mitokondriyel dna pcr-rflp (restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi) markerleri kullanılarak...

8/7/2019 Mitokondriyel DNA PCR-RFLP (Restriksiyon Para Uzunluk Polimorfizmi) Markerleri Kullanlarak Trkiye'nin Farkl Yr

1/141

ANKARA NVERSTESFEN BLMLER ENSTTS

DOKTORA TEZ

MTOKONDRYEL DNA PCR-RFLP (RESTRKSYON PARA UZUNLUKPOLMORFZM) MARKERLER KULLANILARAK

TRKYENN FARKLI YRELERNE ATBAL ARILARININ TANIMLANMASI

Fulya ZDL

ZOOTEKN ANABLM DALI

ANKARA2007

Her hakk sakldr


2/141

ii


3/141

iii

ZET

Doktora Tezi

MTOKONDRYEL DNA PCR-RFLP (RESTRKSYON PARA UZUNLUKPOLMORFZM) MARKERLER KULLANILARAK TRKYE 'NN FARKLI

YRELERNE AT BAL ARILARININ TANIMLANMASI

Fulya ZDL

Ankara niversitesiFen Bilimleri EnstitsZootekni Anabilim Dal

Danman: Do. Dr. Mehmet Ali YILDIZ

Bu aratrmada, Trkiye bal ars populasyonlar 18 farkl mitokondriyel DNA(mtDNA) markeri bakmndan tanmlanmtr. Trkiyenin 20 farkl yresinden toplam244 ii ar rnei materyal olarak kullanlmtr. Bal ars populasyonlarnntanmlanmasnda restriksiyon para uzunluk polimorfizmi (RFLP) ve DNA dizi analiziyntemlerinden yararlanlmtr.Mitokondriyel genomda anonim, sitokrom b (cyt b), sitokrom C oksidaz (COI),ribozomun byk alt birimi (lrRNA), sitokrom C oksidaz ile sitokrom C oksidaz arasndaki blge (COI-COII aras) ve sitokrom C oksidaz ile sitokrom C oksidaz intergenik blge (COI-COII intergenik blge) dikkate alnmtr. almada anonimlokus PCR ile oaltlmtr. Cyt b lokusu BglII enzimi, COI lokusu HincII ve HinfIenzimleri, lrRNA lokusu EcoRI enzimi, COI-COII arasndaki blge XbaI enzimi veCOI-COII intergenik blge DraI enzimleriyle muamele sonucu oluan 6 adet RFLPmarkeri ile anonim lokus ve COI-COII intergenik blgenin dizi analizi sonucunda tespitedilen 11 adet nkleotid farkll olmak zere toplam 18 farkl mtDNA markerizerinde durulmutur.Trkiye bal ars populasyonlar 6 farkl RFLP markeri ve anonim lokus bakmndan

Dou Avrupa ve Akdeniz (C) genetik soyu ierisinde deerlendirilmitir. Ayrca CO-CO intergenik blgenin DNA dizi analizi sonucunda C1a, C1b, C1c, C1d, C1e, C1f,C1g ile C2a, C2e, C2f ve C2g olmak zere toplam 11 haplotip belirlenmitir. Buhaplotiplerden C1b, C1c, C1d, C1e, C1f, C1g ve C2f ile ifade edilen toplam 7 haplotipilk defa bu aratrma sonucunda tespit edilmitir.

2007, 125 sayfaAnahtar Kelimeler:Apis mellifera L., mtDNA, PCR-RFLP, DNA dizi analizi, haplotip


4/141

iv

ABSTRACT

Ph.D. Thesis

THE IDENTIFICATION OF HONEY BEES FROM DIFFERENT LOCATIONS OFTURKEY BY USING MITOCHONDRIAL DNA PCR-RFLP (RESTRICTION

FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) MARKERS

Fulya ZDL

Ankara UniversityGraduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Animal Science

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Mehmet Ali YILDIZ

In this research, the identification of Turkish honeybee populations was investigatedusing 18 different mitochondrial DNA markers. A total of 244 worker bees from 20different locations in Turkey were used. Restriction fragment length polymorphism(RFLP) and DNA sequence data were utilized to identify the honeybee populations.The mitochondrial regions including anonymous locus, cytochrome b (cyt b) gene,cytochrome C oxidase subunit I (COI), large subunit ribosomal RNA (lrRNA), intercytochrome C oxidase subunit I and cytochrome C oxidase subunit II region (inter COI-COII) and cytochrome C oxidase subunit I and cytochrome C oxidase subunit IIintergenic region (COI-COII intergenic region) were analysed in this study.BglII restriction profile of the cyt b gene, HincII and HinfI restriction profile of COIsubunit, EcoRI restriction profile of lrRNA, XbaI restriction profile of inter COI-COIIregion and DraI restriction profile of the COI-COII intergenic region revealed 6 RFLPmarkers. Also the nucleotide sequence of the COI-COII intergenic region gave rise to11 nucleotide sequence variation (haplotype). As a result, anonymous locus, 6 RFLPmarkers and 11 nucleotide sequence variation in the COI-COII intergenic regionrevealed a total of 18 different mtDNA markers.

According to the anonymous locus and 6 RFLP markers, Turkish honeybees belong tothe East European and Mediterranean (C) lineage. Also, the nucleotide variation in theCOI-COII intergenic region revealed 11 different haplotypes designated as C1a, C1b,C1c, C1d, C1e, C1f and C1g in C1 haplotype group and C2a, C2e, C2f and C2g in C2haplotype group. The C1b, C1c, C1d, C1e, C1f and C1g haplotypes in C1 haplotypegroup and C2f haplotype in C2 haplotype group were firstly reported in this study.2007, 125 pagesKey Words:Apis mellifera L., mtDNA, PCR-RFLP, DNA sequence analysis,

haplotype


5/141

v

TEEKKREsas olarak Devlet Planlama Tekilat (DPT-2003K12019015-5) ksmi olarak daTBTAK (TOVAG-103V070/VHAG-2046) tarafndan desteklenen bu aratrmada;

Trkiyenin 20 farkl yresinden toplam 244 ii ar rnei materyal olarak kullanlarak,Trkiye bal ars populasyonlar 18 farkl mitokondriyel DNA markeri bakmndantanmlanmtr. Projeye ekonomik destek salayan DPT ve TBTAKa teekkrederim.Bana bu konuda alma olana salayan, almalarm ynlendiren, her konuda bilgi,neri ve yardmlarn esirgemeyen, yazm aamasndaki sonsuz sabr ve zverilerindendolay danman hocam sayn Do. Dr. Mehmet Ali YILDIZ a, aratrma materyalinintemin edilmesi ile literatr temini noktasnda zel ktphanesindeki temel kaynaklaraulama olana salayan sayn Do. Dr. H. Vasfi GENER e, yapc ve ynlendiricieletirilerinden dolay TK yesi sayn Prof. Dr. etin FIRATLI ile Prof. Dr. Ceyhan

ZBEYAZ a (A. . Vet. Fak.), Dou ve Gney Dou Anadolu blgelerinden materyaltemin edilmesindeki yardmlarndan dolay Yar. Do.Dr. Cengiz ERKANa(Y.Y../Van) ve laboratuvar almalar srasnda birlikte altm arkadalarm Ara.Gr. Hasan MEYDAN, Yasemin GEDK, Muhammet KAYAya da teekkr ederim.Laboratuvarnda bana alma frsat vererek molekler teknikler konusunda nemlibilgiler ve deneyim edindiim University of Florida, College of Agricultural and LifeSciences, Department of Entomology and Nematology blmnden Do. Dr. H. GlennHall ve laboratuar asistan Raquel McTiernana ok teekkr ederim. Ayrcaalmalarm ABDde gerekletirdiim srece desteklerini esirgemeyerek banayreini ve evini aan ve akademik hayatmda rnek aldm hocam, daym Do. Dr.Sleyman TFEKye de bir kez daha bu vesile ile teekkr ederim.Son olarak, bu gne kadar hemen her konuda olduu gibi doktora yapmam konusundada beni yreklendiren ve bugnlere gelmemde nemli paylar olan canm annem, babamve kardeim Oya TZMETe de teekkr etmek istiyorum. Ayrca bu tez almamsrasnda srekli yanmda olan ve birok fedakarlklar gstererek beni destekleyen eimlker ZDLe ve hayatmn en deerli varl canm olum Doruk Alpe de en derinduygularm ile teekkr ediyorum. Sizlerin destei ile bu almay gerekletirdim...

Fulya ZDLKonya, Aralk 2007


6/141

vi

NDEKLER

ZET .......................................................................................................................... iii

ABSTRACT................................................................................................................... iv

TEEKKR................................................................................................................... v

SMGELER DZN ..................................................................................................... ix

EKLLER DZN ....................................................................................................... x

ZELGELER DZN ............................................................................................... xii

1. GR .......................................................................................................................... 1

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER ....................................... 8

2.1 Bal Arsnn Sistematikteki Yeri ve Corafi Irklar............................................... 8

2.2 Molekler Genetik almalarnda Varyasyon Belirleme Yntemleri............. 14

2.2.1 DNA-DNA hibridizasyonu yntemi................................................................... 16

2.2.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yntemi .................................................... 17

2.2.3 Rasgele oaltlm polimorfik DNA (RAPD) yntemi.................................... 20

2.2.4 oaltlm para uzunluk polimorfizmi (AFLP) yntemi ............................. 21

2.2.5 Tek nkleotid polimorfizmleri (SNPs) yntemi ............................................... 222.2.6 Restriksiyon para uzunluk polimorfizmi (RFLP) yntemi ........................... 23

2.2.6.1 Southern emdirim (blotting) temelli RFLP yntemi ......................................24

2.2.6.2 PCR temelli RFLP yntemi..............................................................................26

2.2.7 Basit dizilim tekrarlar (SSR), ardk basit tekrarlar (STR)ya da mikrosatelit yntemi ................................................................................. 28

2.2.8 DNA dizi analizi yntemi.................................................................................... 29

2.2.9 Molekler genetik yntemlerin karlatrlmas ............................................. 33

2.3 Hayvansal Mitokondriyel Genomun (mtDNA) Yaps ....................................... 342.3.1 Mitokondriyel DNA moleklnde yeni kombinasyonlar olumamaktadr ... 35

2.3.2 Mitokondriyel DNA molekl anaya ait kaltm modeline sahiptir............... 36

2.3.3 Hayvan mitokondriyel DNA moleklnn ierii ........................................... 38

2.4 Bal Arlarnda Mitokondriyel Genomun (mtDNA) Yaps ................................ 41

2.5 Bal arlarnda allan Mitokondriyel (mtDNA) Lokuslar .............................. 45

2.6 Kaynak zetleri ..................................................................................................... 56

2.6.1 Southern emdirim (blotting) temelli aratrmalar............................................ 56


7/141

vii

2.6.2 PCR temelli aratrmalar ................................................................................... 58

2.6.2.1 Anonim lokus.....................................................................................................60

2.6.2.2 Sitokrom b (cyt b) lokusu .................................................................................60

2.6.2.3 Sitokrom C oksidaz I (COI) lokusu.................................................................61

2.6.2.4 Ribozomun byk alt birimi (lrRNA) lokusu ................................................62

2.6.2.5 Sitokrom C oksidaz I ile II arasndaki blge (COI-COII aras) ...................63

2.6.2.6 Sitokrom C oksidaz I ile II arasndaki intergenik blge(COI-COII intergenik blge) ...........................................................................64

2.6.2.7 ATP sentaz 6 ve 8 (ATPaz 6 ve ATPaz 8) lokuslar .......................................68

2.6.2.8 NADH dehidrogenaz 2 (ND2) lokusu ..............................................................68

2.6.2.9 NADH dehidrogenaz 5 (ND5) lokusu ..............................................................69

3. MATERYAL ve YNTEM..................................................................................... 70

3.1 Materyal .................................................................................................................. 70

3.1.1 Canl materyal ve rnekleme ............................................................................. 70

3.1.2 Ara ve gereler................................................................................................... 71

3.1.3 Tampon zeltiler................................................................................................ 72

3.2 Yntem .................................................................................................................... 73

3.2.1 Genomik DNA izolasyonu .................................................................................. 73

3.2.2 allan mitokondriyel DNA PCR-RFLP lokuslar........................................ 743.2.3 Sitokrom Coksidaz ile arasndaki intergenik blgenin

(COI-COII intergenik blge) DNA dizi analizi ................................................ 80

3.2.4 Populasyonlar arasndaki nkleotid dnmlerinin beklenenmiktarlarna ait genetik uzaklklar ve dendogram .......................................... 80

4. ARATIRMA BULGULARI VE TARTIMA..................................................... 83

4.1 Anonim Lokus ........................................................................................................ 83

4.2 Mitokondriyel DNA PCR-RFLP Lokuslar......................................................... 84

4.2.1 Sitokrom b (cyt b) lokusu BglII restriksiyon enzimi kombinasyonu ............. 844.2.2 Sitokrom C oksidaz I (CO) lokusu Hinc restriksiyon enzimi

kombinasyonu...................................................................................................... 85

4.2.3 Sitokrom C oksidaz I (CO) lokusu Hinf restriksiyon enzimikombinasyonu...................................................................................................... 86

4.2.4 Ribozomun byk alt birimi (lrRNA) lokusu EcoR restriksiyon enzimikombinasyonu...................................................................................................... 87

4.2.5 Sitokrom C oksidaz I ile II arasndaki blge (CO-CO aras) Xbarestriksiyon enzimi kombinasyonu.................................................................... 88


8/141

viii

4.2.6 Sitokrom C oksidaz I ile II arasndaki intergenik blge(CO-CO intergenik blge) Dra restriksiyon enzimi kombinasyonu ......... 90

4.3 Sitokrom C Oksidaz I le II Arasndaki ntergenik Blge(CO-COntergenik Blge) DNA Dizi Analizi ................................................. 91

4.3.1 C1a haplotipi ....................................................................................................... 94

4.3.2 C1b haplotipi ....................................................................................................... 95

4.3.3 C1c haplotipi........................................................................................................ 95

4.3.4 C1d haplotipi ....................................................................................................... 96

4.3.5 C1e haplotipi........................................................................................................ 96

4.3.6 C1f haplotipi ........................................................................................................ 96

4.3.7 C1g haplotipi ....................................................................................................... 97

4.3.8 C2a haplotipi ....................................................................................................... 974.3.9 C2e haplotipi........................................................................................................ 97

4.3.10 C2f haplotipi ...................................................................................................... 98

4.3.11 C2g haplotipi ..................................................................................................... 98

4.4 Populasyonlar Arasndaki Nkleotid Dnmlerinin BeklenenMiktarlarna Ait Genetik Uzaklklar ve Dendogram ....................................... 102

5. SONU.................................................................................................................... 107

KAYNAKLAR........................................................................................................... 111

EK 1 Sitokrom C oksidaz I ile II arasndaki intergenik blgenin(COI-COII intergenik blge) ksmi nkleotid dizi analizi ...................... 119

ZGEM................................................................................................................ 126


9/141

ix

SMGELER DZN

A Adenin nkleotidi

AFLP oaltlm para uzunluk polimorfizmiATP Adenozin trifosfatAZF Ankara ni. Ziraat Fakltesi Zootekni Blm, Arclk nitesib Baz iftibdH2O Bidestile suC Sitozin nkleotidicDNA Komplementer DNACOI Sitokrom C oksidaz ICOII Sitokrom C oksidaz IIcpDNA Kloroplast DNAcyt b Sitokrom b geni

d Nkleotid dnmlerinin beklenen miktarDNA Deoksiribonkleik asitdNTP Deoksinkleotid trifosfatEDTA Etilen diamin tetra asetik asitG Guanin nkleotidiHCl Hidro klorik asitkb KilobazlrRNA Ribozomun byk alt birimiMgCl2 Magnezyum klorrM MolmtDNA Mitokondriyel DNAmM MilimolM MikromolL MikrolitreNaCl Sodyum klorrnDNA ekirdek DNAnM NanomolPCR Polimeraz zincir reaksiyonupM PikomolRAPD Rasgele oaltlm polimorfik DNARFLP Restriksiyon para uzunluk polimorfizmi

rpm Dakikadaki devir say

s

SDS Sodyum dodesil slfatSNPs Tek nkleotid polimorfizmleriSSR Basit dizilim tekrarlarSTR Ardk basit tekrarlarT Timin nkleotidiTKV Trkiye Kalknma VakfU niteTBE Tris-borik asit-EDTA tampon zeltisiTE Tris-EDTA zeltisi


10/141

x

EKLLER DZN

ekil 2.1 Morfometrik karakterler kullanlarak temel bileenler analizi ile

Bat bal arlarnn genetik soya dalm (Ruttneret al. 1978)................... 11ekil 2.2 Morfometrik karakterler kullanlarak temel bileenler analizi ile

Bat bal arlarnn uzaysal konumlandrlmas (Kauhausen-Kelleret al. 1997)....................................................................... 11

ekil 2.3 SNPs markerleri kullanlarak Bat bal arlarnn drt genetiksoya dalm (Anonymous 2006, Whitfield et al. 2006)................................ 12

ekil 2.4 Morfometrik karakterler kullanlarak Yakn Dou (O: Oryantal)grubunda yer alan Bat bal arlar (Kauhausen-Kelleret al. 1997)................. 12

ekil 2.5 Morfometrik karakterler kullanlarak Bat bal ars

(Apis mellifera L.) genetik soylarnn corafi dalm.Garnery et al. (1992)den deitirilmitir ....................................................... 13

ekil 2.6 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dngs.................................................. 18

ekil 2.7 PCR dngs kullanlarak hedeflenen DNA blgesininssel oaltm................................................................................................. 19

ekil 2.8 Southern emdirim teknii ile hibridizasyona dayal RFLP analizi................. 27

ekil 2.9 Genetik farkllklarn PCR-RFLP yntemi kullanlarak belirlenmesi ............ 28

ekil 2.10 DNA dizi analizi yntemleri (Avise 2004)................................................... 31

ekil 2.11 Otomatik DNA dizi analizi reaksiyonundan elde edilen veriler ................... 32ekil 2.12 Endosimbiotik teori....................................................................................... 34

ekil 2.13 Dllenmi yumurta ve larvada erkek mtDNA orannn azalmas (Moritz 1994). ................................................................................................. 38

ekil 2.14 Herhangi bir restriksiyon enzimi bakmnda haplotiplerin gsterimi........... 39

ekil 2.15 Bat bal ars (Apis mellifera L.) mtDNA genom haritas (Crozier and Crozier 1993) ............................................................................. 43

ekil 2.16 Apis mellifera mtDNA genomunun restriksiyon haritas.Cornuet and Garnery (1991)den deitirilmitir............................................ 44

ekil 2.17 Mitokondriyel DNA COI-COII intergenik blge bakmndanApis trlerinin karlatrlmas. Cornuet and Garnery (1991) veMoritz (1994) den deitirilerek izilmitir................................................... 47

ekil 2.18 Bal arlarnda COI-COII intergenik blgenin yaps.Cornuet et al. (1991) ve Moritz (1994)den deitirilerek izilmitir ............ 49

ekil 2.19 Po blgesinde tespit edilen d, d1, d2, d4, d6 ve d7 nkleotideksilmeleri. Francket al. (2001)den izilmitir............................................. 50

ekil 2.20 tRNALeu ve Q2 blgelerinin ikincil (secondary) yaplarnnkarlatrlmas. Cornuet et al. (1991) ve Moritz (1994)den

deitirilerek izilmitir .................................................................................. 52


11/141

xi

ekil 2.21 Bat bal ars alttrlerinin CO-CO intergenik blge bakmndansnflandrlmas .............................................................................................. 54

ekil 2.22 CO-COII intergenik blge haplotiplerinin restriksiyon haritas (solda)ile restriksiyon para byklkleri (sada) (Francket al. 2001) .................... 55

ekil 4.1 Anonim lokus bakmndan elde edilen modeller ............................................ 83

ekil 4.2 Cyt b lokusunda BglII restriksiyon enzimi kesim modelleri .......................... 84

ekil 4.3 CO lokusunda Hinc restriksiyon enzimi kesim modelleri .......................... 85

ekil 4.4 CO lokusunda Hinf restriksiyon enzimi kesim modelleri ............................ 86

ekil 4.5 lrRNA lokusunda EcoRI restriksiyon enzimi kesim modelleri vePCR rnleri ................................................................................................... 87

ekil 4.6 CO-CO arasXbaI restriksiyon enzimi kesim modelleri vePCR rnleri ................................................................................................... 88

ekil 4.7 CO-CO intergenik blge DraI restriksiyon enzimi kesim modelleri.......... 91

ekil 4.8 COI-COII intergenik blge bakmndan Trkiye bal ars populasyonlar arasnda nkleotid dnmlerinin beklenenmiktarlarndan (d) elde edilen dendogram.................................................... 106


12/141

xii

ZELGELER DZN

izelge 2.1 Bal arlarnn taksonomik snflandrlmas (Engel 1999, Anonymous 2006) ................................................................... 8

izelge 2.2 Bat bal ars (Apis mellifera L.) alttrlerinin corafi dalm ilemorfometri, mtDNA ve SNPs verileri bakmndan yer aldklar genetik soylar ................................................................................................ 9

izelge 2.3 Restriksiyon enzimleri ile elde edilen yapkan ve kt uluDNA paracklar ........................................................................................ 24

izelge 2.4 Molekler genetik yntemlerin karlatrlmas (Avise 2004)................... 33

izelge 2.5 A. mellifera mitokondriyel genomunda yapsal protein ve

ribozomun byk ve kk alt birimlerini kodlayan genler ilebu genlerin A+T ierikleri, D. yakuba mitokondriyel genomu ile olanbenzerlii ve her bir genin nkleotid says (Crozier and Crozier 1993, Moritz 1994) ................................................... 42

izelge 2.6 Apis mellifera alttrleri ve haplotipler (Moritz 1994) ................................. 48

izelge 3.1 Bal ars rneklerinin alnd yreler ve rnek genilikleri (n) .................. 70

izelge 3.2 almada kullanlan ara ve gerelerin listesi............................................ 71

izelge 3.3 Elektroforez ve agaroz jellerinin hazrlanmasnda kullanlanstok ve tampon zeltilerin bileimleri ....................................................... 72

izelge 3.4 Elektroforez ve poliakrilamid jellerinin hazrlanmasnda kullanlanstok ve tampon zeltilerin bileimleri ....................................................... 72

izelge 3.5 allan mtDNA PCR-RFLP lokuslar, primerler,restriksiyon enzimleri ve kaynaklar ............................................................ 76

izelge 3.6 Kullanlan restriksiyon enzimleri, saflatrldklar organizmalarve restriksiyon yaptklar zgn tanma dizileri .......................................... 77

izelge 3.7 allan mtDNA PCR-RFLP lokuslar ve bu lokuslarn oaltlmas iin hazrlanan PCR reaksiyonlar ile programlar...................................... 78

izelge 3.8 Kimurann ki-Parametre Metodu modelinde nkleotid dnmleri ....... 81

izelge 4.1 Bat bal ars genetik soylarn belirlemek amacyla allanmtDNA PCR-RFLP lokuslar, restriksiyon enzimleri verestriksiyon blgelerine gre Apis mellifera mtDNA genetik soylar (Smith et al. 1997, Palmeret al. 2000) ....................................................... 89

izelge 4.2 Apis mellifera mtDNA C genetik soyu iin bildirilen haplotiplerve nkleotid farkllklar.............................................................................. 92

izelge 4.3 Apis mellifera mtDNA C genetik soyu iinde tespit edilen COI-COIIintergenik blge haplotipleri, DraI restriksiyon uzunluklar vefilogenetik analizlerde kullanlan deiken nkleotid sralar..................... 99


13/141

xiii

izelge 4.4 Trkiye bal ars populasyonlarnda COI-COII intergenik blgebakmndan tespit edilen haplotipler ve nkleotid farkllklar ................. 100

izelge 4.5 Trkiye bal ars populasyonlarnda tespit edilen haplotipler vernek saylar (n) ....................................................................................... 101

izelge 4.6 COI-COII intergenik blge bakmndan Trkiye bal ars populasyonlar arasnda nkleotid dnmlerininbeklenen miktarlarna (d) ait genetik uzaklklar ....................................... 105


14/141

1

1. GREvrim ve doal seleksiyonun bal ars populasyonlarnn genetik yaplarnda meydana

getirebilecei genetik deiiklikleri aklayabilmek iin eitli zelliklerden

yararlanlmaktadr. Bu zellikler esas olarak morfolojik, biyokimyasal ve DNA

markerleri olarak snflandrlmaktadr. Genetik markerler, protein ya da DNA

diziliminde var olan farkllklar ortaya koymak iin eitli yntemler ile belirlenebilen

zelliklerdir. zerinde durulan herhangi bir zellik bakmndan genetik varyasyonun

belirlenmesi ve bundan yararlanlarak bireylerin ve populasyonlarn tanmlanmas

kullanlan genetik marker/markerlerin seimindeki isabete son derece baldr. allan

herhangi bir zellik bakmndan genetik markerin baars, populasyonu oluturan

bireyler arasndaki farkllklar ortaya koyma gc, heterozigot genotipteki bireyleri

homozigot genotiplerden ayrmaya olanak salayan kodominant kaltm modeli

gstermesi, evre faktrlerinden etkilenmemesi ve ayrca kullanlan yntemin kolay ve

ucuz olmas gibi faktrlere bal olarak artmaktadr.

Bal ars kolonisindeki biyolojik kurallar Aristodan beri bilim insanlarn cezbetmitir.

Bal ars kolonisinde binlerce ii arnn grnte rasgele olan ve tek bir hedefte son

bulan kouturma halindeki faaliyetleri sanki koordine edilmi bir sistem iinde

yrtlmektedir. Bal arlarnda kemeke halde yrtlen faaliyetlerin gizemi ve nasl

yrtldne ait modeller Aristodan sonra generasyonlar boyunca bilim insanlarnn

alma alann oluturmutur. Bal ars kolonisinde varolan bu byk bulmacann baz

blmlerinin zmlenmesi ve bireyler arasndaki iletiimin temellerinin anlalmas

ok uzun zaman almtr. Moritz (1994)e gre bal ars biyolojisi alanndaki nemli

saylabilen nc almalar, ii arlarn dans dilinin anlalmasn (von Frisch 1965) ve

ana arnn koloni zerindeki kontrolnn feromonlar (pheromones) yoluyla

belirlenmesini (Buttler 1973) ortaya koyan aratrmalarla balamtr. Yirminci yzyln

ikinci yarsnda yaplan bal ars biyolojisi zerine aratrmalar, davran ekolojisi ve

bireyler arasndaki iletiim zerine younlamtr. Ancak, davran ekolojisi zerine

younlaan almalar her zaman gl olmam ve bal arlar modern aratrma alanna

bir Genetik Model Sistem olarak girmitir (Moritz 1994).


15/141

2

Bal arlarnn Genetik Model Sistem olarak kullanlmalar 1800l yllara kadar

uzanmaktadr. Mendel arlarla denemeler yrtm ancak erkek arlarla ana arlar

kafeste iftletiremedii iin almalarnda baarsz olmutur. Bylece Mendel bezelye

denemelerine dayanan teorilerini bal arlarnda dorulmak iin gerekli olan hibir F2

dl elde edememitir. Bal ars zerine yaplan almalardaki gerek baarlar, 1845te

erkek arlarn partenogenetik olarak meydana geldiklerinin ortaya konulmasyla

salanmtr. Yirminci yzyln balarnda bal ars, dllenme eklinin ve kromozom

oalmasnn anlalmasna ynelik almalarda kullanlmtr. Yirminci yzyln ilk

eyreinde meyve sinei (Drosophila)nin genetik almalarda kullanlmasna

balanncaya kadar bal arlar balca Genetik Model Sistemler ierisinde yer almtr.

Bu tarihten sonra meyve sinekleri Genetik Kontrol Organizmas olarak byk kabul

grm ve bal ars genetii ok zellemi dar bir alma alan haline gelmitir. Yapay

tohumlamann uygulama alanna girmi olmas bile bal ars genetii zerinde yaplan

almalarn say olarak azalmasn durduramamtr. Bal ars bir Genetik Model Sistem

olarak meyve sinekleriyle karlatrldnda aada zetlenen baz olumsuzluklara

sahip bulunmaktadr (Moritz 1994). Bu olumsuzluklar;

a)elle temas etmenin ve herhangi bir uygulama yapmann zor olmas,b)

embriyonik gelimenin yava olmas,

c)kromozom saysnn (n = 16) fazla olmas sonucunda yaplan balant (linkage)almalarnn uzun zaman almas ve usandrc olmas,

d)kontroll iftlemelerin ancak zel alet ve ekipman gerektiren yapay tohumlamaile gerekletirilebilmesi,

e)generasyonlar aras srenin uzun olmas nedeniyle yksek kalitede yaynlarnhzl bir seride yaplamamas ve

f)bakm ve koruma maliyetlerinin ok yksek olmaseklinde zetlenebilir.1960l yllarda yaplan molekler genetik almalarda Genetik Model Sistem olarak

bal arlar bir kenara itilmi ve hemen hemen tm aratrmalarda meyve sinei

kullanlmtr. Meyve sinei zerinde yaplan molekler genetik almalar hzla

artarken ar genetii alan bilim insanlar daha ok uygulamalslah almalarna

ynelmilerdir. Onlarca yl artc bir sre ekinceleri olan genetikiler son yllarda

yava yava bal ars aratrmalarna yeniden girmilerdir. nk yeni ve modern

teknikler kullanlarak kimi ok nemli biyolojik sorunlar sadece bal arlarnn


16/141

3

kullanlmasyla zlebilmektedir. Bal ars, meyve sinekleri ile karlatrldnda

yukarda zetlenen eitli olumsuzluklara sahip olmasna ramen, bu tip aratrmalarda

tamamen kullanlmas elverisiz bir hayvan modeli olarak deerlendirilmemelidir.

Gerekten de bal arlarn Genetik Kontrol Organizmas olarak dier organizmalardan

daha ekici klan nemli zellikler bulunmaktadr. Bal arlarn dier organizmalardan

stn ve temel genetik almalarnda kullanlmasn yararl klan balca zellikleru

ekilde zetlenmitir (Moritz 1994).

a)Erkek arlarn tek kromozom setine sahip olmalar, haploidlerde gen rnlerininallmasna olanak salamaktadr.

b)Zengin davran eitlilii ve sosyal yap bal arlarn davran genetiialmalarnda balca sistem haline getirmektedir.

c)Embriyonik gelimenin yava olmas erken geliim evrelerinde genorganizasyonlar ve rnleri almalarna birok olanaklar sunmaktadr.

Bal arlarnn ekonomik ve ekolojik nemi devam ettii srece, bal arlarnda

populasyon genetii ve slah almalar da zorunlu olarak yaplacaktr. Bu noktada

doal ve yapay seleksiyon srelerinin ve bunlarn altnda yatan genetik

mekanizmalarn anlalmasnda molekler teknikler aratrclara yardmc olmaktadr.

Bugn gelinen safha, meyve sinei kullanlarak elde edilen detayl molekler genetik

bilgilerin bal ars genetii almalarna hzl bir ilerleme salayacakekilde

aktarlmasdr.

eitli molekler DNA teknikleri kullanlarak bal ars genomunun detayl birekilde

allmasna ynelik olarak 2003 ylnda Honeybee Genome balkl bir proje

balatlmtr. Geni katlml bir aratrma ekibi (The Honeybee Genome Sequencing

Consortium) tarafndan yrtlen projenin ilk yaynlanan aratrma sonularna gre;

bal ars genomunun bykl ile nkleotid ieriinin (A+T nkleotidlerinin yksek

miktarda olduu) tahmin edilmesine, genomdaki genlerin (yaklak 10.000 gen)

fonksiyonlar ile organizasyonlarna, kromozomlarn karyotip analizlerine, bal ars

trleri/alttrleri arasndaki filogenetik ilikilerin belirlenmesine ve evrim srecinde bal

ars ile dier baz trler arasndaki genomik benzerliklerin ortaya konmasna ynelik

ok detayl veri elde edilmitir (Anonymous 2006, Whitfield et al. 2006).


17/141

4

ekirdek ve mitokondriyel DNA molekllerinin kullanld molekler tekniklerden

yararlanlarak bal arlarnda gen haritalamas, genlerin organizasyonlar ile alma

esaslarnn belirlenmesi, genlerin evriminin anlalmas ve populasyon genetii

konularnda aratrmalar youn birekilde yrtlmektedir. Bylece, bal arlarnda

yrtlen molekler genetik almalar hem temel genetik mekanizmalarn anlalmas

konusundaki bilgilerimizin artmasn hem de bal arlarna zg genetik problemler

hakkndaki bilgi birikiminin daha da iyiletirilmesini salamaktadr (Moritz 1994).

Bal ars trnde yaplan sistematik almalar nceleri morfolojik, 70ler sonrasnda

hem morfolojik ve hem de biyokimyasal markerler temelinde yaplmtr. Ancak

morfolojik zelliklerin hemen hemen tamamnn kantitatif olmas

ndan dolay

bunlar

n

evre artlarndan etkilenmeleri, biyokimyasal markerlerin ise translasyon sonras eitli

deiimlere uramalar gibi nedenlerden dolay filogenetik ve evrim almalarnda

bunlarn kullanmlar giderek azalmaktadr. Morfolojik ve biyokimyasal zelliklerin

belirtilen eksiklikleri DNA dzeyinde yaplan almalarla giderilmekte ve bu

stnlklerinden dolay DNA tabanl markerlerin sistematik almalardaki kullanm

gittike artmaktadr (Garnery et al. 1992).

Bal ars morfolojilerine gre 4 trde incelenmektedir. Ruttneret al. (1978) e gre bal

ars trleri;

a)bat bal ars (Apis mellifera Linnnaeus, 1758)b)dou bal ars (Apis cerana Fabricius, 1793)c)dev ar (Apis dorsata Fabricius, 1793) ved)cce ar (Apis florea Fabricius, 1787) olarak snflandrlmtr.

Bat bal arsnn dndaki bal ars tr Asya ktasnda bulunmaktadr. Trkiyede

bulunan bal arlar, Bat bal ars (Apis mellifera L.) tr iinde snflandrlmtr. Bat

bal ars Afrika, Avrupa ve Yakn Douyu iine alan ok geni bir corafyada yaylm

bulunmaktadr (Ruttneret al. 1978, Ruttner 1988).

Bat bal ars (Apis mellifera L.)nn yaklak 1 milyon yl nce (1 Myr BP) 3 farkl

genetik soya ayrld bildirilmektedir (Garnery et al. 1992). Bat bal arsnn evrimi


18/141

5

zerine iki farkl hipotez bulunmaktadr. lk hipoteze gre, Yakn Dou (Hazar

Denizinin gneyi), Bat bal arsnn k merkezidir ve bu blgeden farkl yol

izleyerek Avrupa ve Afrikann dier blgelerine yaylmtr (Ruttner 1988, Garnery et

al. 1992). kinci hipoteze gre, Afrika Bat bal arsnn merkezidir ve Cebelitark

Boazndan ber Yarmadasna ve Bat Avrupaya, Alp dalarnn gneyini izleyerek de

Dou Avrupa ve Asyann ortalarna kadar yaylmtr. Bu ikinci hipotez, SNPs

markerleri kullanlarak yaplan alma ile de desteklenmektedir (Whitfield et al. 2006).

Morfolojik zellikler kullanlarak yaplan kmeleme analizi (cluster analysis) ve temel

bileenler analizi (principal components analysis) sonucunda bal ars alttrlerinin A

(Africa), M (Mellifera) ve C (Carnica) olmak zere ana genetik soy ierisindesnflandrlabilecei ifade edilmektedir (Ruttneret al. 1978). Buna gre baz Bat

Avrupa ve Kuzey Afrika alttrleri Mellifera soyu (M),Orta ve Gney Afrika alttrleri

Afrika soyu (A) ve Dou Avrupadan talyaya kadar olan corafyadaki A. m. ligustica

ve A. m. carnica alttrleri ile A. m. caucasica alttr Carnica soyu (C) ierisinde

snflandrlmaktadr. Bu ana soya ilave olarak Yakn ve Orta Dou alttrleri

drdnc bir genetik soy olan Oryantal soyu (O) ierisinde deerlendirilmitir (Ruttner

1988, Kauhausen-Kelleret al. 1997).

Son yllarda mtDNA markerleri kullanlarak yeniden yaplan Bat bal ars alttrlerinin

snflandrlmasnda, Ruttner (1988) ve Kauhausen-Kelleret al. (1997) tarafndan

bildirilen 4 ana snflandrma ile paralel sonular elde edilmitir. Ancak, Ruttner (1988)

tarafndan O genetik soyu ierisinde deerlendirilen A. m. anatoliaca, meda, cypria,

caucasica, adami, armeniacann C genetik soyu ierisinde, Suriye (A. m. syriaca)

ar

s

n

n ise yine O genetik soyu ierisinde deerlendirilebilecei ifade edilmitir. (Ariasand Sheppard 1996, Francket al. 2000a, Palmeret al. 2000). Benzerekilde Ruttner

(1988) ve Kauhausen-Kelleret al. (1997) tarafndan A genetik soyu ierisinde

snflandrlan Yemen arsnn (A. m. yemenitica), molekler yntemler sonucunda

Yemenitica (Y) soyu olarak ifade edilen beinci bir genetik soy ierisinde

deerlendirilmesinin daha uygun olaca bildirilmektedir (Francket al. 2001).


19/141

6

SNPs markerleri kullanlarak yaplan Bat bal ars alttrlerinin snflandrlmasnda,

Ruttner (1988) ve Kauhausen-Kelleret al. (1997) tarafndan bildirilen 4 ana

snflandrma ile paralel sonular elde edilmitir. Ancak, Ruttner (1988) tarafndan M

genetik soyu ierisinde deerlendirilen A. m. intermissa altrnn A genetik soyu

ierisinde deerlendirilebilecei ifade edilmitir (Whitfield et al. 2006).

Bal arlarnn snflandrlmas ve populasyondaki genetik varyasyonun tespit edilmesi

amacyla ekirdek (nDNA) ve mitokondriyel (mtDNA) genomda tespit edilebilen DNA

markerlerinden yararlanlmaktadr. ekirdek genomdaki varyasyonu ortaya koymak

amacyla Rasgele oaltlm Polimorfik DNA (RAPD), Restriksiyon Para Uzunluk

Polimorfizmi (RFLP), oaltlm

Para Uzunluk Polimorfizmi (AFLP), Tek Nkleotid

Polimorfizmleri (SNPs), mikrosatelit ya da Basit Dizilim Tekrarlar (SSR) gibi eitli

marker tekniklerinden yararlanlmaktadr. ekirdek DNA (nDNA) markerlerinin para

deiimlerine maruz kalmas ile hem anaya ve hem de babaya ait kaltm modeli

gstermeleri nedeniyle filogenetik almalarda yaygn olarak kullanlmamaktadr.

PCR, RFLP ve DNA dizi analizi yntemleri kullanlarak elde edilen ok saydaki

mtDNA markeriyle yaplan almalar bal ars populasyonlarnn tanmlanmas,orijinlerinin belirlenmesi ve filogenetik ilikilerin ortaya konmas gibi birok konuda

olduka faydal ipularnn tespit edilmesine yardmc olmutur. Bu tip markerler ile

yaplan aratrmalar morfometri almalaryla da uyumlu olan daha duyarl sonularn

ortaya kmasn salam ve gnmzde farkl bal ars alttrlerine zg ok sayda

mtDNA markeri tespit edilmitir (Moritz et al. 1986, Crozieret al. 1991, Hall and

Smith 1991, Garnery et al. 1991, 1992, 1995, Arias and Sheppard 1996, Smith et al.

1997, Francket al. 1998, 2000a, 2000b,Palmeret al. 2000, De La Rua et al. 2001).Bat bal ars alttrlerinin (Apis mellifera L.) de dahil olduu tm bal ars trlerinde

mitokondriyel genomda allan lokuslar; sitokrom b (cyt b), sitokrom C oksidaz I

(COI), ribozomun byk alt birimi (lrRNA), sitokrom C oksidaz I ile II aras blge

(COI-COII aras), CO-CO genleri aras herhangi bir gen rn olmayan intergenik

blge (COI-COII intergenik blge), ATPaz 6 ve 8, NADH dehidrogenaz 2 (ND2) ve

NADH dehidrogenaz 5 (ND5) genleri olarak ifade edilmitir (Hall and Smith 1991,


20/141

7

Cornuet et al. 1991, Crozieret al. 1991, Crozier and Crozier 1992, 1993, Arias and

Sheppard 1996, Garnery et al. 1991, 1992, Moritz et al. 1994,Francket al. 2000a,

2000b, 2001, Bouga et al. 2005).

Trkiye bal ars populasyonlarnn snflandrlmas, tanmlanmas ve aralarndaki

filogenetik ilikilerin tespit edilmesi amacyla morfometrik (Grel 1995; Gener 1996)

ve biyokimyasal genetik (Asal et al. 1995; Yldz and Asal 1996; Kandemir and Kence

1995; Kandemiret al. 2000, Kl ve Bilgen 2006) almalar yaplmtr. Trkiye bal

ars populasyonlarnn DNA seviyesinde tanmlanmasna ynelik yurt dnda

yrtlm bir doktora tez almasna rastlanlm olup, bu alma Trkiye bal ars

populasyonlarn

mtDNA seviyesinde tanmlayan ilk arat

rma olarak

deerlendirilmektedir (Palmer 2000). Daha sonra hem mtDNA ve hem de nDNA da

yaplan eitli aratrmalar ile Trkiye bal ars populasyonlarnn daha duyarl olarak

tanmlanmasna allmtr (Smith et al. 1997; Palmeret al. 2000, Yldz et al. 2005a,

2005b, Kandemiret al. 2006a, zdil et al. 2006, Yldz et al. 2006, zdil et al. 2007).

Trkiye bal ars populasyonlar ve ekotiplerinin snflandrlmas hakknda belirtilen

aratrmalarn varlna ramen, bu konudaki tartmalar da youn birekilde

srmektedir. Bu tartmalarn devam etmesinin altnda esas olarak Trkiye bal ars

populasyonlar ve ekotiplerinin molekler DNA markerleri kullanlarak daha detayl bir

ekilde tanmlanmam olmas yatmaktadr. Bu eksiklie ilave olarak gezginci arcln

Trkiye bal ars gen havuzuna nasl bir katk salad da dier bir tartma konusunu

oluturmaktadr.

Bu tez almasnda, Trkiyenin farkl yrelerine ait bal ars populasyonlarnn eitli

mtDNA markerleri bak

m

ndan tan

mlanmas

hedeflenmitir. Bu amala PCR, RFLP veDNA dizi analizi yntemleri kullanlarak anonim, sitokrom b, (cyt b), sitokrom C

oksidaz I (COI), ribozomun byk alt birimi (lrRNA), sitokrom C oksidaz I ile sitokrom

C oksidaz II arasndaki blge (COI-COII aras) ve sitokrom C oksidaz I ile sitokrom C

oksidaz II arasndaki intergenik blge (COI-COII intergenik blge) mtDNA

lokuslarnda, farkl enzim kombinasyonlarndan ve COI-COII intergenik blgenin

DNA dizi analiziyle tespit edilen genetik benzerlikten/farkllktan yararlanlmtr.


21/141

8

2. KURAMSAL TEMELLER VE KAYNAK ZETLER2.1 Bal Arsnn Sistematikteki Yeri ve Corafi Irklar

Bal arsnn yaklak 1 milyon yl nce evrimletii ve kimi aratrclara gre Asya

ktasndan kimi aratrclara gre ise Afrika ktasndan Avrupa ktasna yayld

bildirilmektedir. lk ar kalntlar 40 milyon yl ncesine dayanan fosil kalntlarnda

bulunmutur. Bat bal arsnn (Apis mellifera L.) orijini Kuzey Dou Afrika ve Yakn

Dou olup bu blgelerden Avrupa ve Afrikann dier blgelerine yayld ne

srlmektedir (Ruttneret al. 1978). Bal arsnn taksonomik snflandrlmas izelge

2.1de verilmitir.

izelge 2.1 Bal arlarnn taksonomik snflandrlmas (Engel 1999, Anonymous 2006)

Alem Animalia Hayvanlar

ube Arthropoda Eklem bacakllar

Snf Insecta Bcekler

Alt Snf Pterygota Kanatl bcekler

Takm Hymenoptera Zar kanatllar

Blm Aculeata nelilerSper Familya Apoidea Arlar

Familya Apidae

Alt Familya Apinae

Cins Apis Bal arlar

Tr Apis mellifera Linnnaeus (1758) Bat bal ars

Apis cerena Fabricius (1793) Dou bal ars

Apis florea Fabricius (1787) Cce ar

Apis dorsata Fabricius (1793) Dev ar

Bal ars alttrleri, bulunduklar corafyada hem yapay hem de doal seleksiyonun ortak

etkisi sonucu ortaya kmlardr. Bu nedenle iftlik hayvanlarndaki rk kavramnn

karl olarak bal arlarnda corafi rk kavramnn kullanlmas tercih edilmektedir.

Bir corafi rk iindeki zel ekolojikartlara uyum salam gruplara da ekotip

(ecotype) denilmektedir (Ruttner 1988).


22/141

9

Dnyada en fazla yetitiricilii yaplan bal ars tr Bat bal ars (Apis mellifera

L.)dr. Bat bal arsnn morfometri ve molekler almalara dayanarak 24 corafi rka

ayrld eitli aratrclar tarafndan bildirilmektedir. Bat bal arlar 4 farkl genetik

soy ierisinde deerlendirilmekte olup bunlarn corafi dalmlar izelge 2.2de

verilmitir (Ruttner 1988).

izelge 2.2 Bat bal ars (Apis mellifera L.) alttrlerinin corafi dalm ile morfometri,

mtDNA ve SNPs verileri bakmndan yer aldklar genetik soylar

Bat bal ars alttrlerinin corafi dalm

(Ruttner 1988)

Morfometri

(Ruttner 1988,Kauhausen-Kelleret al.1997)

MtDNA

(Francket al.2000a, 2000b,2001)

SNPs

(Whitfieldet al. 2006)

I. Yakn Dou (Near East) 1. A. m. anatoliacaMaa (1953) O C O2. A. m. adamiRuttner (1975) O - -3. A. m. cypria Pollmann (1879) O C -4. A. m. syriaca Buttel-Reepen (1906) O O O5. A. m. meda Skorikov (1929) O C -6. A. m. caucasica Gorbachev (1916) O C O7. A. m. armeniaca Skorikov (1929) O C -

II. Tropik Afrika (Tropical Africa) 8. A. m. lamarckii Cockerell (1906)

A A-O A9. A. m. yemenitica Ruttner (1975) A Y -10. A. m. litorea Smith (1961) A A A11. A. m. scutellata Lepeletier (1836) A A A12. A. m. adansonii Latreille (1804) A A -13. A. m. monticola Smith (1961) A A -14. A. m. capensis Escholtz (1821) A A A15. A. m. unicolorLatreille (1804) A - A

III. Akdeniz (Mediterranian) 1. Bat Akdeniz (West Mediterranean) a) Kuzey Afrika (North Africa)

16. A. m. sahariensis Baldensperger (1924) A - -17. A. m. intermissa Buttel-Reepen (1906) M - Ab) Bat Akdeniz ve Kuzey Avrupa

(West Mediterranean and North Europe)

18. A. m. iberica Goetze (1964) M M M19. A. m. mellifera Linnaeus (1758) M M M2. Orta Akdeniz ve Gneydou Avrupa

(Central Mediterranean and South East Europe)

20. A. m. sicula Montagano (1911) C A-C -21. A. m. ligustica Spinola (1806) C C C22. A. m. cecropia Kiesenwetter (1860) C C -23. A. m. macedonica Ruttner (1987) C C -24. A. m. carnica Pollmann (1879) C C C


23/141

10

ekil 2.1de grlebilecei gibi, morfolojik zellikler kullanlarak yaplan kmeleme

(cluster analysis) ve temel bileenler analizi (principal components analysis) sonucunda

Bat bal ars alttrlerinin Mellifera (M), Afrika (A) ve Carnica (C) olmak zere ana

genetik soy ierisinde snflandrlabilecei ifade edilmektedir (Ruttneret al. 1978).

Daha sonralarekil 2.2-2.4de grlebilecei gibi, Yakn Dou bal ars alttrleri

Oryantal (O) olarak adlandrlan drdnc genetik soy ierisinde deerlendirilmitir

(Ruttner 1988, Kauhausen-Kelleret al. 1997, Whitfield et al. 2006).

Bat Akdeniz ve Kuzey Avrupa alttrleri (A. m. mellifera ve A. m. iberica) M soyu, Orta

ve Gney Afrika alttrleri A soyu, Dou Avrupadan talyaya kadar olan corafyadaki

A. m. carnica, cecropia ve ligustica alttrleri C soyu (Ruttneret al. 1978) ve dahasonralar bu genetik soylara ilave bir soy eklenerek, Yakn Dou alttrleri O soyu

ierisinde deerlendirilmitir (Ruttner 1988, Kauhausen-Kelleret al. 1997). Molekler

DNA teknikleri temelinde yaplan almalar sonucu Ruttner (1988) ve Kauhausen-

Kelleret al. (1997) tarafndan O genetik soyu ierisinde deerlendirilen A. m.

anatoliaca, meda, cypria, caucasica, adami ve armeniacay ieren Yakn Dou bal

ars alttrlerinin C genetik soyu ierisinde, Suriye (A. m. syriaca) arsnn ise yine O

genetik soyu ierisinde deerlendirilebilecei ifade edilmektedir (Arias and Sheppard

1996, Francket al. 2000a, Palmeret al. 2000). Francket al. (2001)de Etiyopyadan

alnan A. m. yemenitica rneklerinin Y (yemenitica) olarak adlandrlan yeni bir Yemen

genetik soyu ierisinde deerlendirilebilecei bildirilmektedir. Whitfield et al. (2006),

SNPs markerlerinden yararlanarak, Ruttner (1988) ve Kauhausen-Kelleret al. (1997)

tarafndan bildirilen 4 ana snflandrma ile paralel sonular elde etmi ancak Ruttner

(1988) tarafndan M genetik soyu ierisinde deerlendirilen A. m. intermissann A

genetik soyu ierisinde deerlendirilebilecei bildirilmitir (izelge 2.2).

Belirtilen gruplandrmalara ilave olarak baz blgelerde iki soy arasnda bir geiin de

grlebilecei tespit edilmitir. Sicilya adasndaki bal arlarnn (A. m. sicula) byk bir

ksm A soyu iinde deerlendirilirken bir ksm C soyuna dahil edilmitir (Francket al.

2000b). Yine spanyann gneyinden kuzeyine doru A. m. ibericarknda A soyundan

M soyuna doru bir geiin olduu da bildirilmektedir (Smith et al. 1991, Garnery et al.

1995, Francket al. 1998).


24/141

11

ekil 2.1 Morfometrik karakterler kullanlarak temel bileenler analizi ile Bat balarlarnn genetik soya dalm (Ruttneret al. 1978)

ekil 2.2 Morfometrik karakterler kullanlarak temel bileenler analizi ile Bat balarlarnn uzaysal konumlandrlmas (Kauhausen-Kelleret al. 1997)


25/141

12

ekil 2.3 SNPs markerleri kullanlarak Bat bal arlarnn drt genetik soya dalm(Anonymous 2006, Whitfield et al. 2006)

ekil 2.4 Morfometrik karakterler kullanlarak Yakn Dou (O: Oryantal) grubunda yeralan Bat bal arlar (Kauhausen-Kelleret al. 1997)


26/141

13

ekil 2.5 Morfometrik karakterler kullanlarak Bat bal ars (Apis mellifera L.) genetiksoylarnn corafi dalm. Garnery et al. (1992)den deitirilmitir

Son yaplan almalar ile izelge 2.2de verilen corafi rklara yenileri ilave

edilmektedir. rnein, Malta adasndaki endemik bal arlar morfolojik, davran ve

mitokondriyel DNA dizi analizleri sonucunda ayr bir corafi rk olarak kabul edilmi

ve Prof. Friedrich Ruttnerin ansna bu arlara A. m. ruttneri denilmitir. A. m.

ruttnerinin Avrupa arlarndan ok Kuzey Afrikadaki A. m. intermissaya benzedii

bildirilmitir (Sheppard et al. 1997). Yine Orta Asyada Tien Shan dalarnda endemik

bir bal ars olan Apis mellifera pomonella hem morfolojik karakterler (Sheppard et al.

1997) ve hem de SNPs markerleri (Whitfield et al. 2006) bakmndan O, mitokondriyel

DNA dizi analizleri (Sheppard et al. 1997) sonucunda ise C genetik soyu ierisinde

deerlendirilmitir. A. m. pomonella arsnn morfolojik zellikler bakmndan O

genetik soyu ierisinde yer almasna ramen bu genetik soy ierisinde bulunan dier

alttrlerden farkllk gsterdii bildirilmektedir. Bu nedenle A. m. pomonellann


27/141

14

morfolojik zellikler bakmndan hem O hem de C genetik soyu iinde

deerlendirilebilecei ifade edilmektedir (Sheppard and Meixner 2003).

Dnya da ekonomik deeri yksek olan ve kltr yaygn olarak yaplan bal arsrklar, Esmer (A. m. mellifera), talyan (A. m. ligustica), Kafkas (A. m. caucasica) ve

Karniyol (A. m. carnica) bal arlardr.

Trkiyenin farkl iklim ve yerleim artlarna sahip birok Asya, Avrupa ve Ortadou

lkelerinin gei yollar zerinde yer almas ile iklim koullar ve topografik yapnn

ok deiken olmas mevcut bal ars populasyonlarnn birbirlerinden olan

farkllklarn artran ana unsurlar olarak deerlendirilmektedir. Belirtilen bu faktrlerin

bir sonucu olarak Trkiye bal ars populasyonlarnn morfolojik ve ekolojik veriler

temelinde birbirlerinden olduka farkllk gsterdii ve Trkiyenin kuzeydousunda

Kafkas ars (A. m. caucasica)nn ve Gneydousunda ran ars (A. m. meda)nn

bulunduu, bunun dndaki tm blgelerde Anadolu arsnn (A. m. anatoliaca) ana

populasyonu oluturduu bildirilmektedir (Ruttner 1988). Yaplan dier almalarda

ise Hatay ilinde Suriye arsnn (A. m. syriaca) bulunabilecei ifade edilmektedir

(Palmeret al. 2000, Kandemiret al. 2006a).2.2 Molekler Genetik almalarnda Varyasyon Belirleme Yntemleri

Populasyonlar ya da bireyler arasnda var olan genetik benzerliklerin/farkllklarn tespit

edilmesi amacyla yaplan almalarda morfolojik, fizyolojik ve genotipik farkllklar

dikkate alnmaktadr. ncelenen hemen her populasyonda bireyler arasndaki farkllklar

hemen gze arpmaktadr. Doada birbirinin ayn olan iki birey elde etmek neredeyse

imkanszdr. Ayn genotipe sahip canllar arasnda bile (tek yumurta ikizleri, vejetatif

oalan canllar, klonla oaltlan canllar vs.) farkllklar bulunabilmektedir.

Canllarda ele alnan zellik/zellikler bakmndan fenotipik varyasyonun evre ve

genotip olmak zere balca iki kayna bulunmaktadr. Genetik varyasyon ise zerinde

durulan zellik/zellikler bakmndan canllar arasndaki genotipik yapdan kaynaklanan


28/141

15

farkllklar ifade etmektedir. Genetik varyasyonun esas kaynan DNA moleklndeki

drt farkl baz iftinin says ve bunlarn dizilimlerindeki farkllklar oluturmaktadr.

Genetik materyal eitli faktrlere bal olarak deiiklie urayabilir. Bununsonucunda da bireyler arasndaki genotipik farkllklar meydana gelmektedir. Genetik

materyalde meydana gelen farkllklarn temel kayna mutasyondur. Mutasyon

(mutation) genetik materyalde meydana gelen ani ve kararl deiiklikler olup, esas

olarak nkleotid (nokta veya gen) ve kromozom seviyesinde meydana gelen

mutasyonlar olarak iki snfta deerlendirilmektedirler. Belirtilen mutasyonlara ilave

olarak homolog olmayan kromozomlar arasndaki para deiimleri (translocation) ile

eeyli oalan canllarda reme hcrelerinin meydana gelmesi srecinde homolog

kromozomlar arasnda meydana gelen para deiimleri (crossing-over) de canllar

arasndaki genetik farkllklarn temel nedenleri arasnda yer almaktadr. Mutasyona

ilave olarakans, seleksiyon ve gn de birlikte etkisiyle populasyonlarn gen ve

genotip frekanslar deiiklie urayarak uzun yllar sonra genetik dengede olan bir

populasyon, kken ald populasyonun genetik yapsndan ok daha farkl bir yapya

sahip olabilmektedir.

Son 40 yl ierisinde molekler seviyede yaplan genetik varyasyonun biyokimyasal

zellikler temelinde belirlenmesi almalar sonucunda, biyolojik organizmalarn

genetik yaplar ve bunlarn evrimi hakknda faydal ipular elde edilmitir. Genetik

varyasyonun biyokimyasal dzeyde tespit edilmesine ynelik ilk almalar yirminci

yzyl balarnda gerekletirilmitir. Bu konuda yaplan ilk almalar arasnda yer alan

ABO kan grubu sistemi bakmndan insanlarn farkl genetik yaplarda olduu tespit

edilmitir. Kan grubu sisteminde ortaya konan prensipler farkl

insan gruplar

aras

ndayaplan ilk gruplandrma aratrmalarna da uygulanmtr. Belirtilen bu nadir nc

almalara ramen, biyokimyasal genetik almalar ve bunlarn evrim almalarnda

kullanm esas olarak 1960l yllardan sonra hz kazanmtr (MacHugh 1996).

lk kez 1966 ylnda uygulanan protein elektroforezi teknii ile biyokimyasal dzeyde

genotipik yapnn belirlenmesine balanmtr. Aminoasitler, proteinler, enzimler ve

nkleik asitler gibi nemli biyolojik molekller iyonize olabilen gruplara sahiptirler. Bu


29/141

16

gruplar, solusyonlarda katyon (+) ya da anyon (-) olmak zere ykl molekller halinde

bulunabilirler. Benzer ykl molekller farkl molekl arlklarna sahip olduklarnda

yk/ktle oranlar da farkl olacandan, solusyondaki iyonlar elektrik akm etkisine

braklrlarsa molekl arlklar temelinde farkl bant modelleri gstereceklerdir.

Buradan yola karak elektroforez ilemi bir elektrik alan etkisine braklan biyolojik

molekllerin yklerine, byklklerine ve ekillerine bal olarak ayrlmalareklinde

tanmlanmaktadr (Hames and Rickwood 1990). Evrim sreci ierisinde populasyonlar

ii ve populasyonlar arasndaki fakllklarn/benzerliklerin tespit edilmesi amacyla

biyokimyasal genetik markerler (protein ve enzim), 1990l yllara kadar standart

protokoller halinde yaygn birekilde kullanlmtr. Biyokimyasal genetik almalarn

doasndan kaynaklanan kimi zorluklar gidermek amacyla DNA molekl seviyesinde

daha duyarl yeni yntemlerin gelitirilmesine balanmtr. Bu amala gelitirilen ve

yaygn olarak kullanlan yntemler arasnda DNA-DNA hibridizasyonu (DNA-DNA

hybridization), Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR, Polymerase Chain Reaction),

Rasgele oaltlm Polimorfik DNA (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA),

oaltlm Para Uzunluk Polimorfizmi (AFLP, Amplified Fragment Length

Polymorphism), Tek Nkleotid Polimorfizmleri (SNPs, Single Nucleotide

Polymorphisms), Restriksiyon Para Uzunluk Polimorfizmi (RFLP, Restriction

Fragment Length Polymorphism), Basit Dizilim Tekrarlar (SSR, Simple Sequence

Repeats), Ardk Basit Tekrarlar (STR, Simple Tandem Repeats), mikrosatelitler

(microsatellites) ve DNA dizi analizi (DNA sequencing) gibi yntemler yer almaktadr.

2.2.1 DNA-DNA hibridizasyonu yntemi

ekirdek DNA dzeyinde farkl

l

klar

n tespit edilmesi amac

yla ilk olarak DNA-DNAhibridizasyon teknii gelitirilmitir. DNA-DNA hibridizasyon teknii farkl trlere ait

DNA eksenlerinden oluan sarmal bir DNA moleklnn (hibrit) oluturulmas esasna

dayanmaktadr. 1980lerde eitli canllarda filogenetik ilikilerin aklanmasnda bu

teknik kullanlmtr. Ancak, teorik olarak genom hakknda bir n bilgiye sahip

olunmasnn zorunluluu ve uygulama aamasndaki kimi zorluklar nedeniyle bu

tekniin yerini dorudan DNA analizlerinin yaplmasna olanak salayan PCR temelli

yntemler almtr (MacHugh 1996, Avise 2004).


30/141

17

2.2.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yntemiPolimeraz zincir reaksiyonu ynteminin gelitirilmesi molekler biyoloji alannda ok

nemli bir dnm noktas olarak kabul edilmektedir (Saiki et al. 1985, Saiki et al.

1988). Bu tekniin gelitirilmesinden sonra birok organizmada DNA varyasyonu tespit

etmek amacyla yaplan almalarda byk bir art olmutur.

PCR doal DNA replikasyon ileminin temel bileenleri kullanlarak DNAnn tpler

iinde oaltlmas ya da kopyalanmasdr. Hcrede pek ok proteinin ve enzimin rol

ald karmak ilemler sonucunda btn bir genom replike olmaktadr. ok basit

olarak DNA ikili sarmal

almakta, ebeveyn molekln her bir ekseni kal

p (ablon)

olarak kullanlarak yeni iki tamamlayc (komplementer) eksen sentezlenmektedir. Yeni

eksenlerin sentezlenmesi, Watson and Crick (1953) kurallarna gre A-T ve G-C

arasnda olacakekilde baz iftlerinin olumas yeteneine baldr. Ayrca DNA

replikasyonunun balayabilmesi iin kalp DNA ile tamamlayc olan RNA

primerlerinin de sentezlenmesi gerekmektedir. DNA polimeraz enzimi, ksa

oligonkleotidlerin (primer) 3' OH ucuna yeni nkleotidleri ekleyerek yeni oluan DNA

eksenini uzatabilmektedir. DNAnn tpler iinde oaltlmas iin; 6-30 nkleotid

uzunluunda primerlere, optimum pH seviyesine ve tuz konsantrasyonunu optimum

yapan tampon zeltiye, DNA polimeraz enziminin ihtiya duyduu magnezyuma ve

yeni sentezlenecek olan zincire eklenecek 4 tip nkleotide (dNTP) ihtiya

duyulmaktadr (McPherson and Mller 2001).

PCR yntemi genel olarak basamaklk bir dngnn defalarca tekrarlanmasna

dayanan bir teknik olup aamadan olumaktadr. Bu aamalar;

a)DNA eksenlerinin birbirinden ayrlmas (denaturation),b)Primerlerin komplementer DNA blgesiyle hibrit oluturmas (annealing) vec)Yeni eksenlerin sentezinin yaplmas (extension) aamalardr (ekil 2.6).


31/141

18

ekil 2.6 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dngs

Kalp DNAnn iki ekseni, yaklak 94-95 oC lk scaklk uygulamasyla birbirinden

ayrlmaktadr. PCRn ilk aamas olan bu ilem DNA eksenlerinin birbirinden

ayrlmas olarak bilinmektedir. Eksenlerin ayrlmas, 15 saniyeden birka dakikaya

kadar olabilmektedir. kinci aama oligonkleotid primerlerinin (6-30 bazlk) kalp

DNA zerindeki tamamlayc (complementary) sralara elenmeleri ve hibritlenme

olaynn olmasdr. Bunun iin denatrasyon scaklndan daha dk hibritlenme

scaklna reaksiyon soutulmaktadr. Primerlerin doru bir biimde hibritlenmesi iin

scakln 40-72 oC (optimum 55 oC) arasnda olmas gerekmektedir. Reaksiyon bu

scaklklara soutulduunda primerlerin tamamlayc DNA ile hibritlenmesi salanm

olur. Primerlerin balanmas iin 55 oCde 1-2 dk tutmak yeterlidir. En son aama

olarak optimum sentez scaklnda (72 oC), scakla dayankl zgn bir DNA

polimeraz enzimi primerlerin 3OH ularna deoksiribonkleotidleri ekleyerek yeni

eksenleri kalp sraya komplementer olacakekilde sentezlemektedir. Bu son aama

yeni DNA eksenlerinin sentezinin yaplmas olarak bilinmektedir. Uzama aamasnn 1-

3 dk kadar olmas nerilmektedir (McPherson and Mller 2001).


32/141

19

Bir sonraki dngde balangta kullanlan DNA molekl ile birlikte yeni sentezlenen

DNA molekl de birbirinden ayrlmaktadr. Her bir eksen (hem kalp eksen ve hem de

yeni sentezlenen eksen) primer balanma blgesine sahiptir ve sonraki DNA sentezleri

iin kalp grevi grmektedir. Bu aamal PCR dngs 20-40 kez tekrarlanarak

istenilen kopyada DNA blgesi oaltlm olmaktadr. Her bir dngde DNA

molekl, iki katna karlarak hedeflenen DNA parac ssel bir artla

oaltlmakta ve bu DNA paracklar agaroz gibi eitli destek ortamlarnda tespit

edilebilmektedir (ekil 2.7).

ekil 2.7 PCR dngs kullanlarak hedeflenen DNA blgesinin ssel oaltm

PCR cihaz kullanlarak gnmzde pek ok marker belirleme yntemi gelitirilmitir.

PCR tabanl yntemlerin en nemli stnl, ok eski alarda yaam biyolojik

organizmalardan elde edilen DNA moleklleri zerinde bile eitli aratrmalarn

yaplabilmesine olanak salamasdr. Ancak bu yntemin baz eksik ynleri de

bulunmaktadr.


33/141

20

PCR tabanl yntemlerin eksiklikleri u ekilde zetlenebilir (Avise 2004).

a)PCR oaltmnn gvenilirlii tartmaldr. Hedef blgenin oaltmndazellikle ilk dnglerde, primerlerin zerinde durulmayan sralara balanma

ihtimali bulunmaktadr ve bylece hedef blgeden farkl olan yanl sralarn daoaltlmas mmkn olabilmektedir.

b)zellikle poliploidlerde bir lokus oaltlrken PCR rnleri arasnda paradeiimi sz konusu olabilmektedir.

c)Herhangi bir nedene bal olmakszn hedef blgesinin PCR oaltmnnyaplamamasdr. Bu durum zellikle mikrosatelit uygulamalar ile yaplan

ebeveyn analizlerinde genotiplerin doru tespit edilememesine neden

olmaktad

r.PCR temelli olarak tespit edilen polimorfizmler;

a)Kullanlan primer tipine,b)PCR koullarnn sklna (stringency),c)DNA paracklarnn ayrmna ved)DNA paracklarnn belirlenme yntemlerine bal olarak, rasgele (RAPD) ya

da zgn (AFLP, RFLP ve mikrosatelit gibi) olabilmektedir.

2.2.3 Rasgele oaltlm polimorfik DNA (RAPD) yntemiRAPD yntemi genellikle 9-10 bazlk ksa, tek bir primer kullanlarak genomdaki

rasgele blgelerin oaltld PCR temelli bir yntemdir. Bu yntemde zgn hedef

DNA blgesi ya da hedef gen yoktur. Her bir primer rasgele DNA moleklnn farkl

blgelerine balanabilmekte ve bu blgelerin oaltlmasn salamaktadr. Dier

molekler genetik yntemlerle karlatrldnda RAPD ynteminin eitli stnlkleri

ve de eksiklikleri bulunmaktadr.

RAPD ynteminin stn ynleri u ekilde zetlenebilir.

a)ok sayda lokus zerinde ayn anda allmasna olanak vermesi,b)laboratuvar uygulanmasnn kolay olmas,c)sonularn nispeten daha ksa srede elde edilmesi,


34/141

21

d)ok az miktarda genomik DNAya gereksinim duyulmas vee)deneme bana maliyetinin az olmasdr.

RAPD markerlerinin eksik ynleri de u ekilde zetlenebilir.

a)Dominant markerler olmalar nedeniyle heterozigot genotiplerin homozigotgenotiplerden ayrt edilememesi,

b)tekrarlanabilir sonularn elde edilmesinde kimi zorluklarn bulunmas,c)hedef DNA blgesinin genomun neresinde olduunun belirlenememesi ved)laboratuvarlar arasnda farkl sonularn elde edilmesidir.

Belirtilen bu eksikliklerine ramen gnmzde, farkl trler, alttrler ve populasyonlara

ait nDNA moleklnde mevcut bulunan genetik varyasyon hakknda n bilgilerin elde

edilmesi ve populasyonlarn birbirleri ile karlatrlmas amacyla yaplan almalarda

halen bu yntem yaygn olarak kullanlmaktadr (Williams et al. 1991, Black 1993).

2.2.4 oaltlm para uzunluk polimorfizmi (AFLP) yntemi

AFLP ynteminin kullanlmasndaki esas ama, iki restriksiyon endonkleaz enzimiyle

muamele edilerek kesilmi ok sayda genomik DNA paracnn bulunduu bir

karmda yer alan restriksiyon paracklarnn zel bir alt grubunun oaltlmasdr

(Avise 2004). AFLP teknii ile polimorfizm elde etme olasl olduka yksektir ve

genom hakknda herhangi bir n bilgi olmadan bu teknik uygulanabilmektedir. Elde

edilen her bir marker olduka gvenilir ve bilgi salaycdr. AFLP tekniinin en nemli

eksiklii dominant markerler vermesidir. Ayr

ca bu teknikte 50-100 gibi ok say

daoaltlm parack elde edildii iin bunlarn analizlerinin otomatik olarak bilgisayar

kontrolnde yaplmas gerekmektedir. Genetik haritalamada AFLP markerleri genellikle

kromozomlarn sentromer ve telomer (u blgeleri) blgelerinde toplanmaktadr. Bu

durum kromozomlarn dier blgelerinin analizlerini gletirmektedir (Zabeau and

Vos 1993, Vos et al. 1995).


35/141

22

2.2.5 Tek nkleotid polimorfizmleri (SNPs) yntemi

SNPs, bir purin (A ve G) nkleotidinin dier bir purin nkleotidine veya bir primidin (C

ve T) nkleotidinin dier bir primidin nkleotidine deiimi (transition) eklindeolabilecei gibi, bir purin nkleotidinin bir pirimidin nkleotidine veya bir pirimidin

nkleotidinin bir purin nkleotidine deiimi (transversion) eklinde de olumaktadr.

Ayrca bir ya da birka nkleotidin eklenmesi (insertion) veya eksilmesi (deletion) de

yeni SNPs markerlerinin ortaya kmasna neden olan dier faktrlerdir.

Sr lkosit adhezyon yetersizlii (BLAD, bovine leukocyte adhesion deficiency)

kaltsal kusuru bakmndan normal srlarda CD18 geninin 383. nkleotidi olarakAdenin (A) nkleotidi bulunmaktadr. Meydana gelen D128G mutasyonu sonucunda

mutant BLAD allelini tayan srlarda 383. nkleotid Guanin (G)e dnmektedir. Bu

mutasyon tek nokta mutasyonu (AG) sonucunda meydana gelmekte olup SNPs

markeri olarak deerlendirilmektedir. Bu SNPs markeri bakmndan srlar 3 farkl

genotipte deerlendirilmektedir (Shusteret al. 1992).

---TCGA--- ---TCGG--- ---TCGG---

---AGCT--- ---AGCT--- ---AGCC---

Normal (BB) Tayc (Bb) Hasta (bb)

Genetik almalarda SNPs markerleri kullanmnn yaygnlamasnn 4 nemli nedeni

bulunmaktadr. Bu nedenleru ekilde zetlenebilir (Beuzen et al. 2000).

a)zerinde durulan hemen her lokusta dier molekler yntemlere gre ok dahafazla marker elde edilmektedir. rnein insan ekirdek DNAsnda her 1000 baz

bana bir SNPs olumaktadr.

b)SNPs herhangi bir gen rn karl bulunan blgelerde bulunmakta ve bunedenle dorudan fenotipi etkilemektedirler. rnein, Siyah Alaca srlarnda

BLAD hastalnda olduu gibi bu tip SNPs markerleri bireyler arasndaki

genotipik farkllklarn dorudan sorumlusu olabilmektedir.


36/141

23

c)SNPs mikrosatelitlere oranla daha kararl birekilde dllere aktarlmaktadr. Budurum uzun vadede seleksiyon markeri olarak SNPs markerlerinin kullanmn

daha uygun hale getirmektedir.

d)DNA microarray teknolojisi kullanlarak daha fazla lokusun irdelendii genetikalmalarnda SNPs markerleri mikrosatelitlere oranla daha kullanl

markerlerdir.

SNPs genel olarak populasyonda sadece 2 allelin (biallelic) bulunduu durumlarda

tespit edilebilen genetik varyasyon kayna olarak tanmlanmaktadr. Bir SNPs markeri

bakmndan bir populasyondaki bireyler BLAD rneinde olduu gibi en fazla farkl

genotipte (AT, GT ve GC) gruplandrlmaktadr. SNPs markerlerinin bu zelliine bal

olarak her bir SNPs markeri bana elde edilecek bilgi ierii mikrosatelitlere (oklu

allelizm) oranla ok daha dk olmaktadr. Bir populasyonda 5 SNPs markerinden elde

edilecek genetik bilgi toplamnn ancak bir mikrosatelit markerinden elde edilecek

genetik bilgiye eit olabilecei ifade edilmektedir. Buradan hareketle 2000 SNPs

markeri ile allmas durumunda ancak 10 cMlk bir mikrosatelit lokusunun

allmasna edeer bilginin elde edilecei tahmin edilmektedir. SNPs belirlenmesi

amacyla PCR, RFLP, jel elektroforezi ve dizi analizi gibi temel molekleryntemlerden yararlanlmaktadr. Polimorfik blge hakknda nceden bilgi sahibi

olunmasnn gereklilii SNPs markerlerinin bir eksiklii olarak ifade edilmektedir

(Beuzen et al. 2000).

2.2.6 Restriksiyon para uzunluk polimorfizmi (RFLP) yntemi

kili sarmal DNA molekln belirli nkleotid sralarndan kesen bakteriyel kkenlirestriksiyon enzimlerinin (restriction endonuclease) kefedilmesi ile molekler biyoloji

alannda nemli gelimeler yaanmtr. RFLP teknii DNA dzeyinde polimorfizm

elde etmek amacyla gnmzde yaygn olarak kullanlmaktadr. Bakteriler,

bakteriyofajlara (bakterileri enfekte ederek oalan virsler) kar savunma

mekanizmas olarak eitli restriksiyon enzimleri oluturmaktadrlar. Bu enzimler DNA

molekln zgn tanma sralarndan kesebilen enzimlerdir. Bir bakteri bakteriyofajlar

tarafndan enfekte edildii zaman, konak bakterilerin endonkleaz enzimleri fajlarn


37/141

24

DNAsn eitli noktalardan keserek o fajn konak bakteride oalmasn nlemi

olmaktadr (Griffiths et al. 1996).

Restriksiyon enzimleri DNA molekln 4-8 baz iftlik DNA sralarndan tanyarak bublgelerden kesim yapmaktadrlar. Baz enzimler ile kesim sonucu yapkan ulu

(cohesive ya da sticky ends) paracklar ya da kt ulu (blunt ends) paracklar elde

edilmektedir (izelge 2.3). RFLP teknii Southern emdirim (blotting) ve PCR tabanl

olmak zere iki farklekilde uygulanmaktadr.

izelge 2.3 Restriksiyon enzimleri ile elde edilen yapkan ve kt ulu DNA paracklar

Enzim Tanma blgesi Kesim sonras elde edilen DNA paracklar

EcoRI 5GAATTC3'

3'CTTAAG5'

5'G

3'CTTAA

AATTC3'

G5'

Yapkan ulu

HaeIII 5'GGCC3'

3'CCGG5'

5'GG

3'CC

CC3'

GG5'

Kt ulu

Evrim ve populasyon genetii almalarnda restriksiyon enzimlerinden yararlanlarak

ok nemli farkllklar tespit edilmitir. RFLP analizleri hem ekirdek ve hem demitokondriyel genomda olduka faydal bilgiler ortaya koymaktadr.

2.2.6.1 Southern emdirim (blotting) temelli RFLP yntemiSouthern emdirim temelinde uygulanan RFLP yntemi, DNA dzeyindeki

varyasyonlarn tespit edilmesinde yaygn olarak kullanlan ilk yntemlerden biridir. Bu

teknikte belirli kesim enzimleri ile DNA molekl muamele edildikten sonra elde edilenDNA paracklarnn kesim modellerindeki farkllklarndan yararlanlarak DNA

dzeyinde polimorfizmler tespit edilmektedir (Botstein et al. 1980). Oluabilecek eitli

mutasyonlar (eitli nokta mutasyonlar, ters dnme (inversion) ve homolog olmayan

kromozomlar aras para deiimi (translocation) gibi) DNA molekln farkl

ekillerde etkileyebilmekte ve sonuta bireyler arasnda farkl uzunluklara sahip DNA

paracklar elde edilmektedir. DNA paracklarnda meydana gelen uzunluk


38/141

25

farkllklar jel elektroforezi, hibridizasyon ve grntleme ileminden sonra tespit

edilebilmektedir (Southern 1975, Beckmann and Soller 1983).

RFLP tekniinde ncelikle saflatrlan DNA molekl zgn kesim enzimleri ilekesilmektedir. Her bir kesim enzimi DNA moleklnde zgn sralar tanyarak o

noktalardan kesim yapmaktadr ve sonuta farkl uzunluklarda DNA paracklar (kesim

paracklar) seti elde edilmektedir. Elde edilen ok saydaki kesim paracklar

genellikle agaroz jel elektroforezi ile ayrlmaktadr. Bu ayrmdan sonra agaroz jel,

etidyum bromr ile boyandnda jelde srklenme (smear) meydana geleceinden

sadece boyama polimorfizmin tespit edilmesi iin yeterli deildir. Bu aamada

hedeflenen kesim paracklar

nn belirlenebilmesi iin hibridizasyon yap

lmas

gerekmektedir. Agaroz jel zerinde almann glklerinden dolay hibridizasyon

ileminin baka bir ortamda yaplmas gerekmektedir. Bunun iin agaroz jel zerinde

bulunan kesim paracklar daha stabil olan ve nitroselloz ya da naylondan yaplm

baka bir destek ortamna aktarlmaktadr. Southern (1975) adl aratrcnn ortaya

koyduu DNA transfer yntemi Southern emdirim olarak adlandrlmaktadr (ekil 2.8).

Bu yntemde ncelikle agaroz jel bir solusyon iinde denatre edilerek tek eksenli

kesim paracklar seti elde edilmektedir. Daha sonra jelin zerine gzenekli yapda

naylon ya da nitroselloz bir membran ve onun zerine de arlk konulmaktadr. Bu

sayede tampon solusyonun etkisiyle jeldeki btn kesim paracklar tek eksenli olarak

membrana aktarlmakta ve jeldeki bant modelleri membrana aktarlm olmaktadr.

Bir sonraki aama hedeflenen kesim paracklarn ieren membrann bir sonda (probe)

ile muamele edilmesidir. Sonda, hedeflenen DNA parac ile komplementer olan ksa,

tek eksenli bir DNA molekldr. Sondalar ekirdek ya da komplementer DNA(cDNA) ktphanelerinden hazrlanmaktadrlar. Bu DNA ktphaneleri eitli trlere

ait DNA moleklnn paralanm halini ieren vektrler (rn. plazmid) topluluudur.

Bu vektrler eitli bakterilere aktarlarak sahip olduklar DNA paracklar ok sayda

oaltlmaktadr. DNA sondalar ayrca tek eksenli hale dntrlp herhangi bir

etiketleme yntemi ile (rn. radyoizotop) etiketlenip hibiridizasyondan sonra

grntleme yaplabilir hale getirilmektedir. Sonda yaplrken DNA paracklar,


39/141

26

genellikle [32P] nkleozidleri ile u etiketlenmesi ilemine tabi tutulmaktadr. DNA

sondalar eitli kaynaklardan elde edilebilmektedir. Bu kaynaklar;

a)Genomik ktphaneler-genomik DNA kesim enzimleri ile kesilip, her bir DNAparac bakteriyel ya da viral bir vektre klonlanmaktadr. Bu anonim

ktphane iinden RFLP analizi iin uygun sondalar seilmektedir.

b)Komplementer DNA (cDNA) ktphaneleri-hcre iinden mRNA moleklizole edilip ters transkriptaz enzimi ile cDNA sentezlenmektedir. Elde edilen

cDNA molekl eitli vektrlerde oaltlp RFLP analizi iin uygun sonda

olarak kullanlmaktadr.

c)Sitoplazmik DNA (mitokondriyel ve kloroplast) ktphanelerinden uygunsondalarn seimi yaplabilmektedir.

Naylon ya da nitroselloz destek ortamlarna aktarlm olan membrandaki tek eksenli

kesim paracklar, hazrlanan sondalar ile komplementer olduklar durumda

hibritlenmekte ve radyoaktif etiketli ift eksenli DNA paracklar elde edilmektedir.

Etiketli DNA paracklar grntleme sistemi yardmyla grntlenmektedirler.

(Southern 1975, Beckmann and Soller 1983, Vicente and Fulton 2004).

2.2.6.2 PCR temelli RFLP yntemiPCR-RFLP ya da lokusa zg RFLP teknii zgn bir lokusta polimorfizm tespit etmek

iin gelitirilmitir. Bu yntemde standart PCR ilemi ile zerinde durulan lokus

oaltlmakta ve eitli kesim enzimleri ile elde edilen PCR parac kesilmektedir.

Kesim sonucu oluan kesim parac

k modellerine gre kesim noktas

n

n varl

veyayokluuna gre bireyler arasndaki farkllklar tespit edilmektedir (ekil 2.9). Bu

yntemde bireyler arasnda tespit edilebilen polimorfizm, enzim tanma blgesinde

meydana gelen bir nkleotidin eklenmesi, bir nkleotidin eksilmesi veya bir nkleotidin

deimesi eklinde ortaya kan nokta mutasyonlarndan kaynaklanmaktadr. PCR-

RFLP yntemi kodominant kaltm modeline uygun markerler vermektedir. Bu

yntemde rutin PCR reaksiyonunda olduu gibi uzun oligonkleotid primerler

kullanld iin olduka gvenilir bir oaltm yaplmaktadr. oaltlan lokus ya da


40/141

27

gen hakknda nceden bilgi sahibi olunmasnn gereklilii tekniin bir eksiklii olarak

ifade edilmektedir. Ayrca allacak lokuslar iin zgn primerlerin hazrlanmas

zaman ve maliyet gerektiren bir sretir. almann ieriine bal olarak kullanlacak

olan kesim enzimleri de maliyeti artran dier unsurlar olarak ele alnmaldr (Botstein

et al. 1980, Hall 1998, Vicente and Fulton 2004).

ekil 2.8 Southern emdirim teknii ile hibridizasyona dayal RFLP analizi


41/141

28

ekil 2.9 Genetik farkllklarn PCR-RFLP yntemi kullanlarak belirlenmesi

2.2.7 Basit dizilim tekrarlar (SSR), ardk basit tekrarlar (STR) ya da

mikrosatelit yntemiekirdek DNA seviyesinde gelitirilen dier bir genetik marker yntemi SSR yntemi

olup, STR ya da mikrosatelitler olarak da ifade edilmektedir. Mikrosatelitler karyotik

genom boyunca dalm bulunan ve ardk olarak tekrarlanan 2-5 blik gruplardan

olumaktadr. Bu gruplar rnein (GT)n, (CA)n, (ATA)n veya (CAGA)n eklinde


42/141

29

olabilmektedir. Mikrosatelit lokuslardaki farkl alleller PCR ile oaltlan DNA

paracndaki farkl nkleotid dizisi motiflerinin belirlenmesiyle ortaya konmaktadr.

Her bir allelde tekrar eden birimlerin saylar birbirlerinden farkllk gstermektedir.

Mikrosatelitler, lokus bana 10-3 ile 10-4 gibi yksek mutasyon oranlarna sahiptirler ve

buna bal olarak da bir lokusta allel says olduka fazla olabilmektedir. Bu

stnlklerinden dolay mikrosatelitler, populasyonlarn tanmlanmas, genom

haritalamas ve filogenetik ile evrim almalarnda yaygn olarak kullanlmaktadr.

Ayrca mikrosatelitlerin kodominant markerler vermesi ve PCR ile kolaylkla

allabilmesi kullanmnlarn artran dier faktrler arasnda yer almaktadr.

Mikrosatelit varyasyonu olumasn salayan mutasyonlarnn altnda yatan fiziksel

mekanizmann replikasyon srasnda eksenlerin kaymas ile meydana gelen yanl

elemelerin (slipped strand mispairing) olduu ileri srlmektedir. Bu sayede

mikrosatelit lokuslarndaki basit dizi tekrarlar ortaya kmaktadr (MacHugh 1996,

Avise 2004).

2.2.8 DNA dizi analizi yntemi

Bireyler arasndaki genetik farkllklarn tespit edilmesinde kullanlan etkin yntemlerinbanda DNA dizi analizi yntemi gelmektedir. Otomatik DNA dizi analizi cihazlarnn

gelitirilmesi ve elde edilebilirliklerinin kolaylamas sonucunda molekler biyoloji

almalarnda DNA dizi analizinden yararlanlmas gittike yaygnlamaktadr. DNA

dizi analizinin genetik temeli 1970li yllarda ortaya konan iki farkl ynteme

dayanmaktadr. Bunlardan ilki Maxam and Gilbert (1977) tarafndan ortaya konan ve

baz nkleotidlere (A, T, C ya da G) zg kimyasal kesim reaksiyonu temelinde

gelitirilen yntemdir. MaxamGilbert yntemi olarak ifade edilen bu teknikte dizianalizi yaplacak hedef DNA blgesinin u ksmlar radyoaktif madde ile

etiketlenmekte ve bazlara zgn noktalardan kesim yapabilen eitli kimyasal maddeler

ile DNA molekl 4 ayr reaksiyon alt grubunda incelenmektedir. rnein birinci alt

grup, dimetil slfat ve piperidin ile muamele edilerek sadece G nkleotid

pozisyonundan kesim yaplmaktadr. Bu ilemin sonunda G nkleotidi ile son bulan

farkl uzunluklarda DNA paracklar elde edilmektedir. Daha sonra poliakrilamid jel

elektroforezi ile paracklar ayrlmakta ve otoradyografi ile grntlenmektedir. Dier


43/141

30

nkleotide zg benzer reaksiyonlar da yaplarak elde edilen paracklar jel

elektroforezi ile ayrlmaktadr. En son olarak otoradyografi sonucu grntlenen

bantlardan yararlanlarak DNA dizisi elde edilmektedir (ekil 2.10).

Yine 1970li yllarda Sangeret al. (1977) tarafndan ortaya konan ve Sanger yntemi

olarak bilinen dier bir DNA dizi analizi yntemi, gnmzde kullanlmakta olan

otomatik DNA dizi analizi tekniklerinin ncs olarak kabul edilmektedir. Bu yntem

laboratuvar ortamnda (in-vitro) gerekletirilen DNA replikasyonu ileminin kontroll

birekilde yarda kesilmesi temeline dayanmaktadr. kili sarmal DNA tek eksenli hale

getirilmekte ve hedef DNA blgesinin bir blm ile komplementer olan ksa bir DNA

parac, bu blge ile hibrit oluturmaktadr. Bu primer/hedef DNA (template) karm

DNA polimeraz enzimi tarafndan katalize edilen ve primere yeni nkleotidlerin ilave

edilmesi temelinde 4 ayr reaksiyon alt grubunda incelenmektedir. Her bir reaksiyonda 4

tip deoksinkleotidlere (dA, dC, dG ve dT) ilave olarak deoksinkleotidlerde var olan 3'

OH grubunu tamayan dideoksinkleotidler (ddN) de bulunmaktadr. Yeni sentezlenen

DNA molekl, ya primerin u ksm etiketlenerek ya da sentez srasnda etiketli

deoksinkleotid ilave ederek radyoaktif etiketli hale getirilmektedir. Yeni DNA eksen

sentezinin yaplmas nkleotidlerin serbest 3' OH grubuna eklenmesi ile devam etmekteve uzayan eksene ddNTP eklendii zaman eksen uzamas devam edememektedir.

Polimeraz reaksiyonu, ddNTPlerin nadir ve rasgele ilave edildii durumlarda

yrtlmekte ve ayrca farkl bazlarda sonlandrlan farkl uzunluklarda DNA

moleklleri seti elde edilmektedir. Maxam-Gilbert ynteminde olduu gibi, her bir

reaksiyon grubuna ait parack seti, poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrlmakta ve

otoradyografi ile grntlenerek dorudan jelden okunmaktadr. PCR yntemi

bulunmadan nce, genler biyolojik vektrlere klonlan

p, dizi analizi iin uygun halegetirilmekteydi. Ancak PCR ile bu zor ve zaman alc ilemler yaplmadan dizi analizi

reaksiyonunda primerler ile oaltm yaplmakta ve jel elektroforezi ile dorudan

sonuca gidilebilmektedir (Avise 2004).


44/141

31

ekil 2.10 DNA dizi analizi yntemleri (Avise 2004)

PCR ve DNA dizi analizi ilemleri giderek otomatik sistemlerde ksa srede

yaplmaktadr. Otomatik DNA dizi analizi yapan cihazlarda elde edilen veri eitli

yazlmlardan yararlanlarakekil 2.11de grld gibi bir bilgisayar ktseklinde

elde edilmektedir.


45/141

32

ekil 2.11 Otomatik DNA dizi analizi reaksiyonundan elde edilen veriye ait grafik

Not: Grafikte tek bir DNA ekseninde var olan nkleotidlerin farkl renkte pikler ile belirtildii birbilgisayar kts ve 0-185. nkleotidler arasndaki dizi analizi sonular grlmektedir.


46/141

33

2.2.9 Molekler genetik karlatrlmas

Yrtlen almann amac, allacak organizmann tr ve aratrmann yrtlecei

laboratuvar olanaklar gibi eitli nedenlere bal olarak, molekler genetik almalardadaha duyarl sonularn elde edilebilmesi iin kullanlacak yntemin belirlenmesi son

derece nemlidir. Aratrmann planlanma aamasnda kullanlacak yntemin

belirlenmesi; aratrmann yrtlmesi, aratrma maliyetinin belirlenmesi, elde

edilecek sonularn daha duyarl olmas ve ktlarn yorumlanmas aamalarn

dorudan etkileyen ana faktrdr. Bu tip nedenlerden dolay molekler genetik

almalarnda yararlanlan gncel yntemlerin birbirlerinden olan farkllklarnn

bilinmesi ve bu farkllklar dorultusunda arat

rma projelerinin tasarlanmas

na dikkat

edilmesi son derece nemlidir. Yaygn olarak kullanlan molekler genetik yntemlerin

eitli kriterler bakmndan karlatrlmas izelge 2.4de verilmitir (Avise 2004).

izelge 2.4 Molekler genetik yntemlerin karlatrlmas (Avise 2004)

Ele alnan kriter AFLP RAPD STR nRFLP mtRFLP Allozim

Ayn anda allan lokus say.ok ok Birka Az Bir ok

Lokus bana allel says Az Az ok ok ok ok

Sonularn tekrarlanabilirlii Yksek Az Yksek Yksek Yksek Yksek

Varyasyon belirlenme oran Yksek Orta Yksek Yksek Yksek Orta

Markerin kaltm modeli Dominant Dominant Kodominant Kodominant Anaya ait Kodominant

Uygulanma kolayl Orta Kolay Zor Zor Orta Kolay

Uuygulanma sresi Ksa Ksa Uzun Uzun Ksa Ksa

AFLP : oaltlm para uzunluk polimorfizmiRAPD : Rasgele oaltlm polimorfik DNASTR : Ardk basit tekrarlar, basit dizilim tekrarlar (SSR) ya da mikrosatelitnRFLP : Southern emdirim yntemi kullanlarak belirlenen restriksiyon para uzunluk polimorfizmimtRFLP : Mitokondriyel genomda belirlenen restriksiyon para uzunluk polimorfizmiAllozim : Enzim polimorfizmi


47/141

34

2.3 Hayvansal Mitokondriyel Genomun (mtDNA) YapsGenel olarak karyotik canllarn sahip olduklar toplam genetik materyal, ekirdek

iinde yer alan ve genomik DNA ya da ekirdek DNA (nDNA) olarak ifade edilen

kromozomlara ilave olarak mitokondri (mtDNA) ve kloroplast (cpDNA) organellerinde

yer alan DNA molekllerinin tamamndan meydana gelmektedir. Hayvan hcrelerinde

sadece mitokondriyel DNA, bitki hcrelerinde ise hem mitokondriyel DNA ve hem de

kloroplast DNA moleklleri ekstra kromozomal yaplar olarak bulunmaktadr.

Sitoplazmik kaltm materyalleri olarak da tanmlanan mtDNA ve cpDNA moleklleri

anaya ait kaltm modeline sahip olup yumurtann sitoplazmas vastasyla

generasyonlar boyunca aktarlmaktadr. Mitokondri bulunduu hcre blndndebuna bal olarak kendi kendine oalabilen bir organeldir. Mitokondri iki hcre

membranna sahip, kendine zg DNA molekl (mtDNA) ve ribozomlar olan, eitli

enzimleri sentezleyebilen ve adenozin trifosfat (ATP) formunda enerji sentezini

gerekletiren bir organeldir.

Hayvanlarda

mitokondriyel dna pcr-rflp (restriksiyon parça uzunluk polimorfizmi) markerleri kullanılarak...

Documents