log ( 1 - p )

• log ( 1 - d)

• p - este probabilitate de decelare a microorganismului (în general p = 0,95)

• d - este procentajul de erori permis la lotul întreg (inferior la 0,05).

• Se poate realiza o prelevare de eșantioane satisfăcătoare dpdv statistic cu

• n- numărul de eșantioane de analizat iar N – numărul total de diviziuni al produsului

de analizat. Această metodă duce la un număr prea mare de analize, în special când

n este superior de 10. 10.

• E - 1 - b. Frecvența eșantionării

• Probele trebuie repatizate în timp și în funcție de nivelul de producție și riscurile de

contaminare.

E - 1 - c. Condițiile de prelevare

- Probele trebuie prelevate respectând condițiile de sterilitate;

- probele se aduc în condițiile inițiale fără contaminare aditivă;

- din lichide se prelevă proba de la diferite nivele, după omogenizare;

- se utilizează instrumentar steril;

- flacoanele din sticlă, metal sau plastic, sterilizate, trebuie adaptate la

dimensiunile probei și se închid cu capac ermetic.

Prelevarea de la suprafață și

însămânțarea în sol. salină sau bulion

triptonă-soia salină 10 ml.

• 2) Prelevarea produselor lichide

• Tehnica variază în funcție de produs, volumul și forma conținutului.

• Se omogenizează bine înainte de prelevarea cu pipeta a volumului necesar de

analiză

• 3) Prelevarea produselor solide

• În funcție de produs, prelevarea se face cu cuțitul, cu sonda în cazul brânzeturilor sau

cu pipeta. Se îndepărtează coaja/membrana și se asigura că proba este

reprezentativă pentru produs.

E . 2. Tratamentul eșantioanelor

• E - 2 - a. Transferul eșantioanelor în laborator

• E - 2 - b. Prepararea eșantioanelor

• Din prelevatul solid sau lichid se prepară o suspensie din care se vor face analizele

microbiologice.

• Proba se omogenizează sau se obține broiajul într-un volum de diluant – prima diluție.

Prepararea eșantioanelor din brânzeturi – omogenizarea, triturarea

Din broiajul obținut, prima

diluție, se va proceda la

diluțiile seriate (9ml de sol.

salină cu 1 ml de broiaj)

• E - 3. Soluțiile folosite pentru diluții seriate

• Se folosesc soluții care să nu inhibe sau să altereze microorganismele

• E - 4. Reanimarea microorganismelor

• Pe parcursul proceselor tehnologice microorganismele suferă modificări ale

proprietăților fiziologice (deshidratate, căldură, frig etc.);

• Se impune o etapă de reanimare înainte de trecerea pe medii selective care

conțin diverși inhibitori.

• E - 4 - a. Reanimarea în mediu lichid

• - se poate realiza în prima etapă de analiză, când probei i se adaugă soluția de

diluție.

• Dacă perioada de reanimare este mai mare decât cea de latență, se va produce o

multiplicare a germenilor nealterați ce va determina, în funcție de tehnica de

numărare, la o supraevaluare a numărului de germeni.

• Se folosesc medii lichide neselective, în diferite diluții apoi se însămânțează în medii

selective.

• E - 4 - b. Reanimarea pe mediu solid

• Când numărătoarea se face pe mediu solid, reanimarea poate fi obținută printr-o

precultură pe un mediu agar neutru favorabil cu un timp de incubare superior timpului

de latență, dar fără formarea coloniilor macroscopice vizibile.

• După reanimare, se toarnă al doilea strat de agar selectiv.

• E - 5. Tehnici de diluție

• - eprubete/tuburi cu cel puțin 9 ml de soluție sterilă