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MiSeq®SystemQuickReferenceGuide(MiSeq®システム

クイックリファレンスガイド)FOR RESEARCH USE ONLY

Introduction (はじめに) 4

Components (コンポーネント ) 6

MiSeq Workflow (MiSeqワークフロー) 12

Setting Up the Sample Sheet (サンプルシートのセットアップ) 14

Preparing the Reagent Cartridge (試薬カートリッジの調整 ) 16

Preparing Your Libraries (ライブラリーの調製 ) 18

Load Sample Libraries onto Cartridge (カートリッジへのサンプルライブラリーのロード ) 21

ILLUMINA PROPRIETARYカタログ番号 SY-970-1001パーツ番号 15031821改訂 A2011年 12月

Cleaning and Loading the Flow Cell (フローセルのクリーニングおよびロード ) 22

Loading Reagents (試薬のロード ) 24

Starting the Run (ランの開始 ) 26

Monitoring the Run (ランのモニタリング) 27

Performing a Post-RunWash (ラン後の洗浄の実施 ) 28

Technical Assistance (テクニカルサポート )

本書および本書の内容は Illumina, Inc. (Illumina) が所有権を有する知的財産であり、顧客が契約の下で使用する

ことを意図したものです。本書に記載されたシステムの操作以外の目的での使用は意図されていません。Illumina

の事前の書面による許可なく、目的や方法を問わず、本書およびその内容を使用または配布、通信、開示、また

は複製することを禁じます。

本システムやそのすべての構成部品が正常に動作するためには、経験を積んだオペレータが本書の手順に厳密

かつ明示的に従う必要があります。本システムまたはその構成部品を操作する前に、本書の内容を熟読し、完全

に理解する必要があります。

本システムまたはその構成部品を操作する前に、本書の熟読や完全な理解を怠り、本書の記載に従わない場合、

装置またはその部品が損傷したり、装置またはその部品を操作するオペレータが怪我をしたりする恐れがあります。

また、Illumina, Inc. は、その特許権、登録商標権、著作権、または慣習法上の権利もしくはその他の類似の権利の

下でのいかなる許諾も付与しません。Illumina, Inc. は、予告なく、本書に記載されたあらゆる手順、製品、またはそ

の部品を変更する権利を有します。発行日の時点で、本書の内容については可能な限り完全かつ正確であるよう

に万全を期しておりますが、Illumina は保証または適合性を黙示するものではなく、本書に含まれる情報に起因し

て発生したいかなる損害についても一切責任を負いかねます。

FOR RESEARCH USE ONLY

© 2011 Illumina, Inc. All rights reserved.

Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic

Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix,

SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, パンプキンオレンジ色, および Genetic Energy ストリーミングベースデザイン

は Illumina, Inc. の登録商標または商標です。ここに含まれるその他すべてのブランドおよび名称の所有権はそれ

ぞれの所有者に帰属します。

Intro

ductio

n(は

じめに)

MiSeqSystemQuick Reference Guide (MiSeqシステムクイックリファレンスガイド) 4

Introduction (はじめに)

Illumina MiSeq®システムでは、実績のある SBS (Sequencing by Synthesis) 技術と、最短8 時間で DNA を解析してデータ化できる革新的なワークフローが組み合わせられています。そのため、クラスター増幅、シーケンス、およびデータ解析のステップを、MiSeq 1 台で実施することが可能です。

Applications (アプリケーション)

MiSeq では、以下を含むさまざまなアプリケーションをサポートします。

} ターゲットリシーケンス

} TruSeq カスタムアンプリコンシーケンス

} デノボシーケンス (約 50xカバレージの場合は <20 Mb、約 20xカバレージの場合は <50

Mb)

} Small RNA シーケンス

} メタゲノム解析

} ライブラリーQC

Library Preparation (ライブラリー調製)

以下の Illumina サンプル調製キットのいずれかで調製されたライブラリーをシーケンスすることができます。

} TruSeq™ DNAサンプル調製キット

} TruSeq™ RNAサンプル調製キット

} TruSeq™ Small RNA サンプル調製キット

} TruSeq™ カスタムアンプリコンキット

} Nextera™ サンプル調製キット

Features (機能 )} 自動化による簡単操作:試薬が充填されたカートリッジとフローセルのローディングを含む

ランのセットアップが終了した後は、追加のハンズオン時間は必要ありません。

} 試薬が充填されたカートリッジ: クラスター形成およびシーケンスのための試薬 (ペアエン

ドシーケンス試薬やインデックス試薬など)があらかじめ充填されている、専用にデザイン

された使い切りのカートリッジです。RFID (無線自動識別) タグにより、消耗品の正確な追

跡が可能となっています。

5 パーツ番号 15031821改訂 A

} インターフェースコントロール: MiSeq コントロールソフトウェア (MCS) により、ランの構成

とモニタリングおよびメンテナンスを行うための簡単なインターフェースがタッチスクリーン

モニター上に提供されます。

} 便利なフローセルローディング: クランプメカニズムにより、フローセルを装置にロードする

だけで、自動的に位置決めされます。

} 革新的な送液アーキテクチャ: MiSeq 送液システムにより、シーケンス中におけるケミスト

リーサイクルタイムが大幅に短縮され、高効率化を達成できます。

} Real Time Analysis : この統合1 次解析ソフトウェアにより、シーケンスラン中にリアルタイ

ムで装置上でのデータ解析 (イメージ解析とベースコーリングを含む)が実行されるため、

貴重なダウンストリーム解析時間を節約できます。

} MiSeq Reporter: この統合2 次解析ソフトウェアは、1 次解析データを処理してアライメント

を実施し、解析したサンプルの情報をレポートします。

About This Guide (このガイドについて)『クィックリファレンスガイド』では、装置の概要と、MiSeq でランをセットアップして実行する方法について説明します。

MiSeq および関連ソフトウェアの包括的な情報については、『MiSeq System User Guide(MiSeq システムユーザーガイド)』を参照してください。

Documentation (マニュアル)追加のマニュアルは Illumina の Web サイトでダウンロード可能です。詳細については、このガイドの裏表紙の内側を参照してください。

Components(コ

ンポーネント)


Components (コンポーネント )

MiSeq システムには、以下の主要コンポーネントがあります。

図 1 主要コンポーネント

A フローセルコンパートメント: ランの間、フローセルを保持するフローセルステージが内蔵

されています。フローセルステージはモーターで動作制御されており、フローセルをロー

ドする際は、このモーターにより、密閉式光学モジュールからステージが出ます。ランが

開始されると、元に戻ります。

B 密閉式光学モジュール: フローセルのイメージングを可能にする光学コンポーネントが内

蔵されています。

C ステータスバー: 3 つの色を使用して装置のステータスを示します。青は装置がシーケン

スを実行中、オレンジは装置に対する対処が必要、緑は次のランを開始する準備ができ

ていることをそれぞれ示します。

D タッチスクリーンモニター: 使いやすいソフトウェアインターフェースと一目でわかるランの

モニタリングにより、ランを簡単にセットアップできるようにします。

E 試薬コンパートメント: ランの実行中に使用される試薬、装置の洗浄中に使用される洗浄

溶液、および廃液ボトルを保持します。試薬コンパートメントのドアは、磁気ラッチで固定

されます。

MiSeq ソフトウェアインターフェースは、タッチスクリーンモニターを通じてランのセットアップ全体をサポートします。シーケンスに必要な試薬類をロードするには、試薬コンパートメントとフローセルコンパートメントにアクセスする必要があります。


Reagent Compartment (試薬コンパートメント )試薬コンパートメント内には、試薬チラーと、インコーポレーションウォッシュバッファー (PR2)ボトルおよび廃液ボトルをセットする場所があります。

試薬チラーでは、ランの実行中に使用される使い切りの試薬カートリッジ、または装置の洗浄中に使用される洗浄トレイを保持できます。ソフトウェアの制御によって、シーケンスプロセスに応じて適切なときに、カートリッジの試薬ウェルへとシッパーが自動的に下げられます。 PR2ボトルと廃液ボトルへは、手動でシッパーを下げます。

図 2 試薬コンパートメント

A 試薬チラー

B シッパーハンドル (上がっている状態)

C 試薬 (PR2) ボトル

D 廃液ボトル

E 試薬カートリッジ

試薬チラーの右側には、PR2 ボトルと廃液ボトルにそれぞれフィットするスロットが 1 つずつあります。ボトルを設置したら、適切なシッパーを各ボトルへと下げ、ボトルを所定位置に固定してください。

試薬は、シッパーから送液ラインを通ってフローセルへと送液されます。試薬の廃液は、プロセスの間中、廃液ボトルへと送り込まれます。

Components(コ

ンポーネント)


Reagent Cartridge (試薬カートリッジ)MiSeq 試薬カートリッジは使い切りの消耗品で、ホイルシールで密閉された複数のリザーバーで構成されます。各リザーバーには、特定の試薬があらかじめ充填されています。

図 3 試薬カートリッジ

カートリッジの各リザーバーには、番号が付けられています。次の表では、番号付けされた位置に入っている試薬が一覧表示されています。

位置試薬名説明

1 IMF Incorporation Mix (インコーポレーションミックス)

2 SRE Scan Mix (スキャンミックス)

4 CMF Cleavage Mix (クリーベージミックス)

5 AMX1 Amplification Mix (アンプリフィケーションミックス)

6 AMX2 Read 2 Amplification Mix (リード 2 アンプリフィケーションミックス)

7 LPM Linearization Premix (リニアライゼーションプリミックス)

8 LDR Formamide (ホルムアミド)


位置試薬名説明

9 LMX1 Linearization Mix (リニアライゼーションミックス)

10 LMX2 Read 2 Linearization Mix (リード 2 リニアライゼーションミックス)

11 RMF Resynthesis Mix (リシンセシスミックス)

12 HP10 Read 1 Primer Mix (リード 1 プライマーミックス)

13 HP12 Index Primer Mix (インデックスプライマーミックス)

14 HP11 Read 2 Primer Mix (リード 2 プライマーミックス)

15 PW1 Laboratory-grade Water (ラボラトリーグレード水)


17 Sample Your sample libraries (サンプルライブラリー)

18 オプション Optional (カスタムシーケンスプライマーに対してオプションで使用できる)




22 空 Empty (空)

ランを開始する前に、試薬カートリッジの指定のリザーバーにサンプルライブラリーがロードされている必要があります。単一のライブラリーをロードすることも、インデックスライブラリーのプールをロードすることもできます。

Flow Cell Compartment (フローセルコンパートメント )フローセルコンパートメントには、フローセルステージ、サーマルステーション、およびフローセルへの送液接続部があります。

光学モジュールを出入りするフローセルステージは、フローセルラッチで固定されるフローセルを保持します。フローセルラッチが閉じられると、ラッチヒンジ付近にある 2 つのピンによってフローセルは自動的に位置決めされます。

Components(コ

ンポーネント)


図 4 フローセルステージ

A フローセルステージ

B フローセルコンパートメントドア

C フローセルラッチ

D フローセル

E フローセルラッチ解放ボタン

フローセルステージの下にあるサーマルステーションは、クラスター形成およびシーケンスに必要なフローセル温度の変化を制御します。

送液接続部は、インレットポートを通じて試薬をフローセルへと送り込み、アウトレットポートを通じて廃液をフローセルから排出します。

Flow Cell (フローセル)MiSeq フローセルは、クラスター形成とシーケンス反応が実行されるシングルレーンでガラス製の基板です。このシングルレーン上の「タイル」と呼ばれる合計12 のイメージング領域が、装置のカメラによってイメージ化されます。

11 パーツ番号 15031821改訂 A

図 5 フローセル

A アウトレットポート

B イメージング領域

C インレットポート

サンプルは、試薬カートリッジにロードされた後、クラスター形成プロセスの最初に、フローセルへと自動的に流入されます。

試薬は、インレットポートを通じてフローセルへと入り、イメージング領域を通過した後、アウトレットポートを通じてフローセルから排出されます。フローセルから出る廃液は、廃液ボトルへと送り込まれます。

MiSeqWorkflo

w(M

iSeqワークフロー)


MiSeqWorkflow (MiSeqワークフロー)

シーケンスランのパラメーターを定義するサンプルシートを作成します。

試薬が充填されたカートリッジの使用準備を行います。

ライブラリーの変性と希釈を行った後、試薬カートリッジの指定のリザーバーにライブラリーミックスをロードします。

MCS インターフェースで [Sequence] を選択し、ランのセットアップを開始します。

オプション: データファイルを格納するためBaseSpace に接続します。

フローセルを洗浄し、完全に乾かします。

フローセルをロードします。

PR2 ボトルをロードし、廃液ボトルが空であることを確認します。

試薬カートリッジをロードします。

ランパラメーターとラン前のチェックの結果をレビューします。

[Start Run] を選択します。

[Sequencing] 画面を使用したり、別のコンピューターでSequencing Analysis Viewer (SAV) を使用したりして、ランをモニタリングします。

13 パーツ番号 15031821改訂 A

Approximate Run Duration (概算のラン実行時間 )

プロセスリードの

長さ

実行時間

クラスター形成およびシーケンス

36 サイクル (36 bp)

4 時間以内

50 サイクル (50 bp)

6 時間以内

ペアエンド150 サイクル (2x150bp)

27 時間以内

装置上での解析および変異コーリング

ペアエンド150 サイクル (2x150bp)

16S メタゲノム解析以外のすべての解析ワークフロー: 2 時間以内

16S メタゲノム解析: 24 時間以内

解析にかかる時間が2時間を超える場合は、サンプルにより適したリファレンスにマップするか、または MSR をオフラインでインストールして解析をオフラインで行ってください。

Settin

gUptheSampleSheet(サ

ンプルシートのセットアップ)


Setting Up the Sample Sheet (サンプルシートのセットアップ)

注意

Illumina では、シーケンスランに使用する試薬カートリッジのバーコード番号をサンプルシート名にすることを推奨します。バーコード番号は、カートリッジラベルに記載されています。

1 試薬カートリッジのバーコード番号に csv拡張子を付ける形で、サンプルシートに名前を

付けます。この例では、サンプルシート名はMS0001082-50.csvのようになります。

図 6 試薬カートリッジラベル

2 Illumina Experiment Manager またはサンプルシートテンプレートを使用して、サンプル

シートを装置外で作成します。必要に応じて、実験者名、プロジェクト名、実験名、および

日付も入力してください。

3 適切な解析ワークフロー (Resequencing、Amplicon、Metagenomics、DenovoAssembly、

SmallRNA、または LibraryQC) を入力します。この際、スペースを入力しないように注意し

てください。各ワークフローの詳細については、下の表を参照してください。

4 ランに対するケミストリーを指定します。

• デュアルインデックスランに対しては、「amplicon」と入力します。

• その他のすべてのランに対しては、このフィールドを空白のままにするか、または

「default」を入力します。

5 各リードに対するサイクル数を入力します。

注意

インデックスランの場合、[Data] セクションで各サンプルのインデックス配列を含める必要があります。 Index1 のパラメーターに対しては、i7 のインデックス配列を記入してください。 Index2 のパラメーター (アンプリコンケミストリーに固有) に対しては、i5 のインデックス配列を入力してください。

15 パーツ番号 15031821改訂 A

6 実施する解析ワークフローに固有な残りのサンプルシートセクションへの入力を完了させ

ます。各サンプルには一意のサンプル ID (SampleID) が必要です。サンプル名

(Sample_Name) は同じでもかまいません。

解析ワークフロー Manifests SiteReports Data

Resequencing 該当なしオプション必須:SampleID、GenomeFolder

オプション:Index、Index2

Amplicon 必須オプション必須:SampleID、Manifest

オプション:Index、Index2、GenomeFolder

DenovoAssembly 該当なし該当なし必須:SampleID


SmallRNA 該当なし該当なし必須:SampleID、Contaminants、miRNA、RNA


Metagenomics 該当なし該当なし必須:SampleID


LibraryQC 該当なし該当なし必須:SampleID、GenomeFolder


注意

TruSeqカスタムアンプリコンサンプルシートの適切なインデックス配列の組み合わせについては、『TruSeq Custom Amplicon Library Preparation Guide (TruSeq カスタムアンプリコンライブラリー調製ガイド)』を参照してください。

Nextera DNA サンプルシートの適切なインデックス配列の組み合わせについては、『Nextera DNA Sample Preparation Guide (Nextera DNA サンプル調製ガイド)』を参照してください。

7 [Setup Options]で指定したネットワークの場所にサンプルシートをコピーするか、または

USBフラッシュドライブと、[Welcome] 画面からアクセスできる [Manage Files] 機能を使用

して、装置にサンプルシートをコピーします。

詳細については、『MiSeq System User Guide (MiSeq システムユーザーガイド)』を参照し

てください。

PreparingtheReagentC

artrid

ge(試

薬カートリッジの調

整)


Preparing theReagentCartridge (試薬カートリッジの調整)

1 -15 ～ -25 °Cの保管庫から試薬カートリッジを取り出します。

2 試薬カートリッジの底がつかるのに十分なだけの室温の脱イオン水が入っている水槽

に、試薬カートリッジを置きます。水が試薬カートリッジに印刷されている最高水位線

(MaximumWater Line) を超えないようにしてください。

図 7 最高水位線

A MaximumWalter Line マーク (最高水位線マーク)

3 約 60 分間、または内容物が完全に解凍されるまで、室温の水槽内で試薬カートリッジを

解凍させます。

4 試薬カートリッジを水槽から取り出し、ベンチの上で軽くたたいて、カートリッジの底に付

いている水を落とします。必要な場合は、カートリッジの底から水分を拭き取ってくださ

い。

5 試薬カートリッジを10 回転倒混和し、解凍された試薬を混ぜ合わせ、すべての位置で解

凍されていることを目視検査します。

6 IMF とマークされている試薬 (紫色) を目視検査し、完全に混和されており、沈殿物がな

いことを確認します。

7 ベンチの上でカートリッジを軽くたたき、カートリッジの底に付いている水を落とし、試薬

内の気泡を取り除きます。

注意

MiSeq シッパーチューブの先端は、試薬を吸引する際、各プレートウェルの底部に入れられます。そのため、試薬ウェルの底に気泡がないようにすることが重要になります。

8 サンプルを試薬カートリッジにロードしてランをセットアップする準備ができるまで、試薬

カートリッジは氷の上に置いておくか、または 2 ～8 °Cで保管しておきます。

17 パーツ番号 15031821改訂 A

警告

この試薬のセットには、生殖毒性を有すると考えられる脂肪族アミドであるホルムアミドが含まれています。吸入、経口摂取、皮膚や目への接触により、怪我をする可能性があります。

廃液や未使用の内容物は、地域の行政安全基準に従って廃棄してください。

詳細については、http://www.illumina.com/msds でこのキットのMSDS を参照してください。

PreparingYourLib

raries(ラ

イブラリーの調

製)


PreparingYourLibraries (ライブラリーの調製)

注意

TruSeq カスタムアンプリコンシーケンスには適用しません。TruSeq カスタムアンプリコンプロトコールでライブラリーを調整した場合は、この手順を実行しないでください。TruSeq カスタムアンプリコンプロトコールでは、正規化された濃度のプールされたライブラリーが用意されるため、そのまま使用できます。

Illumina-Supplied Consumables (Illumina提供の消耗品)} あらかじめ冷やしておいたHT1 (ハイブリダイゼーションバッファー): 冷凍状態で MiSeq

試薬カートリッジボックスに入れられて出荷される

User-Supplied Consumables (ユーザーが用意する消耗品)} 調整した新鮮な 0.2 N NaOH

} 10 mM Tris-Cl pH 8.5 + 0.1% Tween 20

} PhiX (オプション)

Denature DNA (DNAの変性 )注意

最終濃度が 20 pM よりも高いライブラリーがアプリケーションで必要とされる場合、NaOH の濃度が変性溶液で 0.1 N になるようにし、HT1 を使用して希釈した後の最終溶液で 0.0025 N (2.5 mM) 未満になるようにしてください。ライブラリーでのNaOH の濃度が高いと、ライブラリーのフローセルへのハイブリダイゼーションが行われず、クラスター密度が低くなります。

20 pM の濃度に DNA を変性させるには、以下の手順を使用します。

1 新鮮な 0.2 N NaOH を用意します。これは、MiSeq でのクラスター形成の際にサンプルを

完全に変性させるために必須です。

2 サンプルDNA と 0.2 N NaOH を以下の分量ずつ遠心チューブ内で混ぜ合わせます。

• 2 nM サンプルDNA (10 µl)

• 0.2 N NaOH (10 µl)

3 サンプル溶液を混ぜるために軽くボルテックスした後、サンプル溶液を 280 xgで 1 分間

遠心します。

4 DNA を一本鎖に変性させるために、室温で 5 分間インキュベートします。

19 パーツ番号 15031821改訂 A

5 20 pM 変性ライブラリーになるように、あらかじめ冷やしておいた以下の分量の HT1 を、

変性DNA を含むチューブに加えます。

• 変性DNA (20 µl)

• あらかじめ冷やしておいたHT1 (980 µl)

6 最終希釈を行う準備ができるまで、変性DNA を氷の上に置いておきます。

Dilute Denatured DNA (変性 DNAの希釈 )1 次の例を使用して、変性DNA を希望の濃度に希釈します。

最終濃度 6 pM 8 pM 10 pM 12 pM 15 pM

20 pM 変性 DNA 300 µl 400 µl 500 µl 600 µl 750 µl

あらかじめ冷やしておいたHT1

700 µl 600 µl 500 µl 400 µl 250 µl

最終 [NaOH] 0.6 mM 0.8 mM 1 mM 1.2 mM 1.5 mM

2 数回転倒混和し、DNA溶液を混ぜ合わせます。

3 DNA溶液をパルス遠心します。

4 MiSeq試薬カートリッジにサンプルをロードする準備ができるまで、変性および希釈を行っ

たDNA を氷の上に置いておきます。

Denature and Dilute PhiX Control (PhiX コントロールの変性およ

び希釈 )PhiX は、TruSeq カスタムアンプリコンライブラリー以外のすべてのライブラリーに対する内部コントロールとして使用されます。次の手順に従って、10 nM の PhiX ライブラリーを変性させ、8 pM に希釈してください。これにより、750 ～ 850 K/mm² のクラスター密度が得られることが期待されます。

PreparingYourLib

raries(ラ

イブラリーの調

製)


1 以下を指定分量ずつ混ぜ合わせることにより、PhiX ライブラリーを2 nM に希釈します。

• 10 nM PhiX ライブラリー (2 µl)

• 10 mM Tris-Cl pH 8.5 + 0.1% Tween 20 (8 µl)

2 1 nM PhiX ライブラリーになるように、2 nM PhiX ライブラリーと 0.2 N NaOH を以下の分量

ずつ遠心チューブ内で混ぜ合わせます。

• 2 nM PhiX ライブラリー (10 µl)

• 0.2 N NaOH (10 µl)

3 1 nM PhiX ライブラリー溶液を混ぜるために、軽くボルテックスします。

4 テンプレート溶液を280 xgで 1 分間遠心します。

5 PhiX ライブラリーを一本鎖に変性させるために、室温で 5 分間インキュベートします。

6 20 pM PhiX ライブラリーになるように、あらかじめ冷やしておいた以下の分量の HT1 を、

変性PhiX ライブラリーを含むチューブに加えます。

• 変性PhiX ライブラリー (20 µl)


注意

変性 20 pM PhiX ライブラリーは、-15 ～ -25 °Cで最大 3 週間まで保管することができます。 3 週間を過ぎると、クラスター数は減少する傾向があります。

7 次のとおりに、変性20 pM PhiX ライブラリーを8 pM に希釈します。

• 20 pM の変性PhiX ライブラリー (400 µl)


Mix Sample Library and PhiX Control (サンプルライブラリーと

PhiXコントロールの混合 )1 容量比で 1% になるように、変性 PhiX コントロールライブラリーと変性サンプルライブラ

リーを以下の分量ずつ混ぜ合わせます。

• 8 pM PhiX コントロールライブラリー (10 µl)

• 変性サンプルライブラリー (990 µl)

2 MiSeq 試薬カートリッジにロードする準備ができるまで、混ぜ合わせたサンプルライブラ

リーとPhiX コントロールを氷の上に置いておきます。

21 パーツ番号 15031821改訂 A

LoadSample Libraries ontoCartridge (カートリッジへのサンプルライブラリーのロード)

1 新しくて清潔な空の 1 ml ピペットチップを使用して、「Load Samples」というラベルが付い

ているリザーバーの上にあるホイルシールに穴を開けます。

2 ピペットを使用して、600 µl のサンプルライブラリーを「Load Samples」リザーバーに移し

入れます。

注意

その他の試薬の位置に穴を開けないようにしてください。カートリッジが装置にロードされた後、装置のシッパーにより穴が開けられます。

3 MiSeq コントロールソフトウェア (MCS) インターフェースを使用して、ランをセットアップす

る手順へと直接進みます。

CleaningandLo

adingtheFlowCell(フ

ローセルのクリーニングおよびロード)


Cleaning and Loading the Flow Cell (フローセルのクリーニングおよびロード)

フローセルは、保存用バッファーに浸され、フローセル容器内に入れられた状態で届きます。MiSeq にロードする前には、フローセルをラボラトリーグレード水で洗い流して完全に乾かし、アルコールワイプで拭いて完全にきれいにする必要があります。

フローセルをクリーニングしたら、フローセルステージ上に置き、フローセルラッチで固定します。フローセルラッチを閉じると、ヒンジ付近にある 2 つのピンによってフローセルは自動的に位置決めされます。

Cleaning the Flow Cell (フローセルのクリーニング)1 プラスチック製ピンセットを使用してプラスチック製カートリッジの端部をつまみ、フローセ

ルをフローセル容器から取り出します。

2 約 2 mlのラボラトリーグレード水を使用してフローセルアセンブリを軽くすすぎます。ガラ

スとプラスチックのカートリッジの両方から余分な塩分を洗い流すようにしてください。塩

分が余分に残っていると、装置におけるフローセルの設置位置に影響を与える場合があ

ります。

3 フローセルポートガスケット付近に注意しながら、糸くずの出ないレンズクリーニング用

ティッシュを使用してフローセルとカートリッジを拭き、完全に乾かします。ガスケットとガラ

スの境界は、軽くたたくようにして水分を吸い取ります。

4 アルコールワイプを使用して、フローセルガラスに線上の拭き跡や指紋が残っていないよ

う気をつけながら、フローセルのガラス部分をきれいにします。フローセルポートガスケット

にはアルコールワイプを使用しないでください。

5 糸くずの出ないレンズクリーニング用ティッシュを使用して余分なアルコール分を拭き取

り、目視検査を行って、フローセルポートが塞がれていないことと、ガスケットがフローセル

ポート周囲に適切に設置されていることを確認します。

ガスケットが外れているように見える場合は、フローセルポート周囲にしっかりと設置され

るまでガスケットを軽く押します。

注意

装置にロードする前に、フローセルのガスケットを目視検査してください。ガスケットが外れていてしっかりと設置されない場合、Illumina テクニカルサポートまでお問い合わせください。

23 パーツ番号 15031821改訂 A

Loading the Flow Cell (フローセルのロード )1 ソフトウェアインターフェースで [Sequence] を選択します。[Load Flow Cell]画面が開き

ます。

2 新しいパウダーフリーのゴム手袋を付けます。

3 フローセルコンパートメントのドアを持ち上げます。

4 フローセルラッチの右側にある白色の解放ボタンを押します。フローセルラッチが上が

り、開きます。

5 以前にランを実行したフローセルがステージに存在する場合は、フローセルステージを目

視検査して、糸くずがないことを確認します。

糸くずや試薬の析出による汚れが残っている場合は、アルコールワイプ、あるいはエタ

ノールまたはイソプロパノールに浸された糸くずの出ないティッシュを使用して、フローセ

ルステージを清浄してください。完全にきれいになって乾くまで、フローセルステージの

表面を注意して拭く必要があります。

6 Illumina ラベル付近にあるフローセルカートリッジの端をつかむようにしてフローセルを持

ちます。ラベルが上を向いていることを確認してください。

7 フローセルステージにフローセルを置きます。

8 フローセルラッチがフローセルに覆いかぶさるように、静かに押し下げます。フローセル

ラッチが固定されると、カチッという音がします。

9 画面の左下角をチェックして、フローセルの RFIDが正しく読み取られていることを確認し

ます。

注意

MiSeq システムでは、フローセルの RFIDの読み取りを行います。システムが RFID を読み取れない場合、一時コードを取得してランのセットアップを続行するための手順がソフトウェアによって表示されます。この機能を使用するには、インターネットにアクセスできるネットワークに装置が接続されている必要があります。

10 フローセルコンパートメントのドアを閉じます。

11 [Load Flow Cell]画面で [Next] を選択します。[Load Reagents]画面が開きます。

LoadingReagents(試

薬のロード)


LoadingReagents (試薬のロード)

注意

MiSeq システムでは、PR2 ボトルと試薬カートリッジのRFIDの読み取りを行います。システムがRFID を読み取れない場合、一時コードを取得してランのセットアップを続行するための手順がソフトウェアによって表示されます。この機能を使用するには、インターネットにアクセスできるネットワークに装置が接続されている必要があります。

Load PR2 and Check the Waste Bottle (PR2のロードおよび廃

液ボトルのチェック)1 2 ～ 8 °C の保管庫からPR2 のボトルを取り出し、穏やかに混ぜ合わせた後、蓋を取り

外します。

2 試薬コンパートメントのドアを開けます。

3 シッパーハンドルが固定されるまで持ち上げます。

4 PR2 ボトルを、試薬チラーの右側にあるくぼみに置きます。

5 廃液ボトルの中身を適切な廃液容器に出して空にします。

警告




6 シッパーハンドルをゆっくりと下げます。シッパーが PR2 ボトルと廃液ボトルの奥まで挿入

されていることを確認してください。

7 画面の左下角をチェックして、PR2 の RFIDが正しく読み取られていることを確認します。

8 [Load Reagents]画面で [Next] を選択します。

25 パーツ番号 15031821改訂 A

Load the Reagent Cartridge (試薬カートリッジのロード )注意

試薬チラーのドアを長時間開けたままにしないでください。

1 試薬チラーのドアを開けます。

2 Illumina ラベル側を手前にして試薬カートリッジを持ち、カートリッジを試薬チラーの一番

奥までスライドさせて押し込みます。

3 試薬チラーのドアを閉めます。

4 画面の左下角をチェックして、試薬カートリッジの RFID が正しく読み取られていることを

確認します。

5 試薬コンパートメントのドアを閉めます。

6 [Load Reagents]画面で [Next] を選択します。[Review]画面が開きます。

Startin

gtheRun(ラ

ンの開

始)


Starting theRun (ランの開始)

フローセルと試薬をロードすると、ランを開始する前にランパラメーターのレビューとラン前のチェックを実行するよう、MCS インターフェースによって指示されます。

Review Run Parameters (ランパラメーターのレビュー)1 実験名、解析ワークフロー、およびリードの長さをレビューします。これらのパラメーター

は、サンプルシートで指定されています。

2 左下角でフォルダの場所をレビューします。

3 [Next] を選択します。[Pre-Run Check]画面が開きます。

Review Pre-Run Check (ラン前のチェックの実行 )システムでは、ランを開始する前に、すべてのランコンポーネント、ディスク領域、およびネットワーク接続のチェックを行います。

ラン前のチェックにすべてのアイテムが合格したら、ランを開始する準備ができたことになります。

Important Note Before Starting the Run (ランを開始する前の重要な

注意事項 )警告

MiSeq は振動に敏感です。ランを開始した後で装置に触れると、シーケンス結果に悪影響を及ぼす可能性があります。

[Start Run] を選択したら、ランを停止する場合以外は、フローセルコンパートメントまたは試薬コンパートメントのドアを開いたり、装置のモニターに触れたりしないでください。

ランが完全に完了するまでは、モニターに触れたりコンパートメントドアを開けたりしないでください。

装置に触れる必要がある場合は、ランを一時停止してください。

27 パーツ番号 15031821改訂 A

Monitoring theRun (ランのモニタリング)

ラン中に [Sequencing]画面を使用して、ランの進捗状況、蛍光強度、クオリティ値、送液、およびイメージングをモニタリングすることができます。

詳細については、『MiSeq System User Guide (MiSeq システムユーザーガイド)』を参照してください。

より詳細にランをモニタリングするには、Sequencing Analysis Viewer を使用してください。詳細については、『Sequencing Analysis Viewer User Guide (Sequencing Analysis Viewer ユーザーガイド)』を参照してください。

注意

Sequencing Analysis Viewer は、Illumina のシーケンサー (ほとんどの場合、8 レーンのフローセルを使用する) に共通しています。一部のビューには、レーン 1 ～ 8 を表示したドロップダウンリストが含まれます。MiSeq フローセルはシングルレーンのフローセルであるため、[All] または [Lane 1]を選択した場合にデータが表示されます。

Perfo

rmingaPost-R

unWash

(ラン後

の洗

浄の実

施)


Performing a Post-Run Wash (ラン後の洗浄の実施)

シーケンスランが完了したら、ラン後の洗浄を常に実施してください。

ラン後の洗浄には約20 分かかります。

注意

使用済みフローセルは、装置に置いたままにしてください。装置の洗浄を実施するには、フローセルが装置にロードされている必要があります。

1 ランが完了したら、[Start Wash] を選択します。

2 試薬コンパートメントのドアを開けます。

3 試薬チラーのドアを開け、使用済み試薬カートリッジをチラーから取り出します。ランの終

了時にシッパーが自動的に上がっているため、試薬カートリッジはチラーから簡単にスラ

イドするはずです。

4 各リザーバーに約6 ml のラボラトリーグレード水を加えて、洗浄トレイを準備します。

5 洗浄トレイを、試薬チラーの一番奥までスライドさせます。試薬チラーのドアを閉めます。

6 PR2 ボトルと廃液ボトルの前にあるシッパーハンドルが固定されるまで持ち上げます。

7 500 ml洗浄ボトルに少なくとも 350 ml のラボラトリーグレード水を加えて、洗浄ボトルを準

備します。

8 試薬コンパートメントから PR2 ボトルを取り外し、ラボラトリーグレード水が入っている洗浄

ボトルと交換します。

注意

ランが完了するたびにPR2 ボトルを破棄してください。また、残った PR2 は再利用しないでください。

9 廃液ボトルを取り外し、中身を適切に破棄します。廃液ボトルを試薬コンパートメントに戻

します。

警告




29 パーツ番号 15031821改訂 A

10 シッパーハンドルをゆっくりと下げ、シッパーが洗浄ボトルと廃液ボトルの奥まで挿入され

ていることを確認します。

11 試薬コンパートメントのドアを閉めます。

12 [Post-Run Wash]画面で [Next] を選択します。ラン後の洗浄が開始します。

ラン後の洗浄が完了すると、画面上にメッセージが表示されます。

注意

使用済みフローセル、洗浄トレイ、および洗浄ボトルは、液滴を溜めたり、空気がシステム内に入らないようにしたりするため、次回ランを実行するときまで装置に置いたままにしてください。

13 [Done] を選択します。[Welcome]画面が開きます。

TechnicalAssista

nce(テ

クニカルサポート)

MiSeqSystemQuick Reference Guide (MiSeqシステムクイックリファレンスガイド)

Technical Assistance (テクニカルサポート )

テクニカルサポートに関しては、Illumina カスタマーサポートまでお問い合わせください。

Illumina Web サイト http://www.illumina.com

電子メール [email protected]

表 1 Illumina一般問合わせ先情報

地域問合わせ先番号地域問合わせ先番号

北米 1.800.809.4566 イタリア 800.874909

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表 2 Illumina カスタマーサポート電話番号

MSDSs (化学物質安全データシート)

化学物質安全データシート (MSDS) は Illumina の Web サイト http://www.illumina.com/msdsでご覧になれます。

Product Documentation (製品マニュアル)

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