miniguia de técnica histologica e inmunohistoquimica por k. walker bravo

2014

Universidad de Chile, Facultad de Medicina, LACyM Por Kenneth Walker B.

[MINI-GUÍA DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS E INMUNOHISTOQUÍMICA]

1

ÍNDICE

ÍNDICE .................................................................................................................................................. 1

ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA .............................................................................. 3

HISTOLOGÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA ............................................................................ 5

ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA PRÓSTATA HUMANA ....................................................................... 9

ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA MURINA ............................................................................. 11

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA ............................................................................................................ 13

FIJACIÓN ............................................................................................................................................ 14

PREPARACIÓN DEL FORMOL TAMPONADO AL 10% ......................................................................... 17

FIJACIÓN POR PERFUSIÓN: RATÓN ................................................................................................... 18

MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN ...................................................................................................... 20

PROTOCOLO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS PEQUEÑAS....................................................... 22

IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA .................................................................................... 23

CORTE DE LOS TEJIDOS ...................................................................................................................... 25

TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA ..................................................................................................... 27

INTRODUCCIÓN A LA INMUNOHISTOQUÍMICA ................................................................................ 31

PROTOCOLO: RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA ..................................................................................... 34

PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN ...................................................... 35

PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA CON AMPLIFICACIÓN .................................................... 36

PROTOCOLO: IHQ DOBLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN ....................................................... 37

PROTOCOLO: IHQ DOBLE FLUORESCENTE SIN AMPLIFICACIÓN ....................................................... 39

SOLUCIONES ÚTILES .......................................................................................................................... 40

BREVE INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESTADÍSTICOS .................................................................. 43

REFERENCIAS ..................................................................................................................................... 46

2

A mis compañeros y amigos,

Con gran agrado les dejo esta mini-guía que confeccioné para que la utilicen como una

herramienta de consulta la cual describe de manera general, los procesos críticos respecto a la

toma y procesamiento de muestras para los estudios histopatológicos. Esperando que este

documento les sea de gran utilidad y apoyo en su investigación del CaP, les saluda afectuosamente

y agradecido de su cordialidad,

Kenneth Walker Bravo.

3

ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA

La próstata es un órgano compuesto por glándulas y estroma, ambos íntimamente unidos y

delimitados por la cápsula prostática común. Tiene forma de castaña o triángulo achatado en su

base o cara superior. Pesa 20 a 25 g y mide 3 x 4 x 2,5 cm en el hombre adulto. Está alojada en el

compartimiento o nicho prostático inmediatamente por debajo de la vejiga, en relación con la cual

se halla su base o cara superior. Su extremo opuesto, más aguzado, el ápex o vértice prostático,

termina junto al segmento distal de la uretra prostática en la aponeurosis perineal media.

Fig. 1. Esquema de un corte o plano A) sagital y B) coronal de la próstata con zona central (C), de Transición

(T) y periférica (P).

En la próstata se distinguen tres zonas principales: a) zona de transición, correspondiente al 10%

de la glándula, ubicada en la base y en relación con la uretra y vejiga; b) zona central,

correspondiente al 20% de la glándula, ocupa la base en relación con las vesículas seminales; c)

zona periférica, correspondiente al resto de la glándula (70%). La zona central probablemente es

de origen wolffiano, mientras que las zonas de transición y periférica derivan de evaginaciones de

la uretra proximal, de origen cloacal. Estas últimas dos zonas se consideran el sitio de origen del

adenocarcinoma de la próstata (CaP). Las arterias que irrigan la próstata nacen de la arteria ilíaca

4

interna o arteria hipogástrica. Los linfáticos drenan hacia los ganglios ilíacos externos,

hipogástricos medios e inferiores, sacros laterales y prevesicales.

Fig. 2. Vista lateral de un esquema de la anatomía prostática de acuerdo con Mcneal (1978), muestra la zona

anterior (za), la zona periférica (zp) y la zona central (zc). U = uretra, de = ducto eyaculador.

Fig. 3. Mismo esquema anterior después de haber sido retirada parte de la zona periférica y de la zona

anterior lo que permite visualizar la zona de transición (zt), localizada profundamente en la región pre-

prostática en íntima relacion con la uretra. U = uretra, de = ducto eyaculador.

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HISTOLOGÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA HUMANA

La próstata es la glándula sexual accesoria más grande en los hombres. Contiene entre 30 a 50

glándulas tubuloalveolares que desembocan en 15 a 25 conductos excretores independientes.

Estos conductos se abren hacia la uretra. Las glándulas se disponen entre un estroma

fibromuscular, el cual consiste principalmente en músculo liso separados por hebras de tejido

conectivo rico en fibras colágenas y elásticas. El músculo forma una masa densa alrededor de la

uretra y por debajo de la delgada cápsula prostática.

Fig. 4. En la histología al igual que en la anatomía, se distinguen las tres zonas principales mencionadas con

anterioridad (zona de transición, zona central y zona periférica).

6

Fig. 5. Los alvéolos secretores o glándulas

tubuloalveolares (tubuloaveolar glands) de la próstata,

tienen una forma muy irregular debido a las

proyecciones papilares de la mucosa hacia sus lúmenes.

Los conductos de secreción de la próstata están

revestidos por un epitelio columnar simple que cambia a

un epitelio de transición cerca de las aberturas de los

conductos en la uretra.

Fig. 6. El epitelio de revestimiento de las glándulas

tubuloalveolares es predominantemente columnar. En

aquellos segmentos donde las células basales están

presentes, se observa un efecto de pseudo-estratificación

del epitelio. Las células secretoras son ligeramente

acidófilas y sus gránulos secretores pueden ser visibles en

el citoplasma. Pequeñas extensiones del citoplasma

apical en el lumen de los alvéolos pueden representar

productos de secreción (secreción apocrina/merocine).

La secreción de la próstata contiene ácido cítrico, la

fibrinolisina (licua el semen), la fosfatasa ácida entre

otras enzimas. La secreción de la próstata es la primera

fracción del eyaculado.

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Fig. 7. Un rasgo característico de la próstata es la aparición

de los cuerpos amiláceos (corpora amylacea) en los

alvéolos secretores. Son redondeados cuerpos eosinófilos.

Su diámetro medio es de aproximadamente 0,25 mm

(hasta 2 mm). Aparecen al séptimo mes del desarrollo

fetal. Su número aumenta con la edad y en particular, el

pasado los 50 años. Son sujetos a calcificación. Pueden

llegar a aparecer en el semen.

Desde los 30 años en adelante, se producen en la

próstata diversas alteraciones histológicas, como

atrofia focal, fibrosis periglandular e inflamación

crónica focal, alteraciones que afectan

preferentemente la zona periférica.

HPB

La HPB se instala por el crecimiento tisular de esos elementos histológicos que causan profundas

modificaciones en la estructura organizacional de la próstata. Esas modificaciones resultan en el

surgimiento de nódulos hiperplásicos que en el 70% de los casos ocurren en la zona de transición y

acaban estirando las demás regiones peri-uretrales. La proliferación localizada del estroma

fibromuscular es aceptada como el primer paso en el desarrollo de la HPB que incluye

alteraciones importantes en los fibroblastos de los capilares, del estroma fibromuscular y de la

composición de los glicosaminoglicanos (GAGs).

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Fig. 8. LA HPB corresponde a

un aumento de tamaño de la

zona de transición y de la

región periuretral proximal,

debido a un proceso

hiperplásico expansivo del

tejido glandular y del estroma.

Macroscópicamente muestra

un aspecto multinodular, dado

por nódulos blanquecino

amarillentos de 1 a 10 mm de

diámetro, y, entre ellos, por

bandas de tejido fibroso o

fibrohialino. La zona periuretral

hiperplásica macroscópicamente es blanquecina y lisa por estar compuesta preponderantemente de tejido

fibromuscular. Los nódulos pueden ser fibrosos, fibromusculares, musculares, fibroglandulares o

fibromioglandulares. Estos últimos son los más frecuentes. Si tienen muchas glándulas muestran un aspecto

poroso o esponjoso y ellas pueden contener cuerpos amiláceos o concreciones. La consistencia de la

glándula hiperplásica es menor de la que suele tener el cáncer de la próstata.

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ANATOMÍA PATOLÓGICA DE LA PRÓSTATA HUMANA

Adenocarcinoma de próstata (CaP)

Formas o categorías del carcinoma de próstata

• Carcinoma clínicamente manifiesto: el diagnóstico se establece clínicamente, por examen

físico, signos de estenosis u obstrucciones uretral, hematuria, etc.

• Carcinoma oculto: descubierto por sus metástasis antes que el tumor primario,

• Carcinoma incidental (subclínico): clínicamente silente, descubierto casualmente en el

examen microscópico de tejido prostático resecado bajo el diagnóstico de enfermedad no

maligna.

• Carcinoma latente: descubierto en autopsias.

El carcinoma incidental y el latente parecen tener una frecuencia mucho mayor que el carcinoma

manifiesto y el oculto. Por lo tanto, aparentemente existe sólo un pequeño porcentaje de cánceres

que progresan y se diseminan. El porqué de esta agresividad selectiva se desconoce por completo.

Estadios del cáncer de la próstata

Es de gran importancia pronóstica determinar en la forma más precisa posible el estadio en que se

encuentra el carcinoma de la próstata, para lo cual el mejor método es el examen morfológico. Los

estadios básicos son cuatro:

• Estadio I Carcinoma incidental (sin manifestaciones clínicas)

• Estadio II Carcinoma dentro de la cápsula prostática

• Estadio III Carcinoma con extensión extracapsular, sin metástasis

• Estadio IV Carcinoma con metástasis

Cada uno de estos estadios se subdivide en dos atendiendo al grado de diferenciación histológica,

número de focos y extensión del carcinoma, eventual infiltración de órganos vecinos (vesículas

seminales, uretra, vejiga, pelvis) y sitio de las metástasis. En la evaluación de las metástasis

ganglionares linfáticas son importantes el número de ganglios comprometidos y el tamaño de

aquellas. Los estadios que se encuentran más frecuentemente en las resecciones quirúrgicas son

10

el III (45%) y el IV (57%). El paciente con tumor en el estadio inicial (IA1) tiene igual sobrevida que

la población general.

Clasificación histológica

Fig. 9. De todas las clasificaciones actualmente en

uso para determinar el grado de malignidad

histológica del carcinoma prostático, una de las más

apropiadas es la de Gleason. Según ésta se

distinguen 5 tipos histológicos, que van desde un

adenocarcinoma tubular bien diferenciado, de

crecimiento expansivo (tipo 1) hasta uno muy poco

diferenciado e infiltrante (tipo 5). Los tipos más

frecuentes son el 3 y el 4, que en conjunto tienen

una frecuencia relativa de cerca de 60% y

corresponden a un adenocarcinoma tubular

moderadamente diferenciado y poco diferenciado,

respectivamente. Estos tipos histológicos también

son conocidos como grados de Gleason.

El score de Gleason está dado por suma de los dos tipos (grados) predominantes en cada caso. Los score 8, 9

y 10 tienen metástasis ganglionares regionales en más del 90% de los casos y son los de peor pronóstico. Los

score 2, 3 y 4 no tienen metástasis y son de muy buen pronóstico.

11

ANATOMÍA NORMAL DE LA PRÓSTATA MURINA

La próstata murina, a diferencia de la del

hombre, contiene lóbulos separados: Los

dorsales, laterales, ventrales y anteriores.

Todos los lóbulos están formados por

túbulos ramificados y ciegos que están

rodeados por una delgada capa

fibromuscular y separados entre sí por tejido

conectivo laxo.

Las glándulas de la próstata murina, al igual

que la del hombre, contiene células

epiteliales cilíndricas, células basales y

células neuroendocrinas (<0,3%). Las

secreciones de las glándulas de la próstata

son transportadas por los conductos al

colículo seminal y pueden ser vistas como

concreciones prostáticas en los cortes

histológicos. Los lóbulos de la próstata

murina difieren unos de otros en la

apariencia tanto del epitelio de

revestimiento de las glándulas y en la

secreción al lumen de la glándula

(concreción prostática).

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Fig. 11. La próstata dorsal tiene epitelio

cúbico simple que raramente presenta

pliegues proyectados al lumen. Las células

epiteliales tienen sus núcleos dispuestos de

manera basal. La secreción prostática en los

lúmenes dorsales es homogénea y eosinófila.

PrGl = Glándula tubuloalveolar; LoCo = Tejido

conectivo laxo; PrSe = Concreción prostática.

Fig. 12. La próstata ventral presenta células

epiteliales columnares con plegamientos

focales y núcleos basales. La secreción

prostática en los lúmenes ventrales es

homogénea y levemente basófila. LoCo =

Tejido conectivo laxo; CoEp = Epitelio

cilíndrico (columnar); Lu = lumen.

Fig. 13. La próstata anterior presenta células

epiteliales columnares bajas con muchos

plegamientos hacia el lumen de la glándula y

núcleos de disposición central. El lumen de la

próstata anterior presenta abundante

secreción eosinófila. Lu = Lumen; CoEp =

Epitelio cilíndrico (columnar); MI = Músculo;

AdTi = Tejido adiposo.

13

OBTENCIÓN DE LA MUESTRA

Toma de muestra

Todos los pasos de la técnica histológica son muy importantes para la obtención de resultados

finales satisfactorios, pero de este primer paso, depende que se puedan apreciar los detalles de las

estructuras a estudiar.

El punto más importante, tiene que ver con el corte y el tamaño de la muestra a utilizar, ya que de

ello depende el éxito del resto de los pasos del proceso.

El tamaño de la muestra para microscopía de luz, debe ser no mayor de un centímetro cúbico (1

cm3), para que la fijación sea adecuada y facilite los pasos siguientes de la técnica.

Recomendaciones para tomar las muestras

• La muestra debe ser tratada en forma cuidadosa con el instrumental, para evitar inducir

lesiones en el tejido

• Las muestras deben ser pequeñas para facilitar el proceso de fijación

• El corte de la muestra debe ser realizado con hojillas de bisturí, o en su defecto, navajas de

micrótomo en perfectas condiciones, para que los bordes de la muestra sean los

adecuados, evitando así áreas con cortes irregulares

• Luego de tomada la muestra, esta debe ser introducida de inmediato en el recipiente con

fijador (fijación por inmersión)

• Recoja aquellas muestras en un orden tal que sea ágil, que de preferencia a los órganos

que primero se degradan (páncreas e intestino) en una sala a baja temperatura.

Importante: Muchos estudios requieren la localización de una pequeña estructura en un órgano

para luego ser trabajada a través de inmunohistoquímica, como un foco metastásico, por ejemplo.

Siempre identifique y separe las piezas anatómicas que trabaje cada una en bloques aparte y tiña

la estructura que le interese para no perderla de vista posteriormente.

14

Si la fijación es por inmersión, la muestra debe ser colocada inmediatamente después de ser

tomada en el recipiente con fijador, que siempre debe estar listo para tal fin.

FIJACIÓN

Es el procedimiento de la técnica histológica, que tiene como finalidad, conservar de manera

permanente, una estructura lo más semejante al estado que tenía in vivo.

Objetivos de la fijación

• Preservación de la estructura lo más semejante al estado viviente

• Penetración y acción rápida sobre los tejidos

• Evitar los cambios post-mortem

• Preparar los tejidos para los tratamientos subsiguientes

• Impedir la formación de artefactos

• Impedir la desaparición de sustancias solubles, durante y después de la fijación

• Evitar la retracción de los tejidos

“No existe el fijador ideal; todos tienen sus fortalezas y debilidades”

Consideraciones para elegir un fijador

• Preservación de los detalles celulares

• Tasa de penetración

• Cantidad del daño ocasionado

• Técnica de coloración o marcaje

“El objeto del estudio es quien determina el tipo de fijador a ser utilizado”

15

Métodos de fijación

Inmersión

Es el método más utilizado y simple desde el punto de vista técnico. Utiliza recipientes con tapa de

cierre hermético que evita la evaporación del fijador que contiene. Como norma se dice que la

cantidad de fijador a utilizar, está en una proporción de 10:1. Esto quiere decir, que la cantidad de

fijador debe ser 10 veces mayor al tamaño de la muestra a fijar. Este tipo de fijación tiene como

limitación, que extrae con frecuencia sustancias intracelulares, por lo que su uso depende del

objetivo final de la técnica.

Perfusión

Es el método de mayor utilización en animales de experimentación, ya que el líquido fijador es

inoculado en el sistema circulatorio del espécimen, por lo tanto, fija en principio de adentro, hacia

fuera de los órganos a estudiar, lo que da excelentes resultados cuando la técnica es realizada con

éxito.

Hay dos tipos de fijación por perfusión: De gran circuito y de pequeño circuito. El primero, se

realiza inoculando el fijador a partir del corazón (ventrículo izquierdo) por lo que la fijación ocurre

en todos los órganos del espécimen; en la de pequeño circuito, el fijador se inyecta solo en una

porción del animal, fijando solo la parte de interés para el investigador. Ej. Se inocula la arteria

renal si lo que se requiere es solo el riñón.

Tipos de fijadores

• De acuerdo a su acción sobre las proteínas (Coagulantes y No coagulantes)

• De acuerdo a su origen general (Físicos y Químicos)

Ambas clasificaciones utilizan las mismas sustancias, la diferencia está en que la primera explica el

mecanismo de acción del fijador (que será ampliada durante la sesión teórica del tema). La

segunda clasificación es la más utilizada desde el punto de vista práctico, por lo que es la que será

tratada en esta recopilación.

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Fijadores Físicos

Frío: Es muy utilizado cuando se requiere mantener en buenas condiciones y en su lugar, las

diversas sustancias intracelulares, especialmente para técnicas de histoquímica o

inmunohistoquímica. Las diversas formas de fijación por frío serán tratadas en la sesión teórica del

tema

Fijadores Químicos

Simples: Son sustancias químicas de estructura no compleja, que se mezclan con agua destilada

para lograr la proporción adecuada. Ej.:

• Ac. Acético

• Alcohol etílico (C2H5OH)

• Formaldehido (H-CHO) y paraformaldehido

• Ac. Pícrico

• Ac. Crómico

• Dicromato de potasio K2Cr2O7

• Bicloruro de Mercurio HgCl2

• Tetraóxido de osmio OsO4

• Glutaraldehido

• Permanganato de potasio (KMnO4)

Compuestos o Mezclas fijadoras: Se originan por la combinación de varios de los fijadores

químicos simples, y tienen usos particulares para los cuales fueron creados. Ej.:

• Formol tamponado

• Formol calcio

• Líquido de Zenker

• Líquido de Bouin

• Líquido de Helly

• Fijador de Carnoy

• Líquido de Flemming

• Zenker-formalina

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PREPARACIÓN DEL FORMOL TAMPONADO AL 10%

Utiliza Formol puro, el cual va a ser disuelto al 10% en Buffer Fosfato. Esto le da mejores

resultados a la fijación, ya que acerca el pH del fijador al de los tejidos del ser humano y similares.

Si va a destinar las piezas a inmunohistoquímica, prefiera el paraformaldehido.

Para 1 litro de formol diluido, mezclar en siguiente orden:

• 100 cc de formol concentrado (al 37-40%)

• 900 cc de agua destilada

• 20 cc de acetato sódico 3-hidrato en polvo

A continuación debe agitarse para conseguir una buena mezcla. El recipiente que lo contenga

debe estar debidamente rotulado y bien cerrado; la preparación debe hacerse en una habitación

bien ventilada.

Para Inmunohistoquímica

Solución fijadora modificada (en base a paraformaldehido)

• 85 mM Na2HPO4

• 75 mM KH2PO4

• 4% Paraformaldehido

• 14% (v/v) de ácido pícrico saturado, pH 6.9.

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FIJACIÓN POR PERFUSIÓN: RATÓN

Materiales a utilizar

• Dos recipientes de suero, uno con fijador, y el otro con solución fisiológica

• Dos equipos de infusión con su soporte

• Equipo de disección

• Cánula para perfusión

• Soporte de madera e hilo pabilo para la inmovilización

• Papel absorbente, inyectadoras, anestésicos, guantes

Procedimiento:

• Anestesia del espécimen con pentotal sódico (40mg./Kg.) o Ketamina (100mg./Kg.) por vía

intraperitoneal. También puede ser utilizado éter o cloroformo por inhalación en campana

de vidrio

• Fijar el espécimen a un soporte que sostenga todas sus extremidades

• Hacer incisión medial de la piel para exponer la caja toráxica

• Realizar dos incisiones a la parrilla costal en las líneas axilares anteriores y levantar la

parrilla costal

• Exponer el corazón y localizar el ventrículo izquierdo

• Hacer una pequeña incisión con el bisturí en dicho ventrículo e introducir la cánula hasta

llegar a la arteria aorta ascendente. Ligar la cánula a la aorta en forma cuidadosa

• Comenzar a pasar la solución fisiológica (isotérmica al espécimen) a través de la cánula

para extraer por completo la sangre del animal, esto con la finalidad de evitar

vasoconstricción. Simultaneo a este paso, se debe hacer una pequeña incisión en el

ventrículo derecho del animal, para que drene el liquido que está siendo introducido

• Cuando se observe que la solución fisiológica ya está drenando por el ventrículo derecho,

es el momento de iniciar la perfusión con el líquido fijador, en este caso, formol

tamponado al 10% durante 30-40 minutos aproximadamente

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• En el momento en que el fijador penetra en el torrente circulatorio, se observa que el

animal comienza a presentar fibrilaciones musculares, lo que indica que el fijador está

pasando en forma adecuada.

• Luego de agotado el tiempo, se desmonta el espécimen y se aprecia que tiene la

apariencia de piel tipo suela, lo que indica una fijación satisfactoria en principio

• Se hace la disección de los órganos a utilizar, se hacen los cortes en piezas del tamaño

respectivo, y se colocan de inmediato en líquido fijador (por inmersión) para seguir luego

con los siguientes pasos de la técnica.

Anatomía torácica del ratón

Es importante tomar en cuenta que el ventrículo izquierdo (resaltado en negro) es posterior, por

lo que la incisión y la canulación deben ser cuidadosamente realizadas, para el éxito de la técnica.

20

MÉTODOS DE DESHIDRATACIÓN

La deshidratación es el proceso que tiene por finalidad la remoción o eliminación completa del

agua de los tejidos o muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente en un medio de

inclusión no hidrosoluble, para que se solidifique y así permitir el corte de los tejidos.

La deshidratación podrá realizarse utilizando cualquier reactivo capaz de absorber el agua de los

tejidos, mediante el empleo de agentes químicos deshidratantes, entre los cuales se encuentran

los alcoholes, o por procedimientos físico-químicos como la criodesecación y la criosustitución.

Un buen agente deshidratante debe cumplir con las siguientes condiciones:

• No debe alterar las estructuras titulares.

• Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante.

• Debe ser rápido.

• Reducir a un mínimo necesario el endurecimiento que provoca en los tejidos

• Baja toxicidad o peligrosidad (por contacto, ingestión, inhalación y evaporación de

gases tóxicos.

• Mínimos riesgos de incendio/explosión.

Para el proceso de deshidratación se prefiere utilizar los alcoholes isopropílico o etílico,

debiéndose cumplir con los siguientes parámetros:

• Graduación de los alcoholes: Empleando una serie de alcoholes de gradación ascendente

(70%,80%,95% y 100%), se evitaría la marcada retracción del tejido por la acción brusca

que produciría someterlo a una elevada gradación de este agente deshidratante.

• Volumen y número de baños de deshidratación: El volumen de baño debe por lo menos

10 veces superior al volumen de la muestra que se vea a deshidratar. Se recomienda

realizar el mayor número de baños para ayudar a un estado de equilibrio entre el estado

de hidratación del tejido y el alcohol.

• Duración de la deshidratación: Se halla en función del volumen de los fragmentos

titulares y de su contenido de agua. Debe ser completa y evitar exposiciones prolongadas

para no provocar endurecimiento de los tejidos.

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• Empleo de agentes accesorios: Como el Sulfato de cobre anhidro, óxido de calcio, resinas

humectantes, etc., porque eliminan el exceso de agua en el propio agente deshidratante

consiguiendo un efecto deshidratante más uniforme.

Principales agentes deshidratantes

• Alcohol etílico

• Alcohol metílico

• Acetona

• Alcohol butílico

• Dióxido de etileno

• Alcohol isopropílico

• Tetrahidrofurano

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PROTOCOLO DE DESHIDRATACIÓN PARA BIOPSIAS PEQUEÑAS

Tiempo total de procesamiento: 3 – 4 horas

• Enjuague la muestra de tejido en agua corriente durante 15 minutos para desenmascarar

antígenos para un futuro uso en inmunohistoquímica.

• Colocar la muestra de tejido en alcohol al 80%.

• Someter la muestra de tejido a alcohol al 95% realizándose 3 cambios de 15 minutos cada

uno.

• Someter la muestra de tejido a alcohol absoluto, se realizarán 3 cambios de 15 minutos

cada uno.

• Colocación de la muestra a partes iguales de alcohol absoluto y xilol 15 minutos.

• Colocación de la muestra en Xilol realizando 2 cambios de 15 minutos cada uno.

• Colocación en parafina realizándose 3 cambios de 15 minutos cada uno.

• Incluir la muestra de tejido en parafina.

Para muestras grandes (realizar sólo si las muestras no se pueden empequeñecer más)

• Enjuague la muestra de tejido en agua corriente durante 30 minutos para desenmascarar

antígenos para un futuro uso en inmunohistoquímica.

• Se realizarán 5 cambios de alcohol de 45 minutos cada uno. Si el espécimen o muestra de

tejido es grande 60 minutos cada uno. 80%, 90%, 95% y 99%.

• 1 cambio de xilol-alcohol de 45 minutos. Si la muestra es grande 60 minutos.

• 2 cambios de xilol de 45 minutos cada uno. Si es grande el espécimen 60 minutos cada

uno.

• 3 cambios de parafina de 45 minutos cada uno. Si es grande la muestra 60 minutos cada

uno.

23

IMPREGNACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA

Es el procedimiento más utilizado que se realiza para poder cortar los tejidos tratados, en

secciones suficientemente delgadas que permitan el paso de la luz, de modo que los detalles finos

puedan ser observados con distintos microscopios en sus diversas capas.

Aunque los tejidos adquieren cierta consistencia al ser sometidos a la fijación, por lo general

continúan siendo demasiado blandos para poder cortarlos en láminas delgadas, por lo tanto, es

necesario que la porción de tejido a estudiar infiltre y englobe dentro de sí una sustancia líquida

o semilíquida, de modo que una vez solidificada adquiera la suficiente dureza para formar bloques

que puedan cortarse.

Los materiales empleados con esta finalidad, por lo general son sustancias como la parafina.

También pueden utilizarse como medios de inclusión, procedimientos físicos como la congelación

con CO2 comprimido o freon a – 150º C; éste tipo de procedimiento se utiliza con tejidos frescos

(recién tomada la muestra). Se requiere del uso de microtomos de congelación, criostato y de

personal experto, pues es necesaria la destreza y mayor rapidez en la ejecución, ya que el tejido al

congelarse si no es cortado rápidamente, se le forman cristales de agua que ocasionan deterioro

de la nuestra. Se utiliza este tipo de inclusión para el estudio de biopsias y de histoquímica celular

(ejem: lípidos, enzimas).

Inclusión en parafina

La parafina es un hidrocarburo saturado de cadena lineal. Es un residuo del petróleo obtenido por

destilación del crudo; de color blanquecino, insoluble en agua, soluble en cloroformo, xilol, toluol,

benzol. Es muy estable químicamente. A temperatura ambiente se solidifica y funde a

temperaturas comprendidas entre 33 y 60ºC.

Para la inclusión en parafina deben cumplirse los siguientes pasos de impregnación

• La parafina sólida, se hace líquida, fundiéndola sobre una platina (plancha metálica,

eléctrica con temperatura regulable), introducida en recipientes de porcelana, resistentes

al calor.

24

• Se lleva la muestra al recipiente que contiene parafina líquida (se debe mantener la

temperatura constante entre 50º a 56ºC, por un tiempo de 24 horas en la estufa), para

iniciar así la fase de impregnación.

• La muestra se debe pasar por 3 baños de parafina líquida, en recipientes separados (cada

2 horas, en uno), en las condiciones previamente descritas, para que ésta penetre

profundamente.

• Se retira la biopsia de la última parafina líquida (la más pura) y se lleva al recipiente

formador del bloque o un molde para realizar la inclusión.

• No olvide: Reflexionar detenidamente la orientación que le dará a la muestra en el

bloque. Debe asegurar que aquello que desee cortar más tarde enfrente el fondo del

molde pues esa será la cara de corte.

• La muestra se introduce al molde que debe ser rellenado previamente con parafina

líquida. Antes de introducir la muestra, retire las burbujas del fondo del molde pasando

una pinza caliente. Se tendrán algunos segundos para orientarla antes de que la parafina

comience a solidificar. Se recomienda meter la muestra a la parafina líquida de tal manera

que caiga al fondo del molde con una relativa orientación evitando su reacomodación.

Luego, se deja solidificar por varias horas.

• No incluya más de un órgano por bloque. Sea ordenado para no perder el seguimiento de

sus muestras más tarde. Además, los bloques con muchos tipos de tejidos distintos crean

densidades distintas que terminan dañando la navaja y haciéndola durar menos y crear

artefactos en los cortes. Existen técnicas específicas para la confección de tissue-arrays, si

este es su ideal, consulte una guía adecuada.

• Se desmolda el material solidificado y se lleva al micrótomo para ajustarlo al portabloques

y proceder a cortar.

25

CORTE DE LOS TEJIDOS

Existen 2 tipos de hojas desechables en el mercado hoy en día: Hojas de bajo y alto perfil. Para la

mayoría de los tejidos, las hojas de alto perfil funcionan muy bien y son las más utilizadas. La

diferencia entre ambas es muy subjetiva.

Pasos para cortar

• Antes de cortar un bloque hay que examinarlo y saber cómo va a ser orientado en el

portabloque.

• Remover el exceso de parafina de los lados creando una pirámide truncada.

• Colocar el bloque en el portabloque.

• Ajuste bien los tornillos del portabloque.

• Oriente y ajuste con los tornillos de direccionamiento (eje x e y) hasta que el bloque

quede completamente paralelo al porta cuchilla.

• Coloque la cuchilla. Si va a realizar procedimientos inmunohistoquímicos, se

recomienda realizar un lavado de las cuchillas en xilol antes de utilizarlas pues muchos

fabricantes les colocan aceite que puede más tardíamente, desprender los cortes.

Además, disponga de portaobjetos silanizados para adherir sus cortes.

• Proceda a desgastar. El desgaste se basa en cortes gruesos de 10 micrones hasta llegar

al tejido. Para comprobar que se ha llegado al mismo, observe como la luz da al bloque.

Si la superficie donde se ubica el corte se ve opaca al reflejo luminoso, entonces ha

llegado al tejido.

• Una vez logrado, reajuste a 5 micrones y tome cortes. Se sugiere enfriar el bloque con

un hielo de vez en cuando para facilitar el proceso. Recuerde que debe cortar hasta

obtener un corte representativo de la muestra. Para asegurarse de ello, observe en el

microscopio a baja luminosidad, algunos cortes que realice y asegúrese de que la

macroestructura que busca se encuentre presente.

• Estire su corte en un baño de agua destilada a 45 grados.

26

Importante: Aun cuando su estudio se base en la obtención de cortes seriados, no coloque la cinta

en un solo portaobjetos. Separe los cortes uno a uno en el baño son sondas dentales o un objeto

punzante y rotule los portaobjetos con números que hagan referencia al orden de los cortes. De

esta manera, en pasos posteriores, si decide realizar inmunohistoquímica y desea dedicar cortes

para sus controles, estos no se contaminarán con los químicos que aplique a los tejidos

adyacentes.

Sellado de bloques

Una vez que la secciones deseadas se hallan cortado, remueva el bloque del portabloque y selle la

superficie expuesta con parafina derretida. Esto hace que los tejidos no se sequen y que no se

expongan duros y quebradizos, facilitando así la obtención de nuevas secciones semanas, meses, y

aun años más tarde. Sin embargo, para muestras escasas, no realice este procedimiento puesto

que durante un nuevo desgaste, puede llegar a removerse mucho tejido. Es preferible para estos

casos, almacenar los bloques a 4°C.

27

TINCIÓN HEMATOXILINA-EOSINA

Hematoxilina

La hematoxilina es un colorante natural y de naturaleza química básica que se extrae de la corteza

del árbol Hematoxylon campechianum, oriundo de Centroamérica. En el comercio se encuentra en

forma de cristales rosados o amarillentos solubles en agua o en alcohol. Tradicionalmente se ha

mantenido que la hematoxilina en su forma natural no es un colorante, para ser empleada como

tal, ha de ser oxidada previamente a hemateína.

Tras el proceso de oxidación, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial

agregándole determinados grupos auxocromos que, además, le confieren un carácter fuertemente

básico y son los responsables de su especificidad por los núcleos celulares. Como auxocromos se

emplean sales metálicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma

que se forman diversas lacas de hematoxilina de carácter catiónico y tonalidad azulada o negruzca,

dependiendo de la sal metálica utilizada.

La laca de hematoxilina más utilizada es la producida a partir del alumbre alumínico-potásico,

conocida también en forma genérica como hemalumbre.

28

Preparación de Hematoxilina

Reactivos

• Alumbre de Amonio o de Potasio (mordiente) 50 g

• Cristales de hematoxilina 1 g

• Yodato de Sodio 0,2 g

• Ácido cítrico 1 g

• Hidrato de cloral (bactericida) 50 g

• Agua destilada 1000 mL

Procedimiento

• Calentar la mitad del volumen de agua destilada a una temperatura por debajo del punto

de ebullición.

• Pesar el alumbre de amonio o de potasio y agregarlo al agua que se está calentando hasta

que se disuelva.

• Pesar los cristales de hematoxilina y agregarlos hasta que se disuelvan (aproximadamente

en 20 minutos).

• Agregar el resto del agua destilada.

• Pesar y agregar el ácido cítrico, dejar reposar por 10 minutos.

• Pesar y agregar el yodato de sodio, dejar reposar por 10 minutos.

• Pesar y agregar el hidrato de cloral, dejar reposar por 10 minutos.

• Envasar en frasco ámbar y almacenar en la oscuridad. Mientras más tiempo permanezca

en depósito, el proceso de maduración del colorante será mejor y se obtendrán mejores

resultados.

29

Eosina

La eosina es un colorante xanténico artificial y de naturaleza química ácida, es un derivado

hidroxianténico halogenado con tres grupos arilo. Las diferencias de coloración que existen entre

ellos están motivadas por el tipo y número de átomos de halógeno que contienen (eosina Y:

cuatro átomos de bromo y la eosina B: dos átomos de bromo).

En general, los colorantes xanténicos tienen autofluorescencia espontánea y colorean los tejidos

de diversas tonalidades entre rojo y rosado. Por lo común, se difunden fácilmente en las

estructuras hísticas, sobre todo en las más compactas, a las cuales tiñen debido a que, por su

carácter ácido, son atraídos fuertemente hacia los radicales básicos de la histidina, lisina y arginina

presentes en las proteínas citoplasmáticas y tisulares.

Preparación de Eosina

Solución “A”

• Reactivos Cantidad

• Eosina amarillenta (Y) 3 g

• Alcohol etílico o isopropílico 300 mL


Solución “B”

• Reactivo Cantidad

• Biebrich escarlata 1 g


Procedimiento

• Preparar las 2 soluciones por separado. Las dos soluciones constituyen la solución madre.

• Tomar 1 parte de la solución madre y 3 partes de alcohol al 70 %.

• Agregar 3 –6 gotas de ácido acético.

30

Método de la Hematoxilina-Eosina

Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina

(generalmente se emplea la de Harris, aunque también se emplean la de Mayer y la de Ehrlich).

Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos

celulares con la hematoxilina, y una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los

componentes extracelulares con la eosina.

Procedimiento Técnico

Soluciones

• Xilol

• Alcohol isopropílico al 95 %

• Agua corriente

• Hematoxilina

• Eosina

• Xilol/Alcohol

Protocolo para cortes de bloques en parafina

• Desparafine y rehidrate la muestra.

• Bañe en agua corriente durante 2-3 minutos, agitar suavemente.

• Sumerja en hematoxilina por 5 minutos

• Bañe en agua corriente por 5 minutos.

• Sumerja en eosina (sumergir porta-objetos y sacarlo inmediatamente)

• 3 baños rápidos en alcohol isopropílico al 95 %.

• Deshidrate, aclare y monte en medio permanente.

Para cortes por congelación, omita la desparafinación y la rehidratación pues el corte ya está

hidratado.

31

INTRODUCCIÓN A LA INMUNOHISTOQUÍMICA

Antes de aventurarse en la inmunohistoquímica (IHQ), reconozca el mejor procedimiento a

realizar para su objetivo de estudio. Si necesita realizar un estudio que involucre la evaluación de

marcadores antigénicos y observación simultánea de estos respecto a la histología del tejido,

prefiera una IHQ del tipo cromogénica. Si desea semicuantificar el marcador antigénico evaluado,

sin importar su relación histológica, utilice IHQ del tipo fluorescente.

Si desea evaluar más de un marcador, debe considerar que se pueden realizar IHQs cromogénicas

e IHQs fluorescentes para dos o más marcadores.

La IHQ cromogénica debe utilizar cromógenos

de colores muy contrastantes para no ser

confundidos tras su observación (Ej.: Rojo y

azul, ambos intensos) ni confundidos con la

hematoxilina (utilizada comúnmente como

counterstain en IHQ). Además, debe

considerarse que nunca se debe evaluar a

través de este método, antígenos localizados en

el mismo compartimiento subcelular. Tampoco

realice evaluaciones de antígenos escasos a menos de que pretenda utilizar un método de amplificación.

Se pueden utilizar cocteles de

anticuerpos en esta técnica. Sin

embargo, asegúrese de que todos los

anticuerpos hayan sido generados en

animales distintos, incluso sus

anticuerpos secundarios y que

tengan conjugadas enzimas distintas

que metabolicen sustratos distintos.

Si no utiliza cocteles de anticuerpos, deberá realizar una IHQ simultánea que es, básicamente, IHQs simples

consecutivas. Para estos casos, si pretende usar DAB o alguna de sus formas comerciales modificadas,

32

utilícelo como primer cromógeno en el paso de revelado. Recuerde bloquear los elementos endógenos

(biotina, peroxidasa, etc.) y considere bloquear la peroxidasa endógena en caso de usarla, después de

aplicar su anticuerpo primario (o su coctel) puesto que de ser aplicada antes, puede bloquear sitios

antigénicos (con peróxido) constituyendo un gran problema para los anticuerpos monoclonales. No se

recomienda evaluar más de 3 antígenos a la vez. Las muestras pueden almacenarse y observarse cuantas

veces se desee.

La IHQ fluorescente Permite la utilización de

cocteles sin mayores problemas. No es un

método enzimático por lo que se omite todo

tipo de pasos de bloqueos (a excepción del

bloqueo de uniones proteicas inespecíficas).

Debe tenerse en cuenta siempre la

autofluorescencia de los tejidos y la elección

de fluoróforos con un rango de emisión

luminosa lejano endógeno. Existen técnicas

para disminuir la autofluorescencia de los

tejidos. Este es el método por excelencia para

la observación de varios antígenos a la vez

con distintos colores. Se toman imágenes de cada señal luminosa y luego se fusionan con software (merge).

Sin embargo, La duración de la fluorescencia de las muestras es limitada y está sujeta también a su

observación por lo que el trabajo debe ser más rápido. Además, si deseamos observar el background

histológico necesitaremos un microscopio de polarización o uno de interferencia (DIC). La IHQ fluorescente

es semicuantitativa por excelencia. Cabe destacar que la IHQ fluorescente posee escasos métodos de

amplificación de señal.

Recomendación: El PBS al tener fosfato es un inhibidor de la enzima fosfatasa alcalina. Lo mismo ocurre con

la azida de sodio y la peroxidasa. No utilice el PBS para diluir anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina.

Evite el uso general del PBS pues puede fosfatar antígenos y modificar su estructura, reduciendo la afinidad

del anticuerpo primaro o al contrario, puede generar background inespecífico al fosfatar proteínas que

terminen pareciéndose al antígeno buscado (problema para los anticuerpos policlonales, principalmente).

Recuerde que los anticuerpos monoclonales son muy específicos y poco sensibles, al reveés de los

policlonales.

33

La gran parte de las IHQs, sea

cromogénica o fluorescente, se realizan

como indirectas. Esto significa, que

utilizan un anticuerpo secundario como

medio de amplificación de la señal.

Varios anticuerpos secundarios pueden

unirse a un anticuerpo primario. Por

esta razón, la IHQ es semicuantitativa

pues no refleja con plena exactitud la

cantidad real de antígeno identificado.

Si se dispone de material fresco, es

recomendable hacer otros ensayos si

nuestro estudio tiene fines

principalmente cuantitativos. La IHQ

entrega una aproximación cuantitativa

sobre la base de tejido preservado en parafina y además permite establecer el vínculo histológico. Para el

caso de la IHQ fluorescente, establece más bien un vínculo celular por sobre el tejido completo.

Fig. 15. Métodos de amplificación para la señal cromogénica.

Importante: Todo trabajo científico debe ser validado con controles claros y con la menor cantidad de

background posible para el caso de las IHQs. Si tiene background persistente en sus IHQs, realice ensayos de

dilución de sus anticuerpos primarios (1:100, 1:200, 1:500). Si el problema persiste, aumente en 1 la

cantidad de lavados para el anticuerpo primario y para el anticuerpo secundario. Si el problema persiste,

aumente los tiempos de bloqueo en 10 minutos. Esto para peroxidasa endógena y biotina endógena (u

otros). Si el problema persiste y si su anticuerpo es policlonal, puede que no sea lo suficientemente

específico. Purifique su anticuerpo. Realice sus controles en frascos aparte de sus muestras. Reemplace las

incubaciones a 37°C por incubaciones overnight a 4°C. Vaya comprobando una a una estas variables.

34

PROTOCOLO: RECUPERACIÓN ANTIGÉNICA

Por K. Walker

La recuperación antigénica es una etapa necesaria para la realización de inmunoensayos sobre

muestras que hayan sido fijadas e incluidas en parafina. Requiere que las muestras hayan sido

rehidratadas previamente. De las técnicas de recuperación antigénica, se prefiere la técnica de

HIER (heat induced epitope retrieval) la cual se basa en el desenmascaramiento de los epítopes

antigénicos a través de la exposición de los cortes histológicos a temperaturas entre 95-100°C.

• Se llenan contenedores de vidrio temperado de aproximadamente 250 ml de capacidad con buffer

citrato de sodio (10[mM] Citrato de sodio, 0.05% Tween 20, pH 6.0) y se les colocó su tapa

respectiva.

• Luego, los contenedores se colocan en el horno microondas doméstico y se hierve el buffer.

• Una vez hervido el buffer, con un termómetro se comprueba constantemente que la temperatura

una vez retirada la tapa del contenedor no descendiera de los 95°C.

• Se retiraran las burbujas acumuladas al fondo del contenedor para evitar que suban durante el

proceso y desprendan los cortes de los portaobjetos.

• Luego, se procede a retirar rápidamente el canastillo con los cortes rehidratados desde el agua

destilada para depositarlos dentro del buffer recién hervido.

• Luego se coloca la tapa al contenedor y se lleva a una vaporera precalentada durante 10 minutos

para iniciar la recuperación antigénica por 30 minutos.

• Una vez concluidos los 30 minutos, se procede a enfriar a temperatura ambiente por 10 minutos el

contenedor destapado.

• Luego, por otros 10 minutos se hace pasar agua corriente por sus paredes.

35

PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN

Por K. Walker

Detección con enzima peroxidasa (HRP)

• Una vez concluido el procedimiento de recuperación antigénica, se retiran los cortes histológicos

del buffer y se lavan 2 veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-100.

• Todos los lavados se realizan en contenedores de aproximadamente 250 ml de capacidad, con los

cortes dispuestos en canastillos.

• Las incubaciones y bloqueos se realizan fuera de los canastillos, de manera individual.

• Bloquee uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5%

(u otra) por 30 minutos.

• Remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar

sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte.

• Luego, aplique el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incube con éste durante 1

hora y 30 minutos a 37°C.

• Luego, proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación

leve.

• Posteriormente, incube con una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos.

• Luego, proceda a aplicar el anticuerpo secundario conjugado la enzima HRP. Incube durante 1 hora

a temperatura ambiente.

• Lave 4 veces durante 5 minutos en TBS.

• Proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización del sustrato

cromogénico 3,3′-Diaminobenzidina (DAB) para HRP (u otro) siguiendo las instrucciones del

fabricante (por lo general, 2 minutos de DAB es suficiente).

• Pasado los 2 minutos, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos.

• Use hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve

agitación, un enjuague suave en agua destilada y una deshidratación en una batería de etanoles

ascendentes. Aclare y monte con medios compatibles con su cromógeno.

Para cubrir un tejido es suficiente con 50 µl. 1 Gota (drop) equivale a 0.065ml.

36

PROTOCOLO: IHQ SIMPLE CROMOGÉNICA CON AMPLIFICACIÓN

Por K. Walker

Amplificación con método ABC (VECTASTAIN® Elite® ABC system, Vector

Laboratories®)


del buffer y se lavan 2 veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-100.




• Bloquee uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de caballo al 2,5%

(u otra) por 30 minutos.

• Remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a secar

sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte.

• Luego, aplique el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incube con éste durante 1


• Luego, proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación

leve.

• Posteriormente, incube con una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos.

• Proceda a aplicar el anticuerpo secundario conjugado con biotina (prediluted universal biotinylated

anti-mouse/rabbit IgG secondary antibody). Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

• Luego, se proceda a lavar 3 veces durante 5 minutos en TBS.

• Proceda a aplicar el medio de amplificación basado en estreptavidina conjugada con HRP (ready-to-

use stabilized ABC reagent). Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

• Luego, proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS.

• Revele la localización de los anticuerpos a través de la utilización del sustrato cromogénico DAB

para HRP (u otro) siguiendo las instrucciones del fabricante (por lo general, 2 minutos de DAB es

suficiente).

• Pasado los 2 minutos, se detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos.

• Use hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve

agitación, enjuague suave en agua destilada y deshidratación en una batería de etanoles

ascendentes. Aclare y monte con medios compatibles con su cromógeno.


37

PROTOCOLO: IHQ DOBLE CROMOGÉNICA SIN AMPLIFICACIÓN

Por K. Walker

Detección con enzima peroxidasa (HRP) y fosfatasa alcalina (AP). Método

consecutivo sin cocteles.


del buffer y se lavaron dos veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-

100.




• Proceda a bloquear uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de

caballo al 2,5% (u otro) por 30 minutos.

• Luego, remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a

secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte.

• Aplique el primer anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo e incuba con éste durante 1


• Proceda a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve.

• Incube en una solución bloqueadora de peroxidasa endógena por 30 minutos.

• Proceda a aplicar el primer anticuerpo secundario conjugado con la enzima HRP. Se incuba con

este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente.

• Proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS.

• Terminado el lavado, proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización

del sustrato cromogénico DAB (u otro) para HRP siguiendo las instrucciones del fabricante del kit

utilizado.

• Pasado el tiempo de incubación con DAB, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3

minutos. Luego, se procede a lavar 2 veces durante 5 minutos en TBS.

• Posteriormente, proceda a bloquear uniones inespecíficas con la solución de bloqueo por 30

minutos.

• Sin lavar, aplique el segundo anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo y e incube

durante 2 horas a 37°C.

• Luego, proceda a lavar dos veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación

leve.

38

• Posteriormente, proceda a aplicar el segundo anticuerpo secundario conjugado con la enzima AP.

Incube con este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente.

• Terminada la incubación, se proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS.

• Terminado el lavado, proceda a revelar la localización de los anticuerpos a través de la utilización

del kit de sustrato cromogénico para fosfatasa alcalina (Ej.: StayRed/AP Plus, ABCAM®) siguiendo

las instrucciones del fabricante y estandarizando el tiempo de incubación. Se sugiere para este kit,

12 minutos.

• Pasado los 12 minutos, detenga la reacción con un lavado de agua destilada por 3 minutos.

• Se usa hematoxilina para contrateñir seguido de un lavado de 5 minutos en agua corriente con leve

agitación, un enjuague suave en agua destilada y una deshidratación en una batería de etanoles

ascendentes terminada en un aclaramiento con xilol y montaje con el medio permanente. Aclare y

monte con medios compatibles para ambos cromógenos.


39

PROTOCOLO: IHQ DOBLE FLUORESCENTE SIN AMPLIFICACIÓN

Por K. Walker

Detección simultánea con cocteles de anticuerpos.


del buffer y se lavaron dos veces durante 5 minutos en contenedores con TBS + 0.025% de Triton X-

100.




• Proceda a bloquear uniones inespecíficas con una solución de bloqueo producida con suero de

caballo al 2,5% (u otro) por 30 minutos.

• Luego, remueva los excesos de solución de bloqueo sin permitir que el corte se seque. Proceda a

secar sólo alrededor del mismo, circundándolo, para delimitar la zona del corte.

• Aplique el coctel de anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo e incube overnight a

4°C.

• Proceda a lavar 3 veces durante 5 minutos en TBS + 0.025% de Triton X-100 con agitación leve.

• Proceda a aplicar el coctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos distintos. Incube

con este anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente. Desde este momento, procure no

exponer directamente a la luz sus muestras.

• Proceda a lavar 4 veces durante 5 minutos en TBS.

• Terminado el lavado, proceda a revelar contrastar los núcleos con DAPI de ser necesario. Recuerde

que DAPI es un agente intercalante del DNA y puede obscurecer antígenos nucleares que esté

buscando.

• Luego, proceda a lavar 1 vez durante 5 minutos en TBS.

• Monte con un medio de base acuosa con anti-fade.

• Observe dentro de las próximas 12 horas.

• Realice todas sus mediciones basándose en los resultados de su control negativo. Trate de tomar

las fotografías apenas termine su IHQ o siempre al cabo de la misma cantidad de horas de

terminado el experimento.


40

SOLUCIONES ÚTILES

Buffer citrate de sodio (10 mM Sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0)

Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g

• Agua destilada 1000 ml

• Mezclar hasta disolver. Ajustar pH a 6.0 con 1N HCl.

Agregue 0.5 ml de Tween 20 y mezcle. Almacene a temperatura ambiente por 3 meses o a 4°C

para un almacenamiento más largo.

Buffer de bloqueo universal (Universal Blocking Buffer)

• 1% BSA (Bloqueador y estabilizador)

• 0.1% cold fish skin gelatin (bloqueador)

• 0.5% Triton X-100 (Mejorador de la penetración)

• 0.05% sodium azide (preservante)

• 0.01M PBS, pH 7.2-7.4

Mezcle y almacene a 4 ºC. No lo utilice para diluir anticuerpos conjugados a HRP.

Solución bloqueadora de peroxidasa (Peroxidase Blocking Solution)

Peroxidase Blocking Solution (3% H2O2 in TBS)

• 10 ml de 30% H2O2

• 90 ml de 1X TBS

Almacene a 4°C por un máximo de 3 meses. Usar después de la incubación con el anticuerpo

primario. Se recomienda usar solo en cortes de bloques de parafina.

41

Solución bloqueadora de peroxidasa en base a Metanol (0.3% H2O2 in

Methanol)

• 1 ml de 30% H2O2

• 99 ml de Methanol

Almacene a 4°C por un máximo de 3 meses. Bloquee los cortes por 20-30 minutos antes del

bloqueo con suero o solución de bloqueo universal y antes la incubación con el anticuerpo

primario. Esta solución se recomienda usar solo en cortes por congelación.

Solución bloqueadora de fosfatasa alcalina (Alkaline Phosphatase Blocking

Solution)

• 2M Levamisole o levamizol

Disolver 0.5g de levamizol en 1mL de agua destilada. Levamisole hydrochloride tiene una

solubilidad de 50mg/mL y cuando se disuelve forma una solución transparente.Las soluciones son

estables hasta un mes luego de su preparación manteniéndolas a 4°C. Se usa es casos especiales

pues HIER inactiva la AP.

Paraformaldehido (al 4%, tamponado)

A) 8% Paraformaldehyde

• 40 g de Paraformaldehido

• 500 ml de agua destilada

B) Buffer fosfato 0.2M, pH 7.4

• 10.9 g de Na2HPO4

• 3.2 g de NaH2PO4

• 500 ml de agua destilada

42

La solución debe estar a pH 7.4. El pH solo se puede ajustar agregando sal monobásica. Caliente la

solución al 8% de PFA hasta los 60ºC mientras revuelve (No permita que la temperatura exceda los

60ºC). Una vez que la solución ha llegado a los 60°C y se ha disuelto todo el soluto, agregue 500 ml

de Buffer fosfato 0.2M, para hacer de la solución una al 4% PFA. Cuidadosamente agregue NaOH

1N hasta que la solución transparente (1-2 gotas por cada 500 ml). Enfríe la solución y luego filtre.

Prepare al momento de usar.

43

BREVE INTRODUCCIÓN A LOS MÉTODOS ESTADÍSTICOS

Una de las aplicaciones de la estadística es hacer inferencias a poblaciones, a partir de muestras.

En la realización de este proceso inferencial, siempre existe el riesgo de error o imprecisión ya sea

por el azar o la variabilidad biológica del fenómeno a estudiar. La carencia de error aleatorio

debido al azar se conoce como precisión. Cuanto más grande es el tamaño muestral, mayor es la

precisión y la variabilidad explicada por el azar disminuye. Esta posibilidad de error o falta de

precisión, siempre que no existan sesgos o variables de confusión, se corrige aumentando el

tamaño de la muestra. De cualquier manera el papel del azar debe ser siempre contemplado,

evaluado y medido, realizando test de hipótesis o construyendo intervalos de confianza para

conocer la precisión de nuestra estimación dentro de una seguridad previamente definida.

A pesar de las limitaciones de la estadística, el término "estadísticamente significativo" invade la

literatura médica y se percibe como una etiqueta que indicase "garantía de calidad". El considerar

el término significativo implica utilizar términos comparativos de dos hipótesis. Los test de

hipótesis son test de significación estadística que cuantifican hasta qué punto la variabilidad de la

muestra puede ser responsable de los resultados de un estudio en particular.

Ejemplo de lo anterior: Disponemos de 2 tratamientos (A y B). El tratamiento A lo reciben 25

pacientes y el tratamiento B otros 25 pacientes. 15 pacientes responden favorablemente al

tratamiento A y 20 al tratamiento B. ¿Existe diferencia significativa entre ambos tratamientos?

Ho (hipótesis nula) = No hay diferencia entre ambos tratamientos.

Ha (hipótesis alternativa) = Sí existe diferencia.

El proceso de aceptación o rechazo de la hipótesis lleva implícito un riesgo que se cuantifica con el

valor de la "p", que es la probabilidad de aceptar la hipótesis alternativa como cierta, cuando la

cierta podría ser la hipótesis nula.

El valor de "p" que indica que la asociación es estadísticamente significativa ha sido

arbitrariamente seleccionado y por consenso se considera en 0.05. Una seguridad del 95% lleva

implícito una p < de 0.05 y una seguridad del 99% lleva implícita una p < 0.01. Cuando rechazamos

la Ho (hipótesis nula) y aceptamos la Ha (hipótesis alternativa) estamos diciendo en otras palabras

44

que es muy poco probable que el azar fuese responsable de dicha asociación. Del mismo modo si

la p>0.05 decimos que el azar no puede ser excluido como explicación de dicho hallazgo y no

rechazamos la Ho (hipótesis nula).

Los tests de hipótesis

Al iniciar el análisis estadístico de una serie de datos, y después de la etapa de detección y

corrección de errores, un primer paso consiste en describir la distribución de las variables

estudiadas y, en particular, de los datos numéricos. Una de las distribuciones teóricas mejor

estudiadas en los textos de bioestadística y más utilizada en la práctica es la distribución normal,

también llamada distribución gaussiana. Su importancia se debe fundamentalmente a la

frecuencia con la que distintas variables asociadas a fenómenos naturales y cotidianos siguen,

aproximadamente, esta distribución. Caracteres morfológicos (como la talla o el peso), o

psicológicos (como el cociente intelectual) son ejemplos de variables de las que frecuentemente

se asume que siguen una distribución normal. No obstante, y aunque algunos autores6,7 han

señalado que el comportamiento de muchos parámetros en el campo de la salud puede ser

descrito mediante una distribución normal, puede resultar incluso poco frecuente encontrar

variables que se ajusten a este tipo de comportamiento.

Uno de los análisis estadísticos más comunes en la práctica es probablemente el utilizado para

comparar dos grupos independientes de observaciones con respecto a una variable numérica. Este

test corresponde a t de Student para dos muestras independientes. La aplicación de un contraste

paramétrico como este test requiere la normalidad de las observaciones para cada uno de los

grupos. La comprobación de esta hipótesis puede realizarse tanto por métodos gráficos (por

medio de histogramas, diagramas de cajas o gráficos de normalidad) como mediante tests

estadísticos (test de Kolmogorov-Smirnov, test de Shapiro-Wilks).

El caso en el que se dispone de dos grupos de observaciones independientes con diferentes

varianzas, la distribución de los datos en cada grupo no puede compararse únicamente en

términos de su valor medio. El contraste estadístico planteado en el apartado anterior requiere de

alguna modificación que tenga en cuenta la variabilidad de los datos en cada población.

Obviamente, el primer problema a resolver es el de encontrar un método estadístico que nos

permita decidir si la varianza en ambos grupos es o no la misma. El F test o test de la razón de

varianzas viene a resolver este problema.

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Esta información no alcanza a abarcar completamente la gran cantidad de tests estadísticos que

existen y sus usos respectivos. Pero entrega luces de algunos elementos fundamentales en la

comprensión de la utilidad de la estadística como herramienta científica. Si se desea continuar la

lectura de este capítulo de la mini-guía, sugiero encarecidamente visitar el sitio web:

http://www.fisterra.com/formacion/metodologia-investigacion/

Y realizar los trabajos estadísticos sobre el software Minitab® 17.1.0 que dejaré a libre disposición.

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REFERENCIAS

1. Walker K. Evaluación histopatológica de la distribución de las células troncales tumorales en cáncer

prostático y sus metástasis en un modelo ortotópico murino. Santiago, Chile. 2014.

2. Bravo M. Manual de procedimientos y técnicas histopatológicas. Morelia, Michoacan. 2011.

3. Conti C, Gimenez-Conti I, Benavides F, Frijhoff A, Conti M. Department of Carcinogenesis, Science

Park - Research Division, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Smithville, Texas.

American College of Laboratory Animal Medicine. 2004.

4. Kumar GL, Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods Fifth Edition.

Carpinteria CA: Dako North America. 2009.

5. Nakata T, Suzuki N. Chromogen-based immunohistochemical method for elucidation of the

coexpression of two antigens using antibodies from the same species. J Histochem Cytochem.

2012;60(8):611–9.

6. Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbins Pathologic Basis of Diseases, 5a edición, W.B. Saunders

Co., Philadelphia.

Las imágenes presentadas aquí son de exclusiva autoridad de sus respectivos autores.

miniguia de técnica histologica e inmunohistoquimica por k. walker bravo

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