mirka Šafaříková tel. 38777 5627 [email protected] na sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140
DESCRIPTION
Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 [email protected] Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140. Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů: zopakovaní základních principů a postupů. Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin. R CH COOH. R CH COO -. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/1.jpg)
Mirka Šafaříková
Tel. 38777 5627
Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140
Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:
zopakovaní základních principů a postupů
![Page 2: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/2.jpg)
Acidobazické rovnováhy v roztocích aminokyselin a bílkovin
Aminokyseliny - amfionty
R CH COOH
NH2
R CH COO-
NH3+
H3O
+OH
-
R
+H
3N
H
C COO-
R
+H
3N
H
C COOH
R
H2N
H
C COO-
Komerční - většinou hydrochloridy (NH3+Cl-)
Amfolyty - sloučeniny schopné vystupovat jako kyseliny nebo jako zásady
![Page 3: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/3.jpg)
pH 4 - 8 → aminokyselin jako amfionty
Proteiny – amfolyty
- na povrchu molekuly několik desítek postranních řetězců AK schopných disociace
![Page 4: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/4.jpg)
Isoelektrický bod (pI)
Isoelektrický bod - Hodnota pH, kdy výsledný náboj molekuly je roven nule
R CH COO-
NH3+
pI = 1
2(pK1 + pK2)
amfolyty odštěpují H+amfolyty přijímají H+ pI
NH3+RCOOH NH2RCOO-
pI proteinů: neutrální cca 5-6 kyselé cca 2-3 bazické cca 9-11
![Page 5: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/5.jpg)
Purifikace proteinů
Cíl: získat co nejlepší výsledek (čistota, aktivita, množství enzymu)
Dostupnost a typ vstupního materiálu, stabilita a obsah izolovaného enzymu, nároky na čistotu preparátu
počet purifikačních kroků – omezení ztrát, časová a finanční náročnost
Žádná metoda není dokonalá – je třeba si ujasnit k jakému účelu má sloužit
Typ purifikační metody a její parametry je třeba volit uváženě, abychom získali dobré výsledky.
- záleží na typu analyzovaného vzorku, parametrech metody, velikosti souboru zpracovávaných vzorků... (klinická lab, potravinářská a environmentální analytika, výzkum)
![Page 6: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/6.jpg)
Metody obecně používané v
biochemických laboratořích
Metody
základní• rozpuštění• hrubé oddělení
speciální• izolace• stanovení
homogenizace, desintegrace, filtrace, centrifugace
chromatografické, elektroforetické, spektrofotometrické, enzymové, ...
převedení biomolekul do kapalné fáze
![Page 7: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/7.jpg)
Volba separační metody
Dělení látek podle rozdílných vlastností: molekulová hmotnost elektrické vlastnosti povrchové vlastnosti biochemická aktivita
Metoda pokusu a omylu obvykle nedává optimální výsledky
Metody používané v programu:
purifikace - srážení, dialýza, chromatografie ionexová, hydrofobních interakcí, gelová, (chromatofokusace)
kontrola stupně purifikace – celkové množství proteinu, enzymová aktivita, elektroforesa, výtěžnost, nabohacení
![Page 8: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/8.jpg)
Srážení (NH4)2SO4 - vysolováníprotein
(NH4)2SO4
snížení rozpustnosti
zvýšení rozpustnosti
(NH4)2SO4
vsolování – snižování hydrofobních int.
vysolování – ztráta hydratačního obalu
různé bílkoviny se sráží při různých koncentracích
Používá se v počátcích purifikace, kdy je koncentrace proteinu ještě vysoká (> 1mg/ml)
![Page 9: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/9.jpg)
Množství pevného síranu amonného (g), které je potřeba přidat k 1 litru roztoku, aby se dosáhlo žádané změny v procentech nasycení roztoku síranem amonným.
![Page 10: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/10.jpg)
Difuse nízkomolekulárních látek přes membránu vyšší koncentrace → nižší koncentrace
Použití:odstraňování (výměna) nízkomolekulárních látek (odsolování, výměna pufru)
Dialýza
koncentrační gradient
elektrodialýza - urychlení pohybu nabitých iontů v el. poli
Membrány: deriváty celulosy, MWCO 100 Da → 1 000 kDa
Membrány, dutá vlákna
odsolování – MWCO 10 (25) kDa
voda, pufr s nízkou iontovou silou
![Page 11: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/11.jpg)
Ionexová chromatografieChromatografie na měničích iontů
Ion Exchange Chromapography - IEC
Princip: separace podle náboje
Iontoměniče (ionexy - “ion exchangers”) - pevné látky, které jsou schopny vyměňovat ionty s kapalnými fázemi. Částice iontoměničů obsahují kovalentně vázané ionizovatelné skupiny.
porézní materiály
elektrostatické interakce – eluce změnou pH, iont. síly
![Page 12: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/12.jpg)
katex - výměna kationtů anex - výměna aniontů
Separace látek podle afinity k ionexu - velikost nábojů na povrchu molekuly, tvar molekuly
Pevnost vazby - pH, iontová síla roztoku
Ionex = nerozpustná matrice s kovalentně navázanými skupinami nesoucími náboj
Cl-, OH-Na+, H+
![Page 13: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/13.jpg)
Vliv pH na velikost náboje:
Vliv iontové síly:
vyšší iontová síla → slabší vazba na ionex
P-
P+
pH:
většina bílkovin má pI v rozmezí pH 5 - 6 a je stabilní obvykle v rozmezí pH 6 - 9
katex: pH 3 – 8 (bazické proteiny)
anex: pH 5 – 10většinou vazba na anex
![Page 14: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/14.jpg)
Funkční skupiny
CM karboxymethyl- slabý katex SP sulfopropyl- silný katexS sulfomethyl- silný katexSHP sulfohydroxypropyl- silný katexDEAE diethylaminoethyl- slabý anex TEAE triethylaminoethyl- silný anexQAE kvarterní aminoethyl- silný anexQ kvarterní amin – silný anexTMAHP trimethylaminohydroxypropyl- silný anex
Silné ionexy – jsou úplně disociovány v širokém rozmezí pH (sulfoskupiny, kvarterní aminoskupiny)
Slabé ionexy – jejich ionizovatelnost je silně závislá na pH. Slabé ionexy jsou obvykle ionizované při pH 6 - 9, jinak ztrácejí náboj
![Page 15: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/15.jpg)
Průtoková rychlost:
závisí na: rozměrech kolony, velikosti a tvaru ionexových částic
rychlost 3 - 10 ml.cm-2.min-1 (cca 5 cm/h)
Eluce:
vymytí změnou složení eluentu gradientová eluce gradient iontové síly - vzestupný směrgradient pH – směrem k pI příkrost gradientu (příkrý - menší naředění, nižší rozlišení)celkový objem eluentu – 10ti – 20ti násobek objemu náplně kolony
![Page 16: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/16.jpg)
Chromatografie s hydrofobní interakcí
Hydrofobní interakce
Makromolekuly - hydrofobní skupiny (na povrchu nebo zanořené v kapsách)
Zcela hydrofobní materiály (polystyren) – vazba molekuly ireversibilní (denaturace)
hydrofobní sorbenty – hydrofobní zóny
ligandy: oktyl-, fenyl-, propyl-
![Page 17: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/17.jpg)
Desorpce: snížení iont. síly, záměna iontů s nižším vysolovacím efektem, snížení polarity, přidavek tenzidu
Metoda silně závislá na experimentálních podmínkách.
Síla vazby roste s:rostoucí iont silou (4M NaCl, 1M (NH4)2SO4, teplotou,nejsilnější interakce: pH – pI
Síla vazby klesá v přítomnosti chaotropních iontů, alifatických alkoholů, hydrofobních molekul
![Page 18: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/18.jpg)
Gelová (permeační) chromatografie Gelová filtrace
na principu molekulárního síta - molekuly se separují podle velikosti a tvaru v pórech gelu
relat. nezávislá na složení mobilní fáze
Frakcionace peptidů, oligosacharidů, nukleotidů, bílkovin, enzymů, virů, nukleových kys.
malé molekuly – difuse do struktury gelu → pomalejší postup kolonou
velké molekuly – volně protékají
nesferické molekuly - chovají se jako by byly větší
![Page 19: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/19.jpg)
Stupeň rozlišení:
Rs =vzdálenost mezi separovanými zónami
šířka zón Rs > 1.2
Rozlišovací schopnost stoupá úměrně s druhou odmocninou délky sloupce
Aplikace vzorku:
objem vzorku 1-5% objemu kolony, pro odsolení až 30%
neúčinné dělení zředěných vzorků!!!
Pro lepší rozlišení - delší kolony s menším průměrem (ale roste doba separace). → opakovaně aplikovat vzorek na kolonu nebo použít sérii kolon
![Page 20: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/20.jpg)
Frakcionační rozsah gelu:
Rozsah molekulových hmotností nebo velikostí molekul, v němž změna velikosti způsobí změnu elučního objemu.
Sephadex G-25 1 – 5 kDa
Sephadex G-100 4 – 150 kDa
molekuly penetrují do gelu bez zábran Ve → Vt
molekuly nepronikají do gelu Ve → V0
mez vyloučení - velikost největšího proteinu, který může penetrovat do pórů gelu
![Page 21: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/21.jpg)
Často se překrývají, potom lépe použít gel s nižší vylučovací mezí, protože požadované látky budou z kolony eluovány dříve.
![Page 22: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/22.jpg)
Použití:
orientační stanovení Mr, odsolování (Sephadex G-25, oddělení molekul do 5 kDa)purifikace, zakoncentrování (přídavkem suchého Sephadexu G-25)
Výhody:
šetrná metoda, není důležité složení eluentu, separace je nezávislá na koncentraci látky (lze separovat i vysoce konc. vzorky – ale nesmí být moc viskozní), teplotělevná, jednoduchá
Omezení:
nutné aplikovat malý objem vzorku (ca 1% Vt) – omezení vlivu difuse
![Page 23: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/23.jpg)
techniky s vysokou kapacitou
techniky s nízkou kapacitou
![Page 24: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/24.jpg)
Produkt jedné metody by měl být využit v další metodě.
![Page 25: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/25.jpg)
precipitace
hydrofobní interakce
ionexová chromatogr. (afinitní chromatogr.)
obsah solí, pH – není důležité objem a koncentrace vzorku
zakoncentrování vzorku (elektroforesa)
gelová filtrace odstranění částečně zdenaturovaných nebo agregovaných artefaktů
dialýza, gelová f. G-25
![Page 26: Mirka Šafaříková Tel. 38777 5627 mirkasaf@usbes.cz Na Sádkách 7, 1. patro , č. dveří 140](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062409/56815044550346895dbe454c/html5/thumbnails/26.jpg)
Obsah protokolu:1. Číslo a charakteristika enzymu2. U každého purifikačního kroku uvést zdůvodnění použité
metody a nastavení jejích parametrů 3. U každého purifikačního kroku uvést výsledek – případné
ztráty, výtěžnost (množství celkového proteinu a aktivity), nabohacení a efektivitu purifikace
4. Na závěr celý postup prezentovat formou tabulky
Izolace enzymuProtein (mg)
Enzym (U)Výtěžek
enzymu (%)Nabohacení
Časová náročnost (čl./hod)
Na začátku izolace 511 14700 100 1 0
Amonium sulfát 181 14831 100 2,8 0,01
Hydrofobní interakce 172 14075 95,7 2,8 0,06
Ionex 26,4 13879 94,4 18,3 0,12
Gelová filtrace 20,2 13544 92,1 23,3 0,18
5. Závěr: Formulovat výsledek celého purifikačního procesu