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Micropropagation of ornamentalgeophytes

Abstract. Ornamental geophytes are plants with

exploited aesthetic properties that survive the unfa-

vorable season by underground storage organs.

Traditional propagation methods of geophytes

species have low efficiency and may be the way for

diseases transmission. In vitro propagation can over-

come these problems. The procedures for in vitro

propagation of bulb crops may differ slightly from the

traditional five stages process of micropropagation,

since geophytes have such a unique structure. So, a

bulb induction stage is necessary after shoot prolifer-

ation, while a rooting stage usually is not needed.

Efficient geophytes micropropagation systems are

described based on the initiation of in vitro culture

from perpetuating underground organs and ending

with the differentiation of bulblets, propagules that are

naturally rustic and can be transferred directly to the

ground without acclimatization. However, bulblets and

cormlets regenerated in vitro are dormant and must

be subjected to treatments in order to release dor-

mancy. Differentiation of shoots and multiplication by

shoot clumps can be achieved in most geophytes by

direct organogenesis, indirect organogenesis and

somatic embryogenesis. The multiplication system

influences both the genetic stability and the multiplica-

tion rate of propagules. Usually, direct organogenesis

is preferred and usually high proliferation rates are

achieved. The use of bioreactors for micropropaga-

tion has proved applicable to many species and plant

organs including shoots, bulbs, microtubers, corms

and somatic embryos. However, transplanting shoots

in the soil is a major constraint of bioreactor technolo-

gy for mass propagation of plants due to the fact that

most shoots are etiolated and tender and they are

easily damaged by handling or environmental stress.

It is not the case of geophytes because the hard stor-

age organs produced in vitro can be handled for

direct planting in the field; so, these organs are per-

fectly suitable for mass propagation by using bioreac-

tors. Bioreactor techniques for large-scale propaga-

tion of geophytes were described for Lil ium,

Gladiolus, Hyacinth, Hippeastrum and Ornithogalum,

but only a few have found their way to practical appli-

cation. The most advanced techniques for the micro-

propagation of Tulipa, Lil ium, Gladiolus and

Alstroemeria are reviewed in this paper.

Key words: bulb, corm, rhizome, in vitro propaga-

tion, bioreactors, Lil ium, Tulipa, Gladiolus,

Alstroemeria.

Introduzione

Geofite è un termine generico utilizzato per indica-re le piante che superano la stagione sfavorevolemediante organi di riserva sotterranei (bulbi, cormi,rizomi, tuberi e radici tuberose) dotati di germogli oapici (Raunkiær, 1934; De Hertogh e Le Nard, 1993).Le piante geofite rappresentano un gruppo particolareentro le piante superiori originariamente classificatecome Cryptophyta (Raunkiær, 1934).

Le geofite ornamentali, comunemente note comebulbose da fiore, possono essere utilizzate per la pro-duzione industriale di fiori recisi e di piante in vaso oessere impiegate in giardino. Le geofite ornamentalicomprendono più di 800 Generi diversi, 60 dei qualivengono utilizzati commercialmente, anche se inrealtà la produzione industriale è dominata da 7Generi: Tulipa, Lilium, Narcissus, Gladiolus,Hyacinthus, Crocus e Iris (Benschop et al., 2010). Alivello globale, il valore dell’intero settore dei bulbida fiore nel 2005 era stimato in circa 800 milioni dieuro (Buschman, 2005). Quattro geofite ornamentali(Tulipa, Lilium, Alstroemeria e Freesia) sono tra iprimi 10 fiori recisi nelle aste olandesi e rappresenta-no il 19% del volume d’affari di fiori reciso (VanHuylenbroeck, 2010).

Botanicamente si indicano con il termine orticolodi monocotiledoni petaloidi quelle specie di mono-cotiledoni che hanno petali o segmenti di perianzio(tepali) cospicui, appartenenti principalmente allefamiglie Liliaceae, Amaryllidaceae, Iridaceae e

Review n. 16 – Italus Hortus 19 (1), 2012: 65-76

Micropropagazione delle geofite ornamentali

Pablo Marinangeli*

Centro de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS), Consejo Nacional de

Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Departamento de Agronomía, Universidad

Nacional del Sur, Bahía Blanca (Argentina)

Ricezione: 27 dicembre 2011; Accettazione: 17 febbraio 2012

* pamarina@cerzos-conicet.gob.ar

Marinangeli

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Orchidaceae (Brickell et al., 1980). La presentereview riguarda in particolare la micropropagazionedi monocotiledoni petaloidi geofite.

Le specie bulbose ornamentali si propagano vege-tativamente mediante la separazione dei bulbetti pro-dotti naturalmente dal bulbo genitore, oppure indu-cendo differenziazione ascellare o avventizia dalbulbo intero, da parti di bulbo, da foglie o da talee(Hartmann et al., 2011). Queste tecniche di propaga-zione presentano due problemi principali: bassa effi-cienza di propagazione (bassa quantità di propaguliottenuti e tempi lunghi per produrli) e possibilità didiffusione di parassiti. La propagazione in vitro puòcontribuire a superare questi problemi.

Questa review si occupa principalmente di sistemidi micropropagazione di specie geofite basati sull’usodella coltura in vitro di organi sotterranei di sopravvi-venza e termina con la produzione di piccoli bulbi(bulbetti), che sono propaguli naturalmente rustici chepossono essere trasferiti direttamente nel terreno perla coltivazione senza acclimatazione. Viene prestataparticolare attenzione ai sistemi di coltivazione cheutilizzano bioreattori per la micropropagazione com-merciale su larga scala, considerati i notevoli vantaggiin termini di automazione, di propagazione massiva edi diminuzione di manodopera, fattori che contribui-scono a ridurre i costi di produzione.

Coltura in vitro di specie geofite

La coltura in vitro di specie geofite può essere util-mente applicata per una propagazione efficiente dispecie recalcitranti, di nuove selezioni e cultivar, perla produzione di piante in condizioni di sanità control-lata, come strumento per il miglioramento genetico,per ottenere metaboliti utili e per scopi di ricerca(Kim e De Hertogh, 1997).

La produzione di piante in sanità controllata e inparticolare virus esenti è uno degli impieghi piùimportanti riguardanti la coltura in vitro di speciegeofite e risulta determinante per l’applicazione com-merciale di sistemi di micropropagazione ai fini dellamoltiplicazione di materiale risanato. La coltura invitro di apici meristematici con o senza chemioterapiae termoterapia, abbinata ad una micropropagazioneefficiente, è uno strumento essenziale per l’eradica-zione di virus in molte specie geofite e fa parte delsistema di certificazione e classificazione per la pro-duzione del nucleo di propagazione esente da organi-smi patogeni della Organizzazione europea e mediter-ranea per la protezione delle piante (OEPP)(Marinangeli, 2003). Infatti, l’applicazione della cul-tura di apici meristematici per l’eradicazione di virus

e la successiva micropropagazione è riportata con suc-cesso in diversi generi di geofite quali Alstroemeria

(Hakkaart e Versluijs, 1985, 1988; Chiari e Bridgen,2002), Freesia (Bertaccini et al., 1989) Gladiolus

(Logan e Zettler, 1985, Lilien-Kipnis et al., 1992),Hyacinthus (Asjes et al., 1974; Blom-Barnhoorn et

al., 1986), Iris (Allen e Anderson, 1980), Lachenalia

(Klesser e Nel, 1976), Lilium (Marinangeli, 2003),Narcissus (Mowat, 1980; Phillips, 1990),Ornithogalum (Klesser e Nel, 1976; Vcelar et al.,1992) e Polianthes (Wang e Hu, 1980).

Come complemento e contributo al miglioramentogenetico, le tecniche di coltura di tessuti in vitro

hanno consentito l’immissione continua sul mercatodi nuove specie, ibridi e varietà di geofite tradiziona-li, come è il caso di Lilium e Alstroemeria (Lawson,1996). Le biotecnologie associate al miglioramentogenetico delle geofite ornamentali che coinvolgonocoltura di tessuti riguardano: coltura e fusione di pro-toplasti, coltura di callo e cellule, impollinazione invitro, salvataggio di embrioni, produzione di aploidida andro- e gino-genesi, poliploidizzazione e mutage-nesi in vitro, crioconservazione e trasformazionegenetica (Kim e De Hertogh, 1997).

Il miglior esempio di applicazione con successodelle tecniche di coltura di tessuti come strategia disupporto del miglioramento genetico nelle specie bul-bose da fiore è il giglio (Lilium spp.). Negli ultimi 50anni, lo sviluppo e l’applicazione di tecniche innovati-ve di coltura in vitro hanno permesso la continuaespansione e rinnovamento della gamma di ibridi diLilium, consentendo a questa bulbosa di affermarsicome uno dei fiori recisi più importanti del mondo. Letecniche di impollinazione in vitro, di salvataggiodegli embrioni (embryo rescue) e di duplicazione deicromosomi hanno portato alla realizzazione di incrociinterspecifici contribuendo alla spettacolare crescitacommerciale dei moderni ibridi di Lilium (Grassotti eGimelli, 2011; Van Tuyl e Arens, 2011). Un altroesempio riguarda lo sviluppo di nuovi ibridi interspe-cifici di Ornithogalum spp. ottenuti mediante il salva-taggio dell’embrione, con l’obiettivo di migliorare lalunghezza dello scapo floreale ed estendere l’offertadai tradizionali colori bianchi e arancioni a diversegamme di giallo (Griesbach et al., 1993).

La trasformazione genetica non è stata ancorasfruttata commercialmente in specie ornamentali geo-fite, ma può avere un grande potenziale, dovuto prin-cipalmente ai risultati a cui questa tecnologia puòportare per dare una significativa risposta alla costantericerca di novità nella industria dei fiori. Inoltre l’opi-nione pubblica è meno ostile all’adozione di OGMsulle ornamentali rispetto ai prodotti alimentari

Geofite ornamentali

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(Chandler e Lu, 2005; Cohen, 2011). La trasformazio-ne genetica è stata applicata con successo su Lilium

(Cohen, 2011), Tulipa (Wilmink et al., 1992),Gladiolus (Löffler e Van Harmelen, 1998; Kamo eJoung, 2007), Hyacinthus (Popowich et al., 2007) eNarcissus (Sage e Hammatt, 2002). Dopo l’applica-zione di ognuna delle tecniche di miglioramento gene-tico sopra menzionate, l’impiego della micropropaga-zione risulta comunque uno strumento essenziale perla propagazione efficiente della variabilità ottenuta.

Applicazione commerciale delle tecniche di micro-

propagazione

Sistemi efficaci di propagazione commerciale,compresa la propagazione in vitro, hanno bisogno diessere ulteriormente sviluppati nel caso di molte spe-cie geofite. La propagazione in vitro rimane infatticostosa, è fortemente legata al costo del lavoro edancora non è diventata una soluzione definitiva a tuttii problemi. Il costo della propagazione in vitro

aumenta con lo sviluppo dell’economia nei paesi invia di sviluppo e pertanto, senza la messa a punto ditecniche più efficienti di propagazione, il florovivai-smo è costretto a produrre materiale di propagazionenei paesi con costo di manodopera sempre più basso(Benschop et al., 2010). L’investimento economico inimpianti, macchinari e lavoro manuale nelle colture invitro hanno determinato un notevole aumento deicosti: tra queste voci quella più rilevante è la manodo-pera, particolarmente utilizzata nella fase di radicazio-ne quando i germogli neoprodotti vengono separati(Han et al., 2004).

Sono state descritte molte tecniche di micropropa-gazione riguardanti bulbose da fiore, ma solo pochehanno trovato applicazione commerciale. Una serie diragioni può spiegare questa discrepanza: la letteraturaè spesso molto frammentaria anche su un argomentocome la micropropagazione; il trasferimento di tecno-logia ha bisogno di tempo; nella maggior parte deicasi la tecnologia costa troppo; in alcuni casi le poten-zialità delle tecniche vengono ignorate ed in altri, infi-ne, le tecniche sono troppo complicate (Van derLinde, 1992).

Sistemi di moltiplicazione naturale delle specie

geofite, a confronto con la micropropagazione

Le tecniche di propagazione asessuale per speciegeofite utilizzano sistemi naturali o sistemi sviluppatiartificialmente (Benschop et al., 2010) (tab. 1). Ilbulbo, dal punto di vista botanico è un fusto meta-morfosato, ovvero costituito dal disco basale, da una

gemma nel suo centro geometrico, circondata da tuni-che, ovvero strati di foglie carnose nella parte basale.I bulbi vengono classificati come “tunicati” o “nontunicati” (squamosi). I bulbi tunicati hanno le basicarnose di foglie disposte in strati concentrici attornoal punto in crescita e lo strato esterno di foglie seccheforma una tunica di protezione che copre il bulbo.Esempi di bulbi tunicati ornamentali sono il giacinto,gli amarilli, i tulipani ed i narcisi. Nei bulbi non tuni-cati o squamosi le basi ingrossate delle foglie sisovrappongono e conferiscono al bulbo un aspettosquamoso, o embricato. Bulbi squamosi, come i gigli,non hanno la tunica di protezione (Swift, 2009).

La moltiplicazione vegetativa dei bulbi tunicatipuò essere effettuata tramite bulbetti, piccoli bulbi chesi sviluppano naturalmente alla base del bulbo genito-re, o ricorrendo a tecniche artificiali in vivo qualiscooping, star cutting, scoring, chipping e twin sca-

ling. L’impiego di queste tecniche è finalizzato adindurre la formazione di bulbetti eliminando la domi-nanza apicale ed attivando la formazione di germogliascellari ed avventizi alla base delle foglie/scaglie uti-lizzando le sostanze di riserva accumulate al suointerno per sostenere lo sviluppo ulteriore del bulbo.

Lo scaling, o propagazione per scaglie o squama-tura, è un metodo comunemente utilizzato per propa-gare bulbi non tunicati, quali quelli del Lilium, e con-siste nel rimuovere le scaglie vicino al disco basaleper indurre bulbi avventizi che si svilupperanno daltessuto cicatriziale alla base delle scaglie stesse(Swift, 2009).

La coltura in vitro sfrutta la capacità delle piantebulbose di produrre germogli e/o micro-bulbi diretta-mente dall’organo di riserva, evitando la variabilitàsomaclonale. In effetti, la propagazione in vitro dellebulbose induce la formazione avventizia di piante daitessuti asportati (ad esempio scaglie da bulbo, porzio-ni di fusto, disco o gemme), senza il rischio di ottene-re piantine diverse da quelle del donatore di espianti ocomunque una variabilità superiore a quella ottenutamediante tecniche di propagazione classiche(Debergh et al. 1990; Capellades Queralt et al. 1993).

Micropropagazione delle specie geofite

La velocità di propagazione per via naturale omediante tecniche in vitro di molte specie geofite èrelativamente bassa. Questo spesso ostacola la diffu-sione commerciale di piante virus esenti, di nuovevarietà e di cultivar di valore. Per esempio, utilizzan-do le procedure di propagazione vegetativa, ci voglio-no circa 10 anni per produrre abbastanza cormi di gla-diolo di una nuova cultivar per uso commerciale,

Marinangeli

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mentre utilizzando la micropropagazione sono richie-sti solo 2 anni (Kim e De Hertogh, 1997). Allo stessomodo, mediante micropropagazione possono essereprodotti in un anno circa 2.500 bulbetti di tulipano e1.000 bulbetti di narciso a partire da un espianto.

La micropropagazione può essere utilizzata nonsolo per la rapida moltiplicazione massiva di materia-le di elevata qualità genetica e sanitaria, ma anche perla manutenzione di materiale di élite, per il ringiova-nimento di cultivar, per la fornitura di piantine duran-te tutto l’anno, per facilitare lo scambio di materialevegetale e per la produzione di biomassa per l’estra-zione di prodotti di interesse.

Bulbi, cormi e altri organi di riserva sotterraneivengono comunemente utilizzati come materiale dipartenza per l’ottenimento di espianti per la coltura invitro delle geofite.

La micropropagazione, tradizionalmente, com-prende cinque fasi:

selezione e preparazione delle piante donatrici,•scelta del propagulo e sua disinfezione, prelievo•dell’espianto e messa in coltura,proliferazione degli espianti,•radicazione degli espianti,•acclimatazione o indurimento delle piantine.•

Le procedure per la propagazione in vitro di talipiante differiscono leggermente tra le diverse specie.Molte volte una fase di induzione del bulbo è necessa-ria dopo la proliferazione di germogli, mentre uno sta-dio di radicazione generalmente non è necessario(Ulrich et al., 1999) (fig. 1). Poiché i bulbetti prodottiin vitro sono dormienti, è necessario procedere allarottura della dormienza.

Secondo uno studio condotto da Zaidi et al.(2000), su 29 specie di geofite ornamentali coltivate

in vitro, il substrato di coltura maggiormente utilizza-to è MS (68,4%) (Murashige e Skoog, 1962), seguitoda B5 (10,5 %) (Gamboerg et al., 1968) e in misuraminore da LS (Linsmaier e Skoog, 1965), Nitsch(Nitsch e Nitsch, 1956) e Nel (Nel, 1983). Lo stessostudio ha rilevato che i regolatori di crescita più utiliz-zati per l’organogenesi diretta sono l’acido 1-naftale-nacetico (NAA) (63,1%) nella concentrazione 0,25-3,00 mg l-1 e 6-benzilamminopurina (BAP) (73,6%) inconcentrazione di 0,1-30,0 mg l-1, utilizzati in combi-nazione nel 31,5% dei casi.

Gli espianti che vengono prevalentemente utilizza-ti per organogenesi diretta provengono da organi sot-terranei (76%), dei quali 33% meristemi apicali edascellari, 29% scaglie del bulbo o basi ingrossate difoglie ed il 14% bulbetti o cormi interi. Sono state uti-lizzate anche parti aeree quali meristemi ascellari eapicali (10%) ed organi fiorali (14%). In contrasto,per embriogenesi somatica nel 53% dei casi vengonoutilizzati espianti della parte aerea (Zaidi et al., 2000).

Problematiche legate a inquinamento, disinfezione e

messa in coltura

Poiché molti degli organi donatori di espianti sonosotterranei, ovvero provengono dal suolo, spessohanno un’alta carica di microrganismi, nematodi,acari ed insetti di piccole dimensioni, responsabilidella pesante contaminazione che compare di solitonelle fasi iniziali della coltura in vitro (Leifert eCassells, 2001). La contaminazione può essere ridottacon manipolazione specifiche e trattamenti alle piantedonatrici prima di coltivare gli espianti in vitro, comela coltivazione dei bulbi con ridotta umidità del terre-no, l’impiego di sistemi di irrigazione con ridottabagnatura del fogliame, la coltivazione in substrati

Sistemi dipropagazione Tipi di propagazione Generi

Naturale

Bulbetti, minicormi e kralen Bulbo madre perenneRizoma

Tulipa, Freesia e GladiolusHyacinths e HippeastrumIris rizomatose e Convallaria

Bulbillo di fustoBulbetto di scagliaBulbetto sotteraneo Talea di foglia

LiliumLiliumLilium e TulipaLachenalia

Artificiale

Talea di bulboScooping e scoring di bulboChipping e twin-scaling di bulboTalea di fogliaTalea di radice tuberosaBulbillo di pianta forzata Coltura in vitro

LiliumHyacinthusNarcissus e HippeastrumLachenaliaDahlia Tulipa Lilium

Tab. 1 - Sistemi di propagazione asessuata per alcune geofite ornamentali (modificata da Benschop et al., 2010).Tab. 1 - Systems for asexual propagation of some ornamental geophytes (modified from Benschop et al., 2010).

Geofite ornamentali

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artificiali e l’applicazione di trattamenti fisici e chimi-ci per combattere gli organismi contaminanti (Kim eDe Hertogh, 1997).

Una valida alternativa per evitare gli inquinamentilegati alla utilizzazione di organi a diretto contattocon il suolo è l’impiego di organi aerei. A questoriguardo l’utilizzazione del peduncolo dell’infiore-scenza è una adeguata alternativa ai fini della ridu-zione di questo tipo di contaminazione. Espianti delleinfiorescenze di Allium, Dichelostemma, Eucrosia,

Gladiolus, Haemanthus, Hyacinthus, Narcissus,Nerine e Ornithogalum sono stati utilizzati per lamessa in coltura. Il potenziale di rigenerazione del-l’infiorescenza è paragonabile alla rigenerazione datwin scales da bulbi e da gemme apicali isolate dacormi (Ziv e Lilien-Kipnis, 2000).

Un altro problema legato alle fasi iniziali della col-tura in vitro è la mancanza di risposta di alcuniespianti a causa di fattori genetici, morfologici e fisio-logici. Per le specie geofite ornamentali la causa piùcomune della mancanza di risposta è la dormienzadelle gemme degli organi di riserva. Per superare que-sto tipo di difficoltà i bulbi vengono spesso sottopostia trattamenti fisici come temperatura o luce, o tratta-menti ormonali come l’applicazione di citochinine egibberelline (Kim e De Hertogh, 1997). Un ulterioreproblema frequente durante la messa in coltura èl’ossidazione e la morte dei tessuti prima della diffe-renziazione. Per superare questa difficoltà, gli espianti

vengono trattati con antiossidanti prima della messain coltura o durante le fasi iniziali della coltura in

vitro (Debergh e Read, 1991).

Messa in coltura e proliferazione in vitroNegli schemi di micropropagazione per organoge-

nesi diretta delle specie geofite, per la messa in coltu-ra vengono prevalentemente utilizzati espianti degliorgani sotterranei di riserva. Di solito, viene effettuatala disinfezione, tutta o in parte, dell’organo che poiviene usato per ottenere l’espianto (Marinangeli,2003). Poiché gli organi di riserva delle piante geofitesono dotati di buona rusticità e ben protetti, la disinfe-zione può essere eseguita con concentrazioni più ele-vate di disinfettanti e per un tempo più lungo(Marinangeli, 1997). Zephyranthes grandiflora è statomicropropagata dopo il controllo della contaminazio-ne microbica dei bulbi: un pre-trattamento con 0,2%Bavistin e 0,1% Pantomycin per 4 ore prima della ste-rilizzazione finale con 0,1% di cloruro di mercurio per30s, è stato necessario per eliminare la contaminazio-ne (Gangopadhyay et al., 2010).

Il tipo di espianto da utilizzare dipende dallo scopoprefissato: se si vuole ottenere un risanamento davirus, viene realizzata una coltura di apici meristema-tici estratti direttamente dalle gemme apicali o ascel-lari da organi sotterranei. Inoltre, il meristema apicalepuò essere ottenuto anche da germogli e bulbetti otte-nuti in vitro. Se l’obiettivo è la moltiplicazione, gli

Fig. 1 - Ciclo di micropropagazione di Lilium spp. in condizioni di oscurità (Marinangeli, 2003; parzialmente modificato).Fig. 1 - Cycle of micropropagation of Lilium spp. in dark conditions (Marinangeli, 2003; partially modified).

Marinangeli

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espianti che vengono utilizzati variano a seconda deltipo di organo di riserva tipico della specie e il mododi propagazione asessuale naturale o commercialedella specie stessa. Ad esempio, i bulbi tunicati comeNarcissus, Hippeastrum ed altre Amaryllidaceae ven-gono propagate da “doppia scaglia” (twin scales),rappresentate da una porzione di due scaglie unite traloro da una piccola porzione del disco basale.

La moltiplicazione dei germogli può essere otte-nuta da:

organogenesi diretta, cioè mediante la prolifera-•zione ascellare o avventizia dei germogli,organogenesi indiretta da callo,•embriogenesi somatica.•

I sistemi di moltiplicazione influenzano sia la sta-bilità genetica che la velocità di moltiplicazione. Laorganogenesi diretta è preferibile ed alti tassi di proli-ferazione di solito si ottengono aggiungendo citochini-ne o ritardanti di crescita al substrato di coltura (Ulrichet al., 1999); possono essere utili anche auxine a basseconcentrazioni. Lilium longiflorum è stato moltiplicatoin modo efficiente da cluster di germogli in substratoMS con 30 g l-1 saccarosio, 0,5 mg l-1 BAP e 0,5 mg l-1

acido indolacetico (IAA), con esposizione alla luce(Han et al., 2004). Cluster di germogli proliferati ven-gono separati e sub-coltivati nello stesso substrato peravviare altri cluster e il processo può continuare inde-finitamente. Alla fine, i cluster possono essere radicatio indotti a formare bulbi in vitro. Subculture sono statieseguite ogni 4 o 8 settimane e ciascuna subcolturapuò moltiplicarsi tra 5 e 10 volte in ogni sottocultura(Kim e De Hertogh, 1997).

Produzione di bulbi in vitro La produzione di micro-bulbi da germogli diffe-

renziati in vitro è vantaggiosa perché evita la fase diradicazione in vitro e quella di acclimatazione, facili-tando la manipolazione dei propaguli, aumentando iltasso di sopravvivenza ex vitro e accorciando i tempidi produzione dei bulbi (Marinangeli e Curvetto,1997). Le condizioni per stimolare la produzione dibulbi in vitro sono alta concentrazione di saccarosio ealte temperature (Jásik e de Klerk, 2006). Altri fattori,da soli o in combinazione, che sono stati riportaticome stimolanti della la produzione di bulbi in vitro

sono la cultura con o senza luce, l’aggiunta di carboneattivo al substrato e l’uso di ritardanti di crescita. Lacoltivazione in presenza di luce fluorescente o LEDrosso + blu, 70 mmol m-2 s-1 di densità del flusso difotoni fotosintetici (PPFD, photosynthetic photon flux

density) ha aumentato numero, diametro e biomassadei bulbetti e numero e biomassa delle radici inLilium Orientale cv Pesaro (Lian et al., 2002). La col-

tivazione in presenza di luce di L. longiflorum non hamigliorato il tasso di rigenerazione di microbulbi,come viceversa è avvenuto con l’aggiunta di carboneattivo nel substrato MS ad elevata concentrazione disaccarosio (Han et al., 2004). L’uso dei ritardanti dicrescita Alar, Cycocel e Paclobutrazol nella concen-trazione 1 mg l-1 stimolano lo sviluppo di bulbetti inLilium. Il numero di bulbetti risulta superiore quandole scaglie di bulbo vengono coltivate nel substrato con90 g l-1 di saccarosio e vengono esposte a luce conti-nua invece che al buio (Kumar et al., 2005)

Di solito i bulbetti rigenerati in vitro sono dor-mienti e devono essere sottoposti a un trattamento afreddo al fine di rompere la dormienza. Shin et al.(2002) hanno constatato che 4-9 settimane di tratta-mento a freddo a 4 °C sono necessarie per superare ladormienza per molte cultivars di Lilium. Il trattamentocon 10 mg l-1 gibberelline per 24 ore ha ottenuto lostesso risultato in L. speciosum ‘Star Gazer’ e ‘SnowQueen’ (Langens-Gerrits et al., 2001). Durante il trat-tamento a freddo dei bulbetti rigenerati in vitro, glienzimi che degradano amido, α- e β-amilasi mostranoalta attività e il saccarosio diventa il carboidrato solu-bile dominante, con glucosio e fruttosio presenti inconcentrazioni significativamente più basse. La con-servazione a T=2-5 °C per un periodo variabile da 30a 100 giorni è stata usata per rompere la dormienza dimicobulbi di Iris hollandica, Lilium e Narcissus e dimicrocormi di Ixia e Galdiolus (Kim e De Hertogh,1997). Una volta rotta la dormienza, i microbulbi pos-sono essere trapiantati ex vitro con successo senzaacclimatazione, se le condizioni ambientali sono favo-revoli (Marinangeli e Curvetto, 1998) (fig. 1).

Uso del bioreattore per colture su larga scala

L’uso di bioreattore per la micropropagazione èstato la prima volta riportato nel 1981 per la propaga-zione di Begonia e si è dimostrato applicabile a moltespecie e organi vegetali, compresi germogli, bulbi,microtuberi, cormi ed embrioni somatici (Peak et al.,2001). Recentemente, i bioreattori hanno cominciato aessere utilizzati per la micropropagazione commercia-le, in virtù delle possibilità di automazione, propaga-zione su larga scala e diminuzione del ricorso a mano-dopera, tutti fattori che riducono i costi di produzione(Peak et al., 2005).

Vari tipologie di bioreattori sono state sviluppateper una vasta gamma di specie, tipi di coltura e fasi dimicropropagazione. Funzionalmente, i bioreattori percoltura di piante possono essere suddivisi in due gran-di categorie: quelli in cui le colture vengono continua-mente sommerse, utilizzati per la fase di moltiplica-

Geofite ornamentali

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zione in colture in cui l’immersione non si traduca insviluppo vegetale anomalo (hyperhydricity, foglie egermogli malformati, embrioni anomali e embriogen-esi ricorrenti), e quelli in cui le culture sono immerseparzialmente o temporaneamente nel substrato (ebb &

flood), di costruzione e funzionamento più complessi,ma che producono piante di migliore qualità. .

In linea generale, i tipi full immersion sono miglio-ri per cellule, embrioni e colture di hairy roots (radicipelose), mentre i tipi ad immersione parziale vengonoutilizzati per la conversione degli embrioni somatici aplantule, per lo sviluppo dei germogli, per la micro-propagazione e per la crescita di piantine (Adelberg eFari, 2010). Comunque, i bioreattori sommersi vengo-no utilizzati anche per lo sviluppo di protocormi,bulbi e cormi (Takayma et al., 1991).

Secondo Peak et al. (2005), la principale limita-zione della tecnologia del bioreattore per la propaga-zione di piante è la fase di trapianto dei germogli nelterreno; in tale fase infatti questi possono esserefacilmente danneggiati con la manipolazione o sesottoposti a stress ambientale perché sono eziolati esucculenti. Non è il caso delle geofite perché gliorgani di riserva prodotti in vitro possono esseretranquillamente manipolati per la messa a dimoradiretta in campo senza subire danni. Perciò questiorgani sono perfettamente adatti per la propagazionedi massa utilizzando bioreattori.

Tecniche di coltivazione in bioreattore per la pro-pagazione su larga scala di geofite sono stati descrittiper Lilium, Gladiolus, Hyacinthus, Hippeastrum eOrnithogalum (Ziv, 2000; Takayama e Akita, 2005).

Un processo in quattro fasi per la micropropaga-zione di Lilium in bioreattori è stato riportato e bre-vettato da Takayama et al. (1991). Recentemente èstata sviluppata una procedura più efficiente, in soledue fasi, per la produzione di bulbetti di Lilium in bio-reattore (Peak et al., 2005). Nella prima fase i bulbettisono indotti dalle scaglie da bulbo con un bioreattoread immersione temporanea con 4 cicli di immersioneal giorno di 15 minuti ciascuno. Le scaglie vengonocoltivate nel substrato MS con aggiunta di 0,3 mg l-1

NAA, 1 mg l-1 BAP e 30 g l-1 saccarosio, a T=25 °Calla luce (Lian et al., 2003a). Sebbene la percentualedi formazione di bulbetti sia più bassa in bioreattoread immersione temporanea rispetto alle colture insubstrato semisolido, sono stati raccolti un grannumero di bulbetti da ogni coltura. Questa coltura dibulbetti in bioreattori (immersione temporanea) ridu-ce le manipolazioni necessarie rispetto alla moltipli-cazione in substrato semisolido e facilita lo scaling-up

della produzione di bulbetti (Lian et al., 2003a). Laseconda fase riguarda la crescita e si attua utilizzando

bioreattori a immersione continua. Lian et al. (2003b) hanno studiato l’effetto del tipo

di bioreattore, del rinnovo del substrato di coltura edel tipo e concentrazione di zuccheri sulla crescita dimicrobulbi di Lilium Orientale cv Casablanca, in sub-strato MS senza regolatori a T=25 °C, al buio. Gliautori hanno trovato che la crescita è stata maggiorequando gli espianti sono stati coltivati in un bioreatto-re ad immersione permanente rispetto al sistema adimmersione temporanea. Inoltre hanno trovato che lacrescita è stata più elevata con il rinnovo mensile delsubstrato di coltura con 90 g l-1 di saccarosio rispettoad altre fonti e concentrazioni di zuccheri.L’assorbimento dei minerali ha subito variazioni siain quantità che in selettività. Durante la crescita deibulbetti, è stato verificato l’esaurimento rapido diNH4

+, NO3-, SO4

2- e H2PO4- mentre il consumo di K+,

Mg2+, Ca2+, Na+ e Cl- è stato lento. E’ stata osservataanche una rapida riduzione del pH del mezzo dopol’aggiunta, o cambio, di substrato fresco durante lacrescita dei bulbetti (Peak et al., 2005).

Ziv et al. (2000) hanno osservato una abbondanteproliferazione da cluster di germogli in cormi di gla-diolo in bioreattori aggiungendo ancymidol, paclobu-trazol o uniconazole al substrato. I cluster meristema-tici vengono separati meccanicamente e produconomicrocormi che possono essere trapiantati ex vitro

senza precedenti acclimatazioni. Il metodo consistein due fasi: la prima di crescita di germogli con 10 g l-

1 di saccarosio, e la seconda di differenziazione dimicrocormi, aumentando la concentrazione di sacca-rosio a 90 g l-1. Ciò ha permesso la produzione dicirca 300 piccoli cormi in un bioreattore di 1 l(Takayama e Akita, 2005).

La micropropagazione di Hippeastrum spp. è statalimitata principalmente dal basso tasso di moltiplica-zione. Questa limitazione è stata superata dalla colturadi bulbetti parzialmente sezionati e posti in bioreattoricon substrato MS con 30 g l-1 saccarosio alla luce per 4mesi. Dopo un anno di coltura possono essere ottenutebulbi di 2 cm di diametro (Takayama e Akita, 2005).

Casi di studio

Micropropagazione di bulbi tunicati e non tunicati

(squamosi)

Tulipano (fig. 2). Un metodo di micropropagazio-ne del tulipano tramite la moltiplicazione ciclica digermogli è stato sviluppato per accelerare il migliora-mento e per la produzione di stock di piante virusesenti (Podwyszyńska, 2001). Nei protocolli standarddi micropropagazione, i microbulbi sono stati svilup-pati dai germogli formati negli espianti iniziali isolati

Marinangeli

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dal peduncolo fiorale (Rice et al., 1983; Le Nard et

al., 1987; Hulsher et al., 1992) o di germogli ascellaridi scaglie da bulbo (Nishiuchi, 1980; Hulscher eKrijksheld, 1995). Il microgermogli sono indotti emoltiplicati su substrato MS con 1 mg l-1 NAA e BAP(Taeb e Alderson, 1990) e thidiazuron (TDZ)(Podwyszyńska e Marasek, 2003) con un fotoperiododi 16 ore a T=15 °C (Minas, 2007). Gli espianti piùefficaci per la rigenerazione dei microgermogli sonosezioni di peduncolo fiorale di 1-2 mm presi dallabase all’interno del bulbo e dopo un breve periodo diconservazione (Taeb e Alderson, 1990). La formazio-ne del bulbo è un passo essenziale nella coltura in

vitro di tulipano perché solo i microbulbi possonoradicare e crescere in campo. Per indurre la produzio-ne di bulbetti in vitro, i germogli devono essere colti-vati per 8-16 settimane sullo stesso substrato prima diessere trasferiti su un substrato adatto alla produzionedi bulbetti (Taeb e Alderson, 1990). Inoltre, se questacoltura è fatta in substrato liquido con l’aggiunta diNAA (2 mg l-1) o di inibitori della biosintesi di gibbe-relline come ancymidol e paclobutrazol (1-2 mg l-1), èpossibile raggiungere livelli massimi di produzione dibulbetti in vitro (Podwyszyńska, 2006). Per l’induzio-ne di tale produzione è necessario un trattamento afreddo (5 °C) per 10-12 settimane e l’aggiunta di sub-strato senza citochinine contenenti alte concentrazionidi saccarosio (6-7%). Le colture sono state effettuatea T=23 °C con un fotoperiodo di 16 h (55 μmol m-2 s-1

di densità del flusso di fotoni fotosintetici)(Podwyszyńska, 2006). È anche noto che i livelliendogeni di auxine e citochinine e il loro equilibriodurante la fase di induzione (prima del trattamento afreddo) svolgono un ruolo importante nella prepara-zione dei germogli di tulipano nella formazione invitro dei bulbi. I microbulbi devono essere essiccati econservati a temperatura ambiente per 5 settimane

prima di essere messi a dimora nel terreno(Podwyszyńska, 2001).

Lilium (fig. 3). La micropropagazione da organo-genesi diretta di bulbetti e germogli è stata fatta dascaglie di bulbo, foglie, apice di fusto e bulbo, ovari,stili, filamenti, antere, peduncoli ed embrioni. È statoanche possibile micropropagare da embriogenesisomatica ed organogenesi indiretta da callo provenien-te da apici di gambo, scaglie, stami e semi (Kim e DeHertogh, 1997). La maggior parte degli studi riguardala rigenerazione di bulbetti da scaglie, che è ormai ilmetodo utilizzato commercialmente per la moltiplica-zione vegetativa di Lilium (Peak et al., 2005). Oltre alprotocollo precedentemente descritto, Varshney et al.(2000) hanno proposto uno schema semplice, rapidoed economico per la moltiplicazione massiva in vitro

di ibridi di Lilium utilizzando coltura liquida staziona-ria. Una media di sette bulbetti si sono formati dopo lacoltivazione di segmenti di scaglie di 1×1 cm2 per 17giorni in substrato MS con 30 g l-1 saccarosio e 0,1mgl-1 NAA. Un gran numero di bulbetti di maggioridimensioni (3,5-5,0 cm di circonferenza) si sono for-mati, a seconda della cultivar, su substrato MS conte-nente 0,1 mg l-1 NAA e 60 o 90 g l-1 saccarosio con unfotoperiodo di 16/8 h. Un sistema continuo di propa-gazione massale di bulbetti è stato ottenuto attraversola formazione in vitro di bulbetti da microscaglia(espianto secondario) in coltivazione liquida staziona-ria su substrato MS addizionato con 5 mg l-1 di chine-tina e 0,1 mg l-1 di NAA. Al momento del trapiantotutti i bulbetti sono germogliati ed il 40% di questisono fioriti nel primo anno. Secondo gli autori, circa9.68×105 bulbetti possono essere prodotti da un singo-lo segmento di scala in un anno.

Fig. 2 - Fiori di tulipano.Fig. 2 - Tulip flowers.

Fig. 3 - Fiori di lilium.Fig. 3 - Lily flowers.

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Geofite ornamentali

Micropropagazione di cormi

Gladiolo. Ci sono numerosi studi di micropropaga-zione delle specie e cultivar di gladiolo sulla base diapice e gemme ascellari di cormi e piccoli cormi (Zivet al., 1970; Simonsen e Hildebrandt, 1971; Wilfret,1971; Hussey, 1977; Logan e Zettler, 1985; De Bruyne Ferreira, 1992). Il gladiolo è stato micropropagatoanche partendo da cormo, apici di stoloni, foglie,peduncolo fiorale e perianzio (Kim e De Hertogh,1997). Logan e Zettler (1985) sono riusciti a risanaredal Virus del mosaico del cetriolo (CMV) e dal Virusdel mosaico giallo del fagiolo (BYMV), ed a micro-propagare in modo efficiente 23 cultivar di gladioloutilizzando un “sistema trifase”. La prima fase è lacoltivazione dell’apice del germoglio del cormo susubstrato MS con l’aggiunta di 1 mg l-1 di chinetina e0,1 mg l-1 NAA, coltivati a T= 25 °C, con un fotope-riodo di 16 ore (27 μmol m-2 s-1 di densità del flusso difotoni fotosintetici). La seconda fase si svolge nellestesse condizioni di coltura in substrato senza NAA ela fase di radicazione è fatta utilizzando un substratocontenente la metà della concentrazione salina delsubstrato MS liquido, con vermiculite come supportoe l’aggiunta di 1 mg l-1 NAA e 5 g l-1 di carbone attivocon il doppio dell’energia luminosa. De Bruyn eFerreira (1992) hanno micropropagato Gladiolus tri-

stis utilizzando un sistema a due fasi: nella prima fasesi ha la proliferazione di germogli, coltivando sezionidi cormo con gemme ascellari su substrato MS con 1mg l-1 BAP e 90 g l-1 saccarosio a T= 15 °C; nellaseconda fase viene indotta la formazione di microcor-mi nelle stesse condizioni, ma senza l’aggiunta diBAP e con 60 gl-1 saccarosio nel substrato. La micro-propagazione tramite embriogenesi somatica in diver-se cultivar gladiolo è risultata altamente efficente(Stefaniak, 1994) coltivando sezioni di cormo di 2mm su di un substrato MS con 2 mg l-1 di acido 2,4diclorofenossiacetico (2,4-D) a T= 23 °C, al buionella fase di induzione del callo ed alla luce (40 molm-2 s-1 di densità del flusso di fotoni fotosintetici) nellafase di formazione di embrioni. La germinazionedegli embrioni somatici è stata effettuata su substratoMS senza regolatori di crescita, mentre la prolifera-zione e la radicazione sono state eseguite seguendo lefasi II e III di Logan e Zettler (1985). I microgermoglisono stati trasferiti con successo ex vitro senza forma-zione dei bulbetti.

Micropropagazione di rizomi

Alstroemeria (fig. 4). La micropropagazione inAlstroemeria è necessaria perché molti degli ibridisono sterili, la moltiplicazione asessuata convenziona-le è lenta ed il Virus del mosaico della Alstroemeria

(AlMV) è trasmesso via seme. Gli espianti nell’orga-nogenesi diretta sono costituiti da scapo fiorale,foglie, apici di rizomi e fusti e pezzi di rizomi. Lamicropropagazione è stata anche conseguita attraver-so organogenesi indiretta ed embriogenesi somatica(Kim e De Hertogh, 1997). L’Alstroemeria è statarisanata di AlMV e micropropagata con successo daapici meristematici da gemme ascellari di rizomi, col-tivati a T=18 °C, con un fotoperiodo di 16 ore di luce(50 mol m-2 s-1 di densità del flusso di fotoni fotosinte-tici) nel substrato MS contenente 2 mg l-1 BAP e 30 gl-1 saccarosio (Chiari e Bridgen, 2002). In queste con-dizioni gli espianti producono germogli e in successi-ve subculture sviluppano rizomi. Germogli con rizomivengono trasferiti nello stesso substrato addizionatocon 0,2 mg l-1 NAA per la radicazione e quindi trasfe-riti per l’acclimatazione ex vitro. Dopo 4 mesi di col-tivazione in serra, si verifica la fioritura (Chiari eBridgen, 2002). Un’altra tecnica di micropropagazio-ne efficiente utilizza le foglie giovani con una porzio-ne del nodo di fusto come espianto. Viene utilizzatauna procedura di rigenerazione in due fasi: gli espian-ti di foglie vengono incubati per 10 giorni in substratodi induzione (MS, 2 mg l-1 TDZ, 0,1 mg l-1 acidoindolbutirico, e 30 g l-1 saccarosio) e poi trasferiti sulsubstrato di proliferazione di germogli (MS, 0,5 mg l-1

BAP, e 30 g l-1 saccarosio). Tutte le culture sono incu-bate a T=18 °C, al buio (Lin et al., 1998). Una combi-nazione di micropropagazione di rizomi e di foglie

Fig. 4 - Fiori di alstroemeria.Fig. 4 - Alstroemeria flowers.

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Marinangeli

dei germogli generati in vitro da questi rizomi,aumenta significativamente l’efficienza del processo(Lin el al., 2000).

Prospettive future

Di tutti i generi qui riportati, Lilium è stato il piùstudiato e, dal punto di vista commerciale, quellomaggiormente propagato in vitro. Ulteriori approfon-dimenti sono necessari sulle altre bulbose ornamentaliper estendere l’applicazione della micropropagazionefino al livello commerciale. Tuttavia in alcune specie,in cui sono state incontrate difficoltà, è ancora neces-saria la messa a punto e l’ottimizzazione dei protocol-li di coltura in vitro. La micropropagazione, giàimpiegata nella produzione di micropiante e propaguliquali cormi, rizomi e bulbi, vedrà accrescere la suaimportanza nei prossimi anni.

Per quanto riguarda i sistemi di rigenerazione in

vitro, l’organogenesi diretta resta la forma preferita acausa del basso rischio di variazione genetica nei pro-paguli, tuttavia l’embriogenesi somatica mostra gran-di potenzialità se si riescono a mettere a punto tecni-che di rigenerazione efficienti.

I sistemi di micropropagazione che utilizzano bio-reattori verranno imposti sempre più dall’economiadel mercato, perché consentono minori costi di pro-duzione per processi produttivi su larga scala. Alcontrario, sarà necessario utilizzare tecniche tradizio-nali per la messa in coltura e per il risanamento dicampioni infetti.

In conclusione, la micropropagazione rimarrà unpotente strumento in mano agli operatori del settoredelle bulbose ornamentali, che può integrarsi conaltre biotecnologie come la crioconservazione e l’in-gegneria genetica.

Riassunto

Le geofite ornamentali sono piante dotate di organidi riserva sotterranei che sopravvivono alla stagionesfavorevole e che vengono coltivate ed utilizzate perle loro caratteristiche estetiche. Di solito, i metodi tra-dizionali di propagazione delle specie geofite hannouna bassa efficienza e possono essere una via di tra-smissione per alcune malattie. La propagazione in

vitro può superare questi problemi. In questo lavorovengono descritti sistemi di propagazione di speciegeofite basati sull’impiego della coltura in vitro diorgani sotterranei di sopravvivenza, che si realizzacon la produzione di bulbetti ovvero propaguli natu-ralmente rustici che possono essere trasferiti diretta-mente in coltivazione a terra senza un periodo di

acclimatazione. Particolare attenzione viene riservataai sistemi di coltivazione che utilizzano bioreattori perla micropropagazione commerciale su larga scala.

Parole chiave: bulbo, cormo, rizoma, propagazionein vitro, bioreattori, Lilium, Tulipa, Gladiolus,

Alstroemeria.

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