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MicroImmunoTerapia: lettura degli esami di laboratorio Dipartimento Scientifico GUNA S.p.A.

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MicroImmunoTerapia:

lettura degli esami di laboratorio

Dipartimento Scientifico GUNA S.p.A.

Ci occuperemo di:

definizione dei singoli protagonisti dell’immunità (cellule) e loro ruolo

pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

(significato e lettura)

riattivazione virale: significato

Chi è il paziente «arruolabile» per la

Micro-Immuno-Terapia?

Pazienti portatori di patologia virale acuta: -Mononucleosi infettiva (CMV) -Infezioni da Herpes Simplex (tipo 1 e 2) HHV1-2 -Varicella ed Infezione da Herpes Zoster -Infezioni da Citomegalovirus -Stati di immunodeficienza da virus stagionali NOTA BENE:

Gli Herpesvirus umani, cioè quelli che attaccano l'uomo, o Human Herpes Virus, sono indicati

con la sigla HHV. Attualmente sono noti 8 Herpes virus umani, suddivisi in 3 gruppi: Alphaherpesviridae: (virus dell'Herpes simplex e Varicella-zoster); sede di latenza: terminazioni nervose del SNC)

HHV-1 Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) HHV-2 Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) HHV-3 Virus varicella-zoster (VZV) Betaherpesviridae: (Cytomegalovirus); sede di latenza: endotelio e epitelio di ghiandole salivari e tubuli renali)

HHV-5 Cytomegalovirus (CMV) HHV-6 Herpesvirus umano 6 HHV-7 Herpesvirus umano 7 Gammaherpesviridae: (virus di Epstein-Barr); sede di latenza: cellule linfoidi

HHV-4 Epstein-Barr Virus (EBV) HHV-8 Herpesvirus umano 8 (o KSHV o Virus del Sarcoma di Kaposi)

Pazienti portatori di sindrome da fatica cronica

-quadri clinici associati a «riattivazione virale»

-quadri clinici associati a stress psico-fisico

Patologie cronico-degenerative

-Malattie autoimmuni

Tiroiditi

Artrite reumatoide

LES

Vasculiti

M. di Crohn

M.di Sjogren

- Epatopatie croniche

-Malattie degenerative del SNC e SNP

-Cancro

Le forze in campo

Immunità naturale = si forma durante la vita fetale; è già perfettamente efficiente alla nostra nascita (es. linfociti Natural Killer, granulociti)

Immunità acquisita (adattativa) = necessita di elaborazione dell’informazione (antigene) e di progressivo riconoscimento del sist. Immune (es. APC, linfociti, Th, T8, etc)

Immunità cellulo-mediata = mediata da cellule

Immunità umorale = anticorpale (IgA, G, M, etc)

Immunità naturale/innata

Le cellule Natural Killer o cellule NK o Linfociti

NK sono cellule del sistema immunitario,

particolarmente importanti nel riconoscimento e

distruzione di cellule tumorali e infette da virus.

Sono in grado inoltre di produrre citochine, come

l'interferone gamma (che attiva i macrofagi). Le

NK non necessitano di attivazione, sono infatti

indipendenti dal sistema immunitario specifico ed

esplicano un'importante azione come prima

difesa, tipica dell'immunità cellulo-mediata

innata.

I protagonisti - 1 Linfociti NK (Natural Killer)

I protagonisti - 1 Linfociti NK (Natural Killer)

Essendo le uniche in grado di riconoscere e

combattere le cellule tumorali queste sono importante

oggetto di studio nella ricerca contro il cancro. Sono le

uniche cellule del sistema immunitario che NON

vengono prodotte durante la vita dell'organismo, si

formano infatti durante la dodicesima settimana di

sviluppo dell'embrione.

Queste cellule sono le meno specializzate del

sistema immunitario e distruggono ogni elemento

cellulare riconosciuto come "non-self".

Il riconoscimento avviene grazie a interazioni con

il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I)

I protagonisti - 1 Linfociti NK (Natural Killer)

A differenza dei linfociti Tcitotossici le cellule NK

riconoscono come non-self le cellule con bassa

espressione di MHC-I come le cellule tumorali,

inducendone la lisi; infatti le NK non trovando i

giusti recettori self liberano intorno alla cellula estranea o

modificata le perforine e i granzimi, le prime formano

dei pori nella membrana plasmatica e i secondi, entrando

attraverso questi pori, inducono la cascata caspasica e

quindi la morte della cellula per apoptosi.

Cellule con alta espressione di MHC-I sono resistenti

alla citotossicità mediata dalle cellule NK perché

queste ultime posseggono sulla loro superficie una

famiglia di recettori inibitori (KIRs) che, ingaggiati nel

legame con il complesso MHC-I mediano una cascata di

segnali che prevengono il rilascio dei granuli citotossici.

Altri protagonisti dell’immunità

innata:

granulociti neutrofili eosinofili

basofili monociti macrofagi

Rappresentazione di una reazione immunitaria innata

Immunità acquisita/adattativa

Immunità acquisita/adattativa

Il complesso maggiore di istocompatibilità (MHC-I e II)

MHC-I MHC-II

Gruppo di geni polimorfici costituito da 30 unità, localizzato sul cromosoma 6.

I prodotti genici tipici del complesso MHC legano frammenti di antigeni ad una

porzione di tale molecola, rendendoli visibili ai recettori dei linfociti T.

Nell'uomo l'MHC prende il nome di Human Leukocyte Antigen (HLA).

su tutte le

cellule nucleate

solo su alcune

cellule

immunocompetenti:

cellule dendritiche,

APC, macrofagi,

linfociti B Antigene + MHC-I

= CD8+ = T8

(suppressor o

citotossici)

(virus e oncogeni)

Antigene + MHC-II

= CD4+ = Th (helper)

(batteri e parassiti)

I protagonisti – 2 APC (Antigen Presenting Cell)

E’ il “mediatore culturale” del sistema immunitario,

ovvero la cellula che trasforma la complessità

molecolare dell’antigene non-self nella

semplicità di un messaggio comprensibile,

fruibile dalle nostre difese, al fine di organizzare

una risposta opportuna.

Es. quando non capiamo bene una parola al

telefono, chiediamo di farci lo “spelling”; l’APC fa

analoga cosa, al fine di farsi ben comprendere.

Classificazione dei linfociti T

Esistono diversi tipi di linfociti T, caratterizzati dal diverso funzionamento e

meccanismo d'azione:

linfociti Thelper (Th / CD4+) = solo MHC di classe II. Si dividono a loro

volta in Th1 o Th2 secondo il tipo di risposta, cellulo-mediata per i primi

e umorale per i secondi (Ig = immunoglobilinica/anticorpale), Th3

(=Treg) e Th17 (difesa dai patogeni extracellulari, infiammazione e

autoimmunità)

linfociti Tregolatori (Treg / CD4+CD25+) = alcuni linfociti CD4+ (Th3)

possono differenziarsi in linfociti Tregolatori, che esprimono CD25+. Sono

essenzialmente coinvolti nello spegnimento della risposta immunitaria e

nel mantenimento della tolleranza periferica, producono e liberano in

soluzione grandi quantità di IL-10 e TGF-β1 (“off” dell’infiammazione)

linfociti Tcitotossici (T8c / CD8+) = I linfociti Tcitotossici riconoscono ed

inducono alla lisi le cellule infettate (uccidono la cellula “corrotta”, sono i

cosiddetti T KILLER)

Linfociti Tsuppressor (T8s / CD8+CD28-) I linfociti Tsuppressor svolgono

specifica azione inibitoria nei confronti delle cellule T CD4+ (helper),

rendendole irresponsive (anergiche), ovvero tollerigene.

I protagonisti - 3 Linfociti T

I linfociti T giocano un ruolo fondamentale nell’immunità cellulo-mediata acquisita.

Si distinguono dagli altri linfociti, quali i linfociti B e le cellule Natural Killer per la presenza di uno specifico recettore presente sulla loro superficie chiamato recettore delle cellule T (T Cell Receptor, TCR).

I linfociti T riescono a riconoscere un antigene solo se esso viene "presentato" (vedi: APC, Antigen Presenting Cell) sulla superficie di una cellula complessata con le proteine del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), e non quindi nella sua forma solubile. I linfociti T possiedono un sistema di recettori, TCR/CD4-CD8 (CD= Cluster of Differentiation), tramite i quali riescono a riconoscere il peptide antigenico, presente in un complesso associato alle proteine dell'MHC.

I linfociti T entrano in gioco non solo in presenza di un antigene “non-self” (estraneo al ns organismo), ma anche in caso di frammenti proteici derivati dall’azione del proteosoma, ovvero molecole “self”.

Posseggono sia una funzione effettrice capace di eliminare cellule tumorali, infette e organismi patogeni, sia una funzione regolatrice tramite la produzione di linfochine, molecole che sono alla base di fenomeni di cooperazione cellulare nella risposta immunitaria. Le cellule a funzione effettrice possiedono la molecola di riconoscimento CD8 (sono dette CD8+) e sono i linfociti Tcitotossici; le cellule con funzione regolatrice sono marcate dalla CD4 (dette CD4+) e sono i linfociti Thelper.

I protagonisti - 3 Linfociti T

Le cellule APC (Antigen Presenting Cell – vedi in precedenza), presentano l'antigene ai linfociti Tnaïve (= vergini, che NON sono mai venuti a contatto prima con un antigene) e attivano quei cloni linfocitari che legano lo specifico MHC-peptide mediante uno specifico TCR (recettore per le cellule T).

Il linfocita Tnaïve attivato inizia a produrre sia la citochina IL-2 che il suo recettore IL-2R, in questo modo, per via autocrina, stimola se stessa a crescere e a dividersi determinando espansione clonale per lo specifico antigene presentato dalla APC. Se l'antigene è complessato con MHC (HLA) di classe I il linfocita attivato sarà CD8+ (T8) e l’agente infettante un virus o un oncogeno; se è invece complessato a MHC (HLA) di classe II il linfocita attivato sarà CD4+ (Th) e l’infettante un batterio o un parassita.

I protagonisti - 3 Linfociti T - ATTIVAZIONE

I protagonisti - 4 Linfociti B

I linfociti B sono cellule del sistema immunitario che giocano un ruolo primario nell'Immunità umorale acquisita.

La principale funzione dei linfociti B è quella di produrre anticorpi contro uno specifico antigene; i linfociti B memo-ria trattengono l’informazione ricevuta dopo l’attivazione da contatto con un antigene.

I linfociti B in seguito a stimolazione, sono capaci di proliferare e trasformarsi in cellule effettrici, le plasmacellule, queste ultime capaci di produrre anticorpi (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).

Immunoglobulina

Anticorpo

Rappresentazione di un’immunità specifica

Il referto Il pannello delle sottopopolazioni

Il referto Il pannello delle sottopopolazioni

Limite alto dell’intervallo di norma

Limite basso dell’intervallo di norma

Intervallo di norma

Il pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

Da sinistra a destra:

LEU = Leucociti totali (tutti i glob. bianchi)

LYM = Linfociti totali (tutti i linfociti)

T3 = Linfociti T3 (CD3+) = APC (Antigen Presenting Cell)

T4 = Linfociti T4 (CD4+CD3+) = Riconoscono Ag present-ati da MHC di II classe (batteri e parassiti)

T8 = Linfociti T8 (CD8+CD3+) = Riconoscono Ag presentati da MHC di I classe (virus e oncogeni)

(T4 e T8 valutano un 1° e 2° criterio di valutazione di soggettiva risposta immunitaria - adeguatezza)

T4/T8 = rapporto T4/T8

B = Linfociti B totali (CD19 +) = Prod. di anticorpi

Ta = Linfociti T attivati (CD3+HLA-DR+) = espri-mono i linfociti che entrano in contatto con un Antigene (self o non-self). Si suddividono in: linfociti T4a e linfociti T8a

T4a = CD3+CD4+HLA-DR+

T8a = CD3+CD8+HLA-DR+

NK = Linfociti Natural Killer (CD3- CD56+)

T8c = Linfociti T8citotossici (CD8+ CD57-)

Il pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

T8s = Linfociti T8suppressor (CD8+CD57+)

T8c/s = Rapporto T8citotossici/T8suppressor = questo rapporto costituisce un 3° criterio di valutazione di reattività soggettiva

T4v = Thelper = T4 effettori (v sta per “veri”) = Attivano i macrofagi nelle risposte immunita-rie cellulo-mediate - Stimolano la produzione di anticorpi da parte dei linfociti B nelle rispo-ste immunitarie umorali

Il pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

T4n = T4naïve (CD4+CD45RA+) = T4 “vergine” che non ha ancora incontrato un antigene

T4v/n = rapporto T4v/T4n (T4effettori/T4naïve) = evidenzia la potenzialità del S.I. ad avviare una rispo-sta adeguata T dipendente (4° criterio di valutazione della reattività soggettiva)

Treg = Tregolatori (CD4+CD25+) essenzialmente coinvol-ti nel controllo della risposta immunitaria e nel man tenimento della tolleranza periferica, producono e liberano in soluzione grandi quantità di IL-10 e TGF-β1 (“off” dell’infiammazione) e inibiscono l’attivazio-ne dei linfociti T e delle cellule dendritiche (APC)

Il pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

LYM%

T4%

T8%

rsIL2 = recettore solubile dell’Interleuchina 2 = clinicamente l’aumento dei livelli serici di questa proteina rappresenta un indicatore di forte stimolazione antigenica (5° criterio di valutazione della reattività soggettiva)

Il pannello delle sottopopolazioni linfocitarie

% dei linfociti, dei T4 e dei T8 rispetto al totale dei LEUCOCITI ( LEU - prima colonna a sx del pannello)

Ruolo della IL 2

IL2 stimola sopravvivenza, proliferazione e

differenziazione dei linfociti attivati dall’Ag

IL2 induce proliferazione e differenziazione di

cellule NK

IL2 è necessaria per

la sopravvivenza e

per la funzione dei

Treg, che limitano le

risposte immunitarie

verso Ag self

Ruolo della IL 2

Recettore solubile IL2 (rsIL2): 5° criterio di

valutazione di reattività soggettiva

IPO-REATTIVITA’

IMMUNITARIA

Razionale dei 5 criteri di

valutazione della reattività soggettiva

1. T4

2. T8

3. T8c/T8s

4. T4v/T4n

5. rsIL2

IPER-REATTIVITA’

IMMUNITARIA

se tutti i criteri sono nella norma

e almeno uno è al di sopra

se tutti i criteri sono nella norma

e almeno uno è al di sotto idonei prodotti

idonei prodotti

PANNELLO SOTTOPOPOLAZIONI LINFOCITARIE: I 5 CRITERI (PALLINO GIALLO)

1° e 2°criterio

di valutazione dello stato immunitario

Riguarda il valore percentile dei

linfociti T4 e T8

Considerazioni relative al deficit di T4

Abbiamo visto come i T4 servano per l’avvio della risposta di difesa, fondamentali per il riconoscimento antigenico e l’attivazione di un’immunità consona al controllo dell’invasore: i T8 servono invece a ucciderlo.

Analizzando il pannello precedente (HIV) possiamo dedurne:

• valore molto SOTTO norma dei T4 (CD4+) e del rapporto T4/T8, poiché, invece, alle stelle i T8 (compenso)

• rapporto T8c/s normale (no autoimmunità)

• alle stelle il rsIL 2 (stimolazione T4, NK, Treg, - compenso)

…la chirurgia si avvale anche del talcaggio, tecnica

questa che viene praticata in pleuroscopia, tramite il

pleuroscopio si asporta il liquido presente e si introduce

del talco che creando una reazione infiammatoria locale

fa aderire i due foglietti pleurici impedendo il riformarsi

del versamento che in modo significativo riduce il

performance status del paziente. A questa tecnica deve

seguire una radioterapia sulla breccia toracoscopia per

limitare o evitare una potenziale inseminazione di

cellule neoplastiche che provocano la formazione di

noduli sottocutanei che complicherebbero il quadro.

Mesotelioma: terapia chirurgica e talcaggio

Considerazioni relative al deficit di T8

Generalmente sono i linfociti Tkiller (T8c) e riconosco-no antigeni presentati da MHC di I classe (virus e oncogeni). In questo caso clinico (mesotelioma) possiamo dedurre che sono fortemente DEFICITARI (come anche i B, i T8c e i T8s), nonostante una conservata capacità di riconoscimento (nella norma i T4). Alta invece la produzione di rsIL 2 (stimolazione T4, NK – che risultano nella norma – , Treg), a significare il tentativo di compenso del S.I. per aumentare le difese di fronte all’aggressione della neoplasia, con particolare riguardo al controllo di crescita self - Treg.

Significato dei Linfociti NK

Le cellule NK (Natural Killer)

agiscono nelle risposte immuni-

tarie innate per uccidere cellule

infettate da microbi e attivare

fagociti mediante la secrezione

di INFγ

Si attivano nella risposta tumorale

controllano l’ampiezza della risposta

immunitaria e assicurano la tolleranza

immunitaria

inibiscono l’attivazione dei linfociti T

(Ta) e delle cellule dendritiche (APC)

Significato dei Tregolatori

(Treg)

Classificazione delle neoplasie (4 stadi, da 0/1 a 3/4 da meno grave a più grave)

G = Grading = grado di differenziazione della neoplasia (da 1 = più differenziato – meno grave – a 4 = meno differenziato – più grave)

T = Grandezza della lesione = da 1 (piccolo) a 4 (grande). Può essere “is”, ovvero “in situ” (delimitato, NON infiltrante la membrana basale del tessuto, a basso rischio di diffusione) es. TisN0M0

N = Stato dei linfonodi vicini al tumore (di cui fa parte il cosiddetto “sentinella”) = 0 se indenni, 3 se gravemente alterati

M = Presenza di eventuali metastasi = 0 (assenza di metastasi), 1 (presenza di metastasi)

x = parametro in attesa di valutazione – risposta diagnostica certa (TAC, RMN, scintigrafia ossea. etc)

Es: G2T2N1Mx significa: neoplasia di medio-bassa differenziazione, di grandezza medio-piccola, con poche alterazioni dei linfonodi vicini, in attesa di referti comprovanti la presenza di metastasi.

Facciamo alcune considerazioni…

La paziente è affetta da Lichen planus, patologia autoimmune

correlata ad un’alterata immunoregolazione mediata dai linfociti T

citotossici (da cui il danno tissutale)

L’attività delle cellule T8 è tenuta sotto controllo dai Treg (T regolatori)

che sopprimono la risposta immunitaria e mantengono la tolleranza

al self

Nelle patologie autoimmuni è stata dimostrata una correlazione negativa

tra i livelli di Treg e dei linfociti T8c

In corso di processo infiammatorio, la risposta infiammatoria (↑ dei T8c) è

correlata ad un notevole decremento dei meccanismi regolatori

cellulo-mediati, rappresentati dai Treg.

Al contrario, in "fase di guarigione" si osserva un aumento delle cellule

Treg ed una diminuzione delle cellule T citotossiche.

Immagine a CATTEDRALE

Immagine a PODIO

Immagine a scala ASCENDENTE

Immagine a scala DISCENDENTE

Immagini caratteristiche

del pannello delle sottopolazioni

Rapporto T8c/T8s

Immagine a CATTEDRALE

Rapporto T8c/T8s

SIGNIFICATO dell’immagine a “cattedrale”

Rapporto T8c/T8s

T8c T8sT8c/s

Aggressione virale

(sierologia)

Confronto dei T8

citotossici e dei T8

suppressor

Rivela la capacità di

adattamento del S.I.

nella risposta del soggetto

all’aggressione del virus

Aggressione virale = Cattedrale – sistema immunitario con adeguata reattività T8citotossici in intervallo norma; T8suppressor sotto intervallo norma; rapporto

T8citotossici/T8suppressor in intervallo norma verso i limiti superiori

Significato immagine a PODIO

Rapporto T8c/T8s

T8c T8sT8c/s

Aggressione virale

(sierologia)

Nel rapporto T8citotossici e

T8suppressor il valore

maggiore (ben fuori norma

dai limiti superiori dei T8s)

rivela che il S.I. è inadeguato

nei confronti dell’aggressore

virale

Aggressione virale = Podio

Il rapporto T8citotossici e

T8suppressor sotto la norma

rivela che il S.I. è inadeguato

nei confronti dell’aggressore

virale

Interpretazione clinica

delle immagini cattedrale e podio (T8c/T8s)

Aggressione virale

CATTEDRALE

Sistema immunitario soggettivo

ADEGUATO

Aggressione virale

PODIO

Sistema immunitario soggettivo

INADEGUATO

Il CICLO LITICO e il CICLO LISOGENO sono i due modi in cui

i virus sopravvivono utilizzando le cellule umane parassitate.

Entrambi i cicli cominciano con l'iniezione dell'acido nucleico virale nella

cellula ospite. Questa fase rappresenta un bivio tra i due possibili cicli.

Nel CICLO LITICO il genoma virale prende il controllo della cellula ospite

inducendola a sintetizzare nuovo acido nucleico virale e proteine che,

una volta assemblate con il genoma, andranno a costituire nuovi virioni, i

quali usciranno dalla cellula uccidendola in una fase detta lisi o verranno da

essa secreti.

Nel CICLO LISOGENO il genoma virale, invece, si inserisce

nel DNA della cellula ospite, prendendo il nome di provirus e

mantenendo molti dei suoi geni disattivati. Una volta che la cellula si

duplica viene trasmesso anche il DNA virale alle cellule figlie formando così in

un breve periodo una vasta colonia di genomi virali senza che avvenga la lisi.

Il genoma del provirus reprime la maggior parte dei suoi geni, che

vengono riattivati in caso di danni alla cellula ospite, dando il via ad un

ciclo litico.

Un esempio a tutti familiare è quello dell'Herpesvirus umano, i cui

provirus vengono indotti da stress termici, psicologici o da radiazioni

ultraviolette, dando origine alla cosiddetta febbre nascosta.

Riattivazione virale

Infezione cronica = mononucleosi cronica

(sierologia: positive IgG)

Infezione persistente = riattivazione virale

(sierologia: positive IgG)

Esempio: Epstein-Barr Virus

Malattia acuta = mononucleosi infettiva

(sierologia: positive IgM)

Principali sintomi collegati a una sospetta riattivazione virale

quadro di astenia fisica prolungata febbricola cefalea eruzioni cutanee aftosi polimialgie e poliartralgie parestesie disturbi motori alterazioni dell’umore (ansia, depressione, stati psicotici maggiori)

Il laboratorio e le sierologie specifiche vanno ricercati i titoli anticorpali IgG

(in dosaggio quantitativo). se questi superano il valore massimo

(limite superiore di norma) di 5 volte, è possibile parlare di riattivazione virale

Principali titoli anticorpali da ricercare

anticorpi anti-EBNA (ac. nucleici EB) anticorpi anti-EA (early antigen = giovani) anticorpi anti-VCA IgG (capside virale) anticorpi anti-CMV IgG anticorpi anti-Herpes 1 e 2 IgG anticorpi anti-Varicella/Zona (Zoster) IgG

ATTENZIONE! numerose patologie cronico-degenerative

(autoimmuni, oncologiche, neurologiche) possono essere correlate ad uno stato di riattivazione virale.

su questo argomento esiste una ricca documentazione bibliografica in letteratura

ma questa correlazione deve solo far supporre che il virus partecipi e/o alimenti uno stato di malattia.

Non ne rappresenta la sua patogenesi!

Si ringrazia il Dr. Cesare Santi, responsabile europeo per la MIT, per la gentile

concessione di molte immagini di questa relazione

Dove eseguire gli esami (pannello sottopopol. e sierologia)

http://www.cam-monza.com

Grazie dell’attenzione!