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© Segunda Edición

Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María Telf. 471-3254 / Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997

Diseño e impresión : Art. Lautrec S.R.Ltda.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS TECNICOS PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO DE GONORREA

COMITÉ RESPONSABLE Dr. Carlos Carrillo Parodi Blgo. Marina Chiappe G. Blgo. Rosa Galván H. Blgo. José Portilla COMITÉ EDITOR Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIÓN Dr. Marino Costa Bauer Ministro Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PUBLICA Dr. César Cabezas Sánchez Director General

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PERFIL DE LA AUTORA Dr. Carlos Carrillo Parodi Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Blga. Marina Chiappe Gutierrez Bióloga, Master Ciencias Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Blga. Rosa Galván Huamán Bióloga Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. Profesor Auxiliar, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Blga. José Luis Portilla Carbajal Biólogo, Microbiólogo Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual y Leptospiras, División de Bacteriología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. PERFIL DE LOS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez-Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humbolt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Parodi Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Investigador, Instituto de Medicina Tropical “Alexander von Humbolt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia. El Comité Responsable agradece los comentarios y sugerencias realizados por los Drs. Pablo Campos y Jorge Sánchez del PROCETSS-MINSA. La publicación del Manual fue posible gracias al apoyo financiero brindado por USAID. La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

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INDICE

Presentación....................................................................................................................... 8 Resolución Jefatural.......................................................................................................... 9 CAPITULO I Introducción....................................................................................................................... 10 CAPITULO II OBJETIVOS Y ALCANCES DEL MANUAL................................................................ 11 2.1 Objetivos..................................................................................................................... 11 2.2 Alcance........................................................................................................................ 11 CAPITULO III OBTENCION DE LAS MUESTRAS............................................................................... 12 3.1 Hisopado uretral... ..............................................................................……………… 13 3.2 Hisopado cérvico vaginal... ................................................................……………… 14 3.3 Hisopado rectal........................................................................................................... 14 3.4 Hisopado faringeo ...................................................................................................... 14 3.5 Hisopado de Conjuntiva ............................................................................................ 14 3.6 Otras localizaciones.................................................................................................... 14 CAPITULO IV MEDIOS DE CULTIVO................................................................................................... 15 4.1 Aspectos generales..................................................................................................... 16 4.2 Siembra, incubación e identificación......................................................................... 16 4.3 Identificación presuntiva............................................................................................ 17 4.4 Identificación confirmatoria....................................................................................... 17 4.5 Reporte de Resultados................................................................................................ 17 CAPITULO V PROCESAMIENTO Y ENVIO DE LAS MUESTRAS................................................... 18 5.1 Procesamiento de las muestras................................................................................... 18 5.2 Envío de las Cepas..................................................................................................... 18 5.3 Identificación de Beta-Lactamasa.............................................................................. 19 5.4 Conservación de los aislamientos.............................................................................. 19 Flujograma de muestras para investigar Neisseria gonorrhoeae....................................... 20 Flujograma para identificación de Neisseria..................................................................... 21 CAPITULO VI NORMAS DE BIOSEGURIDAD.................................................................................... 22 CAPITULO VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.............................................................................. 23 CAPITULO VIII (ANEXOS)........................................................................................................................ 24 Anexo 1 Relación de equipos y materiales...................................................................................... 25 Anexo 2 Relación de Medios de cultivo y reactivos....................................................................... 26 Anexo 3 Preparación de los medios de cultivo............................................................................... 29

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Anexo 4 Pruebas de Identificación Presuntiva................................................................................ 31 Anexo 5 Ficha de envío de cepas.................................................................................................... 34 Anexo 6 Ficha de investigación epidemiológica para Bacterias de Transmisión Sexual (BTS)................................................................................................ 36

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PRESENTACIÓN Hace 117 años que A. Neisser describió a la Neisseria gonorrhoeae, en la pus de un paciente con uretritis, sufriendo desde aquella época (1879) una serie de interpretaciones debido al escaso conocimiento de su intrincada biología. Por algún tiempo se le consideró agente etiológico de la sífilis y por tanto estaba ubicada dentro de las denominadas “enfermedades venéreas”. Ha sido un ejemplo bacteriano de importante estudio que contribuyó mucho al mejor entendimiento de la resistencia a los antibióticos y a conocer los mecanismos de adaptación y desarrollo en medios de cultivo, permitiendo el diseño de formas de cultivo que ahora garantizan el éxito en su estudio. Pero tal vez los hechos más importantes lo constituyen la identificación de los mecanismos de variación que esta bacteria desarrolla a nivel de sus componentes de superficie. No solamente las variaciones de los PILI y los constantes cambios en las secuencias de DNA que son responsables de las variaciones antigénicas, sino también las recombinaciones y los intercambios de material genético explican la estrategia devastadora que desarrolla la Neisseria gonorrhoeae para evitar que el huésped desarrolle una respuesta inmune. Ahora con el avance tecnológico desarrollado en la última década se conocen la localización de los componentes de superficie que poseen un rol en la virulencia del germen y la forma cómo mediatizan la adherencia de su fijación en los tejidos, la formación de microcolonias y su relación con el factor de necrosis tumoral. Este manual permitirá comprender y mejorar los procedimientos para su aislamiento de las muestras y obtener cultivos puros que faciliten el desarrollo de estudios de fisiología experimental acerca de la biología de este microorganismo.

Dr. Carlos Carrillo Parodi Jefe

Instituto Nacional de Salud

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CAPITULO I

INTRODUCCION Las infecciones gonocócicas originan diferentes y variados cuadros clínicos como: uretritis, epididimitis, proctitis, cervicitis, bartolinitis, salpingitis, y faringitis en los adultos, vulvovaginitis en niñas y conjuntivitis en recién nacidos y en adultos. El agente etiológico, Neisseria gonorrhoeae, observado por primera vez por Albert Neisser en 1879, es un diplococo gram negativo cuya característica principal es el parasitismo intracelular leucocitario, con exigentes requerimientos nutritivos, pertenece a la familia Neisseriaceae a la que también pertenecen Moraxella, Kingella, Branhamella. El hombre es el único huesped natural conocido. Esta enfermedad bacteriana de transmisión sexual está limitada al epitelio cilíndrico y de transición y tiene un comportamiento clínico diferente en hombres y en mujeres. En los hombres la secreción uretral (exudado o drenaje de la uretra) es la presentación más común, cuyo período de aparición es de 2 a 7 días después del contacto con la persona enferma. La infección del recto suele ser asintomática, pero puede causar prurito, tenesmo y secreción. En las mujeres, después de la exposición y contagio aparece uretritis o cervicitis leve, que puede pasar inadvertida, y en aproximadamente 20% de casos hay invasión uterina, con síntomas de endometritis, salpingitis, o inflamación pélvica aguda. En hombres y mujeres puede originar infecciones faríngeas y anorrectales. La conjuntivitis aparece rara vez en los adultos, pero puede originar ceguera si no hay tratamiento oportuno. Formas generalizadas como la septicemia pueden presentarse en el 0,5% al 1 % de todas las infecciones gonocócicas con manifestaciones de artritis, lesiones cutáneas, y rara vez endocarditis y meningitis. La uretritis no gonocócica y la cervicitis mucopurulenta también pueden ser causadas por Chlamydia trachomatis y otros agentes de transmisión sexual, lo que dificulta el diagnóstico de la gonorrea. El diagnóstico bacteriológico se hace mediante cultivo en medios selectivos, como el Thayer-Martin modificado. En los frotices uretrales en los hombres, la presencia de diplococos intracelulares Gram negativos arriñonados se considera diagnóstica. Para muestras cervicales, anorrectales o faríngeas es necesario el empleo del cultivo debido a la escasa sensibilidad y especificidad de la coloración Gram y por la variada microflora local existente. Este manual tiene por objetivo uniformizar los criterios para los procedimientos e informe de las pruebas de laboratorio orientadas al diagnóstico de la gonorrea, estandarizadas en el Laboratorio de Bacterias de Transmisión Sexual del Instituto Nacional de Salud. Estas pruebas constituyen un invalorable apoyo para complementar el diagnóstico clínico y son base para la confirmación bacteriológica, permitiendo al personal de laboratorio contar con una guía que garantice la reproducibilidad de las pruebas que se realizan en los diferentes laboratorios del país. Con este propósito el Instituto Nacional de Salud, como órgano normativo referencial ha diseñado el presente manual de procedimientos para su uso en la Red Nacional de Laboratorios de Salud y otros.

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CAPITULO II

OBJETIVOS Y ALCANCES DEL MANUAL 2.1 OBJETIVOS

- Estandarizar técnicas para el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae.

- Servir como manual de referencia para los procedimientos de diagnóstico y confirmación etiológica de la Neisseria gonorrhoeae.

- Incentivar la participación de los laboratorios en la notificación y confirmación presuntiva de Neisseria

gonorrhoeae.

- Incentivar el envío de cepas presuntivas al Instituto Nacional de Salud para su confirmación, sensibilidad antimicrobiana y otras pruebas especiales.

- Apoyar el control de las enfermedades de transmisión sexual.

2.2 ALCANCE

- Destinado a los laboratorios de nivel local: Toma y envío de muestras.

- Destinado a los laboratorios de nivel intermedio: Procesamiento y diagnóstico presuntivo.

- Destinado a cualquier laboratorio que realice el diagnóstico microbiológico de Neisseria gonorrhoeae.

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CAPITULO III

OBTENCION DE LAS MUESTRAS Las muestras deberán obtenerse antes de iniciar el tratamiento del paciente y dependiendo del lugar de infección (uretra, cervix, recto, nasofaringe, ocular, etc.) se recolectaran con hisopos de baja toxicidad como dacrón, alginato de calcio o algodón. Es importante mencionar que de una adecuada toma de muestra dependerá la recuperación de un alto porcentaje de Neisseria gonorrhoeae y por lo tanto un diagnóstico acertado.

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3.1 HISOPADO URETRAL:

Se pueden tomar directamente de la uretra (ver Figura 3) o de un exudado obtenido exprimiendo la uretra, siguiendo los pasos que a continuación se detallan: • El paciente no deberá miccionar 2 horas antes de la toma de muestra. • Si hay secreción abundante limpiar externamente con gasa estéril. • Exprimir la uretra peneana • Tomar la muestra con hisopo uretral de alginato de calcio o de dacrón (ver Figura 2), a 1-2 cm del

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meato uretral. • Rotar el hisopo durante 30” en la uretra o si hay secreción abundante colocar la secreción directamente

sobre el hisopo. • Extender en el medio de cultivo e incubar. • Antes de eliminar el hisopo tomar nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina

portaobjeto limpia y desgrasada, para realizar la Coloración Gram. 3.2 HISOPADO CERVICO VAGINAL:

Colocar el espéculo estéril en el canal vaginal (si es necesario lubricarlo con agua destilada estéril, nunca con otro tipo de lubricantes o cremas que pueden ser letales para los gonococos) • Si hay secreción vaginal abundante limpiar con gasa el flujo vaginal. • Obtener la muestra con hisopo de algodón, alginato de calcio o de dacrón, directamente del canal

endocervical, a 1-2 cm. (Ver Figura 4). • Rotar el hisopo durante 30” en el canal cervical, en sentido horario. • Extender en el medio de cultivo, e incubar. • Antes de eliminar el hisopo tomar nuevamente la muestra y extenderla sobre una lámina portaobjeto

limpia y desgrasada para realizar la Coloración Gram. Si el himen está intacto obtener la muestra directamente del orificio vaginal utilizando hisopo de alginato de calcio y extenderlo sobre el medio de cultivo.

3.3 HISOPADO RECTAL:

Las muestras del recto se pueden tomar directamente (ver Figura 5), o con un espéculo (anoscopio): • Si hay secreción rectal, heces o sangrado, limpiar con gasa. • Tomar la muestra con hisopo de dacrón introduciendo 2-3 cm en el recto. • Rotar el hisopo durante 30” en las paredes del recto, en sentido horario (si se observa abundante

contaminación fecal en la torunda descartarla y obtener una segunda muestra). • Extender en el medio de cultivo e incubar. • Antes de eliminar el hisopo tomar nuevamente la muestra y extenderla suavemente sobre una lámina

portaobjeto limpia y desgrasada para realizar la Coloración Gram. 3.4 HISOPADO FARINGEO:

Las muestras faríngeas se toman directamente de las criptas amigdalianas: • Tomar la muestra con dos hisopos de algodón o de dacrón, introduciendo el hisopo hasta las criptas

amigdalianas, evitar chocar con la lengua o paladar, sujetando con un baja lenguas. • Rotar los hisopos por 30”. • Extender en el medio de cultivo e incubar. • Antes de eliminar el hisopo extender suavemente sobre una lámina portaobjeto para realizar la

Coloración Gram. 3.5 HISOPADO DE CONJUNTIVA:

Las muestras de conjuntiva se tomarán de la siguiente manera: • Limpiar con gasa y solución salina estéril la zona adyacente al ojo. • Suavemente con un hisopo de alginato de calcio, tomar directamente la muestra de la secreción

conjuntival. • Extender sobre los medios de cultivo. • Antes de eliminar el hisopo extender suavemente sobre una lámina portaobjeto limpia y desgrasada

para realizar la Coloración Gram. 3.6 OTRAS LOCALIZACIONES:

Si se sospecha de infecciones gonocócicas diseminadas se obtendrán muestras urogenitales, faríngeas y rectales, asi como muestras de sangre y fluido articular, pues la combinación de todas ellas presenta una alta sensibilidad. En caso de pacientes con enfermedad pélvica inflamatoria se obtendrán las muestras por laparoscopía.

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CAPITULO IV

MEDIOS DE CULTIVO 4.1 ASPECTOS GENERALES

Se conoce que el aislamiento de Neisseria gonorrhoeae ofrece mejores resultados, cuando la inoculación de las muestras obtenidas se hace directamente en los medios de cultivo, y se le proporciona una atmósfera de 3 a 7% de CO2 y 70 a 80% de humedad. Cuando no sea posible, la muestra se enviará en un medio de transporte adecuado como el Stuart modificado por Amies y medios selectivos para cultivo y transporte como el Transgrow o Thayer Martin Modificado, cuya eficacia dependerá de las condiciones ambientales que se utiliza. Por ser el gonococo, mucho mas complejo y exigente en cuanto a su requerimiento nutritivo, se utilizan medios enriquecidos como el agar chocolate, y selectivos como el Thayer Martin modificado, que contienen aminoácidos, glucosa, sales, y agentes reductores, complementados con vitaminas, coenzimas, bases nitrogenadas y productos metabólicos intermedios. El agar chocolate enriquecido contiene hidrolizados proteínicos y los suplementos nutritivos los proporciona el suplemento B®, Isovitalex®, Vitox® o autolisado de levadura, que existen en el comercio. La glucosa, los iones férricos, la cisteina, la cocarboxilasa y la glutamina estimulan la proliferación de pequeñas siembras. Los medios selectivos incluyen suplementos antibióticos: vancomicina, colistina, nistatina y la trimetropima en el medio Thayer Martin modificado y anfotericin B en el medio NYC (New York City). El agar base GC contiene nutrientes nitrogenados en forma de caseina y peptona de carne, el buffer fosfato sirve para mantener el pH y el almidón de maíz neutraliza los ácidos grasos tóxicos presentes en el agar. La hemoglobina proporciona el factor X (hemina) y los suplementos Isovitalex® o Vitox® proporcionan el factor V (nicotinamida adenina dinucleótido), vitaminas, aminoácidos, coenzimas, dextrosa, iones férricos y otros factores que aumentan el crecimiento de las Neisserias, los antibióticos: Vancomicina inhihe el crecimiento de bacterias Gram positivas. Colistina inhihe el crecimiento de las Gram negativas y la Nistatina inhibe el crecimiento de hongos y levaduras. A continuación se presentan diferentes medios de cultivo que existen en el comercio con sus respectivos constituyentes. La forma de prepararlos se detalla en el Anexo 3.

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4.2 SIEMBRA, INCUBACION E IDENTIFICACION 4.2.1 Siembra en el Medio de Cultivo (Figura 6):

Las muestras se inocularán directamente sobre los medios de cultivo, procurando depositar toda la muestra, rotando el hisopo directamente sobre la placa, formando una Z y con el mismo hisopo disemina la muestra en todo el medio. Si la muestra ha sido tomada directamente con el asa, se siembra sobre el medio de cultivo, en la forma descrita anteriormente y luego con la misma asa se dispersa toda la muestra.

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4.2.2 Incubación:

Los gonococos son muy sensibles a los extremos de temperatura, humedad y pH. Para su crecimiento óptimo necesitan una atmósfera de 3 a 7% de CO2; proporcionada con una vela blanca encendida (otro tipo de vela puede contener sustancias tóxicas) o pastillas generadoras de CO2 en recipientes herméticos (tipo GasPak o frascos de vidrio con tapa) o introduciendo dióxido de carbono a las estufas; asi tambien necesitan una atmósfera de 70 a 80% de humedad, que se proporcionará humedeciendo un pedazo de algodón o gasa con agua, la temperatura óptima de crecimiento es de 35 a 37°C.

4.2.3 Lectura:

Los cultivos deberán examinarse cada 18 a 24 horas, hasta las 72 horas, las colonias gonocócicas suelen tener 0,5 a 2 mm de diámetro, son brillantes, de color marrón oscuro en algunos casos incoloras, moderadamente convexas, mucoides con bordes uniformes. (Ver Figura 7).

4.3 IDENTIFICACION PRESUNTlVA de Neisseria gonorrhoeae

La identificación presuntiva de las colonias sospechosas se hace por: • Coloración Gram, observando Diplococos Gram negativos con morfología característica. (Anexo 4). • Prueba de oxidasa, cuya reacción es positiva. (Anexo 4). • Prueba de Superoxol (catalasa al 30%), se observa reacción positiva. (Anexo 4)

4.4 IDENTlFICACION CONFIRMATORIA de Neisseria gonorrhoeae

Se realiza a partir de las colonias con identificación presuntiva. mediante la prueba de utilización de carhohidratos esterilizados por filtración, determinándose la producción de acidez a partir de glucosa (GLU), y sin variación a partir de lactosa (LAC), maltosa (MAL) y sacarosa (SUC) a la concentración de 1 a 2%, contenidos en base cystina tripticase agar. (Anexo 4)

Características de Neisseria spp, y Branhamella spp

4.5 REPORTE DE RESULTADOS

Positivo: Si hay crecimiento de colonias con pruebas confirmatorias positivas. Sospechoso: Si se ha realizado las pruebas de identificación presuntiva. Negativo: Si no hay crecimiento de colonias hasta las 72 horas.

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CAPITULO V

PROCESAMIENTO Y ENVIO DE LAS MUESTRAS 5.1 PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS

a. Si la muestra ha sido tomada con hisopo (algodón, dacrón o alginato de Calcio), se inocularán directamente sobre los medios de cultivo, procurando depositar toda la muestra, rotando el hisopo directamente sobre la placa formando una Z y con el mismo hisopo diseminarla en todo el medio. Si la muestra ha sido tomada con asa de siembra, sembrar directamente sobre el medio de cultivo en la forma descrita anteriormente y luego con la misma asa se dispersa toda la muestra.

b. Colocar la placa (en forma invertida) en una campana de CO2 c. Encender una pedazo de vela blanca colocada sobre una lámina portaobjeto, para proporcionar una

atmósfera de 3 a 7% de CO2; así mismo colocar un pedazo de algodón humedecido con agua para darle una atmósfera de 70 a 80% de humedad. (Este paso se repetirá todas las veces que se abra la campana).

d. Cerrar la campana o frasco, esperar que la vela se apague, para garantizar el cierre hermético y la producción de CO2 e incubar a 37ºC.

e. Examinar las placas a las 18 a 24 horas de incubación y si no hay desarrollo microbiano, reincubar por 24 horas más. Si luego de 72 horas de incubación no hay desarrollo reportar como Cultivo Negativo a Neisseria gonorrhoeae.

f. A las colonias pequeñas (2-5 mm), redondas, convexas, brillantes, cremosas y mucoides, realizar la prueba de la OXIDASA, CATALASA y GRAM (Anexo 4).

g. Si se observan diplococos Gram negativos, y son oxidasa positivas, entonces sembrar en una placa de agar chocolate enriquecido con Isovitalex® o Vitox®, e incubar por 18 a 24 horas repitiendo los pasos c y d.

h. A partir de esta placa realizar una siembra con estría superficial en tubos conteniendo el medio de transporte Transgrow, medio Thayer Martín o chocolate enriquecido con Isovitalex® o Vitox®, para su envío al LABORATORIO DE REFERENCIA del INS, y si es posible realizar la confirmación con la prueba de fermentación de carbohidratos y detección de �-lactamasa (Anexo 4).

5.2 ENVIO DE CEPAS:

a. La colonia de Neisseria gonorrhoeae con las características anteriormente mencionadas se inocula por estría superficial en un tubo conteniendo el medio de transporte Transgrow modificado, en el medio Thayer Martín o agar chocolate enriquecido con Isovitalex® o Vitox®, e incubarlo 18 a 24 horas a 37ºC en atmósfera de CO2 y humedad (con vela encendida y algodón o gasa humedecida).

b. Si no se cuenta con el medio de transporte, al término de este periodo, sembrar en otro tubo conteniendo el mismo medio, pero no incubarlo.

c. Rotular los tubos con nombre o código que identifique la muestra. d. Envolver los tubos con papel absorvente o gasa, para evitar que se rompan e. Poner el frasco en una caja de espuma plástica (tecnopor). f. Rotular y enviar la caja lo mas pronto posible, acompañada de la ficha de envío de cepas (Anexo 5) a

nombre de:

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LABORATORIO DE BACTERIAS DE TRANSMISION SEXUAL

Jr. Cápac Yupanqui 1400 - Jesús María, Lima Teléfonos 471-9920, Fax: 471-2529 y 471-7443

Contiene Material Biológico NO REFRIGERAR

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5.3 IDENTIFICACION DE BETA-LACTAMASA

La detección de beta lactamasa debe realizarse en todos los aislamientos de Neisseria gonorrhoeae por su facilidad y bajo costo.

5.3.1 Discos de detección (CEFINASE):

El Nitrocefin es una cefalosporina coloreada que muestra un cambio de color rápido de amarillo a rojo cuando el enlace amino del anillo β-lactam es hidrolizado a β-lactamasa y es sensible a la hidrólisis que producen las lactamasas sean de bacterias Gram positivas o Gram negativas.

5.3.2 Procedimiento:

- Sacar a temperatura ambiente los discos o reactivos para detección de β-lactamasa. - Humedecer los discos con una gota de agua destilada estéril. - Tomar una porción de la colonia de Neisseria gonorrhoeae y colocarla sobre el disco. - Observar inmediatamente la reacción, es positiva si hay cambio de color a rojo, negativa si no se

evidencia ningún cambio de color. 5.3.3 Prueba Iodométrica Rápida:

- Preparar una solución de penicilina, pesando 0,06g de penicilina disuelta en 10 mL de buffer fosfato pH 6, esterilizarla por filtración, repartir 0,1 mL en tubos de 10 x 75 mm.

- Con un asa de siembra realizar un suspensión densa (Mc Farland 3) del cultivo bacteriano en los tubos con la solución de penicilina, agitar por 30”, dejar reposa esta mezcla por 30 minutos para permitir que la penicinilasa descomponga la penicilina.

- Añadir 0,05 mL (2 gota) de una solución que contine 0,1 g de almidón disuelto en 10 mL de agua destilada en baño de agua hirviente (Esta solución es estable hasta por 1 semana), mezclar bien.

- Añadir 0,02 mL (1 gota) de solución yodurada preparada con 0,406 g de yodo y 10,64g de yoduro de potasio disueltos en 20 mL de agua destilada (esta solución debe ser guardada a temperatura ambiente en frasco color ambar, no usarla si contiene precipitados).

- Agitar la mezcla con movimientos rotatorios durante 1 minuto, una decoloración rápida indica la presencia de la enzima β-lactamasa. Si se mantiene el color azul durante más de 10 minutos la bacteria no ha producido la mencionada enzima.

5.4 CONSERVACION DE LOS AISLAMIENTOS

Cuando se quiera conservar un cultivo se realiza una suspensión densa a partir de un subcultivo de 18 a 24 horas realizado en medios enriquecidos sin antibióticos (chocolate enriquecido) en un caldo Tripticase soya con 15% de glicerol y se congela a -70°C. Si se las conserva a -20°C, es necesario realizar subcultivos mensuales para mantener la viabilidad de las cepas.

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CAPITULO VI

NORMAS DE BIOSEGURIDAD* El error humano y las prácticas impropias de laboratorio pueden comprometer las mejores medidas de protección, por ello es indispensable que cada laboratorio adopte un código de prácticas apropiadas a su trabajo y que todo el personal lo cumpla estrictamente. El personal de laboratorio como cualquier otro trabajador, está expuesto a riesgos profesionales; la mayoría de las infecciones adquiridas en el laboratorio pueden atribuirse a uno o varios de los siguientes procedimientos peligrosos, comunes a todo el personal de laboratorio: - Procedimientos que originan riesgos de inhalación, por ejemplo al sembrar placas de agar, abrir cultivos,

flamear asas, emplear pipetas, centrifugar, homogenizar, etc. - Procedimientos que generan riesgos de ingestión, por ejemplo el pipetear con la boca, la manipulación de

muestras, hacer frotices y cultivos. - Procedimientos relacionados con la eliminación de material infeccioso.

Son pocos los casos de gonorrea producidos como consecuencia del trabajo en el laboratorio, la ingestión no constituye un peligro, pero si el contacto de la bacteria con la piel lacerada. La dosis infectante de la Neisseria gonorrhoeae es de una UFC (unidad formadora de colonia) viable. Todos los procedimientos para el diagnóstico de gonorrea deben ser realizados según el Nivel 2 de Bioseguridad, esto implica las siguientes medidas: - El personal de laboratorio debe tener un entrenamiento específico en el manejo de Neisseria gonorrhoeae. - El personal de laboratorio deberá llevar mandiles u otro uniforme apropiado. - Se utilizarán guantes para todos los procedimientos que obliguen al contacto directo con material

infeccioso. - No se debe pipetear material infeccioso con la boca ( muestras, cultivos, etc.) - No se permitirá comer, beber, fumar, almacenar alimentos, ni aplicarse productos de tocador en el

laboratorio. - Todas las personas deberán lavarse las manos después de manipular material infeccioso y también al salir

del laboratorio. - Todos los procedimientos se practicarán cuidadosamente a fin de reducir al mínimo la formación de

aerosoles. - El laboratorio siempre estará ordenado, limpio y libre de todo el material que no corresponda al trabajo

rutinario. - Las mesas de trabajo serán descontaminadas por lo menos una vez al día y después de cada procedimiento

con material contaminado. - Se descontaminará todos los deshechos líquidos o sólidos contaminados antes de su eliminación o darles

otro destino. - Cualquier derrame peligroso, accidente o contacto con material infeccioso se notificará de inmediato al Jefe

del laboratorio. - Sólo tendrán acceso al laboratorio, las personas a quienes se les han advertido los posibles peligros y reúnan

los requisitos específicos para entrar en el local. No se permitirá la entrada en el laboratorio a las personas expuestas a un mayor riesgo de adquirir una infección, o para quienes la infección puede resultar extraordinariamente peligrosa, entre estas personas tiguran los niños y los individuos afectados por inmunodeficiencia o inmunosupresión.

* Nota del editor: Para mayor información revise el Manual de Normas de Bioseguridad del Instituto Nacional de Salud (Ref. 4).

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CAPITULO VII

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. BECTON DICKINSON AND COMPANY. (1992). BBL. Mycrobiology System. USA.

2. CARRILLO C. (1996). Neisseria. Separata, Curso Microbiología Médica. Facultad de Medicina Alberto Hurtado, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Lima, Perú. 30 pp.

3. CUMULATIVE TECHNIQUES AND PROCEDURES IN CLINICAL MICROBIOLOGY. (1993).

Laboratory Diagnosis of Gonorrhea. 4A. American Society for Microbiology. Washington D.C.

4. GUILLEN O., A.; BELTRAN, M.; QUISPE, N.; VALVERDE, A.; ZAVALETA. A. (1996). Manual de Normas de Bioseguridad (Zavaleta, A.; Cabezas, C.; Carrillo, C.; Chang, J.; Eds). Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública. Serie de Normas Técnicas N° 18. Lima, Art. Lautrec. 62 pp.

5. MARDH. P.A. and DANIELSSON, D. (1990). Neisseria gonorrhoeae. In: HOLMES KK ET AL.

Sexually transmitted diseases. 2nd Ed. New York, Mc Graw - Hill : 903-916.

6. OLMOS, Y. y VASQUEZ, J. (1993). Infecciones Gonocócicas. En: VILATA J.J. Enfermedades de Transmisión Sexual. J.R. Barcelona. Prous Editores.

7. ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1963). Serie de Informes Técnicos 262. Comité de

expertos de la OMS en infecciones gonocócicas. ler Informe. Ginebra.

8. ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1978). Serie de Informes Técnicos 616. Neisseria gonorrhoeae e Infecciones gonocócicas.

9. ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD. (1994). Manual de bioseguridad en el laboratorio. 2da.

Ed. Ginebra.

10. ORGANIZAClON PANAMERICANA DE LA SALUD. Publicación científica 538. El Control de las enfermedades transmisibles en el hombre (Abram S. Benensor Ed.) 15° Ed. Ginebra, 295 pp.

11. POTTER. L.; LEWIS, J.; WENTWORTH, B. and LARSEN, H. (1983). Amonium bicarbonate as a

replacement for carbon dioxide in Transgrow bottles for primary isolation of Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology, 18(5): 1258-1259.

12. SPARLlNG P.F. (1990). Biology of Neisseria gonorrhoeae in HOLMES KK ET AL. Sexually

Transmitted Diseases. 2nd Ed. New York, Mc Graw - Hill : 131-147.

13. THAYER, J.D and MARTIN, J.E. (1978). A selective Medium for the cultivation of N. gonorrhoeae and N. meningitidis. Public Health Rep. 81 (6):559-562.

14. UNIPATH. (1995). Manual de Oxoid. España.

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CAPITULO VIII

ANEXOS

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ANEXO 1 A.1 RELACION DE EQUIPOS Y MATERIALES

- Incubadora a 37ºC - Autoclave - Campana o Jarra de CO2, o frasco de vidrio de boca ancha con tapa de rosca. - Placas petri - Frascos de 500 mL - Jeringa de 20 mL o pipeta de 10 mL estériles - Probeta graduada - Tubos de 4mL ó frascos de penicilina - Bagueta de vidrio o agitador con barra magnética - Vela blanca - Gasa o algodón - Papel filtro (Whatman N°1) - Asa de siembra - Palitos de madera estéril o asa de aluminio - Hisopos de algodón, dacrón o alginato de calcio - Láminas portaobjetos

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ANEXO 2 A.2.1 RELACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

- GC Agar base - Hemoglobina soluble (concentración final 2%) - SUPLEMENTOS:

SR-56D (Oxoid) o Isovitalex® (BBL11876) o Vitox® (OXOID) + VCNT (BBL, OXOID) o VCN (BBL, OXOID)

- N ,N ,N ,N, Tetrametil-p-fenilendiamine - Peróxido de hidrógeno al 30 % - Carbohidratos: GLUCOSA, MALTOSA, LACTOSA, SACAROSA o Sistema de identificación

rápida (API Quad-FERM, API, 4H-NG, etc.) (Opcional) - Discos de Nitrocefin u otro (Opcional)

A.2.2 COMPOSICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO A.2.2.1 GC AGAR BASE Caseina digerida por enzimas pancreáticas 7,5 g Tejido animal digerido por enzimas péptidicas 7,5 g Almidón 1,0 g Fosfato dipotásico 4,0 g Fosfato monopotásico 1,0 g Cloruro de sodio 5,0 g Agar 10,0 g A.2.2.2 HEMOGLOBINA SOLUBLE Hemoglobina (Concentración final) 2% A.2.2.3 G.C. SUPLEMENTO ESTERIL SELECTIVO ENRIQUECIDO (Código SR 056D) (Oxoid)

Autolisado de levadura 5,0 g Dextrosa 0,75 g Bicarbonato de sodio 0,075 g Vancomicina 1,5 mg Metilsulfonato de colistina 3,75 mg Nistatina 6250 unidades Trimetoprima 2,5 mg

A.2.3 SUPLEMENTOS ESTERILES ENRIQUECIDOS: A.2.3.1 GC SUPLEMENTO ISOVITALEX® (Código 11876) (BBL) Fórmula aproximada por litro de agua purificada: Vitamina B12 0,01 g L-Glutamina 10,0 g Adenina 1,0 g Guanina HCL 0,03 g Acido p-Aminobenzoico 0,013 g Diphosphopyridine Nucleotide, Oxidized (Coenzyme 1) 0,25 g Cocarboxylasa 0,1 g Nitrato férrico 0,02 g

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Tiamina HCL 0,003 g L-Cysteina HCL 25,9 g L-Cystina 1,1 g Dextrosa 100,0 g A.2.3.2 SUPLEMENTO ESTERIL AUTOLISADO DE LEVADURA Autolisado de levadura 5,0 g Dextrosa 0,5 g Bicarbonato de sodio 0,075 g A.2.3.3 VITOX® (liofilizado) Es un liofilizado concentrado de factores de crecimiento Contenido por vial: Vitamina B12 0,1 mg

L-glutamina 100,0 mg Adenina SO4 10,0 mg Guanina HCL 0,3 mg Acido p-Aminobenzoico 0,13 mg L-cystine 11,0 mg NAD (Coenzyme 1) 2,5 mg Cocarboxylasa 1,0 mg Nitrato Ferrico 0,2 mg Tiamina HCL 0,03 mg Cysteina HCL 259,0 mg Dextrosa 1,0 mg

A.2.3.4 VITOX (Líquido para hidratar)

Contenido por vial

Dextrosa 1,0 g Agua destilada 10,0 mL

Vitox® puede ser usado satisfactoriamente para una concentración final de 1% v/v en medios de cultivo (1 vial para 1000 ml de medio), es recomendable incrementar la concentración al 2% para el medio Thayer Martin (1 vial para 500 ml de medio).

A.2.4 SUPLEMENTOS ESTERILES SELECTIVOS: A.2.4.1 VCN SUPLEMENTO ANTIBIOTICO

Fórmula por vial

Vancomycina 1,5 mg Colistin methane sulfonate 3,75 mg Nistatina 6250 unidades

A.2.4.2 VCNT SUPLEMENTO ANTIBIOTICO

Fórmula por vial

Vancomycina 1,5 mg Colistin methane sulfonate 3,75 mg Nistatina 6250 unidades Trimethoprima 2,5 mg

A.2.4.3 LCAT SUPLEMENTO ANTIBIOTICO

Fórmula por vial

Lincomycin 0,5 mg

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Colistin 3,0 mg Amphotericin B 0,5 mg Trimethoprim lactate 3,25 mg

A.2.4.4 VCAT SUPLEMENTO ANTIBIOTICO Fórmula por vial

Vancomycina 1,0 mg Colistin sulphate 3,75 mg Amphotericin B 0,5 mg Trimethoprim lactate 1,5 mg

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ANEXO 3

PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO A.3.1 THAYER MARTIN (Modificado con fracciones de levadura) SR56D

Para 500 mL de medio a. Pesar 18 g de GCAgar Base y disolver en 235 mL de agua destilada. Calentar hasta su completa

disolución y hervir solo por un minuto. b. Pesar 5 g de Hemoglobina (concentración final 2%) y disolver en 250 mL de agua destilada tibia,

agitar hasta disolver completamente, utilizando bagueta de vidrio y si es posible en agitador con barra magnética.

c. Colocar 20 mL de agua destilada en un frasco, para ser usado como diluyente del suplemento. d. Autoclavar todo este material a 121ºC por 15 minutos. e. Enfriar los medios de cultivo y mantenerlos a 50ºC, mientras se prepara el suplemento. f. Con una jeringa estéril o pipeta, añadir 15 mL de agua destilada estéril (37ºC) al suplemento SR56D,

y agitar hasta su completa disolución. Si se va a usar otro suplemento seguir las instrucciones del fabricante.

g. Mezclar suavemente el GC con la Hemoglobina, evitando formar burbujas, finalmente añadir el suplemento disuelto. Homogenizar rápidamente y repartir en placas petri.

h. Esperar que las placas se solidifiquen. i. Secar las placas en forma invertida en incubadora (37ºC) por 2 horas, sellarlas con parafilm o

cubrirlas con papel kraft y colocarlas en bolsas plásticas. j. Guardar en refrigeración, hasta por 3 semanas.

A.3.2 THAYER MARTIN MEDIUM (Modificado con Vitox® o Isovitalex® y VCN o VCNT)

Para 500 mL de medio a. Pesar 18 g de GC Agar Base y disolver en 240 rnL de agua destilada. Calentar hasta su completa


agitar hasta disolver completamente, utilizando bagueta de vidrio y si es posible agitador con barra magnética.

c. Autoctavar todo este material a 121°C por 15 minutos. d. Enfriar los medios de cultivo y mantenerlos a 50°C, mientras se preparan los suplementos. e. Disolver el contenido del vial de Vitox® o Isovitalex®) directamente con su diluyente. f. Disolver el contenido del vial VCN o VCNT con su respectivo diluyente. g. Mezclar suavemente el GC con la Hemoglobina, evitando formar burbujas, finalmente añadir los dos

suplementos disueltos. Homogenizar rápidamente y repartir en placas petri. h. Esperar que las placas se solidifiquen. i. Secar las placas en forma invertida en incubadora (37°C) por 2 horas, sellarlas con parafilm o

cubrirlas con papel kraft y colocarlas en bolsas plásticas. j. Guardar en refrigeración, hasta por 3 semanas.

A.3.3 CHOCOLATE ENRIQUECIDO (Con Vitox® o Isovitalex®)

Para 500 mL de medio a. Pesar 18 g de GC Agar Base y disolver en 240 mL de agua destilada. Calentar hasta su completa


agitar hasta disolver completamente, utilizando bagueta de vidrio y si es posible agitador con barra magnética.

c. Autoclavar todo este material a 121°C por 15 minutos. d. Enfriar los medios de cultivo y mantenerlos a 50°C, mientras se prepara el suplemento. e. Disolver el contenido del vial de Vitox® o Isovitalex® directamente con su diluyente. f. Mezclar suavemente el GC con la Hemoglobina, evitando formar burbujas, finalmente añadir el

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suplemento disuelto. Homogenizar rápidamente y repartir en placas petri. g. Esperar que las placas se solidifiquen. h. Secar las placas en forma invertida en incubadora (37°C) por 2 horas, sellarlas con parafilm o

cubrirlas con papel kraft y colocarlas en bolsas plásticas. i. Guardar en refrigeración, hasta por 3 semanas.

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ANEXO 4

PRUEBAS DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA A.4.1 COLORACION GRAM

Por este método se pueden separar a las bacterias en dos grupos: las Gram Positivas y las Gram Negativas, aquellos microorganismos que retienen el cristal violeta son designados como Gram positivos, mientras que aquellos que se tiñen con el colorante de contraste (safranina) y toman la coloración rojiza son Gram negativas, las Neisserias son diplococos Gram negativos. Este método es concluyente en el caso de muestras de la uretra masculina, su utilidad es menos segura para muestras tomadas de otros sitios y sobre todo en la mujer. En el examen directo se considera: POSITIVO : si se encuentran diplococos intracelulares gram negativos típicos

(forma arriñonada); SOSPECHOSO o ambiguo: si solo se encuentran diplococos atípicos o extracelulares y NEGATIVO : si no se observan diplococos Gram negativos. A partir de un cultivo se buscará las formas típicas (diplococos Gram negativos de forma arriñonada).

A.4.1.1 Procedimiento:

a. Colocar una porción de la colonia sospechosa sobre una lámina porta objetos limpia, fijar el frotis con calor suave.

b. Cubrir la lámina con cristal violeta durante 60”. c. Lavar con agua corriente. d. Cubrir la lámina con lugol durante 60”. e. Lavar con agua corriente. f. Decolorar con alcohol acetona (1:1), hasta que no haya desprendimiento de colorante. g. Lavar con agua corriente. h. Cubrir la lámina con safranina por 60”. i. Lavar con agua corriente. j. Secar la lámina al aire o con calor, y colorear sobre papel secante suavemente. k. Observar en el microscopio utilizando objetivo de inmersión.

A.4.2 PRUEBA DE LA OXIDASA

Esta prueba sirve para detectar la presencia de la enzima citocromo oxidasa (Indofenolasa u oxidasa de indofenol), presente en las Neisserias, la cual tiene la propiedad de oxidar el tetrametil-p-fenilendiamine en indofenol, presentando una coloración azúl violácea.


a. Preparar el reactivo N,N,N,N, tetrametil-p-fenilendiamine al 1%, en un tubo o frasco color ámbar, disolviéndolo con agua destilada, el excedente guardarlo en refrigeración.

b. Sobre una lámina porta objetos, humedecer un pedazo de papel de filtro con el reactivo preparado.

c. Tomar una porción de la colonia sospechosa con un palito de madera o un alambre de platino (otro tipo de alambre contiene fierro que puede dar reacción falsa positiva).

d. Colocarlo haciendo una estría sobre el papel de filtro, esperar la reacción por 30”. e. Si la reacción es positiva el papel tomará un color azul violáceo, y si es negativa no habrá cambio de

color en el papel.

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Alternativamente se puede añadir unas gotas del reactivo directamente sobre las colonias en el medio Thayer Martin, la reacción es positiva cuando se tiñen de color azúl violáceo.

A.4.3 PRUEBA DE CATALASA O SUPEROXOL

Esta prueba se utiliza para detectar la presencia de la enzima catalasa, presente en todas las especies del género Neisseria, capaces de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular, sin embargo la Neisseria gonorrhoeae produce mayor cantidad de esta enzima, por lo que para poder detectarla se usa el peróxido de hidrógeno al 30% en vez del 3% convencional.


a. Depositar una gota del peróxido de hidrógeno al 30% en una lámina porta objetos. b. Con el asa de siembra colocar una porción de la colonia en estudio sobre la gota. c. Observar inmediatamente, la presencia de burbujas de gas, que indicará que la reacción es positiva,

siendo consideradas como negativas aquellas que tarden más de 3 segundos en dar esta reacción, o presenten un burbujeo débi1.

A.4.4 PRUEBAS DE IDENTIFICACION CONFIRMATORIA

La identificación de la Neisseria gonorrhoeae puede realizarse mediante diferentes métodos, aunque la prueba de utilización de carbohidratos constituye la prueba de referencia de mayor uso.

A.4.4.1 PRUEBA DE UTILIZACION DE CARBOHIDRATOS:

Diversos carbohidratos son utilizados por las bacterias y el modelo de fermentación es característico para ciertas especies, géneros o familias que pueden atacar uno o más azúcares y producir ácido y/o gas, el que se evidenciará por el viraje de color del indicador de pH incorporado al medio de cultivo con 1% de carbohidratos. Existen además métodos rápidos colorimétricos, cromogénicos y bioquímicos que han sido desarrollados con altas concentraciones de carbohidratos que sirven como sustratos deshidratados para ser usados por las enzimas bacterianas presentes en un inóculo denso de bacterias, los carbohidratos son preparados en soluciones tamponadas y tienen como indicador de pH al rojo de fenol. Las reacciones son leídas en 1 a 4 horas. Varios sistemas comerciales (Api-Quad ferm®, 4H-Neisseria®, API®, etc) basados en el principio de degradación de carbohidratos y β-lactamasa son usados para la identificación de Neisseria y Branhamella.

A.4.4.1.1 Procedimiento del método convencional:

a. Del cultivo primario, sembrar una placa de agar chocolate enriquecido, e incubar 18-24 horas a 37ºC en atmósfera de CO2.

b. Preparar el agar Cisteina Tripticase (CTA) como medio base, disolviendo 29,5 g en un litro de agua destilada, autoclavar a 121°C por 15 minutos, enfriar a 45 a 50°c en baño maría.

c. Añadir individualmente al medio base, los carbohidratos: glucosa, lactosa, maltosa y sacarosa al 1%, esterilizados por filtración.

d. Repartir de 4 a 5 mL, en tubos pequeños (12 x 75 mm). e. Inocular las colonias del agar chocolate enriquecido a los tubos con carbohidratos, por puntura

profunda. f. Tomar un tubo del carbohidrato sin sembrar para control. g. Incubar 18 a 24 horas a 37ºC en aerobiosis (sin CO2). h. Realizar la lectura mediante el cambio de color del indicador rojo de fenol, considerar positiva la

producción de ácido cuando ha virado de rojo a amarillo. Alternativamente se puede preparar un inóculo denso, en 0,5 ml de solución salina estéril, y una gota de esta suspensión colocar en la superficie del medio CTA semisólido.

A.4.4.1.2 Procedimiento del método rápido:

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a. De la placa de agar chocolate enriquecido realizar un inóculo bacteriano denso* (Escala McFarland N°3), en solución salina o diluyente incorporado por el fabricante.

b. Depositar 100-200 uL* del inóculo en cada pocillo que contiene los azúcares desecados. c. Incubar de 2 a 4 horas* en aerobiosis. d. Realizar la lectura por cambio de coloración en cada pocillo.

* Dependiendo de la prueba rápida a utilizar.

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Esta publicación se terminó de imprimir en Diciembre de 1997 en los

Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la República 731 - Lima 13

Tel/Fax: 423-7616

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