MICROSCOPIA

El ser humano posee el sentido de la vista desarrollado. Sin embargo, no se pueden ver a simple vista cosas que midan menos de una décima de milímetro. Y muchos de los avances en química, biología y medicina no se hubieran logrado si antes no se hubiera inventado el microscopio.

El microscopio (de micro-, μικρο, pequeño, y scopio, σκοπεω, observar) es un instrumento que se utiliza para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los mismos.

1-¿Cómo se utiliza el microscopio?

El objeto que se quiere observar se coloca en un vidrio transparente que llamamos portaobjetos, y lo cubrimos con otro vidrio más fino que llamamos cubreobjetos.

Una vez conocido el funcionamiento de las partes del microscopio se tiene que saber que el aumento que nos ofrece un microscopio se obtiene con la combinación del objetivo y del ocular. Por ejemplo, si tenemos un ocular de 15x y un objetivo de 40, el aumento obtenido es de:

40 x 15 = 600 aumentos.

Primero se tiene que optar una buena posición, se enciede la fuente de iluminación del microscopio luego se coloca la muestra en la platina del microscopio asegurándonos que enfocamos con el objetivo menor el cual NOS DA UNA VISION PANORAMICA DE LA MUESTRA. El enfoque de la muestra se realiza con el tornillo macrométrico, y después se afina con el tornillo micrométrico, hasta conseguir una visión perfecta. Una vez enfocado la muestra, cada vez que se cambie de objetivo se debe tener cuidado de no tocar la preparación, el vidrio se puede romper.

La luminosidad para observar la muestra se regular moviendo el diafragma hasta conseguir la más adecuada para cada caso.

Como unidad de medida , en microscopia se utiliza la micra (µ). Su equivalencia es:

1µ = 1/1000 mm ; por tanto, 1 mm = 1000 µ

¿Cómo se prepara una observación microscópica? Los pasos para la preparación del tejido son los siguientes:

1. El primer paso es la FIJACION de la muestra que se va a estudiar, es un proceso para conservar la estructura del tejido mediante la utilización de componentes químicos. El fijador mas común es la formalina que consiste en una solución acuosa de formaldehído al 37% en combinación con otras sustancias químicas y amortiguadoras. Con esto se impide la degradación de la muestra y la destrucción de los organismos patógenos que hay en esta.

2. El segundo paso es la DESHIDRATACION, luego de la fijación la muestra se lava (se deshidrata) en una serie de soluciones alcohólicas, esto para eliminar el agua que se encuentra presente en la muestra.

3. El siguiente paso es el ACLARADO donde se extrae el alcohol de la muestra que se utilizo para deshidratarla, esto se realiza utilizando solventes orgánicos como tolueno o xileno.

4. El cuarto paso es la INCLUSION de la muestra con parafina fundida, cuando esta se enfría se forma un bloque llamado taco el cual se coloca en el microtomo que es una maquina cortadora especial. La inclusión de la muestra nos permite realizar cortes muy delgados de esta.

5. El paso siguiente vendría a ser la TINCION de la muestra, después de la inclusión se tiene que retirar la parafina que quedo en esta utilizando solventes orgánicos como xileno y tolueno y la muestra debe rehidratarse con el uso de una serie de alcoholes de concentración decreciente, después se procede al teñido del tejido con HEMATOXILINA y también se lo puede realizar con EOSINA que son los colorantes mas comunes que existen.

6. Después se realiza el paso del MONTAJE donde la muestra después de su coloración se hace pasar por tolueno o xileno y por ultimo se la cubre con un cubreobjetos para que se logre un preparado permanente.

2- Partes del microscopio

El microscopio tiene dos partes: una óptica, para observar, y otra mecánica, que sostiene a la primera.

La parte óptica consta de :

• Ocular, lente situada cerca del ojo del observador.

• Objetivo, lente situada cerca del objeto que se quiere observar.

• Diafragma, dispositivo para graduar la entrada de luz.

• Condensador, dispositivo para concentrar la luz sobre el objeto.

• Foco de luz o espejo, para iluminar el objeto.

La parte mecánica del microscopio consta de:

• Columna , parte que sostiene el tubo óptico.

• Tubo óptico , donde se encuentra ubicado el ocular.

• Revólver , parte móvil que sostiene los objetivos.

• Platina , que soporta el portaobjectes.

• Pié ,sostiene todo el microscopio.

• Tornillo macrométrico, que permite desplazamientos rápidos de las lentes.

• Tornillo micrométrico, que permite desplazamientos suaves de las lentes.

4- Formación de imágenes en el microscopio

Cuando se forma la imagen en el foco, la luz emergente del ocular, en forma de rayos paralelos, forma una imagen invertida en el infinito. La lente del ocular agranda esta imagen y vuelve a invertirla, con lo que percibimos la imagen en su posición normal, pero aumentada.

5- Importancia de la luz

La luz o la iluminación es una de las claves de la buena microscopia.

El sistema de iluminación de un microscopio es de considerable importancia, especialmente cuando se utilizan grandes aumentos. La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparación para que la imagen se traslade de forma adecuada al objetivo y llegue con la mayor calidad posible al ojo del observador a través del ocular. En los microscopios antiguos, la fuente de luz era externa, y se utilizaba un espejo, situado en el propio microscopio, para reflejar esa luz externa hacia la preparación y los objetivos. Actualmente se utiliza un sistema de lentes, incorporado al propio microscopio, llamado condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de la luz y elegirse una posición que consiga el foco preciso. El condensador tiene también un diafragma iris, que controla el diámetro del círculo de luz que pasa por el sistema.

Lo que se busca con este diafragma iris no es controlar la intensidad de la luz que alcanza el objeto, sino asegurar que la luz que pasa por el sistema condensador ocupe justamente el objetivo. Si el diafragma iris es demasiado grande, parte de la luz pasará no sólo al objetivo sino también alrededor de él, y no se utilizará. Si la luz es demasiado brillante, no deberá reducirse alterando la posición del condensador o del diafragma

iris sino usando filtros de neutralización, o disminuyendo el voltaje de la lámpara. Nunca se insistirá lo suficiente en que el ajuste apropiado de la luz es crucial para la buena microscopía, especialmente a los mayores aumentos.

5- Tipos de luz para el microscopio:

En la microscopia óptica encontramos la utilización de la luz normal ósea la que puede provenir de una lámpara ubicado en la subplatina. Esta luz atraviesa unas lentes de cristal para asi observarse los detalles de la muestra.

Por otro lado en los microscopios electrónicos (microscopia electrónica) se utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz.

Un filamento de tungsteno calentado puede una fuente que emite electrones (cátodo), estos son atraídos hacia un ánodo, una diferencia eléctrica entre estos dos componentes (catodo y anodo) imparte un voltaje de aceleración de entre 20000 y 200000 voltios a los electrones, con lo que se genera un haz. Este haz de electrones atraviesa luego una serie de lentes electromagnéticos que cumplen la misma función que las lentes de cristal de un microscopio óptico.

6- Tipos de microscopios y Tipos de energía

Dependiendo de la fuente energética que utilizan, se reconocen dos tipos de microscopios:

1.Microscopio óptico o fotónico, utiliza la luz como fuente energética.

2. Microscopio electrónico, emplea un haz de electrones.

Ambos tipos de microscopios permiten la observación gracias a su capacidad de aumento (la cantidad de veces que se incrementa el tamaño de la imagen del objeto observado) y de resolución (capacidad del microscopio que permite distinguir como separadas dos estructuras que se encuentran muy próximas).

1. Microscopios ópticos o fotónicos: este tipo de microscopios utiliza la luz como fuente de energía y las propiedades de los lentes ópticos que permiten aumentar el tamaño de los objetos observados. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta quince veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2000 veces.

Dentro de los microscopios fotónicos existen varios tipos, distinguidos por pequeñas diferencias, aunque el principio básico de funcionamiento es el mismo:

· Microscopio de campo claro o compuesto: Es el microscopio más comúnmente usado, consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes

que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentra en el punto focal del ocular. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. La muestra que se va a observar debe ser teñida con algún colorante que permita hacerla destacar sobre el fondo claro o brillante que proviene de la fuente luminosa.

. Microscopio de contraste de fase:Este tipo de microscopio permite el examen de tejidos y células sin necesidad de teñirlos y es de especial utilidad para estudiar células vivas.

. Microscopio de campo oscuro:Utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.

. Microscopio de fluorescencia: Es utilizado para la detección de moléculas con fluorescencia natural como algunos neurotransmisores y la vitamina A.

. Microscopio confocal de barrido: Permite La visualización de una muestra biológica en tres dimensiones, este tipo de microscopio combina los componentes de un microscopio óptico de campo claro con un sistema de barrido para disecar ópticamente una muestra, literalmente se puede disecar capa por capa todo el espesor de la muestra.

. Microscopio de polarización: Son microscopios a los que se les han añadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol, dejando pasar únicamente la luz que vibra en un único plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, según que los dos nicoles estén paralelos o cruzados.

2. Microscopios electrónicos: La potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible, dado que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz. El microscopio electrónico utiliza electrones para iluminar un objeto, pudiendo mostrar estructuras mucho más pequeñas. La longitud más corta de la luz visible es de alrededor de 4000 ángstroms (un ángstroms es 0,0000000001 metros); la longitud de onda que se utilizan en los microscopios electrónicos es de alrededor de 0,5 ángstroms.

Los principios básicos de los microscopios electrónicos son similares a los microscopios fotónicos, las diferencias están dadas en la ya mencionada fuente de luz (electrones) y en el tipo de lente, ya que los electrónicos emplean lentes electromagnéticas. La gran diferencia de los dos tipos de microscopios es la potencia que tiene cada cual, ya que

el microscopio óptico es capaz de aumentar unas 2000 veces, con una resolución de 0,2 micrones (0,0001 mm) mientras que el electrónico aumenta hasta unas 1000000 veces, con una resolución de 0.1 nanómetros (0,0000001 mm).

Todos los microscopios electrónicos cuentan con varios elementos básicos. Disponen de un cañón de electrones que emite los electrones que chocan contra la muestra, creando una imagen aumentada. Se utilizan lentes electromagnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, junto con un sistema de vacío al interior del microscopio, para que las moléculas de aire no desvíen los electrones.

TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRONICOS:

Microscopio electrónico de transmisión

es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo característico de este microscopio es el uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra.

Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces.

Microscopio electrónico de barrido

es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También produce imágenes de alta resolución, que significa que características espacialmente cercanas en la muestra pueden ser examinadas a una alta magnificación. La preparación de las muestras es relativamente fácil pues la mayoría de MEB sólo requieren que estas sean conductoras.

La diferencia entre el MET y el MEB es que en este último el haz de electrones no atraviesa la muestra sino que explora su superficie (barre).

TERCER TIPO DE MICROSCOPIO DE RECIENTE APARICION QUE A DEMOSTRADO SER UTIL PARA LOS ESTUDIOS BIOLOGICOS:

Microscopía de Fuerza AtómicaLa microscopía de fuerza atómica se basa en la interacción entre una punta muy fina y la superficie de la muestra. Se trata de provocar un desplazamiento relativo entre punta y muestra mediante un barrido finobasado en materiales piezoeléctricos. Manteniendo la interacción punta - muestra constante, se obtienen mapas tridimensionales de resolución nanométrica en los tres ejes. El uso de puntas especiales con propiedades eléctricas, térmicas o mecánicas permite asimismo la caracterización de la muestra con respecto a estas interacciones. Un gran número de aplicaciones derivadas de esta técnica se basan en la manipulación de la muestra con estas puntas, como por ejemplo nanolitografía o estiramiento ("pulling") de proteínas.

INDICES DE REFRACCION

Material Índice de refracción

Vacío 1

Aire (*) 1,0002926

Agua 1,3330

Acetaldehído 1,35

Solución de azúcar (30%) 1,38

1-butanol (a 20 °C) 1,399

Glicerina 1,473

Heptanol (a 25 °C) 1,423

Solución de azúcar (80%) 1,52

Benceno (a 20 °C) 1,501

Metanol (a 20 °C) 1,329

Cuarzo 1,544

Vidrio (corriente) 1,52

Disulfuro de carbono 1,6295

Cloruro de sodio 1,544

Diamante 2,42