UNIVERSITATEA TRANSILVANIA BRAOVFACULTATEA DE ALIMENTAIE I TURISM

MICROBIOLOGIE ALIMENTARA LUCRRI PRACTICE

Dr. Puchianu Gheorghe Medic Primar Veterinar Doctor n tiine Medicale Veterinare

Dr. Drghici Emilia Medic Veterinar Cercettor tiinific

2010

Condiiile pentru funcionarea laboratoarelor supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor

Funcionarea laboratoarelor n care se desfoar activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor este condiionat de autorizarea acestora de ctre autoritile competente. Categoriile de laboratoare supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor, sunt: laboratoarele de referin: pentru sigurana alimentelor, organizate n cadrul Institutului de Igien i Sntate Public Veterinar; alte laboratoare naionale de referin desemnate prin ordin al preedintelui Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, organizate n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv a municipiului Bucureti; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat, desemnate de autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n cadrul controlului oficial; laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor; laboratoarele private sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor, care includ:laboratoare sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor particulare ori organizate n uniti private n care se desfoar activiti sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor;laboratoare organizate n uniti n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor, cunoscute sub denumirea de laboratoare uzinale; laboratoare sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior privat, desemnate de autoritatea competent s efectueze anumite analize sau examene n cadrul controlului oficial; laboratoare organizate n cadrul institutelor de cercetare private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor. Laboratoarele naionale de referin sunt autoriti centrale pentru domeniile de competen autorizate, iar laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene n domeniu. Acestea funcioneaz sub coordonarea tehnic i operaional a Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor de supraveghere i diagnostic din structura institutelor veterinare centrale sunt autoriti centrale pentru domeniul lor de competen i funcioneaz sub coordonarea tehnic, controlul i supravegherea Serviciului de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti, sunt autoriti judeene pentru domeniile lor de competen i funcioneaz n cadrul direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene i a municipiului

Bucureti, sub coordonarea tehnic a laboratoarelor din cadrul institutelor veterinare centrale i coordonarea operaional prin Serviciul de coordonare tehnic a institutelor de referin i a laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor din cadrul Autoritii Naionale Sanitare Veterinare i pentru Sigurana Alimentelor. Laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat nu au statutul de autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a institutelor veterinare centrale. Laboratoarele organizate n cadrul institutelor de cercetare de stat i private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a institutelor veterinare centrale. Celelalte laboratoare private n care se desfoar activiti supuse controlului sanitar veterinar i pentru sigurana alimentelor nu sunt autoriti n domeniu i funcioneaz sub supravegherea tehnic a direciilor sanitar-veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene i a municipiului Bucureti, prin laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene, respectiv al municipiului Bucureti. Buletinele de analiz emise de laboratoarele autorizate Laboratoarele naionale de Referin i Laboratoarele sanitare veterinare Judeene, precum i cele emise de laboratoarele sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor organizate n cadrul unitilor de nvmnt medical veterinar superior de stat i privat autorizate au caracter oficial. Activitile pentru care se autorizeaz laboratoarele n care se desfoar activiti supuse autorizrii sanitare veterinare i/sau pentru sigurana alimentelor, menionate n domeniul siguranei alimentare sunt urmtoarele: 1. laborator de microbiologia alimentelor i a hranei pentru animale - cu profilurile: a) microbiologia produselor i subproduselor animaliere i de origine animal; b) microbiologia produselor de origine nonanimal; c) microbiologia hranei pentru animale i apei; 2. laborator de analize fizico-chimice ale alimentelor i hranei pentru animale - cu profilurile: a) analize fizico-chimice ale produselor i subproduselor animaliere i de origine animal; b) analize fizico-chimice ale produselor de origine nonanimal; c) analize fizico-chimice ale hranei pentru animale; 3. laborator pentru controlul radioactivitii i detecia alimentelor iradiate - cu profilurile: a) controlul radioactivitii; b) detecia alimentelor iradiate; 4. laborator pentru controlul reziduurilor - cu profilurile: a) control reziduuri la animale vii; b) control reziduuri la produse animaliere i de origine animal; c) control reziduuri din ap i hran pentru animale; d) control reziduuri la produse de origine nonanimal.

Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un laborator Condiii de amplasare - trebuie s includ: referine generale privind distanele, structura terenului i nivelul apei freatice, existena cilor de acces adecvate, a unei suprafee de teren de rezerv sau tampon pentru eventuala extindere. Amplasarea cldirilor destinate laboratoarelor se face astfel nct: distana fa de cldirile nvecinate i drumurile publice s fie astfel proiectat nct s asigure respectarea prevederilor legale privind protecia mediului, sigurana cldirilor, sntatea public i sntatea animalelor; structura terenului i nivelul apelor freatice s permit amplasarea construciei n conformitate cu reglementrile n vigoare; s aib ci de acces proprii adecvate scopului de activitate. Condiii pentru construcie 1. Condiiile pentru construcie trebuie s includ: natura i calitatea materialelor de construcie, a fundaiei, a pavimentelor, a suprafeelor interioare, a uilor i ferestrelor, a acoperiului i a echipamentelor de iluminare, ventilaie i protecie antiseismic. 2. Construcia realizat trebuie s fie rezistent, s aib spaiu suficient pentru desfurarea proceselor de lucru i s asigure condiiile pentru aplicarea msurilor de igienizare, realizarea confortului termic i condiiile tehnice de funcionare a echipamentelor. 3. Materialele de construcie trebuie s fie netoxice, impermeabile, netede, rezistente la uzur i coroziune i s se poat cura uor. Nu se accept folosirea materialelor absorbante, poroase, greu de curat. 4. Pavimentele i pereii interiori trebuie construii din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic i protecia fonic. 5. Tavanele din spaiile de lucru trebuie construite din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic i protecia fonic, i s fie situate la o nlime corespunztoare, adecvat specificului activitii. 6. Instalaiile electrice trebuie astfel proiectate i instalate nct s respecte reglementrile n vigoare cu privire la energia consumat, protecia mediului, a sntii publice i sntii animalelor. 7. Corpurile de iluminat trebuie astfel amplasate nct s asigure iluminatul adecvat specific activitii. 8. Uile i ferestrele trebuie confecionate din materiale netoxice, rezistente la ageni fizici i chimici, impermeabile, neputrezibile i netede, nct s permit igienizarea uoar i eficient a acestora, protecia termic, protecia fonic, adecvate specificului activitii. 9. Acoperiul trebuie s fie construit din materiale rezistente i impermeabile. 10. Ventilaia se asigur n toate spaiile de lucru i administrative prin mijloace adecvate, prin sisteme generale i/sau autonome de climatizare, cu excepia spaiilor speciale n care se realizeaz activiti ce necesit presiune negativ sau alte mijloace de biosecuritate. Condiii privind utilitile 1. Condiiile privind utilitile trebuie s includ: aprovizionarea cu ap potabil i utilitar, alimentarea cu energie electric, asigurarea condiiilor de microclimat, gestionarea i neutralizarea deeurilor, sistemul de canalizare, aprovizionarea cu gaze naturale, protecia mediului i condiii de biosecuritate. 2. Laboratorul trebuie s se aprovizioneze numai cu ap potabil n cantiti suficiente pentru necesitile pe flux i pentru procesul de igienizare. Apa potabil trebuie s provin fie din reeaua de aprovizionare a municipiului sau localitii, fie din surs proprie.

3. n cazul n care unitatea/instituia posed staie de clorinare proprie, se prelev obligatoriu probe de ap din conducta de aducie a apei, ap neclorinat i dup clorinare, pentru a se urmri eficiena operaiei de clorinare a apei. 4. Apa potabil trebuie distribuit n toat reeaua sub presiune adecvat i continu i n cantiti suficiente pentru acoperirea tuturor necesitilor de funcionare a instituiei. 5. Trebuie s se asigure att ap rece, ct i ap cald. Apa cald este furnizat dintr-o instalaie central pentru nclzirea i distribuirea apei calde sau de la instalaii pariale. 6. Nu se admite utilizarea apei nepotabile n procesul de igienizare a spaiilor de lucru i a cilor de acces. 7. Conductele de ap trebuie s fie precis identificate. Trebuie s existe o delimitare separat a fluxului de ap potabil fa de cel de ap nepotabil, prin sistem separat de conducte. 8. n vederea prevenirii contaminrii spaiilor de lucru, conductele interioare vor fi identificate vizibil prin culori diferite, i anume: conducte pentru apa potabil verde; conducte pentru apa nepotabil - negru; conducte de canalizare - negru; conducte de nclzire - rou; conducte de gaze naturale - galben. 9. Alimentarea cu energie electric trebuie s se realizeze din linia de joas tensiune de 380/220 V i surs proprie, n caz de avarie. Pentru aparatura cu risc de electrocutare trebuie asigurat centura de mpmntare, n conformitate cu prevederile legale. 10. Instalaii pentru asigurarea parametrilor de microclimat n spaiile de lucru, astfel: instalaii de captare i evacuare a unor factori nocivi din spaiile de lucru; instalaii pentru meninerea parametrilor de temperatur n spaiile de lucru sau n cele n care este amplasat aparatura de lucru, n special aparatura de nalt precizie; 11. Grupurile sociale trebuie dimensionate n funcie de personalul care activeaz n laboratoare, dotate cu instalaie de ap rece i cald, duuri i vestiare. 12. Pentru managementul deeurilor rezultate din activitile ce au loc n cadrul laboratoarelor sanitare veterinare i pentru sigurana alimentelor judeene trebuie s se respecte reglementrile n vigoare, precum i procedura general intern privind gestionarea deeurilor. Avnd n vedere profilul de activitate al laboratorului i amplasamentul acestuia, materialul patologic i deeurile rezultate n urma activitilor din laborator trebuie denaturate i inactivate prin mijloace adecvate, dup care acestea sunt preluate de o unitate specializat. 13. Laboratorul trebuie s fie prevzut cu o reea de canalizare corespunztoare, racordat la reeaua de canalizare a localitii/oraului sau la un sistem propriu de evacuare. 14. Apele uzate provenite din laborator trebuie tratate pentru a se preveni diseminarea oricrui factor de risc. De-a lungul prii externe a sistemului de canalizare trebuie amplasate guri de vizitare, pentru curenia curent sau pentru deblocare n caz de accidente. Acestea nu trebuie s constituie un pericol de contaminare pentru spaiile de lucru sau pentru zonele nvecinate. 15. Incinta de utilitate a instituiei trebuie s fie betonat sau asfaltat i prevzut cu sistem de canalizare corespunztor. 16. Construcia i incintele trebuie s respecte condiiile de mediu.

Examenul bacteriologic

Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare. Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lnga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea in consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca pericolul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesitate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Tehnica samnarii - ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee:a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza nti pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaa produsului alimentar si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa prin suprafaa cauterizata, facnd cteva miscari spre interior. Se scoate acul din si se face insamntarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facndu-se pe suprafaa acestuia miscari in zig-zag, incepnd de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara. c) Cu poriuni de aliment. Cnd alimentul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. d) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de aliment. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea probelor alimentare sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie). Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si racita in cultura veche, dupa care se face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul). Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete.

In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere cteva reguli general valabile: nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului; n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului; ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.); nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant; n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosfer; imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fr a se omite data nsmnrii.

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotrtoare. Cunoscndu-se insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcie de specia microorganismului in cauza. Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,27,4), sa asigure condiiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati. Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 2830C). Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: medii uzuale (obinuite) - pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele mai pot fi sistematizate n medii: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ; mediile speciale de izolare - favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitnd anumite condiii speciale sau anumii ,,factori de plecare". Mediile de imbogire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bnuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaie. Astfel de medii sint mediul KaufmannMuller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni). Mediile selective favorizeaza, prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul WilsonBlair si Drigalski (pentru salmonele), mediul IstratiMeitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci). Mediile difereniale permit cresterea difereniata a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele evideniaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitnd in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componena acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv.A. B.

Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide.

Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt :

Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: - apa distilata - peptona - NaCl 100,0 ml 1,0 g 0,5 g

Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav. Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine i cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza i se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniial. Se incalzeste la 8090C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,27,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115C. Pentru repartizare se pot folosi pipete de 2550 ml, dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constnd din vase cu tubulura inferioara sau plnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc si clem. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil (aa numitele turntoare de medii). Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina. La ora actuala, este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata, purificata si standardizata, ceea ce asigura obinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck, Oxoid etc.). Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului. La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incalzire la 115C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaza prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii). Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. Se astupa cu dopuri de vata, se sterilizeaza 20 de minute la 120C dupa care eprubetele se pun in pziie inclinata pentru solidificare.

Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei, dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu ct mai proaspat. Examenul caracterelor culturale Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si uneori condiiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor. In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafaa.

Turbiditatea - poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca. Depozitul - ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care s-au dezvoltat in mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, vscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului. Suprafata - mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerri cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea. Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pina la ciiva milimetri diametru. Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata;

Profilul (in seciune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform;

Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata; Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri;

Culoarea coloniilor este diferita in funcie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual il conin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.); Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade intermediare; Consistenta este si ea variabila: untoasa, viscoasa, uleioasa, grun-joasa, friabila, filanta, ea determinind cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafaa mediului. In timp ce coloniile de consistent untoasa i granulara se desprind cu usurinta, cele visooase adera, determinind o dificultate in desprinderea lor;

Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare. In medii lichide: mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi);

mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (E.

coli);

mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi); mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul

antraxului); mediul prezinta un val subtire la suprafaa (vibrionul holeric); mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis); mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la suprafaa, restul lichidului raminnd limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat in verdealbastrui (b.piocianic). Pe medii solide:

E. coli da colonii rotunde cu margini si suprafee netede de 35 mm diametru, de culoare alba-laptoasa, lucioase; Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente, uneori usor albastrui, aderente la mediu; antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor ondulaii ale firelor de par; stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafee netede, unele din ele pigmentate in alb, auriu sau citrin; streptococii dau colonii mici bombate; b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu mar gini neregulate.

Bacteriile anaerobe ofera i ele aspecte variabile in functie de mediul folosit in cultivarea lor.

In cazul mediilor lichide, in general, se produce o tulburare uniforma cu sau fara producie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea lui, fie la suprafata.

In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata de prezenta mobilitatii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii pufoase de aspect sferoid , in timp ce cele imobile ( Cl. perfringens ) produc colonii de aspect lenticular , de talie variabila Examinarea caracterelor metabolice (biochimice) ale germenilor bacterieni

Au o importan deosebit pentru confirmarea datelor furnizate n urma examinrilor morfo culturale. Ele se bazeaz pe anumite particulariti metabolice ale bacteriilor care sunt variabile n funcie de specia microbian sau chiar de tulpin i au la baz existena unui echipament enzimatic diferit care le confer capacitatea de a aciona asupra unor substane coninute n mediu sau de a elabora n cursul multiplicrii lor anumite substane noi identificabile prin diverse reacii chimice. Reacii de punere n eviden a capacitii zaharolitice fermentarea zaharurilor se datoreaz elaborrii de ctre germeni a unor enzime capabile s scindeze glucidele cu formare de aldehide, acizi i gaze (dioxid de carbon, hidrogen, metan). Ea se determin prin folosirea unor medii de cultur lichide sau solide la care se adaug diferite zaharuri i un indicator care s releve transformrile biochimice care survin deobicei consecutive modificrii pH-lui mediului. Substanele hidrocarbonate care se folosesc cel mai frecvent n acest scop sunt:

1. dizaharide maltoza, lactoza, zaharoza sau sucroza; 2. trizaharide rafinoza; 3. pentoze arabinoza, xiloza, ramnoza; 4. hexoze glucoza, fructoza, manoza, galactoza; 5. polizaharide inulina, amidonul, glicogenul; 6. glicozide salicina, esculina; 7. polialcoli ; 8. alcooli trivaleni (glicerina); tetravaleni (aritrina); pentavaleni hexavaleni (manita, dulcita, sorbita, inozita). (adonita);

Dintre mediile de cultur lichide cel mai frecvent se utilizeaz apa peptonat n care se dizolv n proporie de 1% substana hidrocarbonat ce urmeaz a se identifica i o soluie indicatoare (albastru de bromtimol, tinctur de turnesol, rou neutru). Mediul se repartizeaz de preferin n tuburi de reacie tip Wasermann. n mediul zaharat, nsmnarea tulpinii bacteriene de cercetat se soldeaz cu virarea culorii mediului n caz c s-a produs fermentarea sau cu pstrarea culorii iniiale dac aceasta nu s-a produs. Modificare culorii mediului are loc n timpul incubaiei la 37C dup o perioad variabil n funcie de rapiditatea cu care fenomenele fermentative au loc. La unele specii aceasta se produce dup cteva ore n timp ce la altele este nevoie de o incubaie mai ndelungat de cteva zile sau chiar sptmni. Mediile solide folisite pentru a evidenia capacitatea fermentativ a bacteriilor au nglobate n ele zaharul respectiv i un indicator care relev prin virarea culorii prezena procesului de fermentare, astfel: Partea dreapt

galben - glucoz pozitiv (fermenteaz glucoza) Rou sau nescimbat - glucoz negativ (nu fermenteaz glucoza) Negru - formare de hidrogen sulfurat (H2S) Bule de gaz sau spargerea agarului formare de gaz din glucoz

Partea nclinat

Galben lactoz zaharuri sunt folosite)

i/sau

zaharoz

pozitiv

(unul

sau

ambele

Rou sau neschimbat - lactoz i zaharoz negativ (nici un zahar nu este folosit

Reacii de punere n eviden a existenei fermentilor active fa de substanele proteice i aminoacizi i existena unor produi rezultai din dezintegrarea substanelor proteice. Testul de hemoliz se folosete pentru a determina capacitatea de a hemoliza globulele roii aparinnd unor specii variate (cal, oaie, bovine, cobia, iepure, om). nsuirea este prezent numai la anumite specii bacteriene i este de cele mai mute

ori legat de patogenitatea acestora. Capacitatea hemolizant este prezent n diferite grade la unele tulpini de E. coli, streptococci, stafilococi, listerii, Cl. Perfringens, etc. Hemliza poate fi de tip alfa care se caracterizeaz prin producerea n dreptul i n jurul coloniei a unei decolorri mai mult sau mai pui ntinse nsoit de o nverzire a mediului (datorit modificrilor chimice de oxidare ale hemoglobinei effect viridans) i beta care se caracterizeaz numai prin decolorarea mediului din dreptul i din jurul coloniei i denot o liz total a globulelor roii di zona respectiv. Tulpinile care pe medii cu snge nu au nici un fel de aciune asupra globulelor roii se numesc anhemolitice sau de tip gamma i caracterizeaz de regul germenii lipsii de patogenitate att n condiii experimentale ct i naturale. Pentru stabilirea capacitii hemolitice, nsmnarea se face la suprafa n plci Petri pe mediu ce conine snge defibrinat de diferite specii n proprie de 5%. Citirea se face dup o incubaie de 24 ore la 37C Testul indolului indolul rezult din dezintegrarea triptofanului. Tehnica efectuarii frotiurilor Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare i cerecetarea nsuirilor lor morfologice si tinctoriale. Tehnica efectuarii frotiurilor difer n funcie de materialul din care se face i de natura germenilor in cauz. Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire, cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei lame lefuite pe lame de microscop obinuite. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina i sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop. Dac este vorba de frotiuri ce se practica din culturi, in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsioneaz bine intr-o picatura de apa distilata, pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire. In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie vertical (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc, in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate, care se gasesc in diferite puncte ale mediului. Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat, in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine). Se poate recurge, de asemenea, la glisarea unei portiuni de organ, tiat geometric, pe suprafaa unei lame de microscop, avndu-se grij de a nu se atinge marginile lamei. Si n acest caz se prefera frotiurile cit mai fine.

Uneori, frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. In acest scop, se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se strivete prin compresiune. Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara i se coloreaza. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice. Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 34 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, avnd grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este moderata, in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60C. Fixarea termica se poate face si prin flambare, punnd pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool. Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substane fixatoare (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pna la evaporarea totala. Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitatea de a fixa frotiurile, asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila. Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea, care este bine sa se faca ct mai curnd dupa efectuarea frotiurilor.

Metode de colorare i examinarea microscopic a frotiurilor Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic Prin colorare se pot stabili unele particularii morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaiile cu esuturile n care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului. Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica n mod curent si metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii. Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in:

colorare cu solute de violet de Gentiana 1% timp de 1 minut varsarea colorantului de pe lama tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute decolarea cu amestec de alcool-acetona pna cul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat spalare cu apa de robinet recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 2030 secunde spalare cu apa de robinet uscare

cind

ameste-

examinarea la microscop. Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i diferentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% i, dupa 2 5 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea colorati in albastru, uniform. Metoda permite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole. Coloraia ZiehlNeelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile):

acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluie de fucsina Ziehl incalzirea la flacara pna la aparitia vaporilor si mentinerea prin incalziri repetate timp de 510 minute (se va avea grija ca soluia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz c s-a evaporat de pe anumite portiuni de frotiu) varsarea colorantului decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp de cca 2 minute spalare cu apa tratare cu alcool absolut timp de 5 minute spalare cu apa recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 23 minute spalare cu apa uscare si examinare cu imersie. La examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta colorai in rou (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub aciunea acidului, in timp ce ceilali se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul ca in cazul acidorezistenilor acesta fiind bogat in substane lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranilor (fucsina patrunde datorita concentraiei ridicate si a caldurii). Pentru acest motiv, germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite.

Alte metode de colorare: Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda TribondeauFontana - s e foloseste pentru colorarea lepto spirelor Pentru colorarea capsulei bacteriene coloraia Giemsa, metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu verde de

malahit

Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill Determinarea bacteriilor din genul Salmonella Metoda stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene din genul Salmonella n produsele cercetate, acestea fiind un pericol pentru sntatea consumatorului n cazul consumului de alimente contaminate. Metoda se aplic urmtoarelor produse: -

-

Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt, smntn fermentat, lapte btut, kefir, sana) Iaurt cu fructe Smntn dulce pentru fric i fric btut Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal) Brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate Brnzeturi fermentate Unt Margarin de consum Margarin cu lapte ngheat, torturi de ngheat Praf de ngheat Lapte concentrat cu zahr creme vegetal (nlocuitori de fric) Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai proaspei etc.) Preparate din carne srate i/sau afumate Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate) Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) Produse crude (niel, cacava pane) Pete proaspt, decapitat i eviscerat Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre i din lapi) Icre srate Salat de icre cu adaos de ulei Pete srat Pete srat cu ceap Pete afumat la cald, pete afumat la rece Preparate culinare din pete Ou umplute, salate cu maionez Gelatin alimentar

-

-

-

-

-

Prjituri cu crem Torturi cu diferite creme, fric, fructe Maionez Pulberi de maionez (nlocuitori de maionez) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric Paste finoase (macaroane, fidea) Paste finoase cu umplutur (ciuperci, carne brnz) Condimente i amestecuri Buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale i carbogazoase, ghia artificial Bere nepasteurizat, filtrat i nefiltrat Bere pasteurizat Finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin) Produse de panificaie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate) Biscuii uscai i biscuii glazurai Biscuii, pateuri Fursecuri, napolitane cu diferite creme Cacao, pudr, ciocolat tablete, ciocolat cu adaos, bomboane fine i extrafine de ciocolat Ciocolat umplut cu crem Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant Bomboane altele dect ciocolat Jeleuri, rahat, gemuri, erbeturi, dulceuri, fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice Emulsie pentru buturi rcoritoare Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne) Oet alimentar Ceai (plant) Bor Cafea crud prjit i instant Melanj din ou praf Produse din gru germinat Fructe de mare refrigerate Pepsin (pulbere n maestec cu sare) sandviciuri, mncruri tip fast-food.

Documente de referin: - ISO 17025/2001 - SR EN 12824/2001 - ISO 6887/96 ISO 7218

Principiul metodei: Germenii din genul Salmonella pot fi prezeni n numr mic i sunt deseori nsoii de un numr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. n

consecin este necesar mbogirea selectiv n plus deseori este necesar prembogirea pentru a evidenia acei germeni Salmonella care au fost supui alterrii. Aparatur i sticlrie folosit Termostat 35oC; 37o +-0,5oC; 42oC microbian-

aparat electric pentru dezvoltarea

Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 3060 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute-

Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei-

-

Sterilizator electric pentru instrumente

Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de nalt turaie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile-

Baie de ap reglabil la temperatur 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC i 70oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml Aparat pentru sterilizare uscat sau umed ISO 7218 Etuv ventilat prin convecie reglabil la 37oC i la 55oC pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platin-iridiu sau nichel-crom Eprubete de 16 x 160 mm sterile Flacoane pentru medii de cultur Eprubete cu diam de 8/160 mm Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, sterile Eprubete gradate Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml

-

-

-

Eantionarea - este important ca laboratorul s primeasc un eantion cu adevrat reprezentativ, nealterat sau modificat n timpul transportului sau depozitrii n corelaie cu standardul internaional specific al produsului. Reguli de procedur

-

Modul de analiz, acceptare i nregistrare a comenzilor eantioanele trebuie s fie etichetatei iar procesul verbal de prelevare probe s conin urmtoarele date:produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat proba. Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la 180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121oC timp de 30 minute. Pregtirea eantionului pentru analiz. Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului respective: lapte materie prim i produse lactate se cntresc 25 g eantion ntr-un balon Erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (APT), lapte praf, zer dulce i lactoz se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 g mediu de prembogire, brnza i brnza topit se cntresc 25 g prob ntr-un mojar steril, se mojareaz, se transfer ntr-un balon steril, peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire, untul se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril, se nclzete ntr-o baie de ap la 45oC peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire. Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25 g. Se mojareaz, se transfer ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (ATP)

-

-

Aciuni i/sau msuri preventive Protecia personalului -

-

Obligatorie purtarea halatului Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) Folosirea hotei de nsmnare Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante

Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare Modul de lucru

Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale Sticlria steril se folosete maxim 6 zile Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

Pregtirea eantionului pentru analiz - se efectueaz conform standardului internaional pentru produsul de analizat. nsmnare i incubare 1. Faza de prembogire neselectiv.

Se cntresc 25 g produs ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adug 225 ml mediu APT . Se incubeaz la temperatura de 35o 37oC timp de 16-20 h. 2. Faza de mbogire selectiv Din cultura obinut conform 10.3.1. se trec 0,1 ml n 10 ml mediu RV i 10 ml ntr-un flacon ce conine 100 ml mediu SC. Se incubeaz cele dou medii nsmnate dup cum urmeaz:.a) mediul RV nsmnat la temperatura de 42oC timp de 24 h b) mediul SC nsmnat la temperatura de 35o 37oC (conform acordului)timp de 48 h

3. Izolare i identificare. Din cultura obinut n mediu RV dup 24 h de incubare cu o ans bacteriologic se nsmneaz suprafaa primului mediu de nsmnare selectiv (ARFVB) n cutii Petri sterile. Se procedeaz la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectiv (AMC) folosindu-se o alt prelevare cu ansa bacteriologic i cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate.Se incubeaz cele dou medii selective nsmnate la temperatur de 35o 37oC timp de 24 h. Din cultura obinut n mediu SC, dup 48 h incubare se repet operaiunile descrise mai sus.Dup 24 h incubare n ambele situaii se examineaz cutiile pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristic de Salmonella. Interpretare

Coloniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoac virarea culorii mediului de la roz la rou. Dac dezvoltarea este slab sau nu se evideniaz coloniile caracteristice de Salmonella cutiile Petri nsmnate se incubeaz n continuare la temperatura de 35o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h.Se reexamineaz cutiile Petri pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristice de Salmonella. Test de confirmare

Pentru confirmare, din fiecare cutie Petri din fiecare din cele dou medii selective se recolteaz cte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte. Dac se gsete o cutie cu mai puin de 5 colonii caracteristice sau suspecte, se rein toate coloniile caracteristice sau suspecte.Se striaz coloniile selecionate pe suprafaa agarului nutritiv din cutii Petri n prealabil uscate astfel nct s se obin o dezvoltare de colonii bine izolate. Se incubeaz cutiile astfel nsmnate la temperatura de 35o 37oC, timp de 18-24 h. Pentru conformrile biochimice i serologice se utilizeaz culturi pure. Confirmri biochimice Cu ajutorul ansei efilate se nsmneaz mediile indicate de la pn la cu fiecare din culturile obinute din coloniile reinute 1. Agar TSI Se nsmneaz coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare. Se incubeaz la temperatura de 35o 37oC timp de 24 h. Se interpreteaz modificrile care se produc n mediu n modul urmtor: Baza mediului galben glucoz pozitiv (fermentarea glucozei) - roie sau nemodificat glucoz negativ (lipsa fermentrii glucozei) - neagr formare de hidrogen sulfurat - bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoz Panta mediului galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv - roie sau nemodificat lactoz i zaharoz negativ (neutilizarea lactozei i a zaharozei

Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de gaz i a unei baze acide (galben) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (nnegrirea agarului. Atunci cnd se izoleaz o Salmonella lactoz pozitiv panta agarului TSI este galben, n consecin o confirmare preliminar a culturilor de Salmonella nu trebuie s se bazeze doar pe rezultatele obinute pe agarul TSI. 2. Agar cu uree. Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h. 3. Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei Se nsmneaz mediul lichid sub suprafa. Se incubeaz la 35o sau 37oC timp de 24 h. O culoare violet aprut dup incubare indic o reacie pozitiv. O culoare galben indic o reacie negativ. 4. Evidenierea betagalactozidazei Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet ce conine 0,25 ml soluie salin, se adaug o pictur de toluen i se agit eprubeta. Se introduce eprubeta n baie de ap reglat la 35o sau 37oC (conform acordului) i se las s stea cteva minute. Se adaug 0,25 ml Reactiv pentru evidenierea betagalactozidazei i se amestec. Se reintroduc eprubetele n baia de ap la 35o sau 37oC (conform acordului) i se las 24 examinndu-le din timp n timp. O culoare galben indic o reacie pozitiv, deseori reacia este vizibil n 20 minute. n cazul folosirii discurilor de hrtie gata preparate se respect instruciunile fabricantului. 5. Mediu pentru reacia VP Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet coninnd 0,2 ml VP, se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 2 picturi din soluia de creatin, 3 picturi din soluia alcoolic de l-naftol i apoi 2 picturi din soluia de hidroxid de potasiu agitnd dup adugarea fiecrui reactiv. Formarea unei coloraii roz pn la rou aprins ntr-un interval de 15 minute indic o reacie pozitiv 6. Mediu pentru evidenierea indolului Se nsmneaz o eprubet ce conine 5 ml mediu tripton-triptofan cu colonia suspect Se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rou indic o reacie pozitiv. Formarea unui inel galben brun indic o reacie negativ.

Test1)

Reacie pozitiv sau negativ

Procentajul nsmnrilor de Salmonella care prezint reacia2)

Glucoz,TSI (formare de acid) Glucoz, TSI (formare de gaz) Lactoz, TSI Zaharoz, TSI Hidrigen Sulfurat, TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenierea betagalactozidazei Reacia Voges Prostkauer Evidenierea Indolului

pozitiv + pozitiv + negativ negativ pozitiv + negativ pozitiv + negativ negativ negativ -

100 99,93) 99,24) 99,5 91,6 99,0 94,65) 98,54) 100 98,9

2) Aceste procentaje indic doar faptul c toate speciile de Salmonella nu dau reacii pozitive sau negative. Acest procentaj poate varia de la o ar la alta i de la un produs la altul 3) Salmonella typhi este anaerogen (nu produce gaze n anaerobioz) 4) Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacie lactoz pozitiv sau negativ, dar sunt betagalactozidaz pozitiv. Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacie lactoz negativ, dar dau reacia betagalactozidaz pozitiv. Pentru studiul speciilor poate fi util efectuarea unor teste biochimice suplimentare. 5) Salmonella paratyphi A este negativ

Confirmare serologic Cercetarea prezenei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectueaz prin aglutinare pe lam cu seruri adecvate din colonii pure i dup eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lam de sticl curat o pictur de soluie salin, se disperseaz n aceast pictur o fraciune din colonia de testat aa fel nct s se obin o suspensie omogen i tulbure prin micarea lamei timp de 30-60 secunde. Dac bacteriile se adun n grmezi, tulpina este considerat autoaglutinabil i nu mai trebuie supus examinrilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru Evidenierea antigenelor O. Dintr-o colonie pur cunoscut ca neaglutinabil se procedeaz ca mai sus, dar n locul soluiei saline se folosete o pictur de antiser O. Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Se utilizeaz serurile poli i monovalente unul dup altul. Evidenierea antigenelor Vi. Se procedeaz ca mai sus utiliznd o pictur de antiser Vi. Dac se produce aglutinarea reacia este pozitiv. Evidenierea antigenelor H. Se nsmneaz un agar nutritiv semisolid cu o colinie pur neautoaglutinabil, se incubeaz la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizeaz aceast cultur pentru examenul antigenelor H procedmd ca mai sus, dar folosind o pictur antiser H.Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Interpretarea reaciilor biochimice i serologice

Tabelul prezint interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecionate. Reacii biochimice tipice Autoaglutinare nu Reacii serologice antigene O, Vi sau H pozitive toate reaciile negative neefectuate tipice lipsa reaciilor tipice da nu antigene O,Vi sau H pozitive toate reaciile negative lipsa reaciilor tipice nu nu sunt considerate ca fiind Salmonella ar putea fi Salmonella Interpretare tulpini considerate ca fiind Salmonella

tipice

nu

Confirmare definitiv Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau c ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la Institurul de Igien i Sntate Public Veterinar pentru identificarea germenilor din genul Salmonella, pentru determinarea definitiv a serotipului. Aceast expediere trebuie nsoit de toate informaiile disponibile referitoare la tulpin (tulpini). Exprimarea rezultatelor n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena germenilor din genul Salmonella n x grame de prob de analizat.

LIMITELE DE NCREDRE PENTRU ESTIMRI DE NUMERE MICI

Numr de microorganisme 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Limite de ncredere la nivelul de 95% Inferioar Superioar