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Franck BOURGADE, Marion BERARD, Institut Pasteur Paris Christine MEDAILLE, Laboratoire Vébiotel Arcueil Armelle SENECHAL, Laboratoire de Contrôle Sanitaire CDTA Orléans Stéphanie SERRE, Laboratoire Diagnostic CRL France MISE EN PLACE D'UN PROGRAMME SANITAIRE EN ANIMALERIE ET DIAGNOSTICS DES MICROORGANISMES INTERFÉRENTS EN RECHERCHE BIOMEDICALE

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Franck BOURGADE, Marion BERARD, Institut Pasteur Paris

Christine MEDAILLE, Laboratoire Vébiotel Arcueil

Armelle SENECHAL, Laboratoire de Contrôle Sanitaire CDTA Orléans

Stéphanie SERRE, Laboratoire Diagnostic CRL France

MISE EN PLACE D'UN PROGRAMME SANITAIREEN ANIMALERIE

ETDIAGNOSTICS DES MICROORGANISMES

INTERFÉRENTS EN RECHERCHE BIOMEDICALE

La Recherche de Parasites chez La Recherche de Parasites chez les rongeurs de laboratoireles rongeurs de laboratoire

Armelle SENECHAL

Responsable du service des Contrôles Sanitaires au CDTA d’Orléans.

Définitions

• Parasites : organisme animal ou végétal qui vit aux dépens d'un autre (appelé hôte), lui portant ou non préjudice sans le détruire

• Commensaux : être vivant qui vit et se nourrit auprès des autres sans leur nuire

Pourquoi faire les analyses?

• Bien être animal• Santé du personnel• Interférence avec la

Recherche• Indicateur de rupture de

barrière

Sur qui faire les analyses parasitologiques ?

• De préférence sur des animaux jeunes• Sur des animaux immunodéficients ou non• Sur des sentinelles ou des animaux issus de

l’élevage

QUI CHERCHER ?

2 grandes catégories :

• Les ectoparasites

• Les endoparasites

Les recommandations FELASA :- Ectoparasites- Cestodes- Nematodes- Trichomonas- Spironucleus sp- Giardia muris- Amoebae (Entamoeba sp)- Mais aussi Coccidia, Encephalitozoon cuniculi,

Klossiella, Toxoplasma gondii

Les Ectoparasites

présentation

Où chercher ?

MAIS PAS ICI !!!

ET ICI

ICI

Myobia musculini et Radfordia sp• Taille : 300-450µ/150-300µ de long• Localisation: essentiellement au niveau de la tête

(entre les oreilles, autour des paupières)

Myobia musculini et Radfordia sp

Comment les distinguer ?

Myocoptes musculini• Taille : 200-300µ de long sur 130µ de large• Localisation: essentiellement au niveau caudale

♀ ♂

Comment les chercher ?

- Observation du pelage sous loupe

Observation sous loupe

Matériel : - Une loupe- Une pince

Méthode :- Ecarter les poils à la base dela queue et entre les oreilles

Observation sous loupe

Limite de la méthode :- Difficulté à mettre en œuvre sur des animaux

vigiles

Faux positifs/faux négatifs:- Présence abondante de pellicules- Très peu d’individus

Les endoparasites

présentation

Où chercher ?

Les helminthes ou vers : classification

Helminthes = vers

Vers ronds Vers plats Vers annelés

AnnélidesPlathelminthesNémathelminthes

Ex: le lombricCestodesNématodes

Les Nématodes :Oxyures

• Aspiculuris tetrapteraTaille : ♀ 215-275µ♂ 120-190 µœufs: 134x36µ

• Syphacia spTaille :♀ : 240-400µ sur 3,4-5,8µ♂ : 125 sur 1,1-1,6µŒufs : 134x36µ

Les Nématodes :Oxyures

Les Cestodes :Tænias

• Hymenolepis nana• Hymenolepis dimutaTaille :25-40mm de long sur 1mmœufs: 30-56x 44-62µ

Les Flagellés

• Giardia murisTaille : Trophozoites : 7-13 sur 5-10µ

Kystes : 15-17µ

Les Flagellés

• Spironucleus murisTaille : Trophozoites : 3-4 sur 10-15µ

Kystes : 4-7µ

Radil

Les Flagellés• Trichomonas sp :Taille des TrophozoitesT.muris : : 10-14 sur 16-26µT.weynioni : 4-16 sur 2,5-6µT.microti : 4 à 9µ de long

Les Flagellés• (Chilomastix sp :)Taille :

Trophozoites : 6-24µm de long par 3-10µ de large Kystes : 6.5-10µ

Les Protozoaires:

• Entamoeba muris :Taille : Trophozoite: 8-30µ de Ø

Kystes : 9-20µ de Ø

Comment les chercher ?

• 1) Scotch anal

• 2) Observation directe du contenu intestinal

• 3) Technique de Flottaison à partir de fèces

• 4) Histologie

Comment les chercher ?Pourquoi différentes techniques?Quelles méthodes pour qui ?

TrophozoitesAdultes

KystesOeufs

Scotch testPrincipe :

Prélever à l’aide d’une bande de scotch des éléments parasitaires

Scotch test

• Matériel :- Scotch- Lame - Microscope

Scotch test

• Méthode :- Appliquer le scotch en région périanale en

soulevant la queue de l’animal et en appuyant fermement

- Placer le scotch sur la lame- Observer au microscope

Scotch test

Radil

Scotch test

Limite de la méthode :- Valable plutôt pour Syphacia sp en raison

du cycle du parasite.

Faux positifs / faux négatifs : - Débris- Mauvaise application du scotch

Observation directePrincipe:

Observer des prélèvements à plusieurs grossissements pour y repérer les différents

éléments parasitaires qui les composent

Observation directe

• Matériel:- Boite de Pétri- Eau physiologique

stérile- Loupe- Microscope- Lame et lamelle- Pipettes

Observation directe

• Méthode :- Prélever le caecum et les intestins- Vider le contenu dans une boite de Pétri contenant

de l’eau Physiologique- Observer sous loupe pour voir les helminthes- Prélever quelques gouttes de la suspension et

mettre sur lame- Apposer une lamelle- Observer au microscope x20 ou x40

Observation directe

• Lire une lame au microscope

• Que vais-je voir ?

Observation directe

Observation directeLimite de la méthode :- Échantillon d'un échantillon, d'un échantillon...- Difficulté de la lecture au sein du contenu

intestinalFaux positifs / faux négatifs:- Confusion avec les débris présents- Nombre de champs observés

Technique de Flottaison

Principe:On utilise la différence de densité de 2

éléments pour permettre au moins dense des deux de flotter en surface.

Technique de flottaison• Matériel:- Mortier et pilon- Milieu

d’enrichissement- Colorant- Lame et lamelle- Microscope- Pipette- Tube- Passoire maille 1mm

Technique de flottaison

• Les solutions d’enrichissement :

- Nitrate de sodium : bon résultat pour Nématodes mais déforme très rapidement les éléments parasitaires

- Sulfate de magnésium : peu coûteux mais tendance àformer des cristaux

- Solution Seather (ou sucré): facile à faire, peu coûteuse mais risque de moisissure

- Sulfate de zinc : bonne concentration des kystes, mais remontée de débris importante

Technique de flottaison• Méthode :- Diluer les fèces dans un bécher par ajout d'une solution de

flottaison jusqu'à obtenir une suspension homogène.- Filtrer la suspension à l'aide d'une passoire et rincer le tamis à

l'aide de la solution de flottaison. Le faire 3 fois de suite.- Verser la suspension obtenue dans un tube à essais en formant

un ménisque convexe.- Déposer une lamelle sur le tube en contact avec la solution- Laisser le montage 15min- La déposer ensuite sur une lame et observer au microscope.

Technique de flottaison

Limite de la méthode :- Cycle parasitaire- Bonne préparation des solutions

Faux positifs / Faux négatifs : - Altération des œufs et des kystes

HistologiePrincipe :

A partir de coupes d'organes, puis coloration, visualisation des éléments

parasitaires figés

• Technique lourde nécessitant un important appareillage (inclusion, coupe, coloration, lecture)

• Temps de réalisation long• Difficulté de la lecture

Histologie

Et pour conclure...

Que vais-je observer le plus fréquemment ?

Exemple de résultats sur 2 ans

Syphacia obvelata13,4%

Chilomastix muris16,6%

Entamoeba muris18,7%

Spironucleus muris4,9%

Giardia muris0,2%

Trichomonas sp32,9%

Myobia musculi1,0%

Aspiculuris tetraptera

9,1%

Myocoptes musculinus

2,2%

Radfordia sp1,0%

Merci de votre attention!

Franck BOURGADE, Marion BERARD, Institut Pasteur Paris

Christine MEDAILLE, Laboratoire Vébiotel Arcueil

Armelle SENECHAL, Laboratoire de Contrôle Sanitaire CDTA Orléans

Stéphanie SERRE, Laboratoire Diagnostic CRL France

Mardi 13 octobre 2009, à toulouse

MISE EN PLACE D'UN PROGRAMME SANITAIREEN ANIMALERIE

ETDIAGNOSTICS DES MICROORGANISMES

INTERFÉRENTS EN RECHERCHE BIOMEDICALE