mikroskopie griechisch mikro = klein skopien = zu beobachten das beobachten von kleinen objekten
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MIKROSKOPIE
Griechisch
mikro = klein
skopien = zu beobachten
“Das Beobachten von kleinen Objekten“
PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - I
MIKROSKOPISCHE VERFAHREN PRODUZIERENLEDIGLICH KONTRASTUNTERSCHIEDE IM ENDBILD
LM: Selektive Absorption daher Färbung
EM: Unterschiedliche Bindung Schwermetallatome; grundsätzlich Schwarz-Weiß wegen der Wellenlänge
PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - II
INTERAKTIONEN ZWISCHEN STRAHL UND DEM OBJEKT
- Unterschiedliche Absorption (Änderung der Amplitude) Normale Lichtmikroskopie
- Unterschiedliche Geschwindigkeit (Änderung der Wellenlänge) Phasenkontrastmikroskopie
- Unterschiedliche Brechungsindizes (Änderung in Schwingungsrichtung) Polarisationsmikroskopie
-Unterschiedliche Streuungskapazitäten (Einlagerung vonSchwermetallatomen) Transmissionselektronenmikroskopie
MIKROSKOPISCHEMETHODEN:EIN ÜBERBLICK
KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie
1. MITTELS AMPLITUDEN-ÄNDERUNG
DURCH UNTERSCHIEDLICHEN ABSORPTIONEN
- Natürlich vorkommende Chromophoren (z.B. Chlorophyll)- Zellfremde Chromophoren (z.B. Safranin, Resorcinblau)
Durch Anwendung von:
- Chromophoren (z.B. Vital-Farbstoffe)
- Chromophor-Konjugaten (z.B. fluoreszierende Antikörper, Green Fluorescent Protein)
Absorption: „kurzwellig“Austrahlung: „langwellig“
KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie
2. MITTELS FLUORESZENZ
FLUORESZENZMIKROSKOPIE
„CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE -1
„CONFOCAL LASER SCANNING“ MIKROSKOPIE - 2
FLUORESZIERENDE PROTEINE
Aequorea victoria
GFP- MolekuleLebende Bakterien die 8 verschiedenenFluorescent-Proteine exprimieren
Grün: Mikrotubuli Rot: Chloroplasten
SCHLIESSZELL-PAAR (BLATT EPIDERMIS)
KONTRASTERZEUGUNG IN DER LMie
1. MITTELS PHASEN-VERSCHIEBUNG
NORMALES LM PHASEN KONTRAST
PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE
DIFFERENZIELLE INTERFERENZKONTRAST MIKROSKOPIE (DIC)
KONTRAST-ERZEUGUNG IM EM -I
Schwermetallatome verursachen einerStreuung von Elektronen. Solche Elektronen werden durch eine Ringblendevom Endbild ausgegrenzt
KONTRASTERZEUGUNG IN DER EMie
Durch Streuung auf Grund von Schwermetallatomen.
Abgelenkte Elektronen werden abgeschirmt undTragen nicht zum Endbild bei.
KONTRASTIERUNGSMÖGLICHKEITEN IN DER ELEKTRONENMIKROSKOPIE
- EINFÜHRUNG/AUFTRAGEN VON SCHWERMETALLEN
z.B. Blei, Gold, Osmium, Uran, Platin
- ART DER ZUGABE (PRÄPARATIONSVORGANG):
Positivkontrastierung (Ultradünnschnitte)
Negativkontrastierung (Suspensionspräparate)
(Schräg)Bedampfung (Gefrierbruch)
HERSTELLUNGVON ULTRADÜNN-SCHNITTENFÜR DIE EMie
DER GOLGI-APPARAT IM DÜNNSCHNITT
BEARBEITUNG VON SUSPENSIONS -PRÄPARATEN FÜR DIE EMie
a) Bedampfung b) Negativkontrastierung
DER GOLGI-APPARAT NACH NEGATIVE KONTRASTIERUNG
DIE GEFRIER-BRUCHMETHODE
- Supra-schnelles Einfrieren- Aufbrechen- Abdrück-Herstellung
DER GOLGIAPPARAT NACH GEFRIERBRUCH
BESONDERHEITEN DER ELEKTRONENMIKROSOPIE
VORBEDINGUNGEN FORDERUNGEN AN INTERPRETATIONS- DAS PRÄPARAT PROBLEME
Vakuum Wasserfrei (Tot!!) Zelldynamik
Durchdringlichkeit Probendicke (<100 nm) Zellrekonstruktion
Wechselwirkung Schwermetall- Zellstrukturmit dem e-Strahl kontrastierung
PRINZIPIEN DER MIKROSKOPIE - III
KEINE VERGRÖßERUNG OHNE FOKUSSIERUNG!
LM - Sammellins aus Glas EM - Elektromagnetische Polschuhlinse
MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - I
AUFLÖSUNGSVERMÖGEN
Definition: Der Begriff AV bezeichnetdie Unterschiedbarkeit feiner Strukturen,also den kleinst- und noch wahrnehmbarenAbstand zweier Punkte.
d = 0,5 d = Auflösungsvermögen;
sin = Wellenlänge = halber Öffnungswinkel
d (Auge) = 0.1 mm d (LM) = 500 nm ( = 600 nm; = 70-80º)d (EM) = 0.3 nm ( = 0.004 nm; = 0°20‘)
MAßSTÄBE IN DER MIKROSKOPIE - II
VERGRÖßERUNG
Numerisch: Objektiv x (Zwischenlins) x Okular
LM: 100 20 = 2000
EM: 50 20 20 20 = 400,000
„Brauchbare Vergrößerung“:
Die Vergrößerung ber der die Auflösungsvermögen erreicht ist.Darüber hinaus gibt es keine Verbessurung der Auflösung!
ART DER MIKROSKOPIE
„DURCHSTRAHL“: Transmissionsmikroskopie (LM; EM)
Normale EMie (bis 120 kVolt) Hochspannungs EMie (1-2 mVolt)
„RASTERSTRAHL“: Confocal-Laser Scanning Mikroskopie (CLSM)
Raster-Elektronenmikroskopie (SEM/REM)
TRANSMISSIONSMIKROSKOPIE
EM LM
MIKROSKOPIE: Raster-EM
MIKROSKOPIE ALS SOZIALES WISSENSCHAFT