mlle gadou victoire - tel

1

Année Universitaire 2018-2019

Laboratoire de Pharmacodynamie-Biochimique

THESE

Présentée pour l’obtention du Titre de Docteur de L’Université Félix HOUPHOUET BOIGNY

REPUBLIQUE DE COTE D’IVOIRE

Union-Discipline-Travail

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Mlle GADOU VICTOIRE

Spécialité : Biologie Fonctionnelle et Moléculaire

EPIDEMIOLOGIE MOLECULAIRE DES ENTEROBACTERIES PRODUCTRICES DE β-

LACTAMASES A SPECTRE ELARGI RESISTANTES AUX AMINOSIDES ET AUX

FLUOROQUINOLONES DANS LE DISTRICT D’ABIDJAN, CÔTE D’IVOIRE

Mme FAYE-KETTE Hortense Professeur Titulaire UFHB Président M. DJAMAN Allico Joseph Professeur Titulaire UFHB Directeur Mme GUESSENND K. Nathalie Directeur de recherche UFHB Co-Directeur Mme KOUSSEMON Marina Professeur Titulaire UNA Rapporteur Mme M’BENGUE Gbonon Valerie Maitre de Recherche IPCI Examinateur

Commission du jury

Numéro d’ordre 2186/2019

Soutenue publiquement Le, 29/03/2019

I

DEDICACES

II

Je dédie cette thèse,

A mon père, le Pasteur Gadou O. Désiré, pour son soutien permanent dans ma vie et dans mes études, sa confiance en moi, ses encouragements et son amour. Que Dieu te récompense. A la mémoire de ma mère qui nous a quittés trop tôt mais qui reste à jamais dans mon cœur. A mes frères et sœurs : le Pasteur Gadou Daniel, Gadou Ruth Dorcas, Gadou Emmanuel, Gadou Anne-Parfaite Désirée pour leur soutien moral, spirituel, leur chaleur et leur amour. A ma nièce adorée Gadou Noura Eslie Mael pour son enthousiasme et sa joie de vivre. A mon fiancé Kouassi Blé Séverin Tardy pour ses encouragements, sa disponibilité, son soutien et son amour. A mes pères spirituels les Pasteurs Ayé Touali et Séri Mogador pour toutes leurs ferventes prières à mon endroit et leurs encouragements. A la grande famille Gadou qui ne cesse de m’encourager tout le temps. A tous mes parents maternels.

III

REMERCIEMENTS

IV

J’adresse mes vifs remerciements

A M. ABOU KARAMOKO

Président de l’Université Félix Houphouët-Boigny de Cocody. Merci Professeur pour

m’avoir acceptée dans l’Université que vous dirigez.

A M. KOUAMELAN Paul Essetchi

Directeur de l’UFR Biosciences. Merci Professeur pour avoir accepté mon inscription

en thèse et facilité les démarches administratives tout au long de ma formation, ainsi

que la collaboration avec l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire.

A Mme DOSSO Mireille

Professeur Titulaire de Bactériologie-Virologie, Directrice de l’Institut Pasteur de

Côte d’Ivoire. Merci Professeur de m’avoir accueillie au sein de votre Institution où

j’ai pu effectuer mes travaux de master et de thèse. Votre passion pour la

Microbiologie, votre implication dans le développement de la recherche scientifique

et dans la formation des chercheurs est remarquable. Mon souhait est que vous ayez

toujours la santé afin de continuer ce dynamique travail que vous effectuez au sein de

la communauté scientifique.

A Mon Maitre et Directeur de thèse

M. DJAMAN Allico Joseph

Professeur Titulaire de Biochimie-Parasitologie, Directeur du Laboratoire de

Pharmacodynamie-Biochimique à l’UFR Biosciences, Chef du département de

Biochimie Médicale et Fondamentale à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire, Chercheur

associé à l’UPR 3294, Université Paris-Sud, Orsay (France). Cher Maître, merci de

m’avoir encadrée depuis le master jusqu’à la thèse. Vous êtes un modèle dans le

travail, une bibliothèque vivante. La qualité de votre enseignement, votre rigueur

dans le travail et tous les efforts déployés pour la formation de vos étudiants sont à

saluer. Veuillez recevoir cher Maître, mes sincères et profonds remerciements.

V

A Mon Maitre et Co-Directeur de thèse

Professeur GUESSENND Kouadio Nathalie

Directeur de recherche, chef de l’unité des Antibiotiques, des Substances naturelles et

de la Surveillance de la Résistance des Micro-organismes aux anti-infectieux

(ASSURMI) à l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire. Merci Professeur de m’avoir

accueillie sans aucune hésitation dans votre unité. Votre gentillesse, votre

disponibilité, vos conseils, vos encouragements dans le travail, votre simplicité m’ont

beaucoup marquée, veuillez recevoir mes profonds remerciements.

Au Professeur FAYE-KETTE Hortense, Professeur Titulaire de Microbiologie,

Responsable du département Suivi et Evaluation de l’Institut Pasteur de Côte

d’Ivoire. Merci Professeur pour avoir honoré ce travail en l’évaluant et en acceptant

de présider le jury.

Au Professeur KOUSSEMON Marina, Professeur Titulaire de Microbiologie et

Vice-doyen de l’UFR des Sciences et Technologies des Aliments de l’Université

Nangui Abrogoua. Merci Professeur pour m’avoir fait l’honneur d’instruire ma thèse

en tant que rapporteur et d’y avoir apporté des remarques pertinentes afin d’en

améliorer la qualité.

Au Docteur M’BENGUE Gbonon Valérie, Maître de recherche, chef d’unité

adjoint à l’ASSURMI et Responsable de l’Unité de Réception, d’Accueil et de

Prélèvements (URAP) de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire. Merci Docteur pour

m’avoir fait l’honneur d’examiner ma thèse.

J’adresse mes vifs remerciements par ailleurs :

A M. BAHI Calixte

Maître de conférences à l’Université Félix Houphouët Boigny de Cocody. Merci

Docteur d’avoir guidé mes premiers pas universitaires. Votre passion pour la

Biochimie en particulier et pour le travail en général m’ont beaucoup encouragée

dans mon parcours.

VI

A M. Jean-Marc ROLAIN

Professeur des Universités, Praticien hospitalier des disciplines pharmaceutiques.

Responsable d’une équipe de recherche spécialisée dans l’étude de la résistance aux

agents antimicrobiens et sur l’émergence des maladies infectieuses au sein de l’Unité

de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales Emergentes (URMITE) d’Aix-

Marseille Université (France). Editeur en Chef de la revue "International Journal of

Antimicrobial Agents". Merci Professeur pour m’avoir offert l’opportunité de réaliser

une partie de ma thèse dans votre laboratoire. J’ai pu bénéficier de vos conseils, vos

critiques pour améliorer la qualité de mon travail.

A M. TIEKOURA Konan Bertin

Attaché de recherche à l’unité ASSURMI de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire.

Merci Docteur de m’avoir intégrée très vite dans l’équipe, de m’avoir encouragée et

orientée dans le travail. Votre disponibilité dans l’encadrement des stagiaires de

l’ASSURMI est à saluer.

A M. KONAN Fernique


Merci Docteur de m’avoir assistée tout au long de ce travail. Votre amour pour le

travail et votre disponibilité m’ont beaucoup aidé.

A M. TOTY Abalé


Merci Docteur pour votre disponibilité, votre aide précieuse dans la rédaction et vos

encouragements.

A M. OUATTARA Mohamed Baguy

Attaché de recherche à l’unité UPIL de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire. Merci

Docteur pour votre assistance, vos remarques et votre aide dans la rédaction.

VII

Aux Techniciens Supérieurs de l’ASSURMI

M. FOFANA Kouakou

M. KOUAKOU A. Alexandre

Mme N’GUESSAN Rose Sylvestre

Merci pour votre aide si précieuse, vos encouragements et votre disponobilité

pendant mes travaux.

A Mon Amie et Sœur N’CHOTT Sopi Michèle épouse YERE

Tu es une bonne coéquipière tant dans le domaine académique que dans la vie active.

Nous sommes devenues au fil du temps inséparables, merci pour tout.

A mes amis doctorants de l’unité ASSUMRI :

KOUADIO Innocent, TAHOU Eric, GBA KOSSIA Karine

Merci pour ce temps très enrichissant que nous avons passé ensemble, l’entraide les

uns envers les autres, je vous souhaite une bonne carrière de chercheur.

A Linda HADJADJ, technicienne à l’Unité de Recherche sur les Maladies

Infectieuses Tropicales Emergentes (URMITE) d’Aix-Marseille Université (La

Timone)

Merci d’avoir été très disponible et de m’avoir aidée afin que j’effectue mes travaux

de recherche à l’URMITE.

Au groupe Africa-Marseille de l’URMITE composé de

N’GAIGANAM Edgarthe Priscille (Centrafrique)

KOUDOKPON Charles (Benin)

M’PELE Landry Fils (Congo)

Nous nous sommes rencontrés un jour et nous sommes devenus inséparables. Merci

de m’avoir aidée dans mes travaux à l’URMITE et d’avoir rendu agréable mon séjour

à Marseille. Je vous souhaite une bonne carrière de chercheur.

VIII

AU PERSONNEL ENSEIGNANT DU LABORATOIRE DE

PHARMACODYNAMIE-BIOCHIMIQUE DE L’UFR BIOSCIENCES QUI A

CONTRIBUE A MA FORMATION :

ENSEIGNANTS CHERCHEURS

Professeurs titulaires M. DJAMAN Allico Joseph : Directeur de Laboratoire M. BIDIE Alain Dit Philippe M. COULIBALY Adama : Chef d’unité M. N’GUESSAN Jean David : Chef d’unité M. YAPI Houphouët Félix M. YAPO Adou Francis : Responsable pédagogiqie Maîtres de conférences

M. BAGRE Issa M. BAHI Calixte M. BLA Kouakou Brice M. COULIBALY Founzegué Amadou M. KRA Adou Matthieu M. OUATTARA Karamoko M. TREBISSOU Johnson Noël M. YEO Dodéhé Maîtres-assistants

M. AHUA Maximin M. DJYH Bernard Mme THES Péhé Marie Épse SOUMAHORO M. OUATTARA Sitapha M. KOUASSI Kouakou Serge Assistants

Mme AGRE Josette Épse KOUADIO M. PAKORA Gilles Ales M. KONAN KOUAKOU CHERCHEURS Chargés de Recherche

M. KIPRE G. Rolland M. AKAPO-AKUE Joël Mme ASSOHOU A. Constance Épse LUTTY DOCTEUR-INGENIEUR M. DAGNOGO Oléfongo ENSEIGNANT DETACHE (PROFESSEUR CERTIFIE) Mme KONE Salimata Épse COULIBALY

IX

TABLE DES MATIERES DEDICACES ....................................................................................................................................... I

REMERCIEMENTS ....................................................................................................................... III

TABLE DES MATIERES ............................................................................................................... IX

LISTE DES ABREVIATIONS .................................................................................................... XIX

LISTE DES FIGURES .............................................................................................................. XXIII

LISTE DES TABLEAUX .......................................................................................................... XXVI

INTRODUCTION .............................................................................................................................. 1

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................................................ 5

1- Entérobactéries ............................................................................................................................ 6

1-1 Caractères biochimiques ........................................................................................................ 6

1-1-1 Réaction d’oxydase ........................................................................................................ 6

1-1-2 Utilisation du Citrate de Simmons ................................................................................. 6

1-1-3 Recherche de l’uréase ..................................................................................................... 6

1-1-4 Recherche de la production d’indole .............................................................................. 7

1-1-5 Recherche de la lysine décarboxylase et de la lysine désaminases ................................ 7

1-1-6 Fermentation des sucres, production du sulfure d’hydrogène et de gaz ........................ 7

1-1-7 Utilisation du malonate .................................................................................................. 7

1-1-8 Milieu au Citrate de Christensen .................................................................................... 7

1-1-9-Recherche de l’acétoïne ou Réaction de Voges-Proskauer ............................................ 8

1-1-10 Recherche de la galactosidase ...................................................................................... 8

1-2 Caractères culturaux .............................................................................................................. 8

1-3 Caractères morphologiques ................................................................................................... 8

1-4 Différentes espèces des entérobactéries............................................................................... 10

1-4-1 Escherichia coli ............................................................................................................ 10

X

1-4-1-1 Caractères bactériologiques .................................................................................. 10

1-4-1-2 Caractères biochimiques ....................................................................................... 10

1-4-1-3 Caractères antigéniques ......................................................................................... 10

1-4-1-4 Pouvoir pathogène ................................................................................................. 12

1-4-1-4-1 Escherichia coli pathogènes intestinaux ........................................................ 12

1-4-1-4-1-1 Escherichia coli entérotoxinogènes ........................................................ 12

1-4-1-4-1-2 Escherichia coli entéropathogènes ............................................................. 12

1-4-1-4-1-3 Escherichia coli entéroinvasifs .................................................................. 13

1-4-1-4-1-4 Escherichia coli entérohémorragiques ....................................................... 13

1-4-1-4-1-5 Escherichia coli entéroaggrégants .............................................................. 13

1-4-1-4-1-6 Escherichia coli entéroadhérents ou à adhésion diffuse ............................ 13

1-4-1-4-2 Escherichia coli pathogènes extra-intestinaux .............................................. 14

1-4-1-4-2-1 Escherichia coli uropathogènes .............................................................. 14

1-4-1-4-2-2 Facteurs de virulence des Escherichia coli uropathogènes .................... 14

1-4-1-4-2-3 Escherichia coli associé à la méningite néonatale ................................. 15

1-4-1-4-2-4 Escherichia coli pathogènes aviaires ..................................................... 15

1-4-2 Klebsiella pneumoniae ................................................................................................. 15



1-4-2-3 Caractères antigéniques ......................................................................................... 16

1-4-2-4 Facteurs de pathogénicité de Klebsiella pneumoniae ........................................... 16

1-4-2-4-1 Antigènes de surface ...................................................................................... 16

1-4-2-4-2 Adhésines ....................................................................................................... 16

XI

1-4-2-4-3 Sidérophores .................................................................................................. 17

1-4-2-4-4 Ilot de pathogénicité ...................................................................................... 17

1-4-2-4-5 Elément d'intégration et de conjugaison ........................................................ 17


1-4-3 Enterobacter cloacae ................................................................................................... 18




1-4-4 Citrobacter freundii ...................................................................................................... 19




1-4-5 Morganella morganii ................................................................................................... 19




2-Antibiotiques............................................................................................................................... 20

2-1 Définition ............................................................................................................................. 20

2-2 Quelques familles des antibiotiques .................................................................................... 20

2-2-1 β-lactamines.................................................................................................................. 20

2-2-1-1 Classification des β-lactamines ............................................................................. 20

2-2-1-2 Mécanisme d’action des β-lactamines .................................................................. 22

2-2-2 Aminosides ................................................................................................................... 22

XII

2-2-2-1 Classification des aminosides ............................................................................... 23

2-2-2-2 Mécanisme d’action des aminosides ..................................................................... 23

2-2-3 Quinolones/ Fluoroquinolones ..................................................................................... 25

2-2-3-1 Classification des quinolones ................................................................................ 25

2-2-3-2 Mécanisme d’action des fluoroquinolones ........................................................... 25

2-2-4 Rifampicine .................................................................................................................. 27

2-2-4-1 Classification ......................................................................................................... 27

2-2-4-2 Spectre d’action de la rifampicine ........................................................................ 27

2-2-4-3 Mécanisme d’action de la rifampicine .................................................................. 27

3-Mécanismes de résistance des entérobactéries aux antibiotiques ............................................... 27

3-1-Différents modes de transferts horizontaux ......................................................................... 29

3-1-1 Transformation ............................................................................................................. 29

3-1-2 Transduction ................................................................................................................. 29

3-1-3 Conjugaison .................................................................................................................. 30

3-2 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux β-lactamines ........................................ 30

3-2-1 Diminution de la perméabilité membranaire ................................................................ 30

3-2-2 Excrétion de l’antibiotique par des systèmes d'efflux .................................................. 31

3-2-3 Modification des protéines de liaison à la pénicilline .................................................. 31

3-2-4 Inactivation de l’antibiotique par production de β-lactamases ..................................... 31

3-2-4-1 Classification des β-lactamases ............................................................................. 31

3-2-4-1-1 β-lactamases de classe A ............................................................................... 33

3-2-4-1-2 β-lactamases de classe B ................................................................................ 33

3-2-4-1-3 β-lactamases de classe C ................................................................................ 33

XIII

3-2-4-1-4 β-lactamases de classe D ............................................................................... 33

3-2-4-2 β-lactamases à spectre élargi ................................................................................. 33

3-2-4-2-1 Différents types de β-lactamases à spectre élargi .......................................... 34

3-2-4-2-1-1 β-lactamases à spectre élargi de type Temoneira ..................................... 34

3-2-4-2-1-2 β-lactamases à spectre élargi de type Sulfhydryl variable ..................... 34

3-2-4-2-1-3 β-lactamases à spectre élargi de type Cefotaximase-Munich ................. 35

3-2-4-2-1-4 Autres types de β-lactamases à spectre élargi ........................................ 35

3-2-4-3 Epidémiologie des β-lactamases à spectre élargi .................................................. 35

3-3 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux aminosides .......................................... 36

3-3-1 Inactivation enzymatique ............................................................................................. 36

3-3-2 Réduction de l’accumulation intra-cytoplasmique ....................................................... 37

3-3-3 Piégeage de l'antibiotique ............................................................................................. 37

3-3-4 Modification de la cible ................................................................................................ 37

3-4 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux fluoroquinolones ................................. 39

3-4-1 Résistance chromosomique .......................................................................................... 39

3-4-1-1 Modification de la cible enzymatique ................................................................... 39

3-4-1-2 Perméabilité membranaire réduite ........................................................................ 39

3-4-1-3 Pompes à efflux ..................................................................................................... 42

3-4-2 Résistance plasmidique aux fluoroquinolones ............................................................. 42

3-4-2-1 Gènes de résistance aux fluoroquinolones ............................................................ 42

3-4-2-2 Pompes à efflux plasmidiques............................................................................... 42

3-5 Diffusion de la résistance à la rifampicine .......................................................................... 43

4- Typage moléculaire des souches par le Multi-locus sequence typing ....................................... 44

XIV

MATERIEL ET METHODES ....................................................................................................... 45

1- Matériel ...................................................................................................................................... 46

1-1 Type, période et cadre de l’étude ......................................................................................... 46

1-2 Matériel biologique .............................................................................................................. 46

1-3 Critères d’inclusion .............................................................................................................. 46

1-4 Matériel technique ............................................................................................................... 47

1-4-1 Matériel et réactifs pour la caractérisation phénotypique des souches ........................ 47

1-4-1-1 Matériel pour la revivification et l’isolement des souches ................................... 47

1-4-1-2 Matériel et réactifs pour la ré-identification et la confirmation de l’identité

des souches ......................................................................................................................... 47

1-4-1-3 Matériel et réactifs pour la réalisation de l’antibiogramme .................................. 47

1-4-2 Matériel et réactifs pour la caractérisation moléculaire des souches ........................... 49

1-4-2-1 Matériel et réactifs pour la recherche des gènes de résistance .............................. 49

1-4-2-2 Matériel pour le séquençage ................................................................................. 49

1-4-2-3 Matériel pour l’expérience de Conjugaison .......................................................... 49

2-Méthodes..................................................................................................................................... 55

2-1 Caractérisation phénotypique des souches .......................................................................... 55

2-1-1 Revivification des souches bactériennes ...................................................................... 55

2-1-2 Ré-identification des souches bactériennes .................................................................. 55

2-1-2-1 Mise en évidence de la production du cytochrome C oxydase ............................. 55

2-1-2-2 Identification par le portoir réduit de Le Minor .................................................... 55

2-1-2-2-1 Utilisation du citrate de Simmons comme seule source de carbone .............. 55

2-1-2-2-2 Détermination de la production d’uréase et d’indole .................................... 55

2-1-2-2-3 Détermination de la production d’hydrogène sulfuré, de gaz, de

XV

la fermentation du lactose et du glucose ........................................................................ 55

2-1-2-2-4 Détermination de la lysine décarboxylase et de la lysine désaminase ........... 56

2-1-3 Confirmation de l’identité des souches bactériennes par la spectrométrie de

masse MALDI TOF ............................................................................................................... 56

2-1-3-1 Préparation de la matrice ....................................................................................... 56

2-1-3-2 Dépôt des souches, lecture et interprétation des résultats ..................................... 56

2-1-4 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques ......................................................... 57

2-1-4-1-1 Préparation de l’inoculum bactérien .............................................................. 57

2-1-4-1-2 Ensemencement de la gélose Müeller-Hinton ............................................... 57

2-1-5 Recherche de la production de β-lactamases à spectre élargi ...................................... 57

2-1-6 Détermination de la concentration minimale inhibitrice par E-test ............................. 60

2-2 Caractérisation moléculaire de la résistance des souches aux antibiotiques ....................... 60

2-2-1 Extraction d'ADN total bactérien ................................................................................. 60

2-2-2 Réaction de polymérisation en chaîne réalisée en temps réel ...................................... 60

2-2-3 Réaction de polymérisation en chaîne .......................................................................... 61

2-2-4 Electrophorèse sur gel d'agarose .................................................................................. 61

2-2-4-1 Préparation du gel d'agarose ................................................................................. 62

2-2-4-2 Migration des produits d'amplification et révélation ............................................ 62

2-2-5 Séquençage ................................................................................................................... 62

2-2-5-1 Purification des produits de la PCR conventionnelle ............................................ 62

2-2-5-2 PCR Big Dye ......................................................................................................... 63

2-2-5-3 Purification des produits de PCR Big-Dye par le Sephadex ................................. 63

2-2-5-4 Analyse des séquences ADN ................................................................................ 64

XVI

2-2-6 Conjugaison .................................................................................................................. 64

2-2-7 Typage moléculaire des souches par le Multi-locus sequence typing .......................... 65

2-2-7-1 Réaction de polymérisation en chaîne .................................................................. 65

2-2-7-2 Electrophorèse des produits de PCR ..................................................................... 67

2-2-7-3 Séquençage............................................................................................................ 67

2-2-7-3-1 Purification .................................................................................................... 67

2-2-7-3-2 PCR-Big Dye et purification des produits de PCR ........................................ 67

2-2-7-3-3 Analyse des séquences ................................................................................... 67

RESULTATS .................................................................................................................................... 68

1- Caractères phénotypiques des souches étudiées ........................................................................ 69

1-1 Confirmation de l’identité des souches ................................................................................ 69

1-2- Entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre élargi ........................................... 69

1-2-1- Répartition des souches selon les produits biologiques .......................................... 69

1-2-2 Répartition des souches selon la source de provenance ........................................... 69

1-3 Résistance des souches aux antibiotiques ............................................................................ 74

1-3-1 Résistance des souches aux β-lactamines ..................................................................... 74

1-3-2 Résistance des souches aux aminosides ....................................................................... 74

1-3-3 Résistance des souches aux fluoroquinolones .............................................................. 74

1-3-4 Résistance des souches aux autres antibiotiques .......................................................... 74

1-4 Résistance des différentes souches productrices de BLSE aux antibiotiques ..................... 75

1-4-1 Résistance des souches de Escherichia coli aux antibiotiques..................................... 75

1-4-2 Résistance des souches de Klebsiella pneumoniae aux antibiotiques .......................... 75

1-4-3 Résistance des souches de Enterobacter cloacae aux antibiotiques ............................ 75

2- Caractères génotypiques des souches étudiées .......................................................................... 79

XVII

2-1 Gènes de résistances aux β-lactamines détectés .................................................................. 79

2-2 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines ..................................................... 79

2-3 Gènes de résistance aux aminosides détectés ...................................................................... 83

2-4 Coexpression des gènes de résistance aux aminosides ........................................................ 83

2-5 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides ........................ 83

2-6 Gènes de résistance aux fluoroquinolones détectés ............................................................. 88

2-7 Coexpression des gènes de résistance aux fluoroquinolones .............................................. 88

2-8 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones .............. 88

2-9 Coexpression des gènes de résistance aux trois familles d’antibiotiques ............................ 88

2-10 Coexpression des gènes de résistance selon la source de provenance des souches ........... 88

3- Gènes de résistance identifiés après séquençage ....................................................................... 91

3-1- Mise en évidence des différentes mutations dans les séquences protéiques ...................... 91

3-1-1 Alignement des séquences protéiques des β-lactamases de type Temoneira ................... 91

3-1-2 Alignement des séquences protéiques des β-lactamases de type Sulfhydryl variable . 95

3-1-2-1 Alignement des séquences protéiques SHV-1 et SHV-89 .................................... 95



3-1-2-4 Alignement des séquences protéiques SHV-2 et SHV-100 .................................. 99

3-1-2-5 Alignement des séquences protéiques SHV-2 et SHV-106 .................................. 99

4- Transfert de la résistance par conjugaison ............................................................................... 103

5- Identification de gènes de résistance à la rifampicine ............................................................. 103

DISCUSSION ................................................................................................................................. 109

CONCLUSION............................................................................................................................... 119

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..................................................................................... 123

XVIII

ANNEXES............................................................................................................................................ i

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES ............................................................................................ xiii

XIX

LISTE DES ABREVIATIONS

XX

ADN

AMC

AMP

AMPC

APEC

ATP

ATM

ARG-ANNOT

ARN

BCC

BGN

BLSE

BMR

CMI

CTX-M

CTX

CRO

C3G

C4G

CC

CS

CASFM

DAEC

: Acide désoxyribonucléique

: Amoxicilline + acide clavulanique

: Adénosine monophosphate

: Ampicilline-céphalosporinase

: Escherichia coli pathogènes aviaires

: Adénosine triphosphate

: Aztréonam

: Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation

: Acide ribonucléique

: Bouillon cœur cervelle

: Bacille à Gram Négatif

: Bêta-lactamase à spectre élargi

: Bactéries multi-résistantes

: Concentration minimale inhibitrice

: Céfotaximase-Munich

: Céfotaxime

: Ceftriaxone

: Céphalosporines de troisième génération

: Céphalosporines de quatrième génération

: Citrate de Christensen

: Citrate de Simmons

: Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie

: Diffusely-adhering Escherichia coli

XXI

EAggEC :

EBLSE

EMB

EHEC

EIEC

EPEC

ETEC

Fe3+

H2S

IPCI

kDa

LCR

LPS

MH

MLST

NMEC

ONPG

OXA

PDA

PCR

PLP

QNR

QRDR

: Enteroaggregative Escherichia coli

: Entérobactéries productrices de Bêta-lactamases à spectre élargi

: Eosine Methylen Blue

: Enterohemorragic Escherichia coli

: Enteroinvasive Escherichia coli

: Enteropathogenic Escherichia coli

: Enterotoxigenic Escherichia coli

: Ions ferriques

: Sulfure d’Hydrogène

: Institut Pasteur de Côte d’Ivoire

: Kilo Dalton

: Liquide céphalo-rachidien

: Lipopolysaccharides

: Müeller Hinton

: Multi-locus sequence typing

: Escherichia coli associées à la méningite néonatale

: Ortho-nitrophenyl β-D galactopyranoside

: Oxacilline

: Phénylalanine désaminase

: Polymerase chain reaction

: Protéines liant la penicilline

: Quinolone resistance

: Quinolone Resistance Determining Region

XXII

RT-PCR

RTX

SHV

ST

TEM

TFA

TBE

UPEC

UTI

VP

: Real-time polymerase chain reaction

: Repeats-In-ToXin

: Sulfhydryl Variable

: Sequence Type

: Temoneira

: Trifluorate acetic acid

: Tris-Borate-EDTA

: Uropathogenic Escherichia. coli

: infections des voies urinaires

: Voges-Proskauer

XXIII

LISTE DES FIGURES

XXIV

Figure 1 : Structures de quelques β-lactamines................................................................................. 21

Figure 2 : Structure de quelques aminosides: le cycle central DOS est indiqué en bleu .................. 24

Figure 3 : Structure de quelques fluoroquinolones ........................................................................... 26

Figure 4 : Structure de la rifampicine ............................................................................................... 28

Figure 5 : Réaction d’hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase ...................................... 32

Figure 6 : Inactivation enzymatique des aminosides ........................................................................ 38

Figure 7 : Site-A de la sous-unité ribosomale 30 S .......................................................................... 40

Figure 8 : Distribution mondiale des gènes de méthylation .............................................................. 41

Figure 9 : Disposition des antibiotiques sur la gélose Müeller Hinton ............................................. 59

Figure 10 : Disposition des souches sur le milieu sélectif ............................................................... 66

Figure 11 : Profil de résistance aux antibiotiques d’une souche de Escherichia coli ...................... 70

Figure 12 : Répartition des souches productrices de BLSE et non productrices de BLSE .............. 71

Figure 13 : Courbes réprésentant les gènes de résistantes aux β-lactamines détectés par la PCR

en temps réel .................................................................................................................. 80

Figure 14 : Profil électrophorétique des amplicons du gène blaTEM ................................................. 81

Figure 15 : Profils électrophorétiques des amplicons des gènes aac (6)-I, aad et ant (2")-I ............ 85

Figure 16 : Mutation dans la séquence protéique TEM 104 ............................................................ 94

Figure 17 : Mutation dans la séquence protéique TEM 191 ............................................................ 96

Figure 18 : Mutations dans la séquence protéique SHV-89 ............................................................. 97

Figure 19 : Mutations dans la séquence protéique SHV-12 ............................................................ 98

Figure 20 : Mutations dans la séquence protéique SHV-27 ........................................................... 100

Figure 21 : Mutations dans la séquence protéique SHV-100 ......................................................... 101

XXV

Figure 22 : Mutation dans la séquence protéique SHV-106 .......................................................... 102

Figure 23 : Sélection de souches transconjugantes sur le milieu Müeller Hinton modifié ............. 104

Figure 24 : Antibiogrammes des souches donatrice, réceptrice et transconjugante ....................... 105

Figure 25 : Profil électrophorétique des amplicons des gènes aac(6)-Ib et blaCTX-M1 .................... 106

Figure 26 : Profil électrophorétique des amplicons du gène arr 2 ................................................. 107

Figure 27 : Profil électrophorétique des amplicons des 7 gènes de ménage de E. coli et de

K. pneumoniae ............................................................................................................. 108

XXVI

LISTE DES TABLEAUX

XXVII

Tableau I : Principaux caractères biochimiques de certaines entérobactéries .................................... 9

Tableau II : Différents groupes des entérobactéries ......................................................................... 11

Tableau III : Liste des antibiotiques utilisés dans cette étude (EUCAST-CASFM, 2013) .............. 48

Tableau IV : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux β-lactamines par

la PCR en temps réel ................................................................................................... 50

Tableau V : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux β-lactamines par

PCR classique .............................................................................................................. 51

Tableau VI : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux fluoroquinolones,

aux aminosides et à la rifampicine par PCR classique ................................................ 52

Tableau VII : Amorces utilisées pour la détection des 7 gènes de ménage de Escherichia coli ..... 53

Tableau VIII : Amorces utilisées pour la détection des gènes de ménage de

Klebsiella pneumoniae ............................................................................................. 54

Tableau IX : Scores et niveaux d’identification des souches bactériennes ...................................... 58

Tableau X : Répartition des souches selon les produits biologiques et dispositif invasif ................ 72

Tableau XI : Répartition des souches selon la source de provenance .............................................. 73

Tableau XII : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de Escherichia coli productrices

de BLSE .................................................................................................................... 76

Tableau XIII : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de

Klebsiella pneumoniae productrices de BLSE......................................................... 77

Tableau XIV : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de Enterobacter cloacae

productrices de BLSE .............................................................................................. 78

Tableau XV : Répartition des gènes de résistance aux β-lactamines entre les souches

productrices de BLSE ................................................................................................ 82

XXVIII

Tableau XVI : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines chez les EBLSE ............... 84

Tableau XVII : Coexpression des gènes de résistance aux aminosides ........................................... 86

Tableau XVIII : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides chez

les souches productrices de BLSE ....................................................................... 87

Tableau XIX : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones ... 89

Tableau XX : Coexpression des gènes de résistance aux trois familles d’antibiotiques .................. 90

Tableau XXI : Coexpression des gènes de résistance selon la source de provenance ..................... 92

Tableau XXII : Répartition des gènes de résistance aux β-lactamines identifiés selon les espèces 93

1

INTRODUCTION

2

La découverte des antibiotiques au début du XXè siècle a constitué une véritable révolution

dans le traitement des maladies infectieuses d’origine bactérienne. C’est en 1928, qu’Alexander

Fleming a découvert la pénicilline et son excellent pouvoir bactéricide (Rolinson, 1998). Dès la fin

des années 1940 et jusqu’aux années 1970, de nombreux antibiotiques d’origine naturelle et

d’autres synthétisés ont été découverts. Il s’agit entre autres des β-lactamines, des aminosides, des

quinolones, des cyclines (Livermore, 1995). Cependant, leur utilisation abusive et incontrôlée a

conduit à une antibiorésistance et à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité

(Gassama, 2004).

Selon les données de l’OMS, les maladies infectieuses d’origine bactérienne font partir des

10 principales causes de mortalité dans le monde. En effet, les infections des voies respiratoires

étaient à l’origine de 3 millions de décès dans le monde en 2016 tandis que le taux de mortalité

imputable aux affections diarrhéiques s’élevait à 1,4 million de décès en 2015. Au cours de cette

période, la tuberculose a causé le décès d’environ 1,3 million de personnes (anonyme, 2016).

La lutte contre les maladies infectieuses est une priorité de santé dans les pays en voie de

développement. Toutefois, cette lutte est aujourd’hui compromise par certaines pratiques

récurrentes dans nos sociétés. Ce sont, la forte pression de sélection des antibiotiques,

l’automédication et la vente anarchique de médicaments en dehors des structures légales qui

favorisent l’émergence et la dissémination de bactéries multirésistantes (BMR) (Belbel, 2014).

Parmi ces BMR, sont incluses les entérobactéries, constituées d’un ensemble important de

bactéries dont certaines sont pathogènes (Souna, 2011). Leur pathogénicité est exacerbée par leur

résistance aux antibiotiques, notamment aux β-lactamines, par la production de β-lactamases à

spectre élargi (BLSE), qui est souvent associée à la résistance à certaines familles d’antibiotiques

comme les aminosides et les fluoroquinolones (Iabadene et al., 2010).

L’émergence et la dissémination des bactéries résistantes sont dues à leur pouvoir

d’adaptation qui se manifeste par leur capacité à s’approprier de nouvelles propriétés. Elle se fait

soit par modification de leur génome, soit par acquisition d’informations génétiques par

l’intermédiaire d’éléments génétiques mobiles que sont les plasmides et les éléments transposables

(Carattoli, 2008 ; Leverstein et al., 2011).

Par ailleurs, plusieurs mécanismes de résistance des entérobactéries productrices de β-

lactamases à spectre élargi (EBLSE) aux antibiotiques ont été décrits, parmi lesquels l’inactivation

enzymatique des antibiotiques, l’altération ou la modification des cibles auxquelles se lient

l’antibiotique et l’expulsion de l’antibiotique par des systèmes d’efflux (Gassama, 2004).

3

Dans la résistance des entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre élargi aux

aminosides, l’inactivation enzymatique par 3 classes d’enzymes que sont les acétyltransférases, les

nucléotidyltransférases et les phosphotransférases a été le mécamisme principalement développé par

les bactéries (Shaw et al., 1993). Toutefois, la méthylation de l’ARN ribosomique 16S (ARNr) a

récemment émergé comme un nouveau mécanisme de résistance qui confère une résistance de haut

niveau à tous les aminosides (Doi et al., 2004). Les gènes codant pour ces méthyltransférases sont

généralement situés sur des plasmides dont certains (59%) portent également d’autres gènes de

résistance tels que les gènes qnr, AmpC (Hidalgo et al., 2013).

En outre, la résistance des EBLSE aux fluoroquinolones est quant à elle soit chromosomique

soit plasmidique (Robicsek et al., 2005). La résistance chromosomique se manifeste principalement

par la modification de la cible enzymatique des fluoroquinolones que sont l’ADN-gyrase et la

topoisomérase IV, par la diminution de la concentration intracellulaire de l’antibiotique qui se fait

par réduction de la production de porines ou par modification de l’activité de diverses pompes à

efflux (Jacoby, 2005). L’un des déterminants génétique de la résistance plasmidique des

entérobactéries aux fluoroquinolones est le gène qnr dont la caractéristique principale est d’être

portée par un intégron de classe 1 extrêmement mobile entre différents plasmides. La particularité

de ce support génétique est son caractère transférable et sa capacité à accélérer la diffusion de la

résistance aux fluoroquinolones par le biais du transfert de gènes plasmidiques (Robicsek et al.,

2005). Ce nouveau mécanisme fait redouter une diffusion extrêmement rapide de type épidémique

de la résistance aux fluoroquinolones (Paauw et al., 2004 ; Robicsek et al., 2005).

En Côte d’Ivoire, la résistance des bactéries aux antibiotiques et l’émergence des

entérobactéries productrices de BLSE sont devenues un véritable problème de santé publique

(Dadié et al., 2003 ; Akoua-koffi et al., 2004 ; Gbonon et al., 2007).

Certains travaux ont rapporté la présence et la diffusion des souches productrices de BLSE chez les

entérobactéries d'origine humaine (Guessennd et al., 2008a ; Yao et al., 2010) de même que chez

des souches d’origine animale et environnementale (Ouattara et al., 2014). Et les BLSE de type

TEM, SHV, CTX-M ont été décrits chez des entérobactéries d'origine humaine (Guessennd et al.,

2008b ; Toty et al., 2016).

De plus, depuis plusieurs années, certaines études ont fait cas de l’augmentation du taux de

résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones chez les entérobactéries productrices de BLSE en

Côte d’Ivoire, qui serait responsable des impasses thérapeutiques (Akoua-Koffi et al., 2004 ;

Guessennd et al., 2008b ; Ouattara, 2014 ; Cissé et al., 2017).

4

Ainsi, face à l’émergence des souches résistantes aux aminosides et aux fluoroquinolones, la

question qui ressort est de savoir si les gènes codant pour les acétyltransférases, les

nucléotidyltransférases, les phosphotransférases et les protéines QNR sont-ils impliqués dans la

résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones chez les entérobactéries productrices de BLSE à

Abidjan, en Côte d’Ivoire ?

Pour répondre à cette question de recherche, l’objectif principal de cette étude est de

caractériser des gènes de résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones codant pour les

acétyltransférases, les nucléotidyltransférases, les phosphotransférases et les protéines QNR chez

des entérobactéries productrices de BLSE dans le district d’Abidjan.

Des objectifs spécifiques ont été fixés afin d’atteindre cet objectif principal. Il s’est agi de :

1 Détecter les gènes de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux fluoroquinolones

pour les souches retenues pour l’étude,

2 Analyser les mutations conférant la résistance à ces antibiotiques

3 Etudier la possibilité de transfert de la résistance entre les bactéries

4 Déterminer les profils de résistance des souches à étudier vis à vis des antibiotiques

Ce manuscrit s’articule autour de 4 parties : la première partie portera principalement sur la

revue bibliographique concernant la description des entérobactéries, les antibiotiques, leur mode

d’action et les mécanismes de résistance des entérobactéries aux antibiotiques. La deuxième partie

présentera le matériel et les méthodes expérimentales utilisées. La troisième partie portera sur

l’ensemble des résultats obtenus et la discussion qui en découle. Une quatrième partie sera

consacrée à la conclusion, aux perspectives de recherche à venir et aux recommandations.

5

REVUE

BIBLIOGRAPHIQUE

6

1- Entérobactéries

Le nom "entérobactérie" fait référence à la localisation d’une famille de microorganismes

dans le tube digestif et principalement dans le côlon de l’homme et des animaux (Avril et al.,

2000). Ces microorganismes sont très hétérogènes pour ce qui est de leur pathogénicité et de leur

écologie. Les espèces qui composent la famille des entérobactéries sont en effet soit parasites

(Shigella, Yersinia pestis), soit commensales (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella

pneumoniae), soit saprophytes (Serratia marescens, Enterobacter cloacae) (Avril et al., 2000 ; Joly

et Reynaud., 2007).

1-1 Caractères biochimiques

La distinction entre les genres et les espèces se fait par l'étude des caractères biochimiques

que sont l’utilisation du citrate de Simmons comme seule source de carbone, la production d'uréase,

la capacité à fermenter le glucose, la capacité à réduire les nitrates en nitrite, la fermentation du

lactose, la production d'indole, la production d'acetoïne, la désamination du tryptophane (Avril et

al., 2000).

1-1-1 Réaction d’oxydase

La mise en évidence de la production du cytochrome C oxydase à partir du test d’oxydase

est essentielle pour orienter l'identification des bacilles à Gram négatif. Il permet de différencier

dans le grand groupe des bacilles à Gram négatif, la famille des entérobactéries de celles des

Pseudomonaceae et des Vibrionaceae (Niang, 2003). Le test d’oxydase est souvent réalisé à l’aide

des disques d’oxydase imprégnés du réactif chlorhydrate ou d'oxalate de N-diméthyl paraphénylène

diamine ou PDA. Si une bactérie possède l’enzyme respiratoire cytochrome C oxydase, la forme

oxydée rose violacée du PDA est produite à partir de la forme réduite incolore.

1-1-2 Utilisation du Citrate de Simmons

L’utilisation du Citrate de Simmons (CS) comme seule source de carbone par les bactéries se traduit

par une alcalinisation du milieu qui correspond au virage de l’indicateur coloré du vert au bleu

(Avril et al., 2000).

1-1-3 Recherche de l’uréase

Les bactéries possédant une uréase active scindent l’urée en dioxyde de carbone et en ammoniaque.

Ceux-ci en se combinant donnent du carbonate d’ammonium. Le carbonate d’ammonium formé

alcalinise le milieu, ce qui se traduit par le virage de l’indicateur coloré de l’orange au rose (Avril et

al., 2000).

7

1-1-4 Recherche de la production d’indole

Certaines bactéries dégradent le tryptophane grâce à une tryptophanase. Il se forme de l’indole, de

l’acide pyruvique et de l’ammoniac. L’indole est apolaire et réagit fortement avec le para-diméthyl-

amino-benzaldéhyde (réactif de Kovacs) en milieu acide pour donner un anneau rouge qui remonte

en surface (Drame, 2001).

1-1-5 Recherche de la lysine décarboxylase et de la lysine désaminases

Le milieu lysine de fer est un milieu qui contient la lysine, du glucose, du fer. Les réactions

se déroulent en anaérobiose (dans le culot) et en aérobiose (au niveau de la pente) avec production

de désaminases. Ces désaminases sont des enzymes induites qui agissent sur les acides aminés en

entraînant la formation des acides cétoniques correspondants. Les acides cétoniques formés ont la

propriété de donner des complexes colorés avec les ions ferriques (Fe3+). Le virage de la pente du

violet au jaune traduit la production d’une lysine désaminase par la bactérie. Par contre, l’absence

de virage du culot traduit la production d’une lysine décarboxylase par la bactérie (Bakhoum,

2004).

1-1-6 Fermentation des sucres, production du sulfure d’hydrogène et de gaz

Le milieu Kligler-Hajna est un milieu de culture permettant la recherche simultanée de la

fermentation du glucose, du lactose; la production du sulfure d’hydrogène (H2S) et la production de

gaz. La fermentation du glucose par la bactérie est mise en évidence par le virage du culot du rouge

au jaune tandis le virage de la pente au jaune indique la fermentation du lactose. Par ailleurs, la

production de sulfure d’hydrogène est mise en évidence par une coloration noire dans le culot et la

présence de bulles d’air ou le décollement du culot indique la production de gaz (Avril et al., 2000).

1-1-7 Utilisation du malonate

Le malonate inhibe le cycle de Krebs (inhibition de la succinate déshydrogénase). Seules les

bactéries qui peuvent utiliser le cycle glyoxalique sont capables de se développer sur un milieu au

malonate. L’utilisation du malonate s’accompagne d’une libération d’ions hydroxyl (OH-)

alcalinisant (Avril et al., 2000).

1-1-8 Milieu au Citrate de Christensen

A la différence du Citrate de Simmons, le milieu Citrate de Christensen (CC) contient une

faible quantité de glucose, d’extrait de levure et une source d’azote organique. Dans ces conditions,

certaines bactéries qui n’utilisent pas le citrate de Simmons sont capables d’utiliser le citrate de

Christensen. La formation d’ions hydroxyle (OH-) alcalinise le milieu (virage du jaune au rose)

(Joly et Reynaud., 2007).

8

1-1-9-Recherche de l’acétoïne ou Réaction de Voges-Proskauer

La formation de l’acétyl-méthyl carbinol (AMC) ou acétoïne se fait soit à partir de deux molécules

d’acide pyruvique, soit à partir du glucose. En présence d’une base forte, l’acétoïne donne une

coloration rouge en milieu très oxygéné (oxydation en diacétal) (Avril et al., 2000).

1-1-10 Recherche de la galactosidase

Le test à l’Ortho-NitroPhényl β-D-Galactopyranoside (ONPG) permet la recherche de la β-

galactosidase qui est une enzyme qui intervient dans le métabolisme du lactose. L’utilisation du

lactose par la bactérie requiert deux enzymes à savoir le lactose perméase qui permet au lactose de

pénétrer dans la bactérie et la β-galactosidase qui catalyse l’hydrolyse du lactose en glucose et

galactose. La β-galactosidase est une enzyme inductible, c’est-à-dire qu’elle n’est synthétisée par la

bactérie que lorsque celle-ci est en présence de son substrat. L’ONPG est un substrat synthétique,

de structure proche du lactose, capable de pénétrer dans la bactérie sans perméase (Avril et al.,

2000).

Les caractères biochimiques différentiels de certaines entérobactéries sont illustrés dans le Tableau

I.

1-2 Caractères culturaux

Les entérobactéries se développent facilement sur les milieux ordinaires en 24 heures à 37°C

en aérobiose et en anaérobiose (Freney et al., 2000). Sur les milieux gélosés, les colonies

d’entérobactéries sont habituellement lisses, brillantes, de structure homogène (type « smooth » ou

S). Cet aspect peut évoluer après des cultures successives pour donner des colonies à surface sèche

rugueuse (type « rough » ou R). En milieu liquide, les entérobactéries occasionnent un trouble

uniforme du bouillon (Avril et al., 2000).

1-3 Caractères morphologiques

Les entérobactéries sont polymorphes avec des tailles variant de 2 à 3 μm de long sur 0,4 à

0,6 μm de large. Les espèces mobiles, les plus nombreuses, le sont grâce à une ciliature péritriche

tandis que certaines sont immobiles (Abbott, 2007). Quelques unes possèdent une capsule visible

au microscope et la plupart des espèces pathogènes pour l’homme possèdent des fimbriae ou pili

qui sont des facteurs d’adhésion (Drame, 2001 ; Bakhoum, 2004).

9

Tableau I : Principaux caractères biochimiques de certaines entérobactéries

Esch Citro Entero Kleb Serr Salm Shig Prot Prov Yers Morg

Glucose + + + + + + + + + + +

Lactose + + + + - - - - - - -

ONPG + + + + + - +/- - - + -

Indole + - - +/- - - +/- +/- + +/- +

VP - - + + + - - - - + -

Citr - + + + + +/- - +/- + - -

Mob. + + + - + + - + + + +

Urée - - - + - - - + - + +

TDA - - - - - - - + + - +

H2S - +/- - - - + - +/- - - +

ONPG = Ortho NitroPhényl Galactoside ; VP = Voges Proskauer ; Citr = citrate ; Mob = mobilité ;

TDA = Tryptophane désaminase ; H2S = Hydrogène sulfureux ; Esch = Escherichia ; Citro =

Citrobacter ; Entero = Enterobacter ; Kleb = Klebsiella ; Serr = Serratia ; Salm = Salmonella ; Shig

= Shigella ; Prot = Proteus ; Prov = Providencia ; Yers = Yersinia ; Morg= Morganella ; (+) =

positif ; (+/-) = variable ; (-) = négatif (Decoster et Lahieu, 2006)

10

1-4 Différentes espèces des entérobactéries

La famille des entérobactéries se compose d’environ 40 genres et plus de 100 espèces dont

les plus isolées en bactériologie clinique appartiennent aux genres : Escherichia, Klebsiella,

Enterobacter, Citrobacter, Morganella, Hafnia, Proteus, Providencia, Salmonella, Serratia,

Shigella, Yersinia (Avril et al., 2000). Les entérobactéries sont classées en quatre groupes par

rapport à leur résistance naturelle aux β-lactamines (Tableau II). Pour la suite du travail, il semble

nécessaire de rappeler brièvement quelques caractères de certaines entérobactéries fréquemment

rencontrés en pathologie humaine et qui posent des problèmes de résistance.

1-4-1 Escherichia coli

Isolée pour la première fois par Escherich en 1885, Escherichia coli est l'espèce bactérienne

qui a été la plus étudiée pour des travaux de physiologie et de génétique. Elle représente l’espèce

type du genre Escherichia. Appelée communément « colibacille », cette espèce possède certains

caractères bactériologiques (Avril et al., 2000).

1-4-1-1 Caractères bactériologiques

Escherichia coli se présente sous forme de bacille de 2 à 3 µm de long sur 0,5 µm de large,

généralement polymorphes. La plupart des souches de E. coli se multiplient rapidement entre 18 et

24 h sur les milieux de culture sélectifs. Les colonies sont rondes, plates et à bords réguliers. Ce

sont des bactéries mésophiles car la température optimale de croissance est de 37 °C et le pH

optimal est compris entre 7,2-7,4 (Hanes, 2003).

1-4-1-2 Caractères biochimiques

E. coli possède des caractères biochimiques particuliers permettant de le différencier des

autres espèces (Farmer et al., 2007), ce sont : absence d'uréase, fermentation de lactose, absence de

production d'oxydase, production d'indole, absence de croissance sur le citrate et pas de production

de H2S (Minor et Richard, 1993).

1-4-1-3 Caractères antigéniques

E. coli possède des antigènes associés à quatre types de structures. Les antigènes de paroi

(somatiques) ou antigènes O correspondent aux polyosides fixés sur les lipopolysaccharides (LPS).

Les antigènes de flagelles ou antigènes H de nature protéique qui sont constitués de flagellines. les

antigènes de surface de type F présents chez les souches ayant des propriétés d'adhésion et les

antigèncs d'enveloppe K qui sont de nature polysaccharidiques (Kaper et al., 2004).

11

Tableau II : Différents groupes des entérobactéries

Groupe de β-

lactamines

Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4

Principaux genres

d’entérobactéries

rencontrées en

milieu hospitalier.

Escherichia coli

Proteus mirabilis

Salmonella

Shigella

Klebsiella

Citrobacter

koseri

Enterobacter

Serratia

Morganella

Providencia

Citrobacter freundii

Yersinia

Aminopénicillines S R R R

Carboxypénicilline

s

S R S R

Uréidopénicillines S I/ R S I/ R

Céphalosporines

de première

génération

S S R R

Céphalosporines

de troisième

génération

S S S S

Carbapénèmes S S S S

Mécanismes de

résistances

Absence de β-

lactamases

Pénicillinase à

bas niveau

Céphalosporinase à

bas niveau

Pénicillinase +

Céphalo-

sporinase

S : sensible ; I : intermédiaire ; R : résistant (Lagha, 2015)

12

1-4-1-4 Pouvoir pathogène

Escherichia coli est l’une des espèces bactériennes le plus souvent rencontrée en pathologie

humaine. Elle regroupe des souches commensales de l'intestin de l'homme et des animaux de mȇme

que des souches responsables de pathologies intestinales comme les diarrhée aigües (Freney et al.,

2000). Certaines souches de E. coli sont impliquées dans plusieurs infections extra-intestinales

importantes de l'homme telles que les infections urinaires, abdominales et méningées (Fauchère et

Avril, 2002). E. coli est le micro-organisme le plus fréquemment impliqué dans plusieurs infections

urinaires acquises en ville. Il est également responsable d'infections nosocomiales, notamment des

infections des plaies chirurgicales et des bactériémies (Alain et Bernard, 2002). Les souches de E.

coli pathogènes peuvent être séparés en deux grands groupes en fonction du type d’infection dont

elles sont à l’origine. Le premier groupe nommé E. coli pathogènes intestinaux (IntEC) est à

l’origine de syndromes diarrhéiques et comprend six groupes pathogènes ou pathovars. Il s’agit des

E. coli entérotoxinogènes (ETEC), des E. coli entérohémorragiques (EHEC), des E. coli

entéroagrégatifs (EAEC), des E. coli à adhésion diffuse (DAEC), des E. coli entéropathogènes

(EPEC) et des E. coli entéroinvasifs (EIEC). Le deuxième groupe, nommé ExPEC pour E. coli

pathogènes extra-intestinaux, comprend les souches à l’origine d’infections du tractus urinaire

(Uropathogenic E. coli ou UPEC), les souches à l’origine de méningites et de septicémies (neonatal

meningitis E. coli ou NMEC) et le pathovar animal aviaire (APEC) (Nataro et Kaper, 1998).

1-4-1-4-1 Escherichia coli pathogènes intestinaux

1-4-1-4-1-1 Escherichia coli entérotoxinogènes

Ils sont responsables de diarrhées infantiles dans les pays en voie de développement de la

zone intertropicale et représentent l'un des principaux agents de la diarrhée du voyageur (Levine et

al., 1993 ; Hoque et al., 1994). Le pouvoir entéropathogène des Escherichia coli entérotoxinogènes

(ETEC) repose d'une part sur l'élaboration de facteurs d'adhésion qui permettent la colonisation de

l'intestin grêle et d'autre part sur la sécrétion d'entérotoxines. Les entérotoxines des ETEC sont des

protéines qui sont soit de haut poids moléculaire et de type thermolabile, soit de bas poids

moléculaire et de type thermostable. Elles n'altèrent pas la cellule mais déclenchent une fuite

hydroélectrolytique en perturbant les systèmes de contrôle de la secrétion entérocytaire. Il s'en suit

une diarrhée aqueuse riche en électrolytes (Black, 1990 ; Dupont et Ericsson, 1993).

1-4-1-4-1-2 Escherichia coli entéropathogènes

Les souches de E. coli entéropathogènes (EPEC) sont responsables de diarrhées infantiles

persistantes souvent épidémiques particulièrement chez les enfants de 0 à 5 ans.

13

Ce pathovar est rarement responsable de diarrhée chez l’adulte (Scaletsky et al., 2002). Le

pouvoir pathogène des EPEC est dû à leur capacité à adhérer aux entérocytes des cellules de

l'intestin grêle et à produire des lésions histopathologiques au niveau de la bordure en brosse des

entérocytes (Gassama, 2004).

1-4-1-4-1-3 Escherichia coli entéroinvasifs

Les souches de E. coli entéroinvasifs (EIEC) sont responsables de syndromes dysentériques

proches de la shigellose. Le pouvoir pathogène des EIEC est caractérisé par leur capacité à envahir

et à se développer dans les cellules épithéliales du colon. Le phénomène d'invasion est sous la

dépendance de facteurs chromosomiques et plasmidiques (Gassama, 2004).

1-4-1-4-1-4 Escherichia coli entérohémorragiques

Ils ont été identifiés lors d'épidémies de colites hémorragiques pouvant évoluer vers un

syndrome hémolytique urémique (SHU), une insuffisance rénale ou un purpura thrombopénique.

Les souches de E. coli entérohémorragiques (EHEC) ont été à l’origine de plusieurs épidémies de

grande ampleur avec une létalité importante et posent un problème de sécurité alimentaire dans les

pays industrialisés. Actuellement, trois sérotypes d'EHEC sont identifiés, ce sont O:157; O:26;

O:111. Leur pouvoir pathogène est caractérisé par une forte adhérence à la surface de l'iléon distal

du cæcum et du colon droit et à la production de Shiga toxine (Stx) (Bell et al., 1994).

1-4-1-4-1-5 Escherichia coli entéroaggrégants

Les souches de E. coli entéroaggrégants (EaggEC) sont responsables de diarrhées

persistantes aussi bien dans les pays développés que dans les pays en voie de développement.

EAggEC est suspecté d’être responsable de la diarrhée du voyageur au même titre que ETEC, qui

lui est souvent associé (Schultz et al., 2000 ; Adachi et al., 2002). La forte prévalence des EAggEC

chez les patients infectés par le VIH le classe parmi les pathogènes opportunistes (Germani et al.,

1998). La plupart des souches d’EaggEC hébergent un plasmide de 60 à 65 Mda appelé pAA codant

pour les facteurs AAF/I et AAF/II, une entérotoxine EAST1 proche de la toxine thermostable de E.

coli, deux serines protéases Pet responsable des effets cytotoxiques et Pic une protéine impliquée

dans la colonisation intestinale (Piva et al., 2003).

1-4-1-4-1-6 Escherichia coli entéroadhérents ou à adhésion diffuse

Les souches de E. coli entéroadhérents ou à adhésion diffuse (DAEC) sont impliquées dans

les diarrhées infantiles. La virulence des DAEC est liée à leur capacité à adhérer aux cellules

épithéliales.

14

Deux familles de gènes codant pour cette adhésion ont été identifiées ce sont: F1825 et

AIDA-I. Actuellement, deux nouveaux pathotypes sont proposés sur la base de l'identification des

cytokines; il s'agit de: E. coli producteurs de cytokines léthales par distention cellulaire (CLDT)

également retrouvés chez Shigella spp et Campylobacter spp et E. coli producteurs d'hémolysines

alpha détectées par leur capacité à détacher un tapis de cellules HeLa ou Hep-2 en culture

(Gassama, 2004).

1-4-1-4-2 Escherichia coli pathogènes extra-intestinaux

1-4-1-4-2-1 Escherichia coli uropathogènes

Les souches de E. coli uropathogènes (UPEC) sont responsables de 80 % des infections des voies

urinaires (UTI), soit environ 150 millions de personnes par an dans le monde. Les infections dues

aux UPEC sont retrouvées particulièrement chez les femmes de tout âge. Les UTI se produisent

lorsqu’il y a contamination de la région urogénitale par la flore fécale. Les bactéries peuvent

atteindre la vessie et provoquer une cystite aiguë ou infecter les reins et provoquer une

pyélonéphrite aiguë. Dans certains cas, les UTI peuvent mener à une septicémie. Ces septicémies

causent en moyenne 40000 morts par année aux États-Unis. Les UTI reposent sur la présence de

plusieurs facteurs de virulence. La présence ou non de ces facteurs influence la sévérité de l’UTI

(Nataro et Kaper, 1998).

1-4-1-4-2-2 Facteurs de virulence des Escherichia coli uropathogènes

Fimbriae

Les fimbriae aussi connu sur le nom de pili sont des hétéropolymères d’environ 1μm de

longueur et de diamètre allant de 5 à 10 nm (Kaper et al., 2004). Les UPEC expriment plusieurs

fimbriae, tels que des fimbriae de type 1, des fimbriae de type P, des fimbriae F1C et des fimbriae

S. Ils sont nécessaires à la bactérie pour promouvoir la colonisation des surfaces. Chaque souche

peut exprimer différents types de fimbriae selon leur contenu génétique et les phases où la bactérie

se trouve (High, 1988).

Autotransporteurs

Les autotransporteurs sont une famille de protéines capables de s’autosécréter à travers la

membrane d’une bactérie à Gram négatif grâce à un mécanisme appelé sécrétion de type V. Il existe

différents autotransporteurs dont des toxines, des hémagglutinines, des cytotoxines et les SPATEs

(Serine Protease AutoTransporters of Enterobacteriaceae (Restieri et al., 2007).

15

Hémolysine

L’hémolysine est une toxine ‘Repeats-In-ToXin’ (RTX). Les toxines RTX sont produites par

des bactéries à Gram négatif et sont caractérisées par des répétitions dans la séquence protéique

ainsi que par un système de sécrétion de type 1 (T1SS). Les fragments des séquences répétées sont

riches en aspartate et glycine. Ils se situent en C-terminal, ce qui facilite le transport par le système

de sécrétion. Les toxines RTX sont composées d’un regroupement de gènes comprenant la toxine

RTX, une acyltransférase permettant l’activation de la toxine et les protéines du système de

sécrétion de type 1. Ces gènes sont typiquement localisés sur des îlots de pathogénicités (Smith et

al., 2015).

Sidérophores

Les sidérophores sont des molécules de faible poids moléculaire (500 à 1500 Daltons) ayant

une forte affinité pour le fer ferrique (fer oxydé). Ce sont des chélateurs de fer qui permettent

l’obtention de fer par la bactérie pour ses besoins physiologiques. Les sidérophores sont des

facteurs de virulence essentiels dans la plupart des bactéries pathogènes à Gram négatif. Le fer est

nécessaire à la bactérie, cependant il est difficile d’accès. Le fer ferreux (Fe2+) étant toxique et le

fer ferrique (Fe3+) insoluble, il n’y a que très peu de fer libre disponible chez l’hôte infecté. Les

bactéries sont donc en compétition entre elles pour le capturer, mais aussi en compétition avec les

systèmes de défense de l’hôte tels que la transferrine et la lactoferrine (Holden et Bachman, 2015).

1-4-1-4-2-3 Escherichia coli associé à la méningite néonatale

Les souches de E. coli associées à la méningite néonatale (NMEC) provoquent des méningites chez

les nouveau-nés, 15 à 40 % des nouveau-nés atteints décèdent. Bon nombre des survivants souffrent

de défauts neurologiques graves. Les bactéries sont transportées par les voies hématogènes (voies

sanguines) (Kaper et al., 2004).

1-4-1-4-2-4 Escherichia coli pathogènes aviaires

Les souches de E. coli pathogènes aviaires (APEC) affectent les voies respiratoires de la volaille.

Elles peuvent aussi causer des péricardites et des septicémies. Ces pathogènes sont responsables

d’importantes pertes économiques (Kaper et al., 2004).

1-4-2 Klebsiella pneumoniae

Connue autrefois sous le nom de pneumobacille de Friedlander, K. pneumoniae est un

Bacille Gram Négatif (BGN), immobile, commensale de l’intestin et des voies respiratoires (Freney

et al., 2000).

16


K. pneumoniae se développe sur les milieux de culture d'isolement pour entérobactéries à

savoir Drigalski, Hektoen, Mac Conkey, Eosine bleu de méthylène (EMB), après une incubation de

18 à 24 h à 37 °C. Ce sont des bactéries à Gram négatif, immobiles. Sur gélose, les colonies de type

mucoïde ont un aspect caractéristique. Elles sont volumineuses avec un diamètre de 3 à 4 mm,

bombées, brillantes, opaques et parfois filantes à l’anse de platine. En milieu liquide (bouillon

nutritif, eau peptonée), elles forment un dépôt muqueux et une colorette visqueuse en surface

(Freney et al., 2000).


K. pneumoniae une bactérie aéro-anaérobie facultative qui fermente le glucose avec

production de gaz et ne posséde pas d’oxydase (Abbott, 2007).

1-4-2-3 Caractères antigéniques

K. pneumoniae possède des antigènes communs avec ceux portés par les autres

entérobactéries excepté l’antigène flagellaire du fait de son immobilité. Les antigènes présents sont

les antigènes O ou somatiques, les antigènes capsulaires (K) et les antigènes d’adhérence appelés

aussi fimbriae (Avril et al., 2000).

1-4-2-4 Facteurs de pathogénicité de Klebsiella pneumoniae

Cinq types de facteurs sont retrouvés chez K. pneumoniae (Podschun et Ullmann, 1998).

1-4-2-4-1 Antigènes de surface

Deux types d'antigènes sont exprimés à la surface de K. pneumoniae. Ces deux antigènes

contribuent à la pathogénie de cette bactérie. Le premier est l'antigène "O" qui est le composant du

liposaccharide (LPS) et dont 8 types ont été identifiés. Le second est l'antigène capsulaire (K), un

polysaccharide capsulaire dont 82 ont été décrits et 77 caractérisés (Dabernat et al., 1997).

1-4-2-4-2 Adhésines

Les adhésines sont des molécules qui jouent un rôle essentiel dans la première étape du

processus infectieux (Dabernat et al., 1997).

Les propriétés d'adhésion des entérobactéries sont généralement médiées par différents types

de pili ou fimbriae. Les pili ou fimbriae sont des structures protéiques non flagellaires et

filamenteuses formant des appendices à la surface des bactéries qui ont la capacité d'agglutiner les

érythrocytes (Gassama, 2004).

17

Ils sont formés de différentes sous-unités. Les deux types de fimbriae les plus rencontrés chez K.

pneumoniae sont le type 1 et le type 3 (Gassama, 2004).

Les fimbriae de type 1 sont les mieux connus et sont présents chez la majorité des

entérobactéries. Ils ont la plus grande capacité d'adhésion et sont impliqués dans la

colonisation des tractus respiratoire et urinaire (Struve, 2008).

Les propriétés des fimbriae de type 3 sont moins connues. Ils sont impliqués dans l'adhésion

de K. pneumoniae à différents types cellulaires, par exemple aux épithéliums urinaires et

respiratoires. Leur rôle comme facteur de virulence reste hypothétique dans plusieurs

modèles d'infections (urinaire, pulmonaire). Néanmoins, du fait que ces structures semblent

faciliter l'adhésion à des supports inertes et avoir un rôle dans la formation de biofilm, elles

pourraient participer à la physiopathologie des infections urinaires sur sonde (Sebghati,

1998).

1-4-2-4-3 Sidérophores

Les sidérophores sont des structures particulières qui permettent aux bactéries de capter le

fer environnant qui est associé à des glycoprotéines telles que la transferrine et la lactoferrine. En

effet, le fer est essentiel à la croissance et à la réplication in vivo des bactéries et joue un rôle dans

l'installation et la progression de l'infection (Dabernat et al., 1997).

1-4-2-4-4 Ilot de pathogénicité

C’est un grand fragment chromosomique d'ADN de 35 à 45 kb qui porte les gènes de

virulence, en particulier le locus de la yersiniabactine indispensable à l'expression du phénotype

hyper-virulent de Yersinia sp. Il s'insère au niveau de la terminaison 3' du gène de l'ARN de

transfert. Cet îlot contient de nombreux gènes dont le locus de la yersiniabactine qui a pour fonction

essentielle de capter les molécules de fer nécessaires à la croissance et à la dissémination de la

bactérie (Carniel, 1999).

1-4-2-4-5 Elément d'intégration et de conjugaison

Le transfert horizontal de gènes intra-espèces et inter-espèces joue un rôle essentiel dans

l'évolution et la capacité d'adaptation des bactéries (De la Cruz et Davies, 2000).

Trois mécanismes principaux permettent aux souches bactériennes d'acquérir des gènes par transfert

horizontal et de répondre ainsi rapidement aux défis et stress environnementaux. Il s’agit de : la

transformation, la transduction et la conjugaison (Hacker et Kaper, 2000).

18


K. pneumoniae est un pathogène opportuniste responsable d'infections communautaires et

d'infections nosocomiales. Parmi les infections communautaires, K. pneumoniae est responsable

d'infections broncho-pulmonaires incluant les pneumonies lobaires nécrosantes, les abcès

pulmonaires, les pleurésies purulentes (Carpenter, 1990). Cette espèce est également responsable

d'infections intra-abdominales et est isolée du mal perforant plantaire. K. pneumoniae est surtout un

agent d'infections nosocomiales (Podschun et Ullmann, 1998), responsable d'infections urinaires

sur sonde, de bactériémies, de pneumonies, d'infections de sites opératoires et d'infections

néonatales (Stone et al., 2003). Il occupe une place importante dans la pathologie infectieuse du

nouveau-né et les infections nosocomiales à K. pneumoniae dans les services de néonatologie sont

fréquentes, notamment dans les unités de soins intensifs et chez les prématurés (Sahly et al., 2004).

1-4-3 Enterobacter cloacae

E. cloacae est l’espèce la plus fréquemment isolée au sein du genre Enterobacter (Souna,

2015).


E. cloacae est un BGN anaérobie facultatif mesurant 0,6 à 1 μm de diamètre et 1,2 à 3 μm

de longueur. Il se déplace grâce à des flagelles péritriches et est doté de pilus de classe 1 (Hart,

2006). Sur gélose nutritive, E. cloacae forme des colonies rondes avec un diamètre de 2 mm et

légèrement plates avec des bords irréguliers (Grimont et Grimont, 2006).


E. cloacae produit un acide à partir de la fermentation du glucose, donne une réaction

négative à l'épreuve au rouge de méthyle et une réaction positive au test de Voges-Proskauer ; la

température optimale de sa croissance est de 30 °C (Hart, 2006).


E. cloacae est fréquemment impliquée dans les infections nosocomiales et colonise

généralement la flore intestinale endogène des patients hospitalisés, mais peut également se trouver

comme source d’épidémie ou de diffusion de patient à patient (Qureshi et al., 2011).

Les infections surviennent principalement chez des patients ayant reçu un traitement

antibiotique ainsi que ceux en unités de soins intensifs (Qureshi et al., 2011). E. cloacae est une

bactérie pathogène opportuniste responsable en milieu hospitalier d’infections urinaires, de

bactériémies, de méningites ou de suppurations diverses (Iabadene et al., 2010).

19

Elle peut causer également de nombreux types d'infections telles que les abcès cérébraux, les

septicémies, des infections de plaies, des infections de la cavité abdominale ou des intestins

(Farmer et al., 2007).

1-4-4 Citrobacter freundii


Citrobacter freundii est un bacille ou de coccobacille Gram négatif qui mesure 0,3 à 1 µm

de diamètre et de 0,6 à 6 µm de longueur (Abbott, 2007). C’est un anaérobie facultatif dont la

mobilité est assurée par des flagelles péritriches (Holmes et Aucken, 1998 ; Knirel et al., 2002).


Ces bactéries fermentent le mannitol, produisent du H2S et sont aussi capables d’utiliser le

citrate de Simmons comme unique source de carbone (Knirel et al., 2002).


C. freundii est un agent pathogène nosocomial opportuniste qui entraînent des infections des

voies urinaires, des bactériémies, des sepsis abdominaux, des abcès cérébraux, des pneumonies et

d’autres infections néonatales comme la méningite, le sepsis néonatal, l’infection articulaire

(Doran, 1999; Pepperell et al., 2002 ; Ryan, 2004). Les infections du système nerveux central

(SNC) sont plus courantes chez les nourrissons de moins de 2 mois que chez les enfants plus âgés et

les adultes immunodéprimés (Holmes et Aucken, 1998 ; Ryan, 2004).

1-4-5 Morganella morganii


Morganella morganii est un BGN mobile qui se présente sous forme de colonies plates et

qui mesure 0,6 à 1 μm de diamètre et 1 à 3μm de longueur (Del Mar Tavio et al., 2000).


Les Morganella ont la capacité de produire l’uréase et la tryptophane désaminase. Elles

fermentent le glucose, réduise le nitrate en nitrite, métabolise le tryptophane en indole (Del Mar

Tavio et al., 2000).


Morganella morganii est impliquée dans les infections des voies urinaires, des voies

hépatobiliaires, les infections de la peau et des tissus mous.

20

Elle occasionne des infections opportunistes chez des patients immunodéprimés telles que

les infections extra-intestinales ou encore les infections materno-fœtales (Falagas et al., 2006). M.

morganii se trouve dans l'environnement et dans les voies intestinales des humains, des

mammifères et des reptiles par conséquent, la plupart des cas de bactériémie à M. morganii sont des

infections opportunistes acquises dans la communauté (Lee et al., 2006).

2-Antibiotiques

2-1 Définition

Un antibiotique peut ȇtre definit comme étant tout composé chimique d’origine naturelle,

semi synthétique ou synthétique qui en solution très dilué est capable de détruire les

microorganismes ou d’inhiber leur croissance (Van Bambeke et Tulkens, 2008). Il doit avoir une

toxicité sélective envers l’agent infectieux sans toutefois affecter l’organisme hôte infecté par les

germes pathogènes (Gautier, 2007). La spécificité d’action des antibiotiques s’appuie sur les

différences métaboliques et structurales existantes entre les cellules procaryotes et eucaryotes.

L’ensemble des bactéries affecté par un antibiotique donné est appelé le spectre d’activité de cet

antibiotique. Les antibiotiques efficaces contre de nombreuses bactéries Gram positif et négatif sont

dits à "large spectre", tandis que ceux actifs uniquement contre certaines bactéries Gram positif ou

Gram négatif sont dits à "spectre étroit" (Walsh, 2003).

2-2 Quelques familles des antibiotiques

2-2-1 β-lactamines

Les β-lactamines constituent la famille d'antibiotiques la plus importante aussi bien par le

nombre et la diversité des molécules utilisables que par leur indication en thérapeutique

(Livermore, 1995). Cette famille, qui regroupe les pénicillines, les céphalosporines, les

carbapénèmes et les monobactames, est caractérisée par la présence constante du cycle β-lactame

associé à des cycles et des chaînes latérales variables (Bryskier, 1999), Figure 1. La grande variété

de leur mode d'administration, leur large spectre d'activité antibactérien associé à une action

bactéricide, une bonne diffusion tissulaire, une bonne tolérance et un faible nombre d'interactions

médicamenteuses expliquent l'importance de leur utilisation seule ou en association (Cavallo et al.,

2004).

2-2-1-1 Classification des β-lactamines

Les β-lactamines sont classées en quatre groupes (Gautier, 2007):

21

Figure 1 : Structures de quelques β-lactamines

(Bryskier, 1999)

A : pénicillines ; B : céphalosporines ; C : céphamycines ; D : acide clavulanique ; E : imipénème ;

F : monobactames

R

R

A B

C D

E F

22

Les pénicillines (noyau péname) dont font partie la pénicilline G, la méticilline et les

isoxazolylpénicillines (oxacilline et cloxacilline), les amino-benzylpénicillines (ampicilline

et amoxicilline), les uréido-pénicillines (pipéracilline), les carboxy-pénicillines (ticarcilline)

et les amidino-pénicillines (mécillinam).

Les céphalosporines (noyau céphème) de première (céfalotine, céfaloridine), deuxième

(céfamandole, céfoxitine), troisième (céfotaxime, ceftriaxone, ceftazidime) et de quatrième

génération (céfépime, cefpirome).

Les monobactames (noyau azétidine) représentés par l’aztréonam.

Les carbapénèmes (noyau carbapénème) qui sont les plus efficaces actuellement

(imipénème, méropénème, ertapénème, doripénème).

2-2-1-2 Mécanisme d’action des β-lactamines

Les β-lactamines traversent la paroi bactérienne et se fixent sur des protéines cibles que sont

les Protéines liant les Pénicillines (PLP). Ces PLP sont un groupe d’enzymes regroupant les

transpeptidases, transglycosylases et carboxypeptidases, impliquées dans la synthèse et le

remodelage du peptidoglycane, constituant principal de la paroi bactérienne. La fixation des β-

lactamines sur les PLP est facilitée parce que les β-lactamines présentent une analogie structurale

entre le noyau β-lactame et le dipeptide terminal D-alanyl-D-alanine, du pentapeptide constitutif du

peptidoglycane (Stratton, 2000).

En se fixant sur les PLP, les β-lactamines vont subir l’ouverture de leur cycle et bloquer le

fonctionnement de ces enzymes. L’inactivation principalement des transpeptidases déclenche un

ensemble de réaction qui aboutit à l’inactivation des inhibiteurs des autolysines bactériennes. Et, ce

sont ces autolysines qui vont alors dégrader le peptidoglycane, entrainant finalement la lyse

bactérienne et l’effet d’auto-suicide (Stratton, 2000).

2-2-2 Aminosides

Les aminosides, également appelés aminoglycosides sont des molécules naturelles produites

par des actinomycètes ou obtenus par hémisynthèse. Elles sont constituées de deux ou plusieurs

sucres aminés liés par une fonction glycosidique à un noyau hexose. Ce sont des oligosaccharides

basiques, polaires et hydrophiles qui sont d’un point de vue structural, organisés autour d’un cycle

central caractéristique de type aminocyclitol sur lequel sont greffés divers sucres aminés (Mingeot-

Leclercq et al., 1999).

Les aminosides ont un large spectre antibactérien particulièrement contre les bactéries Gram

négatif, peu sensibles aux pénicillines et aux sulfamides.

23

Elles sont majoritairement bactéricides avec une action rapide et dose dépendante qui constitue l’un

de leurs grands avantages thérapeutiques (Vakulenko et Mobashery, 2003).

2-2-2-1 Classification des aminosides

Le cycle central des aminosides est la désoxystreptamine (DOS) qui peut être substituée pour

donner les différentes classes des aminosides (Poole, 2005) Figure 2.

Les désoxystreptamines monosubstituée en position 4: Néamine, Paromamine,

Les désoxystreptamines bisubstituées 4-5 qui comprennent: Néomycine B ou C,

Paromomycine, Lividomycine A ou B, Ribostamycine, Framycétine,

Les désoxystreptamines bisubstituées 4-6 qui comprennent: Kanamycine A, B, C et dérivés,

Amikacine, Tobramycine, Dibékacine, Gentamicine, Sisomycine, Nétilmicine,

Les molécules naturelles ou semi-synthétiques: Streptomycine, Streptidine, Spectinomycine.

2-2-2-2 Mécanisme d’action des aminosides

L’action des aminosides se déroule en 3 étapes:

- La première étape est un passage passif qui permet la traversée de la membrane externe à travers

les porines, puis la traversée du peptidoglycane. Les aminosides se concentrent alors au niveau de la

membrane cytoplasmique (Changeur et Cherruault, 2009).

- La deuxième étape requiert la production d’énergie pour le transport des aminosides. Cette énergie

est fournie par des métabolismes oxydatifs (Bryskier, 1999).

- Au cours de la troisième étape, la plus rapide, les aminosides se fixent sur le ribosome

spécifiquement au site A de l'ARN ribosomal 16S qui compose le ribosome bactérien 30S et

provoquent la fixation d'un ARN transfert incorrect sur l'ARN messager. La reconnaissance codon-

anticodon est perturbée, ce qui induit la synthèse de protéines erronées (Touati, 2013).

24

Figure 2 : Structure de quelques aminosides: le cycle central DOS est indiqué en bleu

(Poole, 2005)

A : Desoxystreptamine (DOS) ; B : Paromamine (R = OH) ; Néamine (R = NH2) ; C :

Paromomycine (R = OH) ; Néomycine (R = NH2) ; D : Kanamycine (R1 = OH, R2 = OH) ;

Tobramycine (R1 = H, R2 = NH2)

A B

C D

25

2-2-3 Quinolones/ Fluoroquinolones

Les quinolones doivent leur découverte à la recherche sur la chloroquine. Des chercheurs du

« the Sterling-Winthrop laboratories in Rochester, NY » ont accidentellement découvert un produit

dérivé de sa synthèse et doué de vertus antibactériennes : la 7-chloroquinoléine. Cette molécule a

été développée pour donner l’acide nalidixique (Sarkozy, 2001). Ce dernier a été grandement

utilisé, depuis pour le traitement des infections urinaires. De façon générale, les quinolones sont

caractérisées par un large spectre d’activité, une bonne biodisponibilité orale, une bonne pénétration

tissulaire (Larouche, 2001). Quant aux fluoroquinolones, ils sont caractérisés par la présence d'un

atome de fluor en position 6 et d'un cycle azoté, le plus souvent une pipérazine, en position 7

(Courvalin et al., 2006) Figure 3.

2-2-3-1 Classification des quinolones

Les quinolones sont classées en quatre générations basées sur leur activité et leur spectre

d’action (Ball, 2000).

Les quinolones de première génération : l’acide nalidixique et l’acide oxolinique,

Les quinolones de deuxième génération qui sont des fluoroquinolones comme la

ciprofloxacine, la norfloxacine, l’ofloxacine et la fluméquine,

Les fluoroquinolones de troisième génération qui comprennent la gatifloxacine, la

grepafloxacine, la levofloxacine, la moxifloxacine ou la sparfloxacine, la danofloxacine,

l’enrofloxacine, la difloxacine, l’orbifloxacine, l’ibafloxacine ou la marbofloxacine,

Les fluoroquinolones de quatrième génération : la gémifloxacine et la trovafloxacine.

2-2-3-2 Mécanisme d’action des fluoroquinolones

Les enzymes bactériennes ADN gyrase ou topoisomérase II et la topoisomérase IV sont les

cibles principales des fluoroquinolones (Muylaert et Mainil, 2013). Les fluoroquinolones

intéragissent avec le complexe ADN-enzyme c'est-à-dire avec l'ADN gyrase liée à ADN bactérien

ou avec la topoisomérase IV liée à l’ADN bacterien pour créer des changements de conformation

qui aboutissent à l'inhibition de l'activité enzymatique. Le nouveau complexe fluoroquinolone-

enzyme-ADN bloque la progression de la fourche de réplication inhibant ainsi la synthèse normale

de l'ADN (Hooper, 2000 ; Cambau et Guillard, 2012).

26

Figure 3 : Structure de quelques fluoroquinolones

(Ball, 2000)

A : Ciprofloxacine ; B : Levofloxacine ; C : Trovafloxacine

A B

C

27

2-2-4 Rifampicine

2-2-4-1 Classification

La classe des rifamycines a été découverte en Italie en 1957. Le chef de file de la famille, la

rifamycine B, est une molécule naturelle isolée de Nocardia mediterranei. La rifamycine B a été

transformée à partir de la solution acqueuse en une molécule plus active, la rifamycine S, elle-même

transformée en rifamycine SV. Cette dernière est un antibiotique très actif et plus soluble, mais non

absorbable par voie orale. En 1965 était synthétisé un dérivé le 3-4-méthyl-pipérazinyl-

iminométhyle administrable par voie orale, appelé rifampicine, qui est devenu le principal

composant de la famille (Figure 4) (Taha et al., 2006).

2-2-4-2 Spectre d’action de la rifampicine

Le spectre antibactérien de la rifampicine est large et comprend les mycobactéries les

staphylocoques et les streptocoques. Utilisé dans le traitement de la tuberculose et des maladies

méningococcies, sa pharmacocinétique est marquée par sa forte pénétration tissulaire et cellulaire

(Baysarowich et al., 2008).

2-2-4-3 Mécanisme d’action de la rifampicine

L’action bactéricide de la rifampicine se situe au niveau du génome bactérien et se traduit

par un blocage transcriptionnel. En effet, la rifampicine se lie de façon covalente à la sous-unité

bêta de l’ARN polymérase codée par le gène rpoB. Cette liaison inhibe l’initiation de la

transcription de l’ADN bactérien et la formation de l’ensemble des ARN messagers, des ARN de

transferts et des ARN ribosomiaux (Xu et al., 2005).

3-Mécanismes de résistance des entérobactéries aux antibiotiques

Une souche bactérienne est dite résistante à un antibiotique quand elle est capable de se

multiplier en présence de cet antibiotique (Lavigne, 2007). Il existe deux grands types de résistance

aux antibiotiques : la résistance intrinsèque et la résistance acquise.

La résistance intrinsèque (ou naturelle) est une résistance qui apparait chez tous les

représentants d’une même espèce de façon naturelle pour un antibiotique donné, indépendamment

de la présence de ce dernier (Skurnik et Andremont, 2006). A l’inverse, la résistance acquise n’est

présente que chez certaines souches de la même espèce ou du même genre.

28

Figure 4 : Structure de la rifampicine

(Taha et al., 2006).

29

Dans certains cas, elle peut concerner la grande majorité de ces souches comme par exemple

la production de pénicillinase chez le staphylocoque qui intéresse plus de 90 % des souches

(Courvalin, 2008).

Sur le plan génétique, la résistance peut être acquise par deux voies totalement distinctes, soit

par des mutations affectant des gènes présents sur le chromosome, soit par l’acquisition de gènes

étrangers. Ces gènes peuvent provenir du chromosome d’une autre souche de la même espèce ou

même d’une espèce voire d’un genre différent (Fauchère et Avril, 2002). Le transfert de gènes par

l’intermédiaire des éléments génétiques mobiles d’une bactérie à une autre (transfert horizontal) est

le principal mécanisme responsable de la dissémination des gènes de résistance au sein du monde

bactérien et concerne 80 % des cas de résistances aux antibiotiques (Ploy et al., 2005). Les

différents modes de transferts horizontaux sont : la transformation, la transduction et la conjugaison.

3-1 Différents modes de transferts horizontaux

3-1-1 Transformation

Il s’agit d’un mécanisme d’acquisition d’ADN libre par certaines espèces bactériennes capables

au cours de leur cycle cellulaire de présenter un état physiologique (état de compétence) nécessaire

à la fixation et l’absorption d’ADN par ces bactéries. La transformation nécessite la présence dans

le milieu environnant d’ADN libre provenant d’une cellule lysée, cet ADN libéré est ensuite fixé et

absorbé par une bactérie réceptrice en phase de compétence. Dans cette bactérie, l’ADN exogène

subit une recombinaison génétique afin de s’intégrer de façon stable au génome et d’être transmis

aux cellules filles (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001). La transformation joue un rôle limité dans

le transfert de gènes de résistance car l’ADN libre doit d’une part présenter une importante

similarité avec l’ADN de la cellule réceptrice et d’autre part l’ADN libre dans l’environnement est

rapidement dégradé. De plus, les espèces bactériennes naturellement compétentes sont peu

nombreuses (Schwarz et Chaslus-Dancla, 2001).

3-1-2 Transduction

La transduction est un processus qui consiste en un transfert de matériel génétique (ADN

bactérien) d'une bactérie donneuse à une bactérie réceptrice par l'intermédiaire d'un bactériophage.

Le bactériophage infecte une première bactérie (bactérie donneuse) et y injecte son ADN viral à

travers la paroi de la cellule. De nouveaux phages s'y développent, et certains intègrent une partie

du génome bactérien dans leur capside de phage (la taille du fragment d'ADN bactérien doit être

proche de celle de l'ADN phagique). Lors de la libération des phages, ceux-ci vont infecter d'autres

bactéries. Les phages comportant une partie d'ADN bactérien vont l'injecter dans une nouvelle

bactérie (bactérie réceptrice (Davison, 1999).

30

3-1-3 Conjugaison

La conjugaison est une technique utilisée par les bactéries pour échanger des informations

génétiques. Elle consiste en une transmission d’éléments génétiques d'une bactérie donatrice à une

bactérie receptrice. La conjugaison nécessite un contact étroit entre la bactérie donatrice et la

bactérie réceptrice par l’intermédiaire d’un pont cytoplasmique permettant un transfert

unidirectionnel. La bactérie réceptrice ayant reçu le plasmide est appelée transconjugant. La

sélection des transconjugants s’effectue en présence de deux antibiotiques: un correspond à l’une

des résistances transférées de la souche donatrice et l’autre à la résistance non transférable de la

souche réceptrice. De nombreux éléments génétiques, comme les plasmides et les transposons qui

représentent les différents supports mobiles des gènes de résistance aux antibiotiques sont

transférables par conjugaison (Davison, 1999).

3-2 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux β-lactamines

Il existe quatre principaux mécanismes de résistance aux β-Lactamines:

- la diminution de la perméabilité membranaire

- l’excrétion de l’antibiotique par des systèmes d'efflux

-la modification des protéines de liaison à la pénicilline (PLP)

- l’inactivation de l’antibiotique par production de β-lactamases (Courvalin et al., 2006).

3-2-1 Diminution de la perméabilité membranaire

Les entérobactéries possèdent une membrane externe composée de lipopolysaccharide (LPS)

estimés chez E. coli à 3,5 millions et couvrant 75 % de la surface cellulaire et de phospholipides

(PP) qui forment une barrière empêchant la pénétration des antibiotiques hydrophobes entrainant

ainsi une résistance naturelle aux antibiotiques (Paolozzi et Liébart, 2015).

Les substances hydrophiles comme les β-lactamines peuvent traverser cette barrière en

passant par les porines qui permettent des échanges par diffusion passive de nutriments et d'autres

substances entre le périplasme et le milieu extérieur (Benz, 2004).

L’altération des porines par mutation est à l’origine des résistances acquises aux β-

lactamines, soit par une modification structurale d’une porine essentielle (ce qui a été décrit chez E.

coli), soit par une diminution quantitative des porines, qui est la situation la plus fréquente (Kumar

et Schweizer, 2005). Bien que plus rare, la suppression des porines provoque l’augmentation des

concentrations minimales inhibitrices (CMI) de certaines β-lactamines comme cela a été mis en

évidence chez certaines entérobactéries telles que E. aerogenes, K. pneumoniae, E. cloacae, E. coli

et chez Pseudomonas aeruginosa (Nikaido, 2000).

31

3-2-2 Excrétion de l’antibiotique par des systèmes d'efflux

Les entérobactéries possèdent différents canaux protéiques impliqués dans le transport d’une

grande variété de composés.

Parallèlement aux porines qui permettent aux nutriments de pénétrer dans la cellule, les

bactéries utilisent des pompes à efflux pour réduire la concentration intracellulaire de composés

toxiques comme les médicaments, les détergents et sont donc impliqués dans le contrôle de la

sensibilité aux antibiotiques. La résistance par efflux est souvent couplée à une diminution de la

perméabilité membranaire. L'association de ces deux mécanismes peut entraîner une résistance de

haut niveau constituant ainsi de véritables systèmes de multi-résistance (Nishino et Yamaguchi,

2001).

3-2-3 Modification des protéines de liaison à la pénicilline

Plusieurs facteurs interviennent dans la résistance par modification des protéines de liaison à

la pénicilline (PLP). Ce sont : les mutations dans les gènes chromosomiques codant pour les PLP

entraînant la perte d'affinité des protéines de liaison à la pénicilline pour les β-lactamines,

l’acquisition de gènes ou fragments de gènes codant pour des PLP d'affinité diminuée ou

l’hyperproduction de PLP normales (Nikaido, 1994).

3-2-4 Inactivation de l’antibiotique par production de β-lactamases

La production de β-lactamases est le mécanisme majeur de résistance aux β-lactamines. Ces

enzymes sont localisées au niveau de l’espace périplasmique chez les bactéries Gram négatif

(Livermore, 2003). Elles catalysent de manière efficace et irréversible l'hydrolyse du pont amide de

l'anneau β-lactame des pénicillines, des céphalosporines, des monobactames et des carbapénèmes

pour donner un acylenzyme qui sera ensuite dégradé en acide inactif (Barrial et Scotet, 2006),

figure 5.

3-2-4-1 Classification des β-lactamases

Les classifications d’Ambler et de Bush-Jacoby-Medeiros sont considérées comme étant les

plus pertinentes.

La classification de Bush a été établie selon les propriétés fonctionnelles de l’enzyme,

définies par son substrat préférentiel et son profil d’hydrolyse (Bush et al., 1995). Les enzymes sont

divisées en quatre groupes (1 à 4) avec plusieurs sous-groupes. Cette classification phénotypique

des β-lactamases pose un certain problème puisque différentes mutations ponctuelles peuvent

influencer leur sensibilité aux substrats et inhibiteurs (Jacoby et Medeiros, 1991).

32

Figure 5 : Réaction d’hydrolyse du noyau β-lactame par une β-lactamase

(Barrial et Scotet, 2006)

33

La classification d'Ambler quant à elle, repose sur la similarité des séquences entre les

différents membres des β-lactamases. De plus, elle reflète les relations fondamentales de chaque β-

lactamase et ne change pas à cause des mutations. Cette nomenclature se compose de quatre

groupes qui sont les β-lactamases de classe A, B, C et D (Jacoby et Munoz-Price, 2005).

3-2-4-1-1 β-lactamases de classe A

D'origine chromosomique ou plasmidique, elles se caractérisent par leur capacité à

hydrolyser l'amide cyclique lié à la molécule de β-lactame. Cette activité hydrolytique, assurée par

une sérine conservée (Ser-70) induit la formation d'acide penicilloïque pour la pénicilline et d’acide

céphalosporoïque pour les céphalosporines. (Knox, 1995 ; Livermore, 1995).

3-2-4-1-2 β-lactamases de classe B

Les β-lactamases de classe B sont des métallo-β-lactamases qui utilisent les ions Zn2+

comme cofacteur permettant ainsi la décomposition de l'anneau β-lactame (Barrial et Scotet,

2006). Ces enzymes ont émergé d’abord chez P aeruginosa et Acinetobacter baumannii, ensuite

chez les entérobactéries. L’importance clinique des métallo-β-lactamases est liée au fait qu’elles

hydrolysent les carbapenèmes, composés qui échappent à l’activité des β-lactamases à sérine active.

(Bebrone, 2007).

3-2-4-1-3 β-lactamases de classe C

Dans la classe C se trouvent les céphalosporinases AmpC qui sont codées par des gènes qui

étaient primitivement situés sur le chromosome de nombreuses BGN telles que C. freundii, Serratia

marcescens et Enterobacter spp. Chez ces bactéries, l’expression de l’AmpC est inductible. Les

gènes codant pour ces enzymes sont aussi présents chez E. coli, où ils ne sont pas inductibles. Ces

enzymes sont résistantes à l’acide clavulanique (Philippon et al., 2002).

3-2-4-1-4 β-lactamases de classe D

Les β-lactamases de classe D se distinguent par leur capacité à hydrolyser l’oxacilline

(OXA), la méthicilline et sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique. Elles sont retrouvées

fréquemment chez P. aeruginosa et Acinetobacter spp et peu chez les entérobactéries (Paterson et

Bonomo, 2005). De plus, certains membres de cette famille, dont OXA-10 et OXA-11 possèdent un

large spectre d'activité assurant une forte résistance aux céphalosporines de troisième génération

dont le céfotaxime, le céfoperazone et la ceftazidine (Hall et al., 1993 ; Livermore, 1995).

3-2-4-2 β-lactamases à spectre élargi

34

Les β-lactamases à spectre élargi (BLSE) sont des β-lactamases de classe A selon la

classification d’Ambler (à l’exception des BLSE de type OXA classe D), capables d’hydrolyser les

pénicillines, céphalosporines de première (C1G), deuxième (C2G), troisième (C3G), quatrième

génération (C4G) et l’aztréonam (Livermore, 1995).

Cependant, les souches productrices de BLSE restent généralement sensibles aux

céphamycines et aux carbapénèmes (imipénème). Les BLSE de classe A sont inhibées par les

inhibiteurs de β-lactamases comme l’acide clavulanique (Livermore, 1995).

3-2-4-2-1 Différents types de β-lactamases à spectre élargi

Les BLSE sont classées selon leurs différences moléculaires et les plus fréquentes sont les

BLSE de types TEM, SHV et CTX-M (Jacoby et Munoz-Price, 2005).

3-2-4-2-1-1 β-lactamases à spectre élargi de type Temoneira

La première β-lactamase plasmidique de type Temoneira (TEM-1) a été isolée en 1965 en

Grèce, à partir d’une souche de E.coli isolée chez une patiente nommée Temoneira d’où la

nomination (Jacoby et Munoz-Price, 2005). La majorité des BLSE de ce type dérivent par quatre à

sept mutations ponctuelles de l’enzyme originale (TEM-1 ou TEM-2). Les substitutions les plus

courantes sont le glutamate en lysine en position 104, l’arginine en sérine en position 164, la

glycine en sérine en position 238 et le glutamate en lysine en position 240 (Bradford, 2001).

Ces mutations rendent l’enzyme capable d’hydrolyser les C3G mais les rend plus vulnérable

à l’action des inhibiteurs comme l’acide clavulanique. Cependant, d’autres mutations peuvent

conférer la résistance aux inhibiteurs. Ces variantes sont appelées TRI (TEM Résistantes aux

Inhibiteurs). Les enzymes dérivées par mutations permettant d’hydrolyser à la fois les C3G et les

inhibiteurs sont de plus en plus fréquentes (Rodriguez-Villalobos et Struelens, 2006).

3-2-4-2-1-2 β-lactamases à spectre élargi de type Sulfhydryl variable

Les BLSE de type Sulfhydryl variable (SHV) dérivent par mutations ponctuelles de

l’enzyme originale SHV-1 qui correspond à un gène blaSHV de pénicillinase chromosomique de K.

pneumoniae (Brisse et Verhoef, 2001 ; Haeggman et al., 2004). Actuellement, plus de 180

variantes BLSE de type SHV ont été décrits. La majorité des BLSE de type SHV est caractérisée

par la substitution d’acides aminés Glycine en Serine à la position 238 et Glutamine en lysine à la

position 240. Le résidu sérine à la position 238 est indispensable pour l’hydrolyse efficace du

céfotaxime de mȇme que le résidu lysine pour l’hydrolyse efficace de la ceftazidime (Elhani,

2012).

35

La majorité des BLSE de type SHV a été décrite chez les souches de K. pneumoniae,

toutefois ces enzymes ont été trouvées chez C. freundii, C. diversus, E. coli et E. cloacae

(Bradford, 2001). Ces enzymes sont aussi présentes chez les espèces de P. aeruginosa et

Acinetobacter spp (Naiemi et al., 2005 ; Poirel et al., 2004). La présence de la séquence d’insertion

IS26 sur le gène blaSHV faciliterait l’acquisition du phénotype BLSE (Hammond et al., 2005).

3-2-4-2-1-3 β-lactamases à spectre élargi de type Cefotaximase-Munich

Ces enzymes représentent à l’heure actuelle les BLSE les plus fréquentes au niveau mondial

après leur diffusion rapide depuis les années 1990 (Bonnet, 2004 ; Livermore et al., 2007). Les

BLSE de type Cefotaximase-Munich (CTX-M) conférait à l’origine, chez les entérobactéries, un

plus haut niveau de résistance à la céfotaxime, au ceftriaxone, au céfépime et à l’aztréonam (Arlet

et Philippon, 2003 ; Bonnet, 2004). Certaines ont évolué par mutation ponctuelle générant un haut

niveau de résistance à la ceftazidime (Bonnet, 2004). La dissémination horizontale des gènes

codant pour les enzymes CTX-M s’effectue par des plasmides conjugatifs mais aussi par d’autres

éléments génétiques comme les intégrons et les séquences d’insertion ISEcp1 (Bradford, 2001).

Actuellement, plus de 150 variants CTX-M ont été décrits et classés en 6 groupes phylogénétiques à

savoir: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25 et CTX-M-45 (Carrer et

Nordmann, 2011).

3-2-4-2-1-4 Autres types de β-lactamases à spectre élargi

D’autres BLSE ont une distribution moins large, caractérisées par un haut niveau de

résistance à la ceftazidime et parfois à l’aztréonam plutôt qu’au céfotaxime (Bradford, 2001 ;

Arlet et Philippon, 2003). Ce sont: BES-1 (brazilian extended spectrum), GES-1 (Guyana

extended spectrum), PER-1 (Pseudomonas extended resistance), SFO-1 (Serratia fonticola), TLA-1

(Tlahuicas, tribu mexicaine), et VEB-1 (Vietnam extended spectrum) (Weldhagen et al., 2003). Des

enzymes proches de GES-1 ont été découvertes en Grèce, malheureusement dénommées à tort IBC

(integron borne cephalosporinase) (Philippon et Arlet, 2006).

3-2-4-3 Epidémiologie des β-lactamases à spectre élargi

Les BLSE de type CTX-M, TEM et SHV ont largement été diffusées dans le monde avec

des prévalences variables selon les pays. Ces variations dépendent de plusieurs facteurs parmi

lesquels la détection de ces enzymes, la mesure de surveillance des maladies infectieuses,

l’utilisation abusive des antibiotiques (Touati, 2013).

36

Aux Etats-Unis, la prévalence des EBLSE a varié de 0 à 25 % avec une moyenne nationale

de 3 %. Jusque dans les années 2007, les enzymes de type CTX-M étaient considérées comme rares.

Les enzymes prédominantes étant TEM et SHV (Castanheira et al., 2008). Depuis les enzymes

CTX-M ont été détectées dans 38,8 % des souches cliniques productrices de BLSE, avec comme

déterminants génétiques prédominants, CTX-M-14 et CTX-M-15 (Castanheira et al., 2008). En

Europe, la prévalence de ces souches est variable en fonction des pays. Une étude récente portant

sur E. coli, K .pneumoniae et Enterobacter spp a montré que la prévalence de souches BLSE était

de 4,7 % en Europe du Nord contre 13,5 % au Sud de l’Europe (Bouchillon et al., 2004).

En France, le changement de bactérie hôte a vu les BLSE émerger des espèces nosocomiales

épidémiques classiques K. pneumoniae, Enterobacter spp.vers E. coli. De plus, une augmentation

très nette des infections communautaires (notamment urinaires) dues aux bactéries productrices de

BLSE a été observée (Nordmann et al, 2009). En Afrique, l’émergence des EBLSE a été signalée

dans certains pays avec des taux variables : 12 % au Cameroun, 15 % en Afrique du Sud, et 38,5 %

en Egypte (Bouchillon, 2004 ; Gangoué-Pieboji et al., 2005). En Côte d’Ivoire, la prévalence des

EBLSE a augmenté significativement de 9 à 56,2% de 2005 à 2016 (Guessennd et al., 2008b ;

Toty et al., 2016).

3-3 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux aminosides

Plusieurs mécanismes confèrent une résistance aux aminosides, ce qui permet d’expliquer la

résistance de plus de 95 % des souches d’entérobactéries (Perichon et al., 2008).

3-3-1 Inactivation enzymatique

Les aminosides possèdent des groupements aminés et des groupements hydroxyles nécessaires à

leur activité. Ces groupements peuvent être la cible de trois classes d’enzymes (Gassama, 2004) :

Les nucléotidyltransférases ou adénylyltransférase (ANT ou AAD) agissent par adénylation

des groupements hydroxyles. Il y’ a quatre isozymes ANT (6), ANT (4'), ANT (3"), et ANT

(2 "). Le gène codant pour l'ANT (2") est retrouvé dans la majorité des bactéries à Gram

négatif.

Les acétyltransférases ou AAC catalysent l’acétylation des groupements aminés dans la

molécule d'aminoside en utilisant le coenzyme A d'acétyle en tant que substrat donneur.

La famille des aminoglycosides acétyltransférases est constituée de 4 isozymes : soit les AAC

(1), AAC (3), AAC (2') et AAC (6).

Les phosphotransférases ou APH catalysant le transfert du groupement AMP du substrat

donneur (ATP) à un groupe hydroxyl dans la molécule d'aminoside.

37

Il y a sept classes d'isozymes qui catalysent la phosphorylation des aminosides : l'APH (3'), APH

(2"), APH (3"), APH (4), APH (7"), APH (6) et l'APH (9). L'enzyme la plus étudiée de cette famille

est I'APH (3'). Toutes ces enzymes sont codées par des gènes plasmidiques ou des transposons.

Lorsqu’un aminoside est modifié par ces enzymes sa fixation sur l'ARN ribosomal 16S peut être

affectée et se traduire par la perte de son activité (Lambert, 2007 ; Ramirez et Tolmasky, 2010).

La figure 6 met en évidence l’inactivation des aminosides par les enzymes modificatrices.

3-3-2 Réduction de l’accumulation intra-cytoplasmique

La pénétration des aminosides dans les bactéries est un phénomène de diffusion passive à

travers des porines de la membrane externe et de transport actif requérant de l’énergie au niveau de

la membrane interne (Durante-Mangoni et al., 2009). Les entérobactéries disposent de systèmes

actifs d’efflux dont certains sont exprimés de façon constitutive, d’autres sont contrôlés et exprimés

par différents systèmes de régulation et enfin plusieurs sont encore inductibles par diverses

mutations (Wang et al., 2001). Les systèmes d’efflux au niveau des entérobactéries entrainent une

dimunition de l’accumulation des aminosides à l’intérieur de la cellule (Durante-Mangoni et al.,

2009).

3-3-3 Piégeage de l'antibiotique

Une enzyme modificatrice peut parfois neutraliser l'action d'un aminoside par une liaison

affine sans pour autant modifier sa structure. Le piégeage de l'antibiotique a été proposé comme

mécanisme responsable du phénotype de résistance à la kanamycine et à la tobramycine alors que la

gentamicine et la nétilmicine restent actives.

Lorsque la bactérie produit une grande quantité de phosphotransférase qui reconnaît la

tobramycine sans la modifier celle-ci peut être piégée dans un complexe enzyme-substrat

fonctionnellement inactif (Menard et al., 1993).

3-3-4 Modification de la cible

La modification de la cible se fait par mutation dans l'ARN ribosomal 16S (Doi et Arakawa, 2007).

La méthylation de l'ARNr 16S au sein de la sous-unité ribosomale 30S des espèces bactériennes par

les gènes de méthylation a récemment émergé comme un mécanisme de haut niveau de résistance

aux aminosides tels que l’amikacine, la tobramycine, la gentamicine, la kanamycine et la

nétilmicine (Doi et al,, 2004).

38

Figure 6 : Inactivation enzymatique des aminosides

(Courvalin et al., 2006)

39

Deux activités de méthylation de l'ARN 16S modifient le site A aux positions G1405 (N7) et

A1408 (N1) (Belbel, 2014), figure 7. Dix gènes de méthylation ont été décrits arm A, rmt A, rmt B,

rmt C, rmt D, rmt E, rmt F, rmt G, rmt H et npm A (Deng et al., 2013) avec prédominance du genre

arm A et rmt B (Wachino et Arakawa, 2012). Le gène Arm A a été détecté pour la première fois en

2003 en France chez une souche de K. pneumoniae montrant un haut niveau de résistance à tous les

aminosides cliniquement très actifs (Galimand et al., 2003). Le gène rmt B a été largement répandu

chez les entérobactéries de l'Asie orientale, de l’Europe et de l’Amérique (Fritsche et al., 2008 ;

Kang et al., 2008). La figure 8 montre la distribution mondiale des gènes de méthylation

(Wachino et Arakawa, 2012). La plupart des gènes de méthylation sont situés sur des plasmides

transférables, et peuvent être facilement transférés à d'autres espèces bactériennes, ce qui a favorisé

leur propagation qui devient actuellement une préoccupation mondiale (Hidalgo et al., 2013).

3-4 Mécanismes de résistance des entérobactéries aux fluoroquinolones

3-4-1 Résistance chromosomique

3-4-1-1 Modification de la cible enzymatique

Chez les entérobactéries, l’ADN gyrase est plus sensible à l’inhibition médiée par les

fluoroquinolones et les mutations responsables de résistance surviendront d’abord au niveau de la

sous-unité gyr A. Ces mutations impliquent des substitutions en acides aminés qui apparaissent dans

une région particulière nommée QRDR pour Quinolone Resistance Determining Region (Muylaert

et Mainil, 2013). Ainsi, le domaine QRDR de la sous unité Gyr A de E. coli se situe entre les acides

aminés 67 et 106, avec des mutations au niveau des acides aminés en positions 83 et 87. Cette

région QRDR est proche de la tyrosine 122 impliquée dans la liaison covalente de l’enzyme aux

groupements phosphate de l’ADN (Hooper, 2003 ; Rodriguez- Martinez et al., 2010).

3-4-1-2 Perméabilité membranaire réduite

La plupart des fluoroquinolones traversent de manière passive la membrane externe des

Bactéries Gram Négatif par les porines bien que certaines molécules soient capables de diffuser

directement à travers la bicouche phospholipidique (Jacoby, 2005). Les mutations intervenant dans

les gènes codant pour ces porines sont responsables de résistance de bas niveau et permet

d’expliquer les différences d’efficacité observées parfois entre certains composés de la famille des

quinolones (Okusu et al., 1996). Par exemple, chez E. coli, la dé-répression du loci de régulation

mar A pour «multiple antibiotic resistance» conduit à une diminution de la sensibilité aux

fluoroquinolones via une sur-expression de la pompe à efflux AcrAB-TolC (Okusu et al., 1996) et

une sous-expression des porines OmpF (Muylaert et Mainil, 2013).

40

Figure 7 : Site-A de la sous-unité ribosomale 30 S

(Belbel, 2014)

41

Figure 8 : Distribution mondiale des gènes de méthylation

(Wachino et Arakawa, 2012)

42

3-4-1-3 Pompes à efflux

Chez les bactéries, il existe des pompes présentes uniquement chez les Gram négatifs, c’est

le cas de la Pompe RND, alors que chez les gram positifs ce sont les pompes MFS et ABC qui sont

les plus répandues. Le mécanisme de résistance par le système des efflux réside dans l’excrétion

active de l’antibiotique par les pompes à protons, il s’agit là d’un mode de résistance intrinsèque des

bactéries (Schumacher et al., 2006).

Chez E. coli, la pompe à efflux AcrAB-TolC, sous contrôles multiples, joue un rôle majeur

dans la résistance par efflux aux fluoroquinolones. Les mutations survenant dans le gène acrR

(répresseur d’acrAB) augmentent l’activité de la pompe (Wang et al., 2001). E. coli possède pas

moins de vingt pompes à efflux responsables de résistances à de multiples antibiotiques (Nishino et

Yamaguchi, 2001).

3-4-2 Résistance plasmidique aux fluoroquinolones

Le support de la résistance aux fluoroquinolones était supposé être uniquement

chromosomique jusqu’en 1998 où Martinez-Martinez et al. ont décrit chez la première souche K.

pneumoniae UAB1, un plasmide transférable noté pMG252 comme le support génétique de la

résistance. Le déterminant génétique de cette résistance est le gène qnr (quinolone résistance) dont

la caractéristique est d’être porté par différents types d’intégrons (Muylaert et Mainil, 2013).

3-4-2-1 Gènes de résistance aux fluoroquinolones

Le gène qnr code pour une protéine QNR de 218 acides aminés appartenant à la famille des

protéines à motifs pentapeptidiques répétés. L’importance de ce support génétique est sa

transférabilité et sa capacité à accélérer la diffusion de la résistance aux fluoroquinolones.

Les gènes qnr ont été identifiés chez différentes souches d’entérobactéries et souvent

associés à la production de BLSE (Muylaert et Mainil, 2013). Ce sont les gènes qnr A, qnr B, qnr

S, qnr C, qnr D (Guillard et al., 2009). Les protéines sont capables de se fixer sur les

topoisomérases II et IV en compétition avec l’ADN. La réduction du nombre des complexes

binaires topoisomérases-ADN diminue la fixation ultérieure des fluoroquinolones sur les

topoisomérases (Tran et al., 2005).

Les souches porteuses du gène qnr appartenaient le plus souvent aux espèces E. coli, K.

pneumoniae et récemment E. cloacae qui sont toutes multi-résistantes en particulier résistantes aux

céphalosporines de 3ième génération par production de BLSE (Honoré et al., 2006).

3-4-2-2 Pompes à efflux plasmidiques

43

En 2002, au Japon, une nouvelle pompe à efflux, nommée Qep A, est découverte. Elle est

codée par un gène situé sur un plasmide de résistance d’une souche clinique isolée de prélèvement

d’urine (Cattoir et al., 2008. Le gène qep A code pour une protéine de 511 acides aminés qui est

une pompe à efflux du type 14-TMS (transmembrane segment) de la famille des transporteurs MFS

(major facilitator superfamily) (Cattoir et al., 2008).

Cette pompe à efflux confère une résistance de bas niveau en produisant une augmentation

de la concentration inhibitrice minimale (CMI) de fluoroquinolones hydrophiles comme la

ciprofloxacine, l’enrofloxacine et la norfloxacine de 32 à 64 fois. Depuis la découverte du gène qep

A, un variant de ce gène, nommé qep A2, qui présente deux substitutions en acides aminés a été mis

en évidence. Ce variant confère un phénotype de résistance similaire à qepA, renommé depuis

qepA1 (Muylaert et Mainil, 2013). Le gène qepA1 localisé sur un plasmide conjugatif du groupe

IncFI se trouve sur un transposon composite encadré de deux séquences d’insertion IS26 et

comprenant le gène rmt B, codant pour une résistance de haut niveau aux aminosides d’usage

thérapeutique (Yamane et al., 2007 ; Périchon et al., 2008 ; Park et al., 2009).

3-5 Diffusion de la résistance à la rifampicine

La rifampicine est un antibiotique utilisé dans le traitement de la tuberculose et la lèpre

depuis plusieurs décennies et la durée du traitement allant de 2 à 4 semaines ou plus a favorisé

l’émergence des bactéries résistantes. Cette résistance se traduisait principalement par des

mutations. En effet, la résistance à la rifampicine chez les souches cliniques de Mycobacterium

tuberculosis et Mycobacterium leprae était principalement due à des mutations dans le gène rpoB

codant pour la sous unité bȇta de l'ARN polymérase, ce qui diminuerait la liaison de l'ARN

polymérase à la rifampicine (Williams et al., 1994). Toutefois, plusieurs autres mécanismes de

résistance ont été identifiés. Ce sont les systèmes d'efflux (Chandrasekaran et Lalithakumari,

1998), l’inactivation de la rifampicine par décomposition (Dabbs et al., 1995), la glucosylation

(Tanaka et al., 1996), la phosphorylation (Yazawa et al., 1994) et la ribosylation (Quan et al.,

1997). Plus tard, la résistance à la rifampicine a été décrite chez Mycobacterium smegmatis par

l'acquisition horizontale du gène arr-1 codant pour les ADP-ribosyltransférases, responsables de

l'inactivation de l’antibiotique (Arlet et al., 2001).

Les souches cliniques de Corynebacterium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et

Pseudomonas aeruginosa étaient incapables autrefois d'inactiver la rifampicine (Dabbs et al.,

1995). Cependant, des mécanismes de résistance à la rifampicine ont été identifiés chez

Pseudomonas spp qui se traduisaient par des systèmes d'efflux et par l’acquisition du gène arr-2

codant pour les ADP-ribosyltransférases (Dabbs et al., 1995 ; Chandrasekaran et Lalithakumari,

1998).

44

Par la suite, la résistance à la rifampicine médiée par le gène arr-2 a été retrouvée chez

diverses entérobactéries de l'Asie du Sud-Est produisant la β-lactamase à spectre élargi VEB-1

(Girlich et al., 2001 ; Naas et al., 2001). Egalement, les gènes arr-2 et arr-3 ont été décrits comme

cassettes de gènes dans les intégrons de classe 1 présents chez les bacilles Gram négatif d'Europe et

d'Asie (Arlet et al., 2001 ; Lee et al., 2005 ; Mammeri et al., 2005).

En Afrique, particulièrement en Côte d’Ivoire et au Burkina faso, la résistance à la

rifampicine chez Mycobacterium tuberculosis due à des mutations dans le gène rpoB a été décrite

dans les travaux de N’guessan et al. en 2014 et dans ceux de Miotto et al. en 2009. Cependant

aucune étude n’a mis en relief la transmission de la résistance à la rifampicine de Mycobacterium

vers les entérobactéries en Côte d’Ivoire.

4- Typage moléculaire des souches par le Multi-locus sequence typing

Le typage moléculaire des souches par le Multi-locus sequence typing (MLST) est une

technique standardisée et discriminante, actuellement appliquée dans des études macro-

épidémiologiques (internationales) ou phylogénétiques qui fournit des données claires et utiles pour

caractériser les relations génétiques entre les souches bactériennes. Le MLST compare les

séquences de gènes codant pour des enzymes métaboliques afin d’établir une rélation clonale entre

les différentes souches (Belbel, 2014).

La technique de MLST des souches de Klebsiella pneumoniae a été développée et mise au

point par Diancourt et al. en 2005. Cette méthode est basée sur le séquençage de 7 gènes de

ménage importants dans le métabolisme de la bactérie. Ces gènes de ménage sont stables dans le

temps, le taux de mutation est faible et les allèles sont caractéristiques à chaque espèce.

Pour Escherichia coli, la technique de MLST a été développée et mise au point par Wirth et

al. en 2006. Elle est basée sur l’analyse, par séquençage nucléotidique, du polymorphisme de 7

gènes de ménage conservés au cour de l’évolution.

L'alignement des séquences d'un locus donné permet de repérer les allèles différents entre

eux par des mutations et/ou recombinaisons pour chaque souche bactérienne. La combinaison des

allèles obtenus à partir de chaque locus sélectionné permet de définir une séquence type (ST),

représentant un génotype multi-locus. Ces séquences types avec les allèles qu'elles définissent sont

consultables dans les bases de données des sites web spécialisés (Belbel, 2014).

45

MATERIEL ET METHODES

46

1- Matériel

1-1 Type, période et cadre de l’étude

Ce travail est une étude expérimentale portant sur les échantillons bactériens préalablement

obtenus lors d’une précédente étude. La sélection des souches et leur ré-identification se sont

déroulées au sein du département de bactériologie et virologie de l’Institut Pasteur de Côte d’Ivoire

(IPCI) site Cocody, précisément à l’unité des antibiotiques, des substances naturelles et de la

surveillance de la résistance bactérienne aux anti-infectieux (ASSURMI) et, au centre national de

référence des antibiotiques de l’IPCI site Adiopodoumé, de janvier 2016 à juillet 2016. La

confirmation de l’identité des souches, l’antibiogramme et les techniques de biologie moléculaire

ont été réalisés à l'unité de recherche sur les maladies infectieuses tropicales émergentes (URMITE)

de la Faculté de Médecine et de Pharmacie de l’Université d’Aix-Marseille en France, de janvier

2017 à juillet 2017.

1-2 Matériel biologique

Le matériel biologique a été constitué de 153 souches bactériennes d’origine humaine

responsables d’infections et isolées à partir de divers échantillons biologiques chez des patients

hopitalisés ou non dans la période de 2012 à 2015. Les 153 souches bactériennes étaient constituées

de 71 souches de Escherichia coli, 57 souches de Klebsiella pneumoniae, 22 souches de

Enterobacter cloacae, 2 souches de Citrobacter freundii et 1 souche de Morganella morganii. Les

échantillons biologiques et dispositif invasif d’où ont été isolées les souches ont été les urines (n=

72), les suppurations (n= 32), le sang (n= 20), les bouts de sonde (n= 10), le crachat (n= 3), les

écouvillons (n= 3), le liquide d’ascite (n= 1), l’aspiration sur cathéther (n= 1), l’expectoration (n=

1), le liquide péritonéal (n= 1), le liquide pleural (n= 1), le prélèvement nasal (n= 1), le liquide

céphalo-rachidien (n= 1), le prélèvement ORL (n= 1).

Ces entérobactéries provenaient de différents services hospitaliers des CHU de Cocody (n=

87), Yopougon (n= 36), du centre national de référence des antibiotiques de l’Institut Pasteur de

Côte d’Ivoire (n= 24) et des cliniques membres du réseau de l’Observatoire de la Résistance des

Microorganismes aux anti-Infectieux en Côte d’Ivoire (ORMICI) (n= 6). Toutes ces souches étaient

conservées soit dans du bouillon cœur cervelle additionné du glycérol, soit dans des géloses

profondes au Centre de Ressources Biologiques (CeReB) de l'IPCI situé sur le site d’Adiopodoumé

1-3 Critères d’inclusion

En utilisant la base de données ADAGIO® de l’unité ASSURMI, les entérobactéries ont été

sélectionnées de 2012 à 2015 en fonction des critères suivants :

47

Entérobactéries productrices de BLSE ou non et résistantes aux aminosides,

Entérobactéries productrices de BLSE ou non et résistantes aux fluoroquinolones,

Entérobactéries productrices de BLSE ou non mais résistantes aux aminosides et aux

fluoroquinolones.

1-4 Matériel technique

1-4-1 Matériel et réactifs pour la caractérisation phénotypique des souches

1-4-1-1 Matériel pour la revivification et l’isolement des souches

Les bouillons tels que le bouillon cœur cervelle (BCC) et le bouillon BBLTMTrypticaseTM

(Becton Dickinson, USA) ont été utilisés pour la revivification des souches. Les milieux de culture

Eosine bleu de méthylène (EMB), Mac Conkey (bioMérieux SA, France) et Trypto-caséine soja

(TSA) de Becton Dickinson, USA ont été utilisés pour l’isolement des souches.

1-4-1-2 Matériel et réactifs pour la ré-identification et la confirmation de l’identité des

souches

Les milieux de culture citrate de Simmons, Kliger-Hajna, lysine-fer de mȇme que les

disques d’oxydase (Bio-Rad®, France), l’urée (Bio-Rad®, France) et le réactif de Kovacs

(bioMérieux, France) ont été utilisés pour la ré-identification des souches bactériennes. L’automate

MALDI-TOF MS® (Brucker), une plaque métallique ou cible MALDI (Brucker Microflex), un

soniqueur (Fischer Scientific), une centrifugeuse (Sigma), la poudre α-cyano-4-hydroxycinnamic

acid (Sigma®), l’acétonitrile (Baker Chemical), le Trifluoracétate (Sigma®) et l’eau HPLC (High

Performance Liquid Chromatography) (Fisher Scientific SAS) ont été utilisés pour la confirmation

de l’identité des souches.

1-4-1-3 Matériel et réactifs pour la réalisation de l’antibiogramme

La gélose Müeller-Hinton (BioMérieux SA, France), la solution NaCl 0,85 % Medium 2 mL

(BioMérieux, France), le Densitomètre (ATB 1550), une étuve (Hera Therm), un applicateur

manuel de disques (Becton Dickinson), des écouvillons (Dutscher), un vortex (Velp Scientifica) ont

servi à la réalisation de l’antibiogramme et un pied à coulisse pour la lecture manuelle des zones

d’inhibition et l’interprȇtation a été faite en utilisnt l’EUCAST-CASFM,2013. Des bandelettes E-

test (bioMérieux, France) et un panel de 16 antibiotiques (SirScan Discs, France) de différentes

familles ont été également utilisés dans cette étude (Tableau III).

48

Tableau III : Liste des antibiotiques utilisés dans cette étude (EUCAST-CASFM, 2013)

Familles Antibiotiques Charge des disques

(μg)

Diamètres critiques

(mm)

S R

Pénicillines

Amoxicilline 25 ≥ 21 < 16

Amoxicilline-acide

clavulanique 20/10 ≥ 21 < 16

Tircalline-acide

clavulanique 75/10 ≥ 24 < 22

Céphalosporines

Céfotaxime 30 ≥ 26 < 23

Ceftriaxone 30 ≥ 26 < 23

Cefoxitine 30 ≥ 22 < 15

Aminosides Amikacine 30 ≥ 17 < 15

Gentamicine 15 ≥ 18 < 16

Carbapénèmes Imipenème 10 ≥ 24 < 17

Ertapénème 10 ≥ 28 < 26

Quinolones Ciprofloxacine 5 ≥ 25 < 22

Sulfamides Triméthoprime-

Sulfaméthoxazole 23,75/1,25 ≥ 16 < 13

Mono-bactame Aztréonam 30 ≥ 27 < 21

Acides fosfoniques Fosfomycine 50 ≥ 14 < 14

Polymyxines Colistine 50 ≥ 15 < 15

Rifamycines Rifampicine 30 ≥ 19 < 14

49

1-4-2 Matériel et réactifs pour la caractérisation moléculaire des souches

1-4-2-1 Matériel et réactifs pour la recherche des gènes de résistance

L’automate EZ1 Advanced XL® et le kit d’extraction d’ADN (EZ1 DNA Tissue, Qiagen,

Germany) comprenant le tampon G2, des cartouches de réactifs (Annexe 1) et des tubes Eppendorf

ont servi à extraire l’ADN des souches bactériennes. Les thermocycleur (CFX-Bio-Rad® et Labnet

International Multigene Optimax), des plaques pour PCR (Dutscher), des amorces spécifiques et

sondes (Life technologies) (Tableaux IV, V, VI), le Quantitect Probe PCR Master Mix (Thermo

Scientific®), l’eau ultra pure (Invitrogen) ont été utilisés pour l’amplification des gènes.

La poudre d’agarose (Binder), une bouteille en verre stérile, une balance à précision (Kern

EWN®), du Tris-Borate-EDTA (Sigma), du SYBR Safe (Invitrogen), du Blue Juice (Invitrogen), un

marqueur de poids moléculaire (BenchTop pGEM® DNA Markers Cat.# G7521, Promega, France),

une cuve d'électrophorèse (Dutscher®) et un transilluminateur (Chemidoc®) ont été utilisés pour

visualiser les fragments d’ADN amplifiés.

1-4-2-2 Matériel pour le séquençage

Un séquenceur ABI 3130 xl (Genetic Analyzer®), la poudre Sephadex G-50 DNA Grade

(Dutscher), le kit de séquençage Big Dye (Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit, Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA) une pompe à vide (KNF®, France), un vibreur automatique de

plaques (Heidolph®), des plaques à filtre (AcroPrep™ Advance), des microplaques de filtration

pour séquençage (Dutscher) et une centrifugeuse (Sigma®) ont été utilisés pour séquencer les

fragments d’ADN. Des amorces spécifiques ont été utilisées pour séquencer les gènes de ménage

pour les espèces Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae (Tableaux VII et VIII).

1-4-2-3 Matériel pour l’expérience de Conjugaison

Les antibiotiques céfotaxime (Panpharma) et amikacine (Mylan) en poudre, la gentamicine

liquide (Panpharma), l’azide de sodium en poudre, un incubateur avec agitation (VWR collection®)

ont été utilisés pour la conjugaison.

50

Tableau IV : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux β-lactamines par la

PCR en temps réel

Nom du gène

Contrôle Positif

Nom de l'amorce

Séquences des amorces (5'->3') Taille de l'amplicon (pb)

Références

blaTEM

Kpnasey numéro

d'Accession Genbank

KJ939560.1

TEM-F TTCTGCTATGTGGTGCGGTA 213

TEM-R GTCCTCCGATCGTTGTCAGA Essack et al.,

2001

TEM-Sonde AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA

blaCTXM

Kpnasey numéro

d'Accession Genbank

JQ397665.1

CTXM-F

CGGGCRATGGCGCARAC

105

CTXM-R TGCRCCGGTSGTATTGCC Birkett et al.,

2007

CTXM -Sonde

CCARCGGGCGCAGYTGGTGAC

blaSHV

Kpnasey numéro

d'Accession Genbank

AF124984.1

SHV-F

TCCCATGATGAGCACCTTTAAA

105

SHV-R TCCTGCTGGCGATAGTGGAT

Yagi et al., 2000

SHV-Sonde TGCCGGTGACGAACAGCTGGAG

blaOXA48

E.coli CMUL64 numéro

d'Accession Genbank

AY236073

OXA48_F TCTTAAACGGGCGAACCAAG

125

OXA48_R GCGTCTGTCCATCCCACTTA Pitart et al.,

2011

OXA48_Sonde

6-FAM-AGCTTGATCGCCCTCGATTTGG-TAMRA

51

Tableau V : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux β-lactamines par PCR

classique

Nom du

gène

Contrôle

positif

Nom de

l’amorce Séquences des amorces (5’->3’)

Taille des

amplicons

(pb)

Références

blaTEM

Kpnasey-

numéro-

d’accession

Genbank

KJ939560.1

TEM_F ATGAGTATTCAACATTTCCG

TG

861

Essack et

al., 2001 TEM_R

TTACCAATGCTTAATCAGTG

AG

blaCTX-M-1

Kpnasey

numéro-

d’accession

Genbank

JQ397665.1

CTXM1_F CCCATGGTTAAAAAATCAC

TGC

944

Birkett et

al., 2007 CTXM1_R CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG

blaCTX-M-9

Cette étude

CTX-M9_F GCGCATGGTGACAAAGAGA

GTGCAA 876

Birkett et

al., 2007 CTX-M9_R

GTTACAGCCCTTCGGCGAT

GATTC

blaSHV

Kpnasey

numéro-

d’accession

Genbank

AF124984.1

SHV_F ATTTGTCGCTTCTTTACTCG

C

1051

Yagi et al.,

2000 SHV_R

TTTATGGCGTTACCTTTGAC

C

52

Tableau VI : Amorces utilisées pour la détection des gènes de résistance aux fluoroquinolones, aux

aminosides et à la rifampicine par PCR classique

Nom du

gène

Contrôle

positif

Nom de

l’amorce

Séquences des amorces (5’-

>3’)

Taille des

amplicons

(pb)

Références

qnr A Cette étude

QnrA_F GATAAAGTTTTTCAGCAAG

AGG

542

Touati et

al., 2008 QnrA_R ATCCAGATCGGCAAAGGTT

qnr B

Enterobacter

cloacae

483

QnrB_F GACAGAAACAGGTTCACCG

GT 594

Touati et

al., 2008 QnrB_R

CAAGACGTTCCAGGAGCAA

CG

aac(6΄)-Ib

Enterobacter

cloacae

483

Aac6-1B_F TATGAGTGGCTAAATCGAT

524

Noppe-

Leclercq et

al., 1999 Aac6-1B_R CCCGCTTTCTCGTAGCA

aac(3)-Ia A. baumanii

451 aac3-1A_F GACATAAGCCTGTTCGGTT

303

Noppe-

Leclercq et

al., 1999 aac3-1A-_R CTCCGAACTCACGACCGA

aph(3)-VI A. baumanii

980 aph(3)-VI_F CGGAAACAGCGTTTTAGA

699

Noppe-

Leclercq et

al., 1999 aph(3)-VI_R TTCCTTTTGTCAGGTC

ant(2")-I

Acinetobacter

baumanii 980

Ant(2΄΄)-I_F GACACAACGCAGGTCACAT

T 394

Kim et al.,

2008 Ant(2΄΄)-I_R

CGCATATCGCGACCTGAAA

GC

aad Acinetobacter

baumanii 610

Aad_F

Aad_R

TTGTACGGCTCCGCAGTG

CCCAATTTGTGTAGGGCTTA 812

Belbel, 2014

arr2 Escherichia

coli 725YO

arr2_F

arr2_R

AATTACAAGCAGGTGCAAG

GA

TTCAATGACGTGTAAACCA

CG

393

LabJMR

53

Tableau VII : Amorces utilisées pour la détection des 7 gènes de ménage de Escherichia coli

(Sara et al., 2005)

Nom du gène

Séquences des amorces (5’->3’) Taille des amplicons (pb)

adk ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG (F) CCGTCAACTTTCGCGTATTT (R)

583

fumC TCACAGGTCGCCAGCGCTTC (F) GTACGCAGCGAAAAAGATTC (R)

806

icd ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA (F) GGACGCAGCAGGATCTGTT (R)

878

purA CGCGCTGATGAAAGAGATGA (F) CATACGGTAAGCCACGCAGA (R)

816

gyrB TCGGCGACACGGATGACGGC (F) ATCAGGCCTTCACGCGCATC (R)

911

recA CGCATTCGCTTTACCCTGACC (F) TCGTCGAAATCTACGGACCGGA (R)

780

mdh ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG (F) TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTT (R)

932

adk : adenylate kinase

fumC : fumarate hydratase

icd : isocitrate/isopropylmal ate déshydrogénase

purA : adenylosuccinate déshydrogénase

gyrB : DNA gyrase

recA : ATP/GTP binding motif

mdh : malate déshydrogénase

54

Tableau VIII : Amorces utilisées pour la détection des gènes de ménage de Klebsiella pneumoniae

(Diancourt et al., 2005)

Nom du

gène

Séquences des amorces (5’-> 3’)

Tailles des amplicons

(pb)

rpoB

GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGGCGAAATGGCWGAGAACCA (F)

501 TTGTGAGCGGATAACAATTTCGAGTCTTCGAAGTTGTAACC (R)

gapA GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTATGAAATATGACTCCACTCACGG (F)

450 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT (R)

mdh GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG (F) 477

TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG (R) pgi

GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC (F) 432 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT (R)

phoE GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG (F) 420 TTGTGAGCGGATAACAATTTCTGATCAGAACTGGTAGGTGAT (R)

inf B GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTCGCTGCTGGACTATATTCG (F)

318 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCTTTCAGCTCAAGAACTTC (R)

tonB GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTTTATACCTCGGTACATCAGGTT (F)

414 TTGTGAGCGGATAACAATTTCATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG (R)

rpoB : beta-subunit of RNA polymerase

gapA : Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

mdh :malate dehydrogenase

pgi : phosphoglucose isomerase

phoE : phosphorine E

inf B : translation initiation factor 2

tonB : periplasmic energy transducer

55

2-Méthodes

2-1 Caractérisation phénotypique des souches

2-1-1 Revivification des souches bactériennes

Le bouillon cœur cervelle (BCC) a été utilisé pour revivifier les souches conservées dans les

géloses profondes. En, effet, par une piqûre profonde, une partie de la gélose contenant les souches

a été prélevée et introduite dans le BCC qui a été ensuite incubé à 37 °C pendant 24 h. Puis, en

utilisant une pipette Pasteur stérile, le BCC a été ensemencé sur le milieu sélectif EMB qui a été

également incubé à 37 °C pendant 24 h.

2-1-2 Ré-identification des souches bactériennes

2-1-2-1 Mise en évidence de la production du cytochrome C oxydase

Pour mettre en évidence la production du cytochrome C oxydase, une colonie bactérienne a

été prélevée à partir d’une culture sur le milieu EMB et étalée sur le disque d’oxydase

préalablement humidifiée avec de l’eau distillée stérile. Après quelques secondes, le résusltat a été

obtenu et se traduisait soit par l’apparition d’une coloration violette (réaction positive) ou par

l’absence de coloration (réaction négative : cas des entérobactéries).

2-1-2-2 Identification par le portoir réduit de Le Minor

2-1-2-2-1 Utilisation du citrate de Simmons comme seule source de carbone

Une colonie bactérienne a été ensemencée sur le milieu citrate de Simmons par stries

longitudinales sur la pente et le milieu a été incubé à 37 °C pendant 24 h. La présence de colonies

sur la pente et le virage du milieu du vert au bleu indique que la bactérie est capable d’utiliser le

citrate de Simmons comme seule source de carbone pour sa croissance.

2-1-2-2-2 Détermination de la production d’uréase et d’indole

Afin de déterminer la production d’uréase, une colonie bactérienne a été ensemencée dans le

milieu urée qui a été incubé par la suite à 37 °C pendant 24 h. La production d’uréase a été mise en

évidence par le virage du milieu de l’orange au rouge. Puis, la recherche de la production d’indole a

été effectuée en ajoutant quelques gouttes du réactif Kovacs dans le milieu pré-incubé. La formation

d’un anneau rouge en surface indique la production d’indole.

2-1-2-2-3 Détermination de la production d’hydrogène sulfuré, de gaz, de la fermentation du

lactose et du glucose

A partir du milieu urée, l’ensemencement du milieu Kliger-Hajna a été effectué par piqûre

centrale dans le culot et par stries longitudinales sur la pente.

56

Puis le milieu a été incubé à 37°C pendant 24 h. La production de sulfure d’hydrogène a été

mise en évidence par une coloration noire dans le culot tandis que la présence de bulles d’air ou le

décollement du culot a mis en évidence la production de gaz. La fermentation du glucose a été

démontrée par le virage du culot du rouge au jaune tandis le virage de la pente au jaune indiquait la

fermentation du lactose.

2-1-2-2-4 Détermination de la lysine décarboxylase et de la lysine désaminase

A partir du milieu urée, l’ensemencement du milieu lysine-fer a été effectué par piqûre

centrale dans le culot et par stries longitudinales sur la pente puis le milieu a été incubé à 37 °C

pendant 24 h. Le virage de la pente du violet au jaune a traduit la production d’une lysine

désaminase par la bactérie. Par contre, l’absence de virage du culot traduisait la production d’une

lysine décarboxylase par la bactérie.

2-1-3 Confirmation de l’identité des souches bactériennes par la spectrométrie de masse

MALDI TOF

L’identification des souches par la spectrométrie de masse MALDI-TOF est une technique

basée sur le profil protéique des souches, qui permet en quelques minutes (une à deux minutes pour

l’identification d’une souche) et avec une haute précision leurs identifications (Seng et al., 2010).

Elle s’est déroulée en différentes étapes :

2-1-3-1 Préparation de la matrice

La matrice permet de minimiser la dégradation de la souche provoquée par l'absorption de

l'énergie des faisceaux laser incident du MALDI-TOF (Belbel, 2014).

A 2g de la poudre α-cyano-4-hydroxycinnamic acid mis dans un tube Eppendorf, 500 μL

d’acétonitrile, 250 μL de TFA et 475 μL d’eau HPLC ont été ajoutés. Le mélange a été

homogénéisé au vortex pendant quelques secondes et soniqué pendant 10 min. Ce mélange a été

centrifugé pendant 5 min à 13000 tours/minute. Le surnageant qui constitue la matrice (prête à

l’emploi) a été transféré dans un autre tube Eppendorf stérile.

2-1-3-2 Dépôt des souches, lecture et interprétation des résultats

Le plan de la cible MALDI a été rempli en indiquant les références des souches à identifier.

Ainsi, à partir d’une colonie bactérienne de chaque souche, 4 spots ont été faits sur la cible

selon le plan défini en utilisant des cônes fins. Ces spots ont été recouverts de 1,5 μL de la matrice

précédemment préparée. La plaque a été laissée au repos pendant 5 min sous le poste de sécurité

microbiologique (PSM) afin de permettre la cristallisation des échantillons bactériens, puis elle a été

introduite dans l’automate pour l’identification des souches.

57

Le résultat d’identification par MALDI-TOF a été donné avec le logiciel MALDI Biotyper

par un score compris entre zéro et trois. Une bactérie est identifiée de façon fiable lorsque le score

d’identification est supérieur à 1,9 (Tableau IX).

2-1-4 Détermination de la sensibilité aux antibiotiques

Le test de sensibilité des souches aux antibiotiques a été réalisé selon la méthode de

diffusion des disques sur la gélose Müeller-Hinton en tenant compte des recommandations du

Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (EUCAST/CA-SFM, 2013).

Ces recommandations concernent la préparation du milieu de culture Müeller-Hinton, de l’inoculum

bactérien, du choix et de la disposition des disques d’antibiotiques. Et la souche de référence

Escherichia coli ATCC 25922 a été utilisée pour le contrôle de la qualité.

2-1-4-1-1 Préparation de l’inoculum bactérien

L’inoculum bactérien a été préparé en utilisant une ou deux colonies bactériennes qui ont été

émulsionnées dans la solution NaCl 0,85%. Cette dernière a été homogénéisée à l’aide d’un vortex

et la suspension a été calibrée à l’échelle 0,5 Mac Farland.

2-1-4-1-2 Ensemencement de la gélose Müeller-Hinton

La gélose Müeller-Hinton a été ensemencée par écouvillonnage en utilisant l’inoculum

bactérien et 16 disques d’antibiotiques de différentes familles ont été disposés sur la gélose à l’aide

d’un applicateur (Figure 9). Les boîtes ont été ensuite incubées à 37 °C pendant 24 h. A l’aide d’un

pied à coulisse, les différents diamètres des zones d’inhibition obtenus autour des disques

d’antibiotiques ont été mesurés et l’interprétation a été effectuée selon les termes Sensible (S),

Intermédiaire (I) ou Résistante (R) en fonction des critères définis par l’EUCAST/CA-SFM, 2013.

2-1-5 Recherche de la production de β-lactamases à spectre élargi

La confirmation phénotypique des souches productrices de β-lactamases à spectre élargi

(BLSE) a été effectuée en recherchant les images en bouchon de champagne ou en entonnoir qui

peuvent apparaître entre les disques d’antibiotiques d’amoxicilline-acide-clavulanique, de

cefotaxime, de ceftriaxone et d’aztréonam disposés sur la gélose Müeller-Hinton pré-ensemencée

(Bakour et al., 2014).

58

Tableau IX : Scores et niveaux d’identification des souches bactériennes

Score

Description

Symboles

Couleur

2,300 ... 3,000

identification des

espèces hautement

probable

( +++ ) vert

2,000 ... 2,299

identification

sécurisée du genre,

identification

probable des espèces

( ++ ) vert

1,700 ... 1,999 identification

probable du genre ( + ) jaune

0,000 ... 1,699 identification non

fiable ( - ) rouge

Source : Bases de données du logiciel MALDI Biotyper (Brucker)

59

Figure 9 : Disposition des antibiotiques sur la gélose Müeller Hinton

AMX : Amoxicilline ; SXT : Triméthoprime- Sulfaméthoxazole ; IPM : Imipenème ; CIP : Ciprofloxacine ; ATM :

Aztréonam. AMC : Amoxicilline-acide clavulanique ; CTX : Céfotaxime ; ERT : Ertapénème ; FOX : Cefoxitine ;

CRO : Ceftriaxone ; TIM : Tircalline-acide clavulanique ; RA : Rifampicine ; GN : Gentamicine ; FF : Fosfomycine ;

AK : Amikacine ; CT : Colistine

60

2-1-6 Détermination de la concentration minimale inhibitrice par E-test

Le E-test est constitué d’une bande en plastique, non poreuse, calibrée par un gradient

préétabli de concentration d'antibiotiques, couvrant 15 dilutions afin de déterminer la concentration

minimale inhibitrice (CMI) en µg/ml d'une souche testée en milieu gélosé. Le gradient couvre une

rangée de concentrations allant 0,002 à 32 µg/ml selon l'antibiotique (Thiam, 2008 ; BelBel, 2014).

Pour déterminer la CMI, un inoculum bactérien a été préparé en émulsionnant une colonie

jeune de 24 h dans du NaCl 0,85%. La densité optique de l’inoculum a été ajustée à 0,5 Mac

Farland et ce dernier a été ensemencé par stries serrées sur la gélose Müeller Hinton coulée en

boîtes de Pétri. Les bandelettes E-test et les disques d’antibiotiques correspondants ont été posés à

la surface de la gélose et les boîtes ont été incubées à 37 °C pendant 24 h.

2-2 Caractérisation moléculaire de la résistance des souches aux antibiotiques

2-2-1 Extraction d'ADN total bactérien

Le principe est basé sur l'utilisation d'un tampon de lyse contenant un détergent qui sert à

décomposer les membranes cellulaires et une protéase pour la digestion des composants cellulaires

protéiques. Pour extraire l'ADN total bactérien, une colonie jeune de 24 h a été introduite dans un

tube contenant 200 μL du tampon G2 du kit d’extraction d’ADN EZY-1, puis le mélange a été

homogénéisé au vortex. Les cartouches de réactifs du kit ont été introduites dans l’automate de

même que les tubes Eppendorf qui ont servi à recueillir l’ADN. Après 20 min d’incubation l’ADN a

été recueilli puis conservé pour les réactions d’amplification.

2-2-2 Réaction de polymérisation en chaîne réalisée en temps réel

Le principe de la PCR en temps réel repose sur la possibilité de suivre la quantité d’ADN

présente dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR, en utilisant des sondes

fluorescentes. La mesure de la fluorescence permet de déterminer en temps réel si le fragment

recherché (amplicon) est effectivement présent et donc amplifié sans avoir besoin de faire une

électrophorèse. De plus, la fluorescence émise est directement proportionnelle à la quantité

d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. Ceci permet d’obtenir une cinétique de la réaction

et donc la quantification de l’ADN (Bustin, 2000).

Les gènes recherchés au cours de cette réaction étaient les gènes codant pour les β-

lactamases, c’est-à-dire les gènes blaCTX-M, blaSHV, blaTEM et blaOXA. Pour ce faire, un mélange

réactionnel de 15 μL a été préparé en utilisant 10 μL d’un mix prêt à l’emploi composé de la taq

ADN polymérase et des dNTP, 2 μL d’amorce sens et anti-sens, 1 μL de sonde spécifique et 2 μL

d’eau ultra pure.

61

Ce mélange a été déposé dans chaque puits d’une plaque de PCR et 5 μL d’ADN bactérien y

ont été ajoutés. L’amplification a consisté en une étape de dénaturation initiale de l’ADN double

brin pendant 5 min à 95 °C. Cette étape a été suivie de 35 cycles d'amplification de la séquence

d'ADN d'intérêt comprenant une dénaturation à 95°C pendant 5 s, une hybridation et une élongation

à 60°C pendant 35 s.

2-2-3 Réaction de polymérisation en chaîne

Le principe de la technique consiste à réaliser une succession de réactions de réplication

d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces ou primers

(séquences nucléotidiques courtes) qui définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier.

Chaque cycle de PCR est constitué de trois étapes : une dénaturation de l’ADN pour séparer les

deux brins complémentaires qui le composent, puis une hybridation des amorces aux extrémités de

la séquence recherchée et enfin une élongation grâce à l’action d’une ADN ploymérase. Ce cycle

est répété un grand nombre de fois afin d’obtenir une multiplication de la séquence d’ADN cible à

la fin de la réaction (Bustin, 2000).

Pour ce faire, un mélange réactionnel de 20 μL a été préparé en utilisant 12,5 μL de

Quantitect Probe PCR Master Mix, 1μL d’amorce sens et anti-sens et 6,5 μL d’eau ultra pure. Ce

mélange a été déposé dans chaque puits de la plaque de PCR et 5 μL d’ADN bactérien y ont été

ajoutés. L’amplification a consisté en une étape de dénaturation initiale de l'ADN pendant 15 min à

94 °C. Cette étape a été suivie de 35 cycles d'amplification comprenant une dénaturation à 94 °C

pendant 1 min, une hybridation à 55 °C pendant 50 s, une élongation à 72 °C pendant 2 min et une

étape d’élongation finale de 7 min à 72 °C. La PCR conventionnelle a été réalisée pour chaque gène

à l’aide d’amorces spécifiques à chacun de ces gènes (gènes de résistance aux β-lactamines, aux

aminosides, aux fluoroquinolones et à la rifampicine).

2-2-4 Electrophorèse sur gel d'agarose

La visualisation du fragment d’ADN recherché se fait lors de l’électrophorèse sur gel

d’agarose. Cette étape de la réaction de PCR est basée sur la migration des bandes d’ADN chargés

négativement sous l’effet d’un champ électrique.

Les fragments d’ADN de petites tailles se déplacent plus rapidement que ceux de grandes

tailles et migrent plus loin. Plus les fragments sont longs, plus la migration est lente; ainsi la durée

de la migration et le voltage employé sont fonction de la taille du fragment d’ADN amplifié

(Ouattara, 2016).

62

2-2-4-1 Préparation du gel d'agarose

Pour préparer le gel d’agarose 1,5%, 6 g de la poudre d'agarose ont été introduits d’abord

dans une bouteille en verre stérile et 400 mL du tampon TBE 0,5 % y ont été ajoutés. La

préparation a été portée ensuite au four à micro-ondes pour fondre le gel et obtenir un mélange

homogène. Ce mélange a été laissé au repos quelques minutes sous la hotte chimique et 15 μL de

SYBR Safe y ont été ajoutés. Enfin, le gel a été coulé dans des moules contenant des peignes.

2-2-4-2 Migration des produits d'amplification et révélation

Après refroidissement du gel, les peignes ont été retirés et le gel placé dans une cuve

d'électrophorèse préalablement remplie de tampon TBE 0,5 %. Un volume de 4 μL d’amplicons

mélangés à une goutte du tampon de charge (blue juice) ont été déposés dans les différents puits

laissés par les peignes en commençant par le deuxième puits. Le premier puits a été rempli par 4 μL

du marqueur de poids moléculaire. La cuve d'électrophorèse a été recouverte et la migration a été

effectuée pendant 20 min sous une tension de 135V. Le temps écoulé, le gel a été retiré de la cuve et

exposé aux rayons ultra-violets d’un transilluminateur afin de visualiser les bandes d’ADN.

2-2-5 Séquençage

Le séquençage a été réalisé selon la méthode de Sanger, en utilisant le kit Big Dye

Terminator v3.1 Matrix Standard Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) et le séquenceur

Automate ABI 3730 (Applied Biosystems), selon les recommandations du constructeur. Le

séquençage a pour but de déterminer la séquence nucléotidique de l’ADN isolé. La technique du

séquençage utilise, en plus des désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP), des

didésoxyribonucléotides (ddNTP) qui diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH en

position 3’ et dont l’incorporation aléatoire va bloquer la réaction de polymérisation (Freney et al.,

2000). Les gènes de résistance aux β-lactamines blaCTXM1 (n=95), blaCTXM9 (n=5), blaTEM (n=84),

blaSHV (n=40), aux aminosides aad (n=15) et aux fluoroquinolones qnrA (n=4) et qnrB (n=54) ont

été séquencés en suivant les différentes étapes :

2-2-5-1 Purification des produits de la PCR conventionnelle

La purification des produits de la PCR conventionnelle a été effectuée en utilisant des

plaques de filtration 96 puits AcroPrep™ Advance constitué d’une membrane exclusive à base de

silice. Cette membrane permet d’éliminer efficacement les amorces, les dNTP, les nucléotides non

incorporés, les enzymes et les sels de PCR sur un équipement automatisé.

63

Pour purifier les produits de PCR, 100 μL d’eau ultra-pure ont été ajoutés dans la plaque de

PCR contenant ces produits et le mélange obtenu a été transféré dans une plaque à filtre pour une

filtration sous une pompe à vide pendant 20 min. Après ce temps, un autre volume de 50 μL d’eau

ultra-pure a été ajouté dans la plaque à filtre et celle-ci a été déposée sur un vibreur automatique de

plaques (Heidolph) pendant 20 min.

2-2-5-2 PCR Big Dye

La PCR Big Dye est une PCR classique comprenant les étapes de dénaturation de l’ADN,

d’hybridation des amorces aux extrémités de la séquence recherchée et d’élongation grâce à l’action

d’une ADN ploymérase. La particularité de cette PCR est la préparation du mélange réactionnel

avec un seul type d’amorce, ce qui équivaut à deux mélanges réactionnels à préparer pour un gène

donné. Pour réaliser la PCR Big Dye, deux mélanges réactionnels de 20 μL ont été préparés avec un

seul type d’amorce (amorce sens dans l’un et amorce anti-sens dans l’autre). Ces mélanges ont été

composés de 3 μL du tampon Big Dye, 2 μL de mix Big Dye, 10 μL d’eau, 4 μL produits de PCR

purifié et 1 μL d’amorce sens ou anti-sens. L’amplification a consisté en une étape de dénaturation

initiale de l'ADN pendant 5 min à 96 °C. Cette étape a été suivie de 25 cycles d'amplification

comprenant une dénaturation à 96 °C pendant 10 s, une hybridation à 50 °C pendant 5 s, une

élongation à 60 °C pendant 3 min.

2-2-5-3 Purification des produits de PCR Big-Dye par le Sephadex

Cette méthode est basée sur la purification par chromatographie d’exclusion pour piéger des

ddNTP libres en excès qui sont de bas poids moléculaires sur une colonne. Ainsi, dans une

microplaque de filtration remplie de la poudre Sephadex G-50 DNA Grade (Dutscher), 300 μL

d’eau ultra pure ont été ajoutés et le mélange a été laissé au repos pendant 3 h. Le temps écoulé, une

nouvelle plaque a été placée en dessous de la première contenant le Sephadex et l’ensemble a été

centrifugé à 1300 tours/min pendant 2 min à 10 °C. L’eau recueillie dans la plaque en dessous a été

éliminée. Puis, les produits de la PCR Big Dye ont été ajoutés dans la microplaque contenant le

Sephadex et une seconde plaque pour séquençage a été placée en dessous pour une autre

centrifugation afin de récupérer l’ADN destiné au séquençage. Les fiches pour séquençage ont été

remplies et la plaque pour le séquençage a été mise sur le support et introduite dans le sequenceur

ABI 3130 xl (Genetic Analyzer) pour analyse.

64

2-2-5-4 Analyse des séquences ADN

Les séquences nucléotidiques obtenues ont été analysées et corrigées en utilisant le logiciel

Chromas-Pro et le site internet spécialisé de bioinformatique NCBI. Après correction, les séquences

ont été analysées dans la banque de données ARG-ANNOT pour l’identification des gènes.

En effet, la banque de données ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation)

est un nouvel outil bioinformatique qui a été créé pour détecter les nouveaux gènes de résistance

aux antibiotiques dans les génomes bactériens. ARG-ANNOT utilise un programme local BLAST

dans le logiciel Bio-Edit, cela permet à l'utilisateur d'analyser des séquences sans interface Web

(Gupta et al., 2014).

Afin de rechercher d’eventuelles mutations, les séquences nucléotidiques ont été traduites en

séquences protéiques en utilisant le site www. Expasy-Translate tool. org. Les séquences protéiques

des gènes blaTEM obtenues dans cette étude ont été comparées avec la séquence protéique du gène

blaTEM-1 avec laquelle elles ont eu 99 % d’homologie. Concernant les séquences protéiques des

gènes blaSHV obtenus dans ce travail, elles ont été comparées avec les séquences protéiques des

gènes blaSHV-1 et blaSHV-2 qui sont les têtes de file des deux sous-groupes auxquels ces gènes

appartiennent (Liakopoulos et al., 2016).

2-2-6 Conjugaison

La conjugaison bactérienne est un mécanisme de transfert d’éléments génétiques entre une

bactérie donatrice et une bactérie réceptrice nécessitant un contact physique entre ces deux bactéries

par le biais d’un pili sexuel. La bactérie réceptrice ayant reçu le plasmide est appelée

transconjugant. La sélection des transconjugants s’effectue en présence de deux antibiotiques dont

l’un correspond à la résistance transférée par la souche donatrice et l’autre à la résistance non

transférable de la souche réceptrice (Davison, 1999).

Pour ce faire, trois souches de Escherichia coli résistantes au céfotaxime et à la gentamicine

et qui portent les deux gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides que sont les gènes

blaCTX-M-1 et aac(6’)-Ib ont été utilisées comme souches donatrices ce sont E. coli 1417C/12, E. coli

1253C/13 et E. coli 1282Y/13. Par ailleurs, la souche de référence E. coli J 53, sensible à tous les

antibiotiques et résistante uniquement à l’azide de Soduim a été utilisée comme souche réceptrice.

La sélection des transconjugants a été faite sur le milieu de culture Mȕeller Hinton additionné de

l’azide de sodium, de la gentamicine, de l’amikacine et du cefotaxime selon la méthode décrite par

Belbel (2014).

65

L’expérience a été réalisée en cinq jours et a consisté au premier jour, à repiquer séparément

sur le milieu Mac Conkey la souche réceptrice E. coli J 53 et les souches donatrices, ensuite, à les

incuber à 37 °C pendant 24 h pour avoir des cultures jeunes le lendemain.

Au deuxième jour, une colonie de la souche réceptrice et une colonie de chaque souche

donatrice ont été ensemencées séparément dans du bouillon BBL et incubées sous agitation à 37 °C

pendant 4 h. Après incubation, un mélange donatrice-réceptrice a été réalisé dans un rapport 1/5

c’est-à-dire 0,5 mL de culture de la bactérie donatrice additionné à 4,5 mL de culture de la bactérie

réceptrice afin d’optimiser le contact. Ce mélange a été incubé sans agitation à 37 °C pendant 24 h.

Au troisième jour, des milieux sélectifs ont été préparés en incorporant à la gélose Mȕeller

Hinton, l’azide de sodium, le céfotaxime, la gentamicine, l’amikacine à des concentrations finales

respectives de 200 μg/mL, 16 μg/mL, 10 μg/mL et 100 μg/mL. Le mélange souche donatrice et

souche réceptrice a été ensemencé par épuisement sur la moitié des boîtes de sélection et sur l’autre

moitié la souche donatrice et la souche réceptrice ont été ensemencées par dépôt de 4 μL à l’aide

d’une micropipette (Figure 10). Les milieux ont été par la suite incubés à 37 °C pendant 24 h.

Au quatrième jour, les milieux de cultures ont été rétirés de l’étuve pour vérifier s’il y a

croissance des transconjugants. Puis, l’identification des souches transconjugantes a été effectuée

par la spectrométrie de masse MALDI-TOF ainsi que les antibiogrammes des souches

transconjugante, donatrice et réceptrice.

Le cinquième jour, le transfert de la résistance entre la bactérie donatrice et la bactérie

réceptrice a été vérifié en comparant les deux antibiogrammes et en réalisant une PCR

conventionnelle pour la recherche des gènes blaCTX-M-1 et aac(6’)Ib codant respectivement pour la

résistance aux β-lactamines et aux aminosides.

2-2-7 Typage moléculaire des souches par le Multi-locus sequence typing

Le typage moléculaire par le MLST a été réalisé pour les espèces Escherichia coli et

Klebsiella pneumoniae en suivant les différentes étapes.

2-2-7-1 Réaction de polymérisation en chaîne

Pour cette réaction, 7 mélanges réactionnels ont été préparés par espèce afin de détecter les 7

gènes de ménage présents chez chaque espèce. Chaque mélange était composé de 12,5 μL de

Quantitect Probe PCR Master Mix, 6,5 μL d’eau ultra pure, 5 μL d’ADN de la souche à étudier et

1μL d’un couple d’amorce sens et anti-sens. L’amplification a consisté en une étape de dénaturation

initiale de l'ADN pendant 15 min à 94 °C. Cette étape a été suivie de 35 cycles d'amplification

comprenant une dénaturation à 94 °C pendant 1 min, une hybridation à 55 °C pendant 50 s, une

élongation à 72 °C pendant 2 min et une étape d’élongation finale de 7 min à 72 °C.

66

Figure 10 : Disposition des souches sur le milieu sélectif

Mélange

Souche réceptrice

(Escherichia coli J 53)

Souche donatrice

E. coli 1417C/12

E. coli 1253C/13

E. coli 1282Y/13

67

2-2-7-2 Electrophorèse des produits de PCR

Les amplicons obtenus ont été déposés sur un gel d'agarose 1,5 % dans une cuve à

électrophorèse contenant du Tris-Borate-EDTA (TBE) 5%. Après 20 min de migration sous une

tension de 135V, le gel a été retiré de la cuve et exposé aux rayons ultra-violets d’un

transilluminateur afin de visualiser les fragments d’ADN.

2-2-7-3 Séquençage

2-2-7-3-1 Purification

Pour purifier les produits de PCR, 100 μL d’eau ultra-pure ont été ajoutés dans la plaque de

PCR contenant les amplicons et le mélange obtenu a été transféré dans une plaque à filtre pour une

filtration sous une pompe à vide pendant 20 min.

Un autre volume de 50 μL d’eau ultra-pure a été ajouté dans la plaque à filtre et celle-ci a été

déposée sur le vibreur automatique de plaques (Heidolph) pendant 20 min.

2-2-7-3-2 PCR-Big Dye et purification des produits de PCR

Pour réaliser la PCR-Big Dye, des amorces de séquençage universelles ayant les séquences

suivantes amorce sens F_ GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA et amorce anti-sens R_

TTGTGAGCGGATAACAATTTC ont été utilisées.

L’amplification a consisté en une étape de dénaturation initiale de l'ADN pendant 5 min à

96°C. Cette étape a été suivie de 25 cycles d'amplification comprenant une dénaturation à 96 °C

pendant 10s, une hybridation à 50°C pendant 5 s, une élongation à 60 °C pendant 3 min. Les

produits de PCR ont été purifiés en utilisant du Sephadex G-50 DNA Grade (Dutscher) et le

séquençage a été effectué dans le sequenceur ABI 3130 xl (Genetic Analyzer).

2-2-7-3-3 Analyse des séquences

Les sites web http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/ et http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/

spécialisés pour l’analyse MLST ont été utilisés afin de déterminer les différentes séquences types

des espèces étudiées.

68

RESULTATS

69

1- Caractères phénotypiques des souches étudiées

1-1 Confirmation de l’identité des souches

Les différentes techniques d’identification utilisées ont permis de confirmer l’identité des

153 souches bactériennes dans les proportions suivantes: 71 souches de Escherichia coli (46,4%),

57 souches de Klebsiella pneunomiae (37,2%), 22 souches de Enterobacter cloacae (14,4%), 2

souches de Citrobacter freundii (1,3%) et 1 souche de Morganella morganii (0,6%).

1-2- Entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre élargi

La production phénotypique de β-lactamases chez les entérobactéries a été mise en évidence

par la synergie (bouchon de champagne) entre les disques d’amoxicilline/acide-clavulanique,

d’aztréonam et de céfotaxime (figure 11). Parmi les 153 entérobactéries testées, 90 ont été

productrices de β-lactamases à spectre élargi, ce qui réprésente un taux de 58,8 % (figure 12). Les

souches productrices de BLSE ont été au nombre 44 souches de E. coli, 31 souches de K.

pneumoniae et 15 souches de E. cloacae. .

1-2-1- Répartition des souches selon les produits biologiques

Les souches bactériennes étudiées ont été isolées de plusieurs produits biologiques tels que

les urines, le sang, le liquide pleural, le liqiude céphalo-rachidien, le liquide d’ascite, le liquide

péritonéal, la salive, les pus, les prélèvements ORL ainsi que de certains dispositifs invasifs tels que

les bouts de sonde. La répartition de l’ensemble des souches et de celles qui étaient productrices de

β-lactamases à spectre élargi (EBLSE) selon les différents produits biologiques et dispositifs

invasifs a été résumée dans le tableau X. Il ressort du tableau que les souches isolées du liquide

d’ascite, du liquide pleural et du prélèvement ORL ont été toutes des souches productrices de

BLSE.

1-2-2 Répartition des souches selon la source de provenance

Les souches bactériennes provenaient de plusieurs services hospitaliers. Le service d’où provenait

le plus grand nombre des souches productrices de BLSE a été le service de diabetologie (100%)

suvi du service d’urologie (81,8%). La répartition des souches selon la source de provenance a été

résumée dans le tableau XI.

70

Figure 11 : Profil de résistance aux antibiotiques d’une souche de Escherichia coli

ATM : aztréonam ; AMC : amoxicilline-acide clavulanique ; CTX : céfotaxime ; CRO : ceftriaxone

Zone d’inhibition sous forme de bouchon de Champagne

ATM AMC CTX

CRO

71

Figure 12 : Répartition des souches productrices de BLSE et non productrices de BLSE

72

Tableau X : Répartition des souches selon les produits biologiques et dispositif invasif

Produits

biologiques et

dispositif invasif

Entérobactéries

testées

(N)

Entérobactéries

productrices de BLSE

(n)

% Entérobactéries


(n/N)*100

Urines 72 46 63,9

Suppurations 32 18 56,2

Sang 20 16 80

Bout de sonde 10 6 60

Crachat 3 1 33,3

Liquide d’ascite 1 1 100

Liquide pleural 1 1 100

Prélèvement ORL 1 1 100

Ecouvillons 3 - -

Aspiration sur

cathéther

1 - -

Expectoration 1 - -

Liquide péritonéale 1 - -

Prélèvement nasal 1 - -

Liquide céphalo-

rachidien

1 - -

Données non

disponibles

5 - -

(-) : pas de souches productrices de BLSE

73

Tableau XI : Répartition des souches selon la source de provenance

Source de provenance Entérobactéries

testées

(N)

Entérobactéries


(n)

% Entérobactéries


(n/N)*100

Consultation externe 37 22 59,5

Pédiatrie 17 10 58,8

Urologie 11 9 81,8

Neurologie 10 8 80

Chirugie 10 5 50

Réanimation 7 5 71,4

Maternité 7 3 42,8

Pneumologie 7 2 28,6

Médecine interne 6 4 66,7

Nephrologie 4 2 50

Traumatologie 4 2 50

Rhumatologie 3 2 66,7

Urgences 3 2 66,7

Orl 3 2 66,7

Obstrétique-gynécologie 3 2 66,7

Diabétologie 2 2 100

Données non disponibles 19 8 42,1

74

1-3 Résistance des souches aux antibiotiques

1-3-1 Résistance des souches aux β-lactamines

Sur l’ensemble des souches testées, le test de sensibilité a montré une résistance élevée aux

céphalosporines respectivement au céfotaxime 85,6 %, au ceftriaxone 81 % et au cefoxitine 80,4 %.

De plus, toutes les souches ont été résistantes à l’amoxicilline et à l’association amoxicilline/acide

clavulanique. Le taux de résistance à l’ertapénème a été de 26,8 % et le E-test à l’imipénème

effectué sur la souche de Morganella morganii qui avait présenté un diamètre d’inhibition de 22

mm a donné une CMI égale à 1mg/L. Ce résultat montre la sensibilté de la souche et par conséquent

définit l’imipénème comme le carbapénème le plus actif sur l’ensemble des souches testées.

Concernant le taux de résistance des souches productrices de BLSE aux céphalosporines, il a

été de 96,7 % au ceftriaxone, 95,6% à la céfotaxime et de 72,2 % à la cefoxitine. Le taux de

résistance aux carbapénèmes principalement à l’ertapénème a été de 31,1 % chez les EBLSE.

1-3-2 Résistance des souches aux aminosides

Concernant la résistance à la famille des aminosides, elle était la plus élevée pour la

gentamicine (80,4 %) et la plus faible pour l’amikacine (8,5 %) chez l’ensemble des souches

testées. Le phénotype sauvage ou sensible à tous les aminosides a représenté 20,3 % de l’ensemble

des souches. Parmi les souches productrices de BLSE, 81 souches ont été résistantes à la

gentamicine soit un taux de 90 % tandis que 9 souches productrices de BLSE ont été résistantes à

l’amikacine soit un taux de 10 %. Le phénotype KGTNt qui correspond à la résistance croisée à la

Kanamycine, gentamicine, tobramycine et nétilmicine a été obtenu chez 48,9% des souches


1-3-3 Résistance des souches aux fluoroquinolones

La ciprofloxacine a été la seule fluoroquinolone utilisée au cours de cette étude. Parmi les

153 entérobactéries testées, 124 souches ont été résistantes à cet antibiotique, ce qui représente un

taux de 81 %. Par ailleurs, parmi les souches productrices de BLSE, 78 (86,7 %) ont été résistantes

à la ciprofloxacine.

1-3-4 Résistance des souches aux autres antibiotiques

Toutes les souches testées ont été sensibles à la colistine tandis que 25, 132 et 153 souches

ont été résistantes respectivement à la fosfomycine, au cotrimoxazole et à la rifampicine.

75

Toutes les souches résistantes à la fosfomycine étaient des BLSE soit un taux de 27,8 % et

toutes les souches productrices de BLSE ont été résistantes à la rifampicine. Le taux de résistance

des EBLSE au cotrimoxazole a été de 88,9 %.

1-4 Résistance des différentes souches productrices de BLSE aux antibiotiques

1-4-1 Résistance des souches de Escherichia coli aux antibiotiques

L’analyse des résultats du test de sensibilté aux antibiotiques a montré que pour les

antibiotiques de la famille des β-lactamines, 100 % des souches de E. coli ont été résistantes à

l’association amoxicilline-acide clavulanique. Le taux de résistance aux céphalosporines était de

63,6 %, 98 % et 100 % respectivement pour la céfoxitine, la cefotaxime et le ceftriaxone. Toutes les

souches ont été sensibles à l’imipénème mais 27,3 % des souches ont été résistantes à l’ertapénème.

Concernant la famille des aminosides, le taux de résistance à l’amikacine a été de 13,8 % tandis que

91 % des souches ont été résistantes à la gentamicine. Le taux de résistance à la ciprofloxacine a été

de 95,4 % (tableau XII).

1-4-2 Résistance des souches de Klebsiella pneumoniae aux antibiotiques

Le taux de résistance des souches de K. pneumoniae a été de 71 % pour la céfoxitine et 96,8

% pour la cefotaxime et le ceftriaxone respectivement. Dans cette espèce également, toutes les

souches ont été sensibles à l’imipénème ; cependant 35,5 % des souches ont été résistantes à

l’ertapénème. Le taux résistance des souches de K. pneumoniae a été de 100 % à l’amoxicilline-

acide clavulanique. Concernant la famille des aminosides, le taux de résistance à l’amikacine a été

de 6,4 % et celui à la gentamicine a été de 96,8 %. Par ailleurs, le taux de résistance à la

ciprofloxacine a été de 74,2 % (tableau XIII).

1-4-3 Résistance des souches de Enterobacter cloacae aux antibiotiques

Le taux de résistance des souches de E. cloacae a été 100 % pour l’amoxicilline-acide

clavulanique et la céfoxitine tandis que 86,7 % des souches ont été résistantes à la céfotaxime et au

ceftriaxone. Toutes les souches ont été sensibles à l’imipénème cependant 33,3 % des souches ont

été résistantes à l’ertapénème.

Concernant les aminosides, le taux de résistance a été de 73,3 % et 6,7 % respectivement

pour la gentamicine et l’amikacine. Par ailleurs, Le taux de résistance à la ciprofloxacine a été de

86,7 % (tableau XIV).

76

Tableau XII : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de Escherichia coli productrices de

BLSE

Familles Antibiotiques Escherichia coli

Nombre de

souches

BLSE

Nombre de

Souches

résistantes

Nature de la

résistance

Pénicillines

Amoxicilline 44 44 100 acquise

Amoxicilline-

acide

clavulanique 44 44 100

acquise

Tircalline-acide


acquise

Céphalosporines

Céfotaxime 44 43 98 acquise

Ceftriaxone 44 44 100 acquise

Cefoxitine 44 28 63,6 acquise

Aminosides Amikacine 44 6 13,6 acquise

Gentamicine 44 40 91 acquise

Carbapénèmes Imipenème 44 0 0

Ertapénème 44 12 27,3 acquise

Quinolones Ciprofloxacine 44 42 95,4 acquise


Sulfaméthoxazole 44 40 91

acquise

Mono-bactame Aztréonam 44 44 100 acquise

Acides

fosfoniques Fosfomycine

44 1 2,3

acquise

Polymyxines Colistine 44 0 0 acquise

Rifamycines Rifampicine 44 44 100 acquise

Pourcentage

77

Tableau XIII : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de Klebsiella pneumoniae


Familles Antibiotiques Klebsiella pneumoniae

Nombre de

souches

BLSE

Nombre de

Souches

résistantes

Nature de la

résistance

Pénicillines

Amoxicilline 31 31 100 naturelle

Amoxicilline-

acide


Acquise

Tircalline-acide


Acquise

Céphalosporines

Céfotaxime 31 30 96,8 Acquise

Ceftriaxone 31 30 96,8 Acquise

Cefoxitine 31 22 71 Acquise

Aminosides Amikacine 31 2 6,4 Acquise

Gentamicine 31 30 96,8 Acquise

Carbapénèmes Imipenème 31 0 0

Ertapénème 31 11 35,5 Acquise

Quinolones Ciprofloxacine 31 23 74,2 Acquise


Sulfaméthoxazole 31 28 90,3

Acquise

Mono-bactame Aztréonam 31 29 93,5 Acquise

Acides


31 18 58,1

Acquise

Polymyxines Colistine 31 0 0 Acquise

Rifamycines Rifampicine 31 31 100 Acquise

Pourcentage

78

Tableau XIV : Taux de résistance aux antibiotiques des souches de Enterobacter cloacae


Familles Antibiotiques Enterobacter cloacae

Nombre de

souches

BLSE

Nombre

Souches

résistantes

Nature de la

résistance

Pénicillines

Amoxicilline 15 15 100 naturelle

Amoxicilline-

acide

clavulanique 15 15 (100)

naturelle

Tircalline-acide

clavulanique 15 14 93,3

acquise

Céphalosporines

Céfotaxime 15 13 86,7 acquise

Ceftriaxone 15 13 86,7 acquise

Cefoxitine 15 15 100 naturelle

Aminosides Amikacine 15 1 6,7 acquise

Gentamicine 15 11 73,3 acquise

Carbapénèmes Imipenème 15

Ertapénème 15 5 33,3 Acquise

Quinolones Ciprofloxacine 15 13 86,7 Acquise


Sulfaméthoxazole 15 12 80

acquise

Mono-bactame Aztréonam 15 13 86,7 acquise

Acides


15 6 40

acquise

Polymyxines Colistine 15 0 0 acquise

Rifamycines Rifampicine 15 15 100 acquise

Pourcentage

79

2- Caractères génotypiques des souches étudiées

2-1 Gènes de résistances aux β-lactamines détectés

L’amplification des gènes de résistance aux β-lactamines par la PCR en temps réel a montré

que les souches produtrices de BLSE et certaines qui étaient résistantes aux céphalosporines

possèdaient les gènes de résistance aux β-lactamines suivants blaCTX-M, blaTEM et blaSHV. Cependant

aucune des souches n’a hébergé le gène blaOXA-48 (figure 13). La détection des gènes de résistance

aux β-lactamines par PCR conventionnelle chez les souches positives à la PCR en temps réel a

montré que 95 souches hébergeaient le gène blaCTX-M1 contre 5 souches qui possédaient le gène

blaCTX-M9. Les gènes de résistance blaTEM et blaSHV ont été détectés respectivement chez 84 souches

et 40 souches (figure 14).

Chez les 90 souches productrices de BLSE les gènes de résistance aux β-lactamines ont été

présents à des taux variables. En effet, le gène blaCTX-M-1 a été détecté chez 87 souches, soit un taux

de résistance de 96,7 % contre 5 souches qui ont hébergés le gène blaCTX-M-9 pour un taux de 5,6 %.

Le gène blaTEM a été présent à un taux de 67,8 % chez 61 souches et le gène blaSHV a été retrouvé

chez 25 souches pour un taux de 27,8 %.

La répartition des gènes de résistance aux β-lactamines entre les différentes espèces

bactériennes a montré que le gène blaCTX-M-1 a été le plus représenté chez l’espèce E. coli à un taux

de 47,8 % suivi des espèces K. pneumoniae et E. cloacae à des taux respectifs de 34,4 % et 14,4 %.

Tout comme le gène blaCTX-M-1, le gène blaCTX-M-9 a été le plus retrouvé chez l’espèce E. coli à un

taux de 4,4 % suivi de l’espèce E. cloacae à un taux de 1,1%. Cependant, aucune des souches de K.

pneumoniae n’a hébergé ce gène. A propos du gène blaTEM, 30 % des souches de K. pneumoniae

avaient ce gène contre 26,7 % des souches de E. coli et 11,1% des souches de E. cloacae. Par

ailleurs, le gène blaSHV a été détecté le plus chez l’espèce K. pneumoniae à 25,6 % contre 1,1 %

respectivement chez les espèces E. coli et E. cloacae (tableau XV).

2-2 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines

La coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines chez les entérobactéries

productrices de β-lactamases à spectre élargi a montré que 59 souches (65,6%) qui avaient le gène

blaCTX-M-1 hébergeaient également le gène blaTEM. Parmi ces souches, il y avait 27 souches de K.

pneumoniae, 22 souches de E. coli et 10 souches de E. cloacae.

Les gènes blaCTX-M-1 et blaSHV ont été exprimés par 25 souches dont 23 souches de K.

pneumoniae, 1 souche de E. coli et 1 souche de E. cloacae. Par ailleurs, les trois gènes blaCTX-M1,

blaTEM et blaSHV ont été exprimés par 23 souches (25,6%) dont 21 souches de K. pneumoniae, 1

souche de E. coli et 1 souche de E. cloacae.

80

A B

C D

Figure 13 : Courbes réprésentant les gènes de résistantes aux β-lactamines détectés par la PCR en

temps réel

A : couleur bleu = gènes blaTEM; couleur rouge = témoin positif

B : couleur bleu = gènes blaSHV ; couleur rouge = témoin positif

C : couleur bleu = gènes blaCTX-M ; couleur rouge = témoin positif

D : couleur rouge = témoin positif, pas de gène blaOXA-48

81

Figure 14 : Profil électrophorétique des amplicons du gène blaTEM

M : marqueur de poids moléculaire (DNA Ladder 100 Pb, Promega), pb : paire de bases, T-:

témoin négatif, T+ : témoin positif

2645 pb

222 pb 861 pb

(gène blaTEM)

861 pb

(gène blaTEM)

82

Tableau XV : Répartition des gènes de résistance aux β-lactamines entre les souches productrices

de BLSE

Gènes de résistance

Souches BLSE (N=90)

E. coli

K. pneumoniae

E. cloacae

blaCTXM-1 43 (47,8) 31 (34,4) 13 (14,4)

blaCTXM-9 4 (4,4) - 1(1,1)

blaTEM 24 (26,7) 27 (30) 10 (11,1)

blaSHV 1 (1,1) 23 (25,6) 1 (1,1)

blaOXA-48 - - -

- : pas de gène détecté

83

Parmi les 5 souches qui avaient le gène blaCTX-M9, 3 souches (3,3%) dont 2 souches de E. coli

et 1 souche de K. pneumoniae ont exprimé les deux gènes blaCTX-M9 et blaTEM tandis qu’une seule

souche de E. cloacae a exprimé les trois gènes blaCTX-M9, blaTEM et blaSHV. Deux souches dont 1

souche de E. coli et 1 souche de E. cloacae ont exprimé les gènes blaCTX-M-1 et blaCTX-M-9.

Cependant, tous les gènes de résistance aux β-lactamines c’est-à-dire, blaCTX-M1, blaCTX-M9, blaTEM,

blaSHV ont été exprimés par une seule souche de E. cloacae (tableau XVI).

2-3 Gènes de résistance aux aminosides détectés

Les gènes de résistance aux aminosides de type aac(6′)-Ib, ant(2′′)-I, aad, qui ont été

détectés au cours de cette étude ont été recherchés chez toutes les souches résistantes aux

aminosides. Ces gènes ont été obtenus à des taux variables. Ainsi, le gène aac(6′)-Ib a été retrouvé

chez 69 souches (56,1%) contre 9 souches (7,3%) qui hébergeaient le gène ant(2′′)-I. Quant au gène

aad, il a été détecté chez 15 souches, ce qui represente un taux de 12, 2 % (Figure 15).

Chez les souches productrices de BLSE, le gène aac(6′)-Ib a été détecté chez 53 souches

dont 48 souches résistantes à la gentamicine et 5 souches résistantes à l’amikacine, ce qui représente

un taux de 58,9 %. Le gène ant(2′′)-I a été détecté chez 8 souches (8,9%) qui ont été toutes

résistantes à la gentamicine et deux résistantes à l’ amikacine. Quant au gène aad, il a été detecté

chez 7 souches (7,8 %) dont une seule résistante à l’amikacine et les 7 à la gentamicine. Toutefois,

aucune souche n’a hébergé les gènes aph(3)-VI et aac (3)-Ia.

2-4 Coexpression des gènes de résistance aux aminosides

La coexpression des gènes de résistance aux aminosides chez les entérobactéries productrices de β-

lactamases à spectre élargi a montré que 5 souches qui avaient le gène aac(6′)-Ib hébergeaient

également le gène ant(2′′)-I. Les gènes aac(6′)-Ib et aad 2 ont quant à eux été exprimés par 3

souches. Et une seule souche hébergeait les gènes ant(2′′)-I et aad 2 (Tableau XVII).

2-5 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides

Il ressort de l’analyse que 53 souches (58,9%) dont 23 souches de E. coli, 20 souches de K.

pneumoniae et 10 souches de E. cloacae ont exprimé simultanément les gènes blaCTXM-1 et aac(6′)-

Ib contre une seule souche de E. coli qui a exprimé les gènes blaCTXM-9 et aac(6′)-Ib. Les gènes

blaCTXM-1 et ant(2′′)-I ont quant à eux été exprimés par 7 souches dont 5 souches de E. coli et 2

souches de K. pneumoniae. De même, les gènes blaCTXM-1 et aad ont été exprimés par 7 souches

dont 4 souches de E. coli et 3 souches de K. pneumoniae. Cependant aucune souche n’a exprimé

tous les gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides (tableau XVIII).

84

Tableau XVI : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines chez les EBLSE


Souches BLSE (N=90)

E. coli E. cloacae K. pneumoniae Total Taux (%)

blaCTXM-1, blaTEM 22 10 27 59 65,6

blaCTXM-1, blaSHV 1 1 23 25 27,8

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV 1 1 21 23 25,6

blaCTXM-9, blaTEM 2 - 1 3 3,3

blaCTXM-9, blaTEM, blaSHV - 1 - 1 1,1

blaCTXM-1, blaCTXM-9 1 1 - 2 2,2

blaCTXM-1, blaCTXM-9, blaTEM, blaSHV - 1 - 1 1,1

- : pas de coexpression

85

Figure 15 : Profils électrophorétiques des amplicons des gènes aac (6)-I, aad et ant (2")-I

A : Profil électrophorétique des amplicons du gène aac (6)-I. B : Profil électrophorétique des

amplicons du gène aad. C : Profil électrophorétique des amplicons du gène ant (2")-I.

524 pb

gène aac (6)-I

812 pb

gène aad

394 pb

gène ant (2")-I

524 pb

gène aac (6)-I

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A

B

C

86

Tableau XVII : Coexpression des gènes de résistance aux aminosides


Souches productrices de BLSE (N=90)

E. coli E. cloacae K. pneumoniae Total Taux

(%)

aac (6′)-Ib, ant (2")-I 5 - - 5 5,6

aac (6′)-Ib, aad2 2 - 1 3 3,3

ant (2")-I , aad1 - - 1 1 1,1

- : pas coexpression

87

Tableau XVIII : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux aminosides chez les

souches productrices de BLSE




(%)

blaCTXM-1, aac (6′)-Ib 23 10 20 53 58,9

blaCTXM-1, blaTEM, aac (6′)-Ib 9 7 17 33 36,7

blaCTXM-1, blaSHV, aac (6′)-Ib - - 15 15 16,7

blaCTXM-1,blaTEM, blaSHV, aac(6′)Ib - - 14 14 15,6

blaCTXM-1, ant (2′′)-I 5 - 2 7 7,8

blaCTXM-1, blaTEM, ant (2′′)-I 1 - 2 3 3,3

blaCTXM-1, blaSHV, ant (2′′)-I - - 1 1 1,1

blaCTXM-1,blaTEM,blaSHV, ant (2′′)I’ - - 1 1 1,1

blaCTXM-1, aad 4 - 3 7 7,8

blaCTXM-1, blaTEM, aad 3 - 3 6 6,7

blaCTXM-1, blaSHV, aad - - 3 3 3,3

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, aad - - 3 3 3,3

blaCTXM-9, aac (6′)-Ib 1 - - 1 1,1

blaCTXM-9, blaTEM, ant (2′′)-I 1 - - 1 1,1


88

2-6 Gènes de résistance aux fluoroquinolones détectés

La recherche des gènes de résistance aux fluoroquinolones qnrA et qnrB a montré que 46,8

% des souches résistantes à la ciprofloxacine, soit 58 souches, ont hébergé ces gènes. Chez les

souches productrices de BLSE, 42,2% (38 souches) ont hébergé le gène qnr B tandis que 3,3% (3

souches) possédaient le gène qnr A.

2-7 Coexpression des gènes de résistance aux fluoroquinolones

Parmi les 38 souches productrices de BLSE qui ont hébergé les gènes qnrB, seulement trois ont

hébergé simultanémént les gènes qnrB et qnrA.

2-8 Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones

La coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones a montré

que 42,2 % des souches dont 7 souches de E. coli, 12 souches de E. cloacae et 19 souches de K.

pneumoniae ont exprimé les gènes blaCTXM-1 et qnrB. Les gènes blaCTXM-1, blaTEM et qnrB ont été

exprimés par 29 souches au nombre desquelles, 3 souches de E. coli, 9 souches de E. cloacae et 17

souches de K. pneumoniae. Seulement 17 souches de K. pneumoniae ont exprimé les gènes blaCTXM-

1, blaSHV, et qnrB tandis que 15 souches de K. pneumoniae ont exprimé les gènes blaCTXM-1, blaTEM,

blaSHV et qnrB. Trois souches de E.coli ont hébergé les gènes blaCTXM-1 et qnrA et parmi ces souches

2 ont exprimé les gènes blaCTXM-1, blaTEM et qnrA (Tableau XVIII).

2-9 Coexpression des gènes de résistance aux trois familles d’antibiotiques

La coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux

fluoroquinolones représentés par les gènes blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, aac(6′)-Ib, qnrB a été la plus

marquée chez l’espèce K. pneumoniae. En effet, 13 souches de K. pneumoniae ont exprimé ces

gènes simultanément, ce qui représente un taux de 14,4% et parmi ces souches, une seule souche a

exprimé les gènes blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, aac(6′)-Ib, qnrB, aad (tableau XIX).

2-10 Coexpression des gènes de résistance selon la source de provenance des souches

La coexpression des gènes de résistance aux antibiotiques chez les souches productrices de

BLSE a montré que 59 souches provenant la consultation externe et de la pédiatrie ont hébergé les

gènes de résistance aux β-lactamines que sont les gènes blaCTXM-1, blaTEM. Par ailleurs, 53 souches

provenant des services de la consultation externe et de la neurologie ont hébergé les gènes de

résistance aux β-lactamines et aux aminosides que sont les gènes blaCTXM-1, aac(6′)Ib.

89

Tableau XIX : Coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones

Gènes



(%)

blaCTXM-1, qnrB 7 12 19 38 42,2

blaCTXM-1, blaTEM, qnrB 3 9 17 29 32,2,

blaCTXM-1, blaSHV, qnrB - - 17 17 18,9

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV,

qnrB

- - 15 15 16,7

blaCTXM-1, qnrA 3 - - 3 3,3

blaCTXM-1, blaTEM, qnrA 2 - - 2 2,2


90

Tableau XX : Coexpression des gènes de résistance aux trois familles d’antibiotiques

Gènes Souches productrices de BLSE (N=90)

E. coli E. cloacae K. pneumoniae Total Taux (%)

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, qnrB,

aac(6′)-Ib,

- - 13 13 14,4

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, qnrB,

aad, aac (6′)-Ib,

- - 1 1 1,1


91

Les gènes de résistance aux β-lactamines et aux fluoroquinolones que sont les gènes blaCTXM-1 et qnr

B ont été exprimés simultanément chez 38 souches et les services les plus concernés ont été la

consultation externe et la neurologie (tableaux XX1).

3- Gènes de résistance identifiés après séquençage

Les gènes de résistance aux β-lactamines (blaCTX-M-1, blaTEM, blaSHV, blaCTX-M-9), aux

aminosides (aad, ant (2′′)-I) et aux fluoroquinolones (qnr B et qnr A) détectés chez les souches

productrices de BLSE ont été séquencés. Après le séquençage, la correction des séquences par le

logiciel Chromaspro et le blast dans la base de données ARG-ANNOT, plusieurs gènes ont été

identifiés. Les gènes blaTEM-191, blaTEM-104 et blaTEM-198 ont été identifiés respectivement chez 12

souches (19,7 %), 10 souches (16,4 %) et 3 souches (5 %).

Par ailleurs, les gènes blaSHV identifiées ont été : blaSHV-12 (2 souches), blaSHV-27 (1 souche),

blaSHV-100 (8 souches), blaSHV-83 (1 souche), blaSHV-89 (2 souches), blaSHV-106 (2 souches) et blaSHV-150

(1 souche). Toutefois, les BLSE de type CTX-M ont été les plus répandues avec la présence du

gène blaCTX-M-15 chez 40 souches, blaCTX-M-1 chez 1 souche et blaCTX-M-27 chez 1 souche. Les gènes de

résistance aux fluoroquinolones identifiés ont été qnr A1 chez 3 souches, qnr B1 chez 28 souches,

qnr B6 chez 2 souches et qnr B7 chez 1 souche. Quant aux gènes de résistance aux aminosides

aad1 et aad2, ils ont été identifiés respectivement chez 1 et 6 souches. Les gènes de résistance aux

β-lactamines séquencés ont été répartis par espèce dans le tableau XXII et il ressort que le gène

blaCTX-M-15 a été largement répandu chez l’espèce E. coli tandis que les gènes blaSHV et blaTEM ont été

plus retrouvés chez l’espèce K. pneumoniae.

3-1- Mise en évidence des différentes mutations dans les séquences protéiques

3-1-1 Alignement des séquences protéiques des β-lactamases de type Temoneira

Les séquences protéiques des gènes blaTEM-104, blaTEM-198 et blaTEM-191 ont été alignées avec la

séquence protéique du gène blaTEM-1. Des mutations par substitution homologues, ont été observées

dans les protéines TEM-104 et TEM-198. Ces mutations par substitution ont été trouvées en

posistion 262 avec l’acide aspartique (D) dans la protéine TEM 1 remplacé par la thréonine (T) au

niveau des protéines TEM-104 et TEM-198. La figure 16 met en évidence la mutation par

substitution observée dans la protéine TEM-104. Cette substitution, notée, D262T a été due à la

délétion d’une cytosine en position 782 au niveau des séquences nucléotidiques des gènes blaTEM-104

et blaTEM-198 (Annexe 2).

92

Tableau XXI : Coexpression des gènes de résistance selon la source de provenance

Gènes Nombre de souches


Services hospitaliers plus

concernés

blaCTXM-1, blaTEM 59 Consultation externe/ Pédiatrie

blaCTXM-1, aac(6′)Ib 53 Consultation externe/ Neurologie

blaCTXM-1, qnr B 38 Consultation externe/ Neurologie

blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV 23 Urologie


aac(6′)Ib 14 Urologie


aac(6′)Ib, qnrB

13 Consultation externe

93

Tableau XXII : Répartition des gènes de résistance aux β-lactamines identifiés selon les espèces

Gènes


E. coli K. pneumoniae E. cloace Total

bla CTXM-15 22 10 8 40

bla CTXM-1 1 - - 1

bla CTXM-9 1 - -

bla TEM-198 1 1 1 3

bla TEM-191 3 5 4 12

bla TEM-104 3 7 - 10

bla SHV-106 - 2 - 2

bla SHV-83 - 1 - 1

bla SHV-27 - 1 - 1

bla SHV-89 - 2 - 2

bla SHV-100 - 8 - 8

bla SHV-12 - 1 1 2

bla SHV-150 - 1 - 1

- : absence de gène

94

TEM-1 1 MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNS TEM-104 1MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNS TEM-1 GKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLV

TEM-104 GKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLV

TEM-1 EYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHN

TEM 104 EYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHN

TEM-1 MGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASR

TEM 104 MGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMPAAMATTLRKLLTGELLTLASR

TEM-1 QQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPD

TEM104 QQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAALGPD

TEM-1 GKPSRIVVIYTDG 263

TEM 104 GKPSRIVVIYTTG 263

Figure 16 : Mutation dans la séquence protéique TEM 104

95

En outre, l’alignement des séquences protéiques TEM 1 et TEM 191 a montré une mutation

par substitution à la position 255 dans la protéine TEM 191. Cependant, cette mutation se situait à

la position 189 dans la protéine TEM 1 (Figure 17). En effet, au niveau de l’alignement des

protéines TEM 1 et TEM 191, l’appariemment a été effectué entre le premier acide aminé de la

protéine TEM 1 et l’acide aminé en position 68 dans la protéine TEM 191. Ainsi, l’acide

glutamique en position 189 dans la séquence protéique TEM 1 a été remplacé par la lysine en

position 255 dans la séquence protéique TEM 191.

3-1-2 Alignement des séquences protéiques des β-lactamases de type Sulfhydryl variable

En vue de faire ressortir les éventuelles mutations, les séquences protéiques des gènes

blaSHV-83 et blaSHV-89 ont été alignées avec la séquence protéique du gène blaSHV-1 tandis que les

séquences protéiques des gènes blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-100 et blaSHV-106 ont été alignées avec la

séquence protéique du gène blaSHV-2. Cependant, en consultant la table SHV sur le site internet

http://www.lahey.org/Studies/, le gène blaSHV-150 n’est associé à aucun sous-groupe. De ce fait, la

recherche de mutations n’a pas été effectuée.

3-1-2-1 Alignement des séquences protéiques SHV-1 et SHV-89

L’alignement des séquences protéiques SHV-1 et SHV-89 a montré deux mutations par

substitution. La première substitution a été trouvée à la position 31 avec la leucine (L) dans la

protéine SHV-1 remplacée par la glutamine (Q) dans la protéine SHV-89. Cette substitution, notée

L31Q est due au remplacement d’une thymine en position 92 dans la séquence nucléotidique du

gène blaSHV-1 par une adénine dans celle du gène blaSHV-89.

La deuxième mutation a été la substitution de la méthionine (M) en position 125 dans la

protéine SHV-1, par la valine (V) dans la protéine SHV-89 (Figure 18). Au niveau de la séquence

nucléotidique du gène blaSHV-1, l’adénine en position 373 a été remplacée par la guanine dans la

séquence nucléotidique du gène blaSHV-89 (Annexe 3). Par ailleurs, l’alignement des séquences

protéiques SHV-1 et SHV-83 n’a montré aucune mutation.


Les séquences protéiques de SHV-2 et SHV-12 ont été alignées et deux mutations par

substitution ont été mises en évidence (Figure 19).

La première mutation correspond à la substitution de la leucine (L) en position 31 dans

SHV-2 par la glutamine (Q) dans SHV-12. Cette substitution, notée L31Q est due au niveau

nucléotidique, au remplacement d’une thymine en position 92 dans le gène blaSHV-2 par une adénine

dans le gène blaSHV-12.

96

TEM-1 68 METMETSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEK TEM-191 1 METMETSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVEYSPVTEK TEM-1 HLTDGMETTVRELCSAAITMETSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMET

TEM-191 HLTDGMETTVRELCSAAITMETSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMET

TEM-1 GDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMETPAAMETATTLRKLLTGELLTL

TEM-191 GDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTMETPAAMETATTLRKLLTGELLTL

TEM-1 ASRQQLIDWMETEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGERGSRGIIAAL

TEM-191 ASRQQLIDWMETEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGAGKRGSRGIIAAL

TEM-1 GPDGKPSRIVVIYT 279

TEM-191 GPDGKPSRIVVIYT 212

Figure 17 : Mutation dans la séquence protéique TEM 191

97

SHV 1 1 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRT SHV-89 1 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKQSESQLSGRVGMIEMDLASGRT SHV 1 LTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDY

SHV-89 LTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDY

SHV 1 SPVSEKHLADGMTVGELCAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIG

SHV-89 SPVSEKHLADGMTVGELCAAITVSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIG

SHV 1 DNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQ

SHV-89 DNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQ

SHV 1 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGAGERGARGIVALLGPNNKAE

SHV-89 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGAGERGARGIVALLGPNNKAE

SHV 1 RIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286

SHV-89 RIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286

Figure 18 : Mutations dans la séquence protéique SHV-89

98

SHV-2 1 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTL

SHV-12 1MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKQSESQLSGRVGMIEMDLASGRTL

SHV-2 TAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYS


SHV-2 PVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQI

SHV-12 PVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQI

SHV-2 GDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQR

SHV-12 GDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQR

SHV-2 QLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASERGARGIVALLGPNNK

SHV-12 QLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASKRGARGIVALLGPNNK

SHV-2 AERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286

SHV-12 AERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286


99

Concernant la deuxième mutation, l’acide glutamique (E) en position 235 dans SHV-2 a été

remplacé par la lysine (K) dans SHV-12 et la mutation a été notée E235K. Dans la séquence

nucléotidique du gène blaSHV-2, c’est la guanine en position 703 qui a été remplacée par une adénine

dans celle du gène blaSHV-12 (Annexe 4)


Deux mutations ont été observées lors de l’alignement des séquences protéiques SHV-2 et

SHV-27. La première mutation a été la substitution de la glycine (G) en position 152 dans SHV-2

par l’acide aspartique (D) dans SHV-27. Cette mutation est due à la substitution d’une guanine en

position 455 dans la séquence nucléotidique du gène blaSHV-2 par une adénine dans le gène blaSHV-27.

La deuxième mutation a été une substitution de la serine (S) en position 234 dans SHV-2 par

la glycine (G) dans SHV-12 (Figure 20). Au niveau de l’alignement des séquences nucléotidiques,

l’adénine en position 700 dans le gène blaSHV-2 a été remplacée par une guanine dans la séquence du

gène blaSHV-27 (Annexe 5).


L’alignement des séquences protéiques SHV-2 et SHV-100 a montré trois mutations dont

deux mutations par substitution et une mutation par insertion. La première mutation a été la

substitution de la tyrosine (Y) à la position 3 dans la protéine SHV-2 par la phénylalanine (F) dans

la protéine SHV-100. Cette mutation, notée Y3F, est due au niveau nucléotidique à la substitution

d’une adénine en position 8 dans la séquence nucléotidique du gène blaSHV-2 par une thymine dans

celle du gène blaSHV-100.

La deuxième mutation a été une insertion de 13 acides aminés à la position 44 dans la

séquence protéique SHV-100. Au niveau de l’alignement nucléotidique, ce sont 39 bases azotées

qui ont été insérées à la position 96 dans la séquence du gène blaSHV-100 (Annexe 6). Cette insertion

a entrainé une troisième mutation à la position 234 de la protéine SHV-2 mais qui correspond à la

position 247 dans la protéine SHV-100 (Figure 21).


L’alignement des séquences protéiques SHV-2 et SHV-106 a mis en évidence une mutation

par substitution. Celle-ci se situe à la position 3 dans la protéine SHV-2 avec le changement de la

tyrosine (Y) par la phénylalanine (F) dans la protéine SHV-106 (Figure 22). Cette mutation, notée

Y3F, est due au niveau nucléotidique à la substitution d’une adénine en position 8 dans la séquence

nucléotidique du gène blaSHV-2 par une thymine dans celle du gène blaSHV-106.

100





SHV-2 PVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIG

SHV-27 PVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQID



SHV-2 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASERGARGIVALLGPNNKAE

SHV-27 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGAGERGARGIVALLGPNNKAE




101

SHV-2 1 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIE----------------

SHV-100 1 MRFIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIESESQLSG

SHV-2 ------------MDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQ

SHV-100 RVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQ

SHV-2 LERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLA

SHV-100 LERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLA

SHV-2 TVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATL

SHV-100 TVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATL

SHV-2 RKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASE

SHV-100 RKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGAGE

SHV-2 RGARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR SHV-100 RGARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR


102


SHV-106 MRFIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTL







SHV-2 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASERGARGIVALLGPNNKA

SHV-106 LLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADKTGASERGARGIVALLGPNNKA

SHV-2 ERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286

SHV-106 ERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 286

Figure 22 : Mutation dans la séquence protéique SHV-106

103

4- Transfert de la résistance par conjugaison

Afin de déterminer le support génétique de la résistance aux antibiotiques et la possibilité du

transfert de plasmides, l’expérience de conjugaison a été réalisée. Parmi les 3 souches sélectionnées,

une souche a transféré la résistance aux antibiotiques à la souche réceptrice E. coli J53. La figure

23 montre la sélection de la souche transconjugante sur le milieu Müeller Hinton additionné de

l’azide de sodium, du ceftriaxone, de l’amikacine et de la gentamicine.

L’identification de la souche transconjugante par la spectrométrie de masse MALDI-TOF a

montré qu’il s’agit d’une souche de E. coli. Les antibiogrammes de la souche donatrice, réceptrice

et de la souche transconjugante qui ont été effectués ont montré le transfert de la résistance aux

céphalosporines de troisième génération, à la gentamicine et la production de BLSE (Figure 24).

Les résultats de la PCR conventionnelle ont montré que la souche transconjugante hébergeait les

mêmes gènes de résistance aux β-lactamines (blaCTX-M-1) et aux aminosides (aac(6’)-Ib) que la

souche donatrice (Figure 25).

5- Identification de gènes de résistance à la rifampicine

Le gène de résistance à la rifampicine arr2 a été recherché chez toutes les souches étudiées

car elles ont présenté toutes une résistance à la rifampicine. Le profil électrophorétique des

amplicons obtenus a montré que 4 souches, soit un taux de 4,4 %, ont hébergé ce gène (Figure 26).

Au nombre de ces souches, il y’a 3 souches de K. pneumoniae et 1 souche de E. coli.

La recherche de la relation clonale entre les 4 souches par la technique du MLST a montré

qu’elles ont différentes séquences types ou ST. La ST 5 a été trouvée chez la souche de E.coli et les

trois souches de K. pneumoniae ont exprimé respectivement les ST 273, ST 307, ST 309. La figure

27 montre le profil électrophorétique des 7 gènes de ménage des espèces E. coli et K. pneumoniae

qui ont permis de déterminer les différentes ST.

104

Figure 23 : Sélection de souches transconjugantes sur le milieu Müeller Hinton modifié

Souche

transconjugante

Dépôt de la

souche réceptrice Dépôt de

la souche

donatrice

105

Figure 24 : Antibiogrammes des souches donatrice, réceptrice et transconjugante

= +

=

A = Souche donatrice B = Souche réceptrice

C = Souche transconjugante

106

Figure 25 : Profil électrophorétique des amplicons des gènes aac(6)-Ib et blaCTX-M1

M : marqueur de poids moléculaire (DNA Ladder 100 Pb, Promega) ; SD : souche donatrice ; TR :

transconjuguant ; T+ : témoin positif

524 pb

gène

aac(6)Ib

gène

bla CTXM1

107

Figure 26 : Profil électrophorétique des amplicons du gène arr 2

393 pb :

2645 pb

gène arr 2

gène arr-2

393 pb

108

Figure 27 : Profil électrophorétique des amplicons des 7 gènes de ménage de E. coli et de K.

pneumoniae

E. coli 725YO/15

K.pn1 : K. pneumoniae 868Y/13

K.pn2 : K. pneumoniae 1141Y/15

K.pn3 : K. pneumoniae 654UB/15

Pour l’espèce E. coli, les puits 1 à 7 réprésentent les 7 gènes de ménage que sont les gènes adk,

fumC, icd, purA, gyrB, recA et mdh. Pour l’espèce K. pneumoniae, les puits 1 à 7 réprésentent les

7gènes de ménage que sont les gènes rpoB, gapA, mdh, pgi, phoE, inf B et tonB.

2645 pb

2645 pb

109

DISCUSSION

110

La résistance des bactéries, particulièrement des entérobactéries aux antibiotiques, constitue un

véritable problème de santé publique. Cette résistance, affecte aussi bien les pays développés que

surtout les pays en voie de développement où cohabitent l’automédication et la vente anarchique

des médicaments en dehors des structures légales (Aminov, 2010). Dans les pays d’Afrique de

l’Ouest, l'endémicité des infections respiratoires, des méningites bactériennes, des diarrhées et

d’autres maladies infectieuses a augmenté la consommation d’antibiotiques (Hounsa, 2009 ; Alsan

et al., 2015).

L’objectif général de cette étude a consisté à caractériser des gènes de résistance aux

aminosides et aux fluoroquinolones codant pour les acétyltransférases, les nucléotidyltransférases,

les phosphotransférases et les protéines QNR chez des entérobactéries productrices de BLSE dans

le district d’Abidjan. Pour ce faire, le travail a porté sur 153 entérobactéries constituées de

différentes espèces à savoir 71 souches de E. coli, 57 souches de K. pneumoniae, 22 souches de E.

cloacae, 2 souches de C. freundii et 1 souche de M. morganii. Parmi ces souches, certaines ont été

sensibles aux antibiotiques tandis que d’autres ont été multi-résistantes.

La prévalence des entérobactéries productrices de BLSE déterminée dans cette étude

s’élevait à 58,8 %. Ce taux est supérieur à ceux des études antérieures qui ont rapporté des

prévalences de 9 % en 2008 et 56,2 % en 2016 chez des entérobactéries productrices de BLSE en

Côte d’Ivoire (Guessennd et al., 2008a ; Toty et al., 2016). En effet, l’augmentation considérable

de la prévalence des souches productrices de BLSE en Côte d’Ivoire pourrait être expliquée par

l’usage abusif et inadéquat des antibiotiques, principale source d’émergence de la résistance aux

antibiotiques (Sirinavin et al., 2004). Des travaux similaires réalisés dans certains pays de l’Afrique

de l’ouest ont mis en évidence la production de BLSE chez les entérobactéries d’origine humaine à

des taux variables.

Au Bénin, les résultats d’une étude ont montré que 35,5 % d’entérobactéries ont été

productrices de BLSE (Anago et al., 2015). Une autre étude réalisée au Nigeria a montré que 52,1

% d’entérobactéries testées étaient productrices de BLSE (Raji et al., 2015). De même, au Burkina

Faso, les résultats des travaux de Ouedraogo et al. (2016) ont rapporté un taux de 58 %

d’entérobactéries productrices de BLSE.

Par ailleurs, les échantillons biologiques d’où ont été isolées les entérobactéries productrices

de BLSE à des taux élevés ont été le liquide d’ascite, le liquide pleural et un prélèvement d’ORL.

La présence d’entérobactéries productrices de BLSE dans ces échantillons pourrait-être due à

plusieurs facteurs. Dans le cas du liquide d’ascite, l’infection est une complication fréquente au

cours de la cirrhose.

111

La flore intestinale est variable chez les patients atteints de cirrhose et la prévalence des

entérobactéries pathogènes varie de 10 à 30 % (Nousbaum, 2015). Concernant l’infection du

liquide pleural cela pourrait-être dû à des pneumopathies bactériennes causées par divers

microorganismes parmi lesquels, les entérobactéries (Otty, 2016). A propos, de la présence

d’entérobactéries productrices de BLSE dans le prélèvement d’ORL, cela pourrait-être due à des

antibiothérapies antérieures effectuées par certains patients (Amana, 2013).

Par ailleurs, les services d’où provenaient les souches productrices de BLSE à des taux

élevés ont été la diabétologie et l’urologie. Ce résultat pourrait-être dû à certains facteurs tels que la

durée d’hospitalisation, l’utilisation de sondes, l’hémodialyse, une chirurgie récente et

l’antibiothérapie. En effet, nombreuses sont les classes d’antibiotiques dont l’utilisation a été

associée à l’émergence d’entérobactéries productrices de BLSE (Zahar, 2009).

Concernant, le taux de résistance aux céphalosporines de troisième génération que sont le

céfotaxime et le ceftriaxone chez les souches productrices de BLSE, au cours de cette étude, a été

respectivement de 95,6 % et 96,7 %. Ces taux de résistance élevés pourraient ȇtre dus à l’utilisation

fréquente des C3G tels que le céfotaxime et le ceftriaxone dans le traitement d’infections

bactériennes selon Rubin et Samore (2002). Des résultats semblables ont été rapportés dans

certaines études comme celle de Warjri et al. (2015) effectuée en Inde où les taux de résistance des

EBLSE à la céfotaxime et au ceftriaxone ont été respectivement de 97,2 % et 94,9 %. En Algérie,

Mathlouthi et al. (2016) lors de leurs travaux effectués dans des services hospitaliers ont également

rapporté des taux de résistance à la céfotaxime et au ceftriaxone de 97 % et 84 %.

Parmi les β-lactamines, l’imipénème a été la molécule la plus active contre les souches, ce

qui justifie sa place en premier choix dans le traitement des infections sévères à bactéries

multirésistantes (Labombardi et al., 2006 ; Endimiani et Paterson, 2007 ; Nordmann et al.,

2009).

Pour le traitement de certaines infections dues aux entérobactéries, l’utilisation des

aminosides et des fluoroquinolones, le plus souvent en association avec les β-lactamines est

nécessaire (Galimand et al., 2005). Les aminosides agissent sur le ribosome bactérien et induisent

la synthèse de protéines érronées (Touati, 2013). Cependant, leur large utilisation a contribué à

l’émergence de souches résistantes (Galimand et al., 2005).

Dans la présente étude, la résistance aux aminosides chez les entérobactéries productrices de

BLSE a été assez marquée pour la gentamicine et moindre pour l’amikacine. En effet, sur les 90

entérobactéries productrices de BLSE, 81 souches (90 %) ont été résistantes à la gentamicine.et 9

EBLSE (10 %) ont été résistantes à l’amikacine.

112

Cette étude a montré l’éfficacité de l’amikacine par rapport à la gentamicine dans le

traitement des infections bactériennes dues aux entérobactéries productrices de BLSE. En effet,

l’amikacine est un antibiotique réservé à la voie parentérale en raison d’une absorption per os

négligeable (1 à 4% de la dose administrée). Après injection intra-musculaire ou en perfusion intra-

veineux lente de 30 à 60 minutes, l’amikacine diffuse rapidement dans l’organisme. Un passage de

la barrière hématoméningée de l’ordre de 10 à 20 % de la concentration sérique à travers les

méninges saines est noté. Par ailleurs, la posologie adulte et enfant est de 15 mg/kg/j en 2 injections

ou en monodose journalière ce qui conduit à un état d’équilibre au bout de 24 heures. De plus, le

taux de fixation de l’amikacine aux protéines plasmatiques est faible (moins de 10 %) et

l’élimination urinaire est rapide par filtration glomérulaire sous forme inchangée (forme active). La

demi-vie est de 2 à 4 heures chez l’adulte normorénal, et de 3 à 6 heures chez le nourrisson et le

nouveau-né (Lacarelle et al., 2004).

La résistance aux aminosides chez les entérobactéries productrices de BLSE constitue un

véritable problème de santé publique qui affecte plusieurs pays. En effet, les résultats des travaux

d’Anago et al. (2015) effectués au Benin ont montré que 82,7 % des souches productrices de BLSE

ont été résistantes à la gentamicine et 72,4 % des souches étaient résistantes à l’amikacine. Au

Burkina Faso, Ouedraogo et al. (2016) au cours de leurs travaux ont montré que 89 % des souches

productrices de BLSE ont été résistantes à la gentamicine et à d’autres membres de la famille des

aminosides tels que la tobramycine (86 %) et la nétilmicine (88 %). Au Ghana, une étude a rapporté

des taux de résistance élevés à la gentamicine et à l’amikacine respectivement de 90 % et 45 %

(Obeng-Nkrumah et al., 2013). Dans les travaux de Belbel (2014) sur l’espèce K. pneumoniae, les

résultats ont montré que 67,5 % des souches ont été résistantes à la gentamicine et 58,7 % à

l’amikacine.

Concernant les fluoroquinolones, ils exercent leur action au moment de la réplication de

l’ADN. Leurs cibles sont l’ADN gyrase et la topoisomérase IV qui régulent la topologie de l'ADN

pour en permettre la réplication (Soussy, 2006). La résistance aux fluoroquinolones chez les

entérobactéries est en général le résultat d’une mutation chromosomique entraînant une altération

des enzymes cibles bactériennes que sont l’ADN gyrase et la topoisomérase IV (Muylaert et

Mainil, 2013). Toutefois, il a été rapporté également une résistance d’origine plasmidique qui

s’explique par une acquisition des gènes qnr, qepA, et aac(6’)-Ib-cr (Poirel et al., 2007 ; Carottoli,

2009).

Dans le présent travail, le taux de résistance à la ciprofloxacine chez les EBLSE a été de

86,7 %. Ce taux est supérieur à celui obtenu par Guessennd et al. (2008b) qui lors de leurs travaux

ont montré que 70,2 % des EBLSE étaient résistantes à la ciprofloxacine. En 2014, Ouattara et

collaborateurs ont quant à eux rapporté un taux de résistance à la ciprofloxacine de 93,2%.

113

Le taux de résistance élevé pourrait être expliqué par le fait que les fluoroquinolones sont les

molécules les plus prescrites après les β-lactamines en Afrique et particulièrement en Côte d’Ivoire

(Dosso et al., 2000).

Les résultats de la présente étude sont similaires à ceux obtenus par certains auteurs en

Afrique. En République Centrafricaine, les résultats des travaux de Rafai et al. (2015) ont montré

que 84,8 % des souches productrices de BLSE testées ont été résistantes à la ciprofloxacine. Au

Burkina Faso, Ouedraogo et al. (2016) ont rapporté que 80 % des souches productrices de BLSE

ont été résistantes à la ciprofloxacine. De même, Mathlouthi et al. (2016) ont obtenu lors de leurs

travaux 80 % des souches productrices de BLSE résistantes à la ciprofloxacine.

En ce qui concerne les autres antibiotiques comme la rifampicine, les souches ont présenté

un taux de résistance très élevé (100 %). La rifampicine est un antibiotique utilisé dans le traitement

de la tuberculose (Baysarowich et al., 2008) et des maladies liées aux méningococcies (Taha et al.,

2006). Elle inhibe la fonction de l’ARN polymérase en bloquant le passage de l'initiation à

l'élongation au niveau de la transcription (Xu et al., 2005). La résistance à la rifampicine est un

problème de santé publique selon Sam et al. (2006) car c'est le médicament de première ligne pour

traiter la tuberculose (Grosset, 1989) et la prévention des méningites (Taha et al., 2006). La

résistance à la rifampicine initiallement retrouvée chez les espèces Mycobacterium smegmatis,

Mycobacterium tuberculosis a été transférée aux bacilles gram négatif comme les entérobactéries

(Arlet et al., 2001). En Côte d’Ivoire, la résistance à la rifampicine à été signalée depuis plusieurs

décennies chez Mycobacterium dans les travaux de Dosso et al. (1999) et Ouedraogo et al. (2000).

Par ailleurs, le support génétique de la résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux

fluoroquinolones au cours de ce travail a été varié car plusieurs gènes de résistance ont été détectés.

Les gènes de résistance aux β-lactamines détectés ont été les gènes blaCTX-M-1 (96,7 %), blaTEM (67,8

%), blaSHV (27,8 %), et blaCTX-M-9 (5,56 %).

La prédominance du gène blaCTX-M obtenu dans cette étude pourrait expliquer les taux de

résistance élevés aux céphalosporines de troisième génération observés chez les souches

productrices de BLSE. En effet, selon Mathlouthi et al. (2016), l'augmentation de la consommation

de la céfotaxime pourrait avoir contribué à l'émergence de BLSE, et en particulier le CTX-M.

En Côte d’Ivoire, les gènes blaCTX-M-1, blaTEM, blaSHV ont été déjà retrouvés dans les travaux

de Guessennd et al. (2008b) chez 151 entérobactéries productrices de BLSE et les proportions des

gènes blaCTX-M-1, blaTEM et blaSHV étaient respectivement de 65,6 %, 64,9%, et 48,3%. Cette

différence des proportions des gènes entre les études peut-être due au nombre de souches

productrices de BLSE utilisé dans chacune d’entre elles.

114

Les gènes blaCTX-M-15 et blaCTX-M-1 identifiés après séquençage ont déjà été rapportés dans les

travaux de Guessennd et al. (2008) et Breurec et al. (2013). Cependant, cette étude est la première

qui décrit le gène blaCTX-M-27 en Côte d’Ivoire. En effet, la présence de ce gène pourrait-être due à la

dissémination des gènes de résistance entre les bactéries qui serait responsable d’émergence de la

résistance.

Ailleurs, ce gène a été détecté chez des souches de E. coli et de Salmonella livingstone

responsables d’infections nosocomiales et d’épidémie en Tunisie (Bouallègue-Godet et al., 2005),

en France (Bruno et al., 2014) et au Burkina Faso (Ouedraogo et al., 2016).

De même, l’identification des gènes blaTEM-104, blaTEM-191 et blaTEM-198 est la première en Côte

d’Ivoire. Leur présence pourrait expliquer également le taux de résistance élevé aux C3G obtenu

dans cette étude. Cependant, ces gènes ont été déjà rapporté dans certains pays comme la Suisse

(Hilty et al., 2012). Les mutations observées dans ces gènes n’ont pas été décrites. Mais, ces gènes

dérivent du gène blaTEM-1 (Fiett et al., 2000).et

En outre, les gènes blaSHV identifiés ont été les gènes blaSHV-12, blaSHV-27, blaSHV-83, blaSHV-89,

blaSHV-100, blaSHV-106 et blaSHV-150, Le gène blaSHV-12 a été identifié pour la première fois en 1997 en

Suisse (Nuesch-Inderbinen et al., 1997) et plus tard rapporté dans certains pays africains comme la

Côte d’Ivoire (Guessennd et al., 2008b), le Mali (Tande et al., 2010), le Nigeria (Kasap et al.,

2010) indiquant son caractère endémique chez les entérobactéries productrices de β-lactamases à

spectre élargi en Afrique de l’Ouest. Selon Magdalena et al. (1997), les mutations observées dans

le gène blaSHV-12 sont impliquées dans la production de BLSE.

Par ailleurs, l’identification des gènes blaSHV-27, blaSHV-83, blaSHV-89, blaSHV-100, blaSHV-106,

blaSHV-150 est la première en Côte d’Ivoire. Leur présence pourrait expliquer les taux de résistance

élevés aux pénicillines et aux céphalosporines obtenus dans cette étude.

Ailleurs dans le monde, le gène blaSHV-27 a été détecté chez différents plasmides isolés de E.

coli, de K. pneumoniae et de E. cloacae. Il a été détecté simultanément chez ces espèces avec

d’autres gènes de résistance tels que les gènes blaTEM-1, blaCMY-2, blaIMP, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15,

blaSHV-12, blaSHV-45 et blaOXA-1 (Muratani et al., 2006 ; Abbassi et al., 2008 ; Kiratisin et al., 2008).

Les mutations décrites dans ce gène sont impliquées dans l’hydrolyse du céfotaxime (Corkill et al.,

2001).

De même, les gènes blaSHV-83, blaSHV-89, blaSHV-100, blaSHV-106 et blaSHV-150 ont été détectés

chez des souches de K. pneumoniae également dans divers endroits du monde tels que la Chine (Li

et al., 2009), l’Algérie (Ramdani-Bouguessa et al., 2011), les Etats-Unis (Castanheira et al.,

2013) et le Portugal (Mendonça et al., 2009). Les β-lactamases de type SHV-83 et SHV-89 sont

capables d’hydrolyser les pénicillines et les céphalosporines de deuxième génération.

115

En revanche, les β-lactamases de type SHV-12, SHV-27, SHV-100, SHV-106 sont capables

d’hydrolyser les céphalosporines de troisième génération comme le céfotaxime, le ceftazidine et

l’aztréonam qui est une Monobactam (Liakopoulos et al., 2016).

Concernant la coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines, les résultats ont

montré que 23 souches productrices de BLSE ont exprimé simultanément les gènes de résistance

blaCTX-M, blaTEM, blaSHV. Ce résultat est similaire à celui de Raji et al. (2015) dont les travaux au

Nigéria ont montré la coexistence des gènes blaCTX-M, blaTEM et blaSHV chez 6 entérobactéries

productrices de BLSE.

Le support génétique de la résistance aux aminosides a été constitué de plusieurs gènes de

résistance que sont les gènes aac(6′)-Ib, ant(2′′)-I, aad1 et aad2.

Le gène aac(6′)-Ib code pour une acétyltransférase et il a été le plus représenté chez les

souches productrices de BLSE résistantes aux aminosides avec un taux de 58,9%. Ce résultat

pourrait expliquer le taux de résistance à la gentamicine et à l’amikacine obtenu chez les souches

productrices de BLSE dans cette étude. En effet Le gène aac (6')-Ib est un gène plasmidique et

chromosomique qui confère une résistance à l'amikacine et à la gentamicine selon Shaw et al.

(1993). Par ailleurs, ce taux est semblable à celui rapporté dans certaines études comme celle de

Park et al. (2006) réalisée aux Etats-Unis où le gène aac (6')-Ib a été retrouvé chez 50,5 % des

souches productrices de BLSE. De même en Inde, les travaux de Chaudhary et Payasi (2014) ont

montré que 51,7 % des souches productrices de BLSE ont hébergé le gène aac (6')-Ib.

Le gène ant (2′′)-I induit la résistance à la gentamicine, à la tobramycine, à la kanamycine et

est généralement porté par des plasmides et des transposons (Cameron et al., 1986). Cette étude est

la première qui décrit ce gène en Côte d’Ivoire. Le gène ant (2′′)-I code pour une

nucléotidyltransférase et il a été détecté chez 8,9 % des EBLSE résistantes aux aminosides. La

présence de ce gène pourrait expliquer également le taux de résistance à la gentamicine chez les

entérobactéries productrices de BLSE obtenu dans cette étude. Ce taux est inférieur à celui trouvé

en Turquie par Over et al. (2001). Ces derniers, ont rapporté un taux de 46,2 % de souches

productrices de BLSE hébergeant le gène ant (2 ")-I. En Inde, Chaudhary et Payasi (2014) ont

montré la présence du gène ant (2 ")-I chez 20,2% des entérobactéries productrices de BLSE testées

au cours de leur étude.

Concernant les gènes aad1 et aad2, désignés aussi sous le nom de ant (3")-1, ils sont

associés à la résistance à la spectinomycine et à la streptomycine (Ramirez & Tolmasky, 2010). Ils

codent pour des nucléotidyltransférases. Le gène aad1 a été détecté pour la première fois chez

Shigella flexneri isolée au Japon à la fin des années 1950 (Nakaya et al., 1960).

116

En 1989, lorsque les intégrons ont été décrits pour la première fois, ce gène a été associé à

un intégron de classe 1 (Stokes & Hall, 1989). Concernant le gène aad2, il a été détecté pour la

première fois au Japon en 1965 chez une souche clinique de P. aeruginosa (Kazama et al., 1995).

Outre l'intégron de classe 1, le gène aad2 est également présent dans les intégrons complexes de

classe 1 (Boyd et al., 2002 ; Boyd et al., 2008). Cette étude est la première qui rapporte la présence

tous ces gènes de résistance aux aminosides chez les entérobactéries d’origine hospitalière en Côte

d’Ivoire.

Concernant les gènes de résistance aux fluoroquinolones détectés, le gène qnrB a été le plus

trouvé à un taux de 42,2 % suivi du gène qnrA (3,2%) chez les EBLSE. Le séquençage réalisé a

permis d’identifier en plus des gènes gènes qnrA1 (3,3 %) et qnr B1 (31,1%) dont la présence avait

été déjà signalée en Côte d’Ivoire (Guessennd et al., 2008b), les gènes qnr B6 (2,2 %) et qnr B7

(1,1%) décrits pour la première fois en Côte d’Ivoire à travers cette étude et qui seraient impliqués

dans la résistance aux fuoroquinolones.

Le gène qnr B6 a été détecté dans plusieurs endroits du monde comme la Corée du Sud chez

une souche de Enterobacter aerogenes productrice de BLSE, issue d’une collection de 644

entérobactéries provenant de 12 laboratoires cliniques (Park et al., 2007). En Argentine, Cruz et al.

(2013) ont rapporté la présence du qnr B6 chez 5 % des entérobactéries productrices de BLSE.

De même, au Maroc selon Jamali et al. (2014), 0,9 % des souches productrices de BLSE

testées dans leur étude ont hébergé ce gène. Les gènes qnr B6 et qnr B7 ont été retrouvés en Corée

du Sud, dans une étude menée sur 347 entérobactéries provenant de deux hôpitaux. Ces gènes ont

été détectés respectivement chez une souche de K. pneumoniae et chez une souche de C. freundii

(Jeong et al., 2011).

Par ailleurs, la coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines, aux aminosides et aux

fluoroquinolones montrée dans ce travail pourrait expliquer les problèmes de diagnostic rencontrés

par les prescripteurs qui conduirait aux échecs thérapeutiques et à la mort des patients (Guessennd

et al., 2008b).

Le support génétique de la résistance des entérobactéries à la rifampicine dans cette étude a

été dû au gène arr-2. Selon Nikolayevskyy et al. (2007), plus de 90 % de la résistance à la

rifampicine était due à des mutations dans le gène rpoB. Plus tard, la résistance a été manifestée par

l'acquisition horizontale du gène arr qui code pour les ADP-ribosyltransférases, responsables de

l'inactivation de l’antibiotique. Le gène arr-1 a d'abord été trouvé dans le chromosome de

Mycobacterium smegmatis et par la suite, les allèles arr-2 et arr-3 ont été décrits comme cassettes

de gènes dans les intégrons de classe 1 présents chez les bacilles Gram négatif d'Europe et d'Asie

(Arlet et al., 2001 ; Lee et al., 2005 ; Mammeri et al., 2005).

117

La résistance à la rifampicine médiée par le gène arr-2 a été rapportée chez plusieurs

espèces bactériennes dont P. aeruginosa (Tribuddharat et Fennewald, 1999), E. coli (Naas et al.,

2001), K. pneumoniae (Arlet et al., 2001) et A. baumannii (Houang et al., 2003). La détection du

gène arr2 au cours de cette étude, pourrait expliquer la résistance à la rifampicine observée chez

toutes les souches testées. Cependant, la présence de ce gène uniquement chez 4 souches alors que

le taux de résistance a été de 100% laisse croire que les souches utilisent d’autres mécanismes de

résistance vis-à-vis de la rifampicine tels que les systèmes d’efflux (Chandrasekaran et

Lalithakumari, 1998), la glycosylation (Yazawa et al., 1993 ; Tanaka et al., 1996), la

phosphorylation (Yazawa et al., 1994) ou encore l’expression du gène arr-3 (Arlet et al., 2001).

Par ailleurs, le typage moléculaire des 4 souches qui ont hébergé le gène arr-2 par la

technique du MLST a montré que ces souches appartenaient à 4 différentes types de séquences à

savoir ST 5, ST 273, ST 307, ST 309. Ce résultat montre que ces souches n’ont aucun lien de

parenté. Des souches ayant les mêmes profiles ont été retrouvées à travers le monde et impliquées

dans diverses infections.

A Douala au Cameroun, une souche de E. coli isolée de prélèvement de selle d’un patient

hospitalisé pour un syndrome inflammatoire associé à une insuffisance rénale était du ST 5 et

hébergeait les gènes de résistance aux β-lactamines blaNDM-1 et blaOXA-1. (Smits et al., 2012).

Par ailleurs, les résultats des travaux de Chou et al. (2016) ont montré qu’une souche de K.

pneumoniae, isolée d’un patient souffrant d’une pneumonie aux Philippines et qui hébergeait le

gène blaNDM-7 était du ST 273. De plus, selon Samuelsen et al. (2011) ainsi que Ageevets et al.

(2014), le ST 273 a été reconnu comme ayant un potentiel pouvoir épidémique.

Concernant le ST 307, des travaux réalisés en Italie par Villa et al. (2017) ont montré que

des souches de K. pneumoniae isolées de trois centres hospitaliers italiens, hébergeant les gènes

blaKPC-2, blaKPC-3 et blaCTXM-15 avaient le ST 307.

Quant au ST 309, il a été retrouvé chez des souches de K. pneumoniae isolées de patients

hospitalisés au nord de la Chine (Zhao et al., 2016).

En outre, l’expérience de conjugaison réalisée dans cette étude a permis de sélectionner une

souche transconjugante qui avait les mêmes caractéristiques de la souche donatrice, à savoir

résistante aux céphalosporines de troisième génération et à la gentamicine. Cette souche

transconjugante a hébergé également les gènes blaCTX-M-1 et aac(6)-Ib. Ce résultat est une

confirmation des résultats obtenus par Gangoué en 2007 lors des expériences de conjugaison

réalisées dans ses travaux de thèse. En effet, parmi les 38 souches productrices de BLSE utilisées

pour son expérience, 16 souches ont pu transférer la résistance aux céphalosporines de troisième

génération et à la gentamicine aux souches transconjuguantes (Gangoué, 2007).

118

Le co-transfert des gènes de résistance blaCTX-M-1 et aac(6)-Ib de la souche donatrice vers la

souche transconjugante suggère que les gènes se trouvent sur un même plasmide. Certains auteurs

comme Paterson et Bonomo (2005) ont expliqué que les gènes qui codent pour les BLSE sont

portés généralement par des plasmides et seraient souvent associés à d’autres gènes de résistance

aux antibiotiques tels que les aminosides.

119

CONCLUSION

120

CONCLUSION

La résistance aux antibiotiques est devenue un véritable problème de santé publique à

travers le monde et particulièrement en Côte d’Ivoire, avec l’émergence et la diffusion de bactéries

multi-résistantes. Le présent travail, réalisé sur une période de quatre ans (2012 à 2015) avait pour

objectif général de caractériser des gènes de résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones

codant pour les acétyltransférases, les nucléotidyltransférases, les phosphotransférases et les

protéines QNR chez des entérobactéries productrices de BLSE dans le district d’Abidjan. L’étude a

porté sur 153 entérobactéries isolées de divers échantillons biologiques provenant de divers services

hopitaliers d’Abidjan.

La production de β-lactamases à spectre élargi a été mise en évidence chez 90 souches

(58,8%). Le profil de résistance des souches productrices de BLSE aux antibiotiques a montré des

taux de résistance élevés au ceftriaxone (96,7 %), à la céfotaxime (95,6 %) et à la céfoxitine (72,2

%). Egalement, des taux de résistance élevés aux aminosides (90 %) et fluoroquinolones (86,7 %)

ont-ils été constatés. Les antibiotiques tels que l’imipénème et la colistine ont été les plus actifs sur

l’ensemble des souches.

La caractérisation moléculaire des souches a montré une diversité de gènes de résistance aux

β-lactamines avec l’émergence de nouveaux gènes dans notre zone géographique. Ce sont les gènes

blaCTX-M-27, blaTEM-104, blaTEM-191, blaTEM-198, blaSHV-27, blaSHV-83, blaSHV-89, blaSHV-100, blaSHV-106, blaSHV-

150. Ces gènes ont une implication en santé publique car ils induisent la résistance aux

céphalosporines de troisième génération et aux pénicillines. De plus, cette étude a confirmé la

propagation internationale du gène blaCTX-M-15, responsable d’épidémies de colonisation et

d'infections nosocomiales dans le monde, chez 41 souches productrices de BLSE (44,4 %).

La coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines a été mise en évidence chez 23

souches productrices de BLSE. L’analyse des séquences des gènes a montré des modifications

mutationnelles qui seraient impliquées dans la résistance aux antibiotiques.

Outre ces gènes, cette étude a montré pour la première fois, l’émergence des gènes aac(6’)-

Ib, ant(2")-I et aad qui confèrent la résistance aux aminosides tels que l’amikacine et la

gentamicine, rendant ainsi les possibilités de traitement des infections causées par les

entérobactéries plus restreintes. La résistance aux fluoroquinolones a été marquée par la détection

des gènes de résistance qnr A1, qnr B1 et de nouveaux gènes de résistance en Côte d’Ivoire qnr B6

et qnr B7.

La coexpression des gènes de résistance aux β-lactamines (blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV), aux

aminosides (aac(6′)-Ib) et aux fluoroquinolones (qnrB) a été la plus retrouvée chez l’espèce K.

pneumoniae avec 14,4% (13 souches) qui ont exprimé simultanément ces gènes de résistance.

121

L’expérience de conjugaison effectuée en utilisant des souches donatrices résistantes aux

céphalosporines de troisième génération et à la gentamicine et une souche réceptrice sensible à tous

les antibiotiques a montré le transfert des gènes de résistance aux β-lactamines (blaCTXM-1) et aux

aminosides (aac(6′)-Ib).

Par ailleurs, une recherche plus poussée sur la résistance à la rifampicine a été effectuée et a

permis de détecter un gène de résistance à la rifampicine nommé arr-2, mis en évidence pour la

première fois en Côte d’Ivoire. Le typage des souches hébergeant ce gène par la technique du

MLST a permis d’identifier les ST 5, ST 273, ST 307, ST 309.

PERSPECTIVES

Cette étude ouvre des perspectives de recherche en vue de compléter les résultats obtenus. Il s’agira

de:

Caractériser les plasmides porteurs des gènes blaCTX-M-15 impliqués dans leur dissémination.

Rechercher les gènes de méthylation ainsi que ceux qui codent pour les systèmes d’efflux

impliqués dans la résistance aux aminosides chez les entérobactéries résistantes aux

aminosides qui n’ont hébergé aucun gène de résistance dans cette étude.

Rechercher les nouveaux gènes de résistance impliqués dans la résistance aux

fluoroquinolones tels que les gènes qnr C et qnr D.

Rechercher d’autres mécanismes de résistance à la rifampicine chez les entérobactéries.

RECOMMANDATIONS

Face à l’émergence et à la diffusion des souches multirésistantes, il convient de faire des

recommandations.

-Aux agents de santé

Le personnel de santé doit maintenir les mesures d’hygiène hospitalière au sein des services

(l’hygiène des mains, la tenue de protection, le port de gants, la gestion du matériel et des surfaces

souillées, le circuit du linge, des déchets et des prélèvements biologiques) pour limiter la diffusion

de ces souches multi-résistantes.

- Aux prescripteurs

Nous recommandons baser au préalable sur les résultats d’antibiogramme avant tout traitement

antibactérien. Egalement de bien observer les règles de prescription des antibiotiques seul ou en

association et de bien renseigner les données informatives sur les malades pour une meilleure

surveillance

122

-Aux populations

Pour permettre une lutte éfficace contre la résistance bactérienne, les populations doivent arrȇter la

vente anarchique d’antibiotiques en dehors des structures légales et leur consommation sans

prescription médicale.

-Aux autorités gouvernementales

Elles doivent faire prendre conscience à la population de la résistance bactérienne et veiller sur la

circulation et la distribution des antibiotiques sur toute l’étendue du territoire en établissant

d’étroites collaborations avec les agents de santé afin de permettre un meilleur contrôle de

l’utilisation des antibiotiques.

123

REFERENCES

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i

ANNEXES

ii

ANNEXE

Matériel et méthodes

iii

ANNEXE 1 : Composants des cartouches du Kit EZY 1

composant d’une cartouche

du kit EZ1

Numéro du Puits Volume (µL)

tampon de lyse (tampon

MTL)

1 720

Suspension diluée de

particules magnétiques

2 300

tampon de perles 3 60

lavage 1 (tampon MW1-

EtOH)

4 900


EtOH)

5 900


EtOH)

6 900

Eau sans RNase (Rincer) 7 1000

tampon d'élution (Eau sans

RNase)

8 220

Tampon TE 9 220

Pas de réactif (vide) 10 0

iv

ANNEXE

Résultats

v

ANNEXE 2 : Alignement des séquences nucléotiques blaTEM-1 et blaTEM-104

TEM 1 1 ATGAGTATTCAACATTTTCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCT 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 1 ATGAGTATTCAACATTTTCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCT 60

TEM 1 61 GTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCA 120

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 61 GTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCA 120

TEM 1 121 CGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCC 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 121 CGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCC 180

TEM 1 181 GAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGTGCGGTATTATCC 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 181 GAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGTGCGGTATTATCC 240

TEM 1 241 CGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTG 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 241 CGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTG 300

TEM 1 301 GTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTA 360

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 301 GTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTA 360

TEM 1 361 TGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTTACTTCTGACAACGATC 420

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 361 TGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTTACTTCTGACAACGATC 420

TEM 1 421 GGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 421 GGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTT 480

TEM 1 481 GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGATACCACGATG 540

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||

TEM 104 481 GATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATG 540

TEM 1 541 CCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCT 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 541 CCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCT 600

TEM 1 601 TCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGC 660

vi

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 601 TCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGC 660

TEM 1 661 TCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCT 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 661 TCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCT 720

TEM 1 721 CGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTAC 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 721 CGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTAC 780

TEM 1 781 ACCGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA 810

| ||||||||||||||||||||||||||||

TEM 104 781 A-CGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA 809

vii

ANNEXE 3 : Alignement des séquences nucléotiques blaSHV-1 et blaSHV-89

SHV-1 1 ATGCGTTATATTCGCCTGTGTATTATCTCCCTGTTAGCCACCCTGCCGCTGGCGGTACAC 60

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-1 61 GCCAGCCCGCAGCCGCTTGAGCAAATTAAACTAAGCGAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTA 120

||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||

SHV-89 61 GCCAGCCCGCAGCCGCTTGAGCAAATTAAACAAAGCGAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTA 120

SHV-1 12 GGCATGATAGAAATGGATCTGGCCAGCGGCCGCACGCTGACCGCCTGGCGCGCCGATGAA 180

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-1 181 CGCTTTCCCATGATGAGCACCTTTAAAGTAGTGCTCTGCGGCGCAGTGCTGGCGCGGGTG 240

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-1 241 GATGCCGGTGACGAACAGCTGGAGCGAAAGATCCACTATCGCCAGCAGGATCTGGTGGAC 300

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-1 301 TACTCGCCGGTCAGCGAAAAACACCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGCGCC 360

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||

SHV-89 301 TACTCGCCGGTCAGCGAAAAACACCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGTGCC 360

SHV-1 361 GCCGCCATTACCATGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTACTGGCCACCGTCGGCGGC 420

|||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

SHV89 361 GCCGCCATTACCGTGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGC 420

SHV-1 421 CCCGCAGGATTGACTGCCTTTTTGCGCCAGATCGGCGACAACGTCACCCGCCTTGACCGC 480

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV89 421 CCCGCAGGATTGACTGCCTTTTTGCGCCAGATCGGCGACAACGTCACCCGCCTTGACCGC 480

SHV-1 481 TGGGAAACGGAACTGAATGAGGCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCACTACCCCGGCC 540

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV89 481 TGGGAAACGGAACTGAATGAGGCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCACTACCCCGGCC 540

SHV-1 541 AGCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCCCGTTCGCAA 600

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV89 541 AGCATGGCCGCGACCCTGCGCAAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCCCGTTCGCAA 600

SHV-1 601 CGGCAGCTGCTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTGATCCGCTCCGTG 660

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV89 601 CGGCAGCTGCTGCAGTGGATGGTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTGATCCGCTCCGTG 660

SHV-1 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTGGCGAGCGGGGTGCGCGCGGG 720

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||

SHV89 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTGGCGAACGGGGTGCGCGCGGG 720

SHV-1 721 ATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGAATAACAAAGCAGAGCGCATTGTGGTGATTTATCTGCGG 780

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

SHV89 721 ATTGTCGCCCTGCTTGGCCCGAATAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGG 780

SHV-1 781 GATACCCCGGCGAGCATGGCCGAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTG 840

||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV89 781 GATACGCCGGCGAGCATGGCCGAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTG 840

SHV-1 841 ATCGAGCACTGGCAACGCTAA 861

|||||||||||||||||||||

SHV89 841 ATCGAGCACTGGCAACGCTAA 861

viii



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||

SHV-12 61 GCCAGCCCGCAGCCGCTTGAGCAAATTAAACAAAGCGAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTA 120


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

SHV-12 361 GCCGCCATTACCATGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGC 420


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-2 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGG 720

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||

SHV-12 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTAGCAAGCGGGGTGCGCGCGGG 720


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV-12 781 GATACGCCGGCGAGCATGGCCGAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTG 840


|||||||||||||||||||||


ix



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||| |||

SHV-27 301 TACTCGCCGGTCAGCGAAAAACATCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGTGCC 360


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||

SHV-27 361 GCCGCCATTACCATGAGCGATAACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGC 420


|||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||

SHV-27 421 CCCGCAGGATTGACTGCCTTTTTGCGCCAGATCGACGACAACGTCACCCGCCTTGACCGC 480


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||


SHV-2 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGG 720

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||

SHV-27 661 CTGCCGGCGGGCTGGTTTATCGCCGATAAGACCGGAGCTGGCGAGCGGGGTGCGCGCGGG 720


||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||



||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV-27 781 GATACGCCGGCGAGCATGGCCGAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTG 840


|||||||||||||||||||||


x



||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 1 ATGCGTTTTATTCGCCTGTGTATTATCTCCCTGTTAGCCACCCTGCCGCTGGCGGTACAC 60

SHV-2 61 GCCAGCCCGCAGCCGCTTGAGCAAATTAAACTAAGC------------------------ 96

||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 61 GCCAGCCCGCAGCCGCTTGAGCAAATTAAACTAAGCGAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTA 120

SHV-2 97 ---------------GAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTAGGCATGATAGAAATGGATCTG 141

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 121 GGCATGATAGAAAGCGAAAGCCAGCTGTCGGGCCGCGTAGGCATGATAGAAATGGATCTG 180

SHV-2 142 GCCAGCGGCCGCACGCTGACCGCCTGGCGCGCCGATGAACGCTTTCCCATGATGAGCACC 201

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 181 GCCAGCGGCCGCACGCTGACCGCCTGGCGCGCCGATGAACGCTTTCCCATGATGAGCACC 240

SHV-2 202 TTTAAAGTAGTGCTCTGCGGCGCAGTGCTGGCGCGGGTGGATGCCGGTGACGAACAGCTG 261

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 241 TTTAAAGTAGTGCTCTGCGGCGCAGTGCTGGCGCGGGTGGATGCCGGTGACGAACAGCTG 300

SHV-2 262 GAGCGAAAGATCCACTATCGCCAGCAGGATCTGGTGGACTACTCGCCGGTCAGCGAAAAA 321

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 301 GAGCGAAAGATCCACTATCGCCAGCAGGATCTGGTGGACTACTCGCCGGTCAGCGAAAAA 360

SHV-2 322 CACCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGCGCCGCCGCCATTACCATGAGCGAT 381

|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 361 CATCTTGCCGACGGCATGACGGTCGGCGAACTCTGCGCCGCCGCCATTACCATGAGCGAT 420

SHV-2 382 AACAGCGCCGCCAATCTGCTACTGGCCACCGTCGGCGGCCCCGCAGGATTGACTGCCTTT 441

|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 421 AACAGCGCCGCCAATCTGCTGCTGGCCACCGTCGGCGGCCCCGCAGGATTGACTGCCTTT 480

SHV-2 442 TTGCGCCAGATCGGCGACAACGTCACCCGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGAATGAG 501

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 481 TTGCGCCAGATCGGCGACAACGTCACCCGCCTTGACCGCTGGGAAACGGAACTGAATGAG 540

SHV-2 502 GCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCACTACCCCGGCCAGCATGGCCGCGACCCTGCGC 561

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 541 GCGCTTCCCGGCGACGCCCGCGACACCACTACCCCGGCCAGCATGGCCGCGACCCTGCGC 600

xi

SHV-2 562 AAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCTGCTGCAGTGGATG 621

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 601 AAGCTGCTGACCAGCCAGCGTCTGAGCGCCCGTTCGCAACGGCAGCTGCTGCAGTGGATG 660

SHV-2 622 GTGGACGATCGGGTCGCCGGACCGTTGATCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGGTTTATC 681

||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 661 GTGGACGATCGAGTCGCCGGACCGTTGATCCGCTCCGTGCTGCCGGCGGGCTGGTTTATC 720

SHV-2 682 GCCGATAAGACCGGAGCTAGCGAGCGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCG 741

|||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 721 GCCGATAAGACCGGAGCTGGCGAACGGGGTGCGCGCGGGATTGTCGCCCTGCTTGGCCCG 780

SHV-2 742 AATAACAAAGCAGAGCGCATTGTGGTGATTTATCTGCGGGATACCCCGGCGAGCATGGCC 801

|||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 781 AATAACAAAGCAGAGCGCATCGTGGTGATTTATCTGCGGGATACCCCGGCGAGCATGGCC 840

SHV-2 802 GAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTGATCGAGCACTGGCAACGCTAA 861

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

SHV100 841 GAGCGAAATCAGCAAATCGCCGGGATCGGCGCGGCGCTGATCGAGCACTGGCAACGCTAA 900

xii

ANNEXE 7 : Code génétique

Acide aminé Code Codon Acide aminé Code Codon Acide aminé

Code Codon

Arginine

Arg

R CGU CGC CGA CGG AGA AGG

Glycine

Gly

G GGU GGC GGA GGG

Proline

Pro

P CCU CCC CCA CCG

Alanine

Ala

A GCU GCC GCA GCG

Histidine

His

H CAU CAC

Sérine

Ser

S UCU UCC UCA UCG AGU AGC

Asparagine

Asn

N AAU AAC

Isoleucine

Ile

I AUU AUC AUA

Thréonine

Thr

T ACU ACC ACA ACG

Acide aspartique

Asp

D GAU GAC

Leucine

Leu

L UUA UUG CUU CUC CUA CUG

Tryptophane

Trp

W UGG

Cystéine

Cys

C UGU UGC

Lysine

Lys

K AAA AAG

Tyrosine

Tyr

Y UAU UAC

Glutamine

Gln

Q CAA CAG

Méthionine

Met

M AUG Valine

Val

V GUU GUC GUA GUG

Acide glutamique

Glu

E GAA GAG

Phénylalanine

Phe

F UUU UUC

STOP

START

UAG UGA UAA

AUG

xiii

PUBLICATIONS

SCIENTIFIQUES

xiv

ARTICLES PUBLIES

PUBLICATION 1 : VICTOIRE GADOU, NATHALIE KOUADIO GUESSENND, ABALE

A.TOTY, FERNIQUE KONAN, MOHAMED BAGUY OUATTARA, MIREILLE DOSSO,

SEYDINA M. DIENE, JOSEPH ALLICO DJAMAN AND JEAN-MARC ROLAIN (2018).

Molecular Detection of the Arr-2 Gene in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Resistant to

Rifampicin in Abidjan, Côte D'Ivoire. Microbiology Research Journal International, 23(4): 1-8,

2018; Article no.MRJI.40552 ISSN: 2456-7043

PUBLICATION 2 : VICTOIRE GADOU, NATHALIE KOUADIO GUESSENND, ABALE A.

TOTY, SEYDINA M. DIENE, JEAN-MARC ROLAIN, JOSEPH ALLICO DJAMAN,

MIREILLE DOSSO (2018). First detection of aminoglycosides resistance genes aac(6)-Ib,

ant(2")-I and aad in enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases in abidjan

(Côte D'Ivoire). International Journal of Microbiology Research, ISSN: 0975-5276 & E-ISSN:

0975-9174, Volume 10, Issue 5, pp.-1171-1174.

PUBLICATION 3 : GADOU VICTOIRE, TOTY ABALE ANATOLE, KONAN FERNIQUE,

TIEKOURA KONAN BERTIN, OUATTARA MOHAMED BAGUY, GUESSENND

KOUADIO NATHALIE, DJAMAN ALLICO JOSEPH (2019). First case of qnr B6 and qnr B7

genes in enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases in Abidjan, Côte

d'Ivoire. South Asian Journal of Research in Microbiology, 3(2): 1-6, 2019; Article

no.SAJRM.48002

COMMUNICATION ORALE

GADOU VICTOIRE, GUESSENND KOUADIO NATHALIE, TOTY A. ABALE, SEYDINA

M. DIENE, JEAN-MARC ROLAIN, DJAMAN JOSEPH ALLICO ET DOSSO MIREILLE

(2018). Resistance aux aminosides chez les entérobactéries productrices de beta-lactamases à

spectre elargi à abidjan (côte d’ivoire). Huitième édition des Rendez-Vous de l’ORMICI

(Observatoire de la Résistance des Micro-organismes aux anti-infectieux en Cote d’Ivoire) du 03 au

04 Octobre 2018 à Abidjan (Côte d’Ivoire)

xv

COMMUNICATION AFFICHEE

VICTOIRE GADOU, NATHALIE KOUADIO GUESSENND, ABALE A.TOTY, FERNIQUE

KONAN, MOHAMED BAGUY OUATTARA, MIREILLE DOSSO, SEYDINA M. DIENE,

JOSEPH ALLICO DJAMAN ET JEAN-MARC ROLAIN (2018). Détection moléculaire du

gène arr-2 chez Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae résistans à la rifampicine

à Abidjan, Côte d’Ivoire

PUBLICATION 1

_____________________________________________________________________________________________________ *Corresponding author: E-mail: [email protected];

Microbiology Research Journal International 23(4): 1-8, 2018; Article no.MRJI.40552 ISSN: 2456-7043 (Past name: British Microbiology Research Journal, Past ISSN: 2231-0886, NLM ID: 101608140)

Molecular Detection of the Arr-2 Gene in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Resistant to

Rifampicin in Abidjan, Côte D'Ivoire

Victoire Gadou1,2*, Nathalie Kouadio Guessennd2,3, Abalé A.Toty2, Fernique Konan2, Mohamed Baguy Ouattara2, Mireille Dosso2,3,

Seydina M. Diène4, Joseph Allico Djaman1,2 and Jean-Marc Rolain4

1Laboratory of Biochemical Pharmacodynamics, Department of Biosciences, Felix Houphouët-Boigny

University, Abidjan, 22 BP 582 Abidjan 22, Côte d’Ivoire. 2Pasteur Institute of Côte d’Ivoire, 08 BP 1563 Abidjan 08, Côte d’Ivoire.

3Laboratory of Bacteriology-Virology, Department of Medical Sciences, Felix Houphouët-Boigny

University, Abidjan, Côte d'Ivoire. 4Research Unit on Emerging Tropical Infectious Diseases, IHU Mediterranee Infection, Faculty of

Medicine and Pharmacy, Aix-Marseille University, Marseille, France.

Authors’ contributions

This work was carried out in collaboration between all authors. Authors VG, NKG and JAD designed the study, wrote the protocol. Authors JMR, SMD and MD provided the material and equipment.

Authors AAT, FK and MBO contributed to the writing and editing of the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Article Information

DOI: 10.9734/MRJI/2018/40552

Editor(s): (1) Juliano de dea lindner, Professor, Department of Food Science and Technology, Federal University of Santa Catarina

(UFSC), Brazil. Reviewers:

(1) Masaaki Minami, Nagoya City University, Japan. (2) Nain Taara Bukhari, University of Karachi, Pakistan.

(3) Maria Demetriou, Democritus University of Thrace, Greece. Complete Peer review History: http://www.sciencedomain.org/review-history/24106

Received 5th January 2018 Accepted 28

th March 2018

Published 11th April 2018

ABSTRACT Aims: The aim of this study was to demonstrate the presence of rifampicin resistance arr-2 gene in certain enterobacteria of clinical origin from various biological products. Place and Duration of Study: National Reference Center for Antibiotics of Pasteur Institute of Côte d'Ivoire, and research unit on emerging tropical infectious diseases of Aix-Marseille University,

Original Research Article

Gadou et al.; MRJI, 23(4): 1-8, 2018; Article no.MRJI.40552

2

between January to July 2017. Methodology: The strains were isolated from different biological samples and identified by biochemical tests and MALDI-TOF MS mass spectrometry. The Antibiotic susceptibility testing was performed by diffusion on Mueller- Hinton (MH) agar. Results: All strains were resistant to rifampicin (100%) and amoxicillin (100%), but sensitive to imipenem and colistin. Conventional PCR using specific primers detected the arr-2 gene in four strains, including 3 strains of Klebsiella pneumoniae and one strain of Escherichia coli. Molecular typing of the strains by MLST showed that the E. coli strain had ST 5 and the three strains of K. pneumoniae had ST 307, ST 309, ST 273 respectively. Conclusion: This article is the first report that highlights the presence of the arr-2 gene in enterobacteria in Côte d’Ivoire.

Keywords: Escherichia coli; Klebsiella pneumoniae; rifampicin; aar-2 gene; Abidjan.

1. INTRODUCTION

Rifampicin is an antibiotic used in the treatment of tuberculosis [1], meningitis [2] and against Staphylococcus aureus infections [3,4]. It works by binding to the β-subunit of the RNA polymerase and inhibits the transition from initiation to elongation during transcription [5]. Resistance to rifampicin was mainly due to the mutations in the rpoB gene that encodes the β-subunit synthesis of bacterial RNA polymerase, resulting in decreased binding of R-RNA polymerase to rifampicin [6]. Presently, several others resistance mechanisms are identified, including efflux systems [7], glycosylation [8,9], phosphorylation [10] and inactivation of the antibiotic by ADP-ribosyltransferase (Arr) [11]. The first arr-1 resistance gene has been described in Mycobacterium smegmatis [12] and subsequently the arr-2 and arr-3 genes have been described, carried by class I integrons in gram-negative bacilli in Europe and Asia [13,14, 15]. In particular, the arr-2 gene is present on several transposons and integrons found in strains of Pseudomonas aeruginosa [16], Escherichia coli [17], Klebsiella pneumoniae [13] and Acinetobacter baumannii [18].

The objective of the present work was to highlight the presence of the arr-2 gene in rifampicin-resistant clinical enterobacteria isolated from Abidjan.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1 Bacterial Strains

The strains that were used in this study were 153 in number mainly of Enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) and those that did not. They were isolated from different biological samples, pre-

identified by biochemical tests and stored at the Center of Biological Resources (CeReB) of the Pasteur Institute of Côte d'Ivoire. Their identification was confirmed by MALDI-TOF MS (Bruker) mass spectrometry.

2.2 Antibiotic Susceptibility Test

Antibiotic susceptibility was determined from young colonies grown on Mac Conkey agar (BioMérieux SA, France) for 24 hr. The antibiotics used to perform the antibiogram were: amoxicillin (25 μg), amoxicillin + clavulanic acid (20 μg + 10 μg), ticarcillin + clavulanic acid (75 μg + 10μg), cefotaxime (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftriaxone (30 μg), aztreonam (30 μg), imipenem (10 μg), ertapenem (10 μg), amikacin (30 μg), gentamicin (15 μg), ciprofloxacin (5 μg), fosfomycin (50 μg), colistin (50 μg), cotrimoxazole (25 μg), rifampicin (30 μg ). Mueller-Hinton agar growth medium was used for diffusion according to the method described by the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology (CA-SFM, 2013).

2.3 Total DNA Extraction

Extraction of the total DNA from the strains was performed from 24 h young colonies using the G2 buffer contained in the EZ1 DNA Tissue Kit (QIAGEN). Using a vortex, a colony of the strain was homogenized in 200 mL of buffer G2. The homogenate was then introduced into the EZ1 automated for extraction. The DNA thus extracted was stored at -20°C.

2.4 Gene Detection by Conventional PCR

Conventional PCR was performed for detection of arr-2 using the following primers: arr-2_Forward_AATTACAAGCAGGTGCAAGGA and arr-2_Reverse_ TTCAATGACGTGTAAACCACG. The reaction


3

was carried out in a reaction volume of 25 μL consisted of 12.5 μL of Master Mix (Quantitect Probe PCR master mix, Qiagen), 1 μl of the primer mixture (Eurogentec), 6.5 μL of UP water and 5μL of total DNA. The amplification consisted of an initial denaturation step of the double-stranded DNA for 15 min at 95°C. This step was followed by 35 amplification cycles comprising denaturation at 94°C for 1 min, hybridization at 55°C for 50 sec, elongation at 72°C for 2 min and final elongation of 7 min at 72°C.

2.5 Visualization of Amplified Genes The PCR products were analysed using 1.5% agarose gel electrophoresis prepared with 0.5% Tris-Borate-EDTA (TBE). The BenchTop pGEM

R

DNA Markers Cat.# G7521 (Promega, France) molecular weight marker were used and the migration lasted for 20 minutes at a voltage of 135 V. The visualization of the DNA bands were done on a transilluminator.

2.6 PCR, Sequencing and Molecular Typing by MLST of Resistant Strains

To determine the typical sequences of the resistant strains, a conventional PCR using specific primers of the house-keeping genes per species was carried out. The functions of these genes and the sequences of the primers were summarized in Tables 1 and 2. The purified PCR products were sequenced using the BigDye® kit (Invitrogen, Life Technologies, North America) following the manufacturer's user's guide, in the automated ABI PRISM 3730xl Genetic Analyzer.

Sequence analysis was performed on the MLST websites of the Pasteur Institut of Paris and MLST Warwick in order to assign a standard sequence number according to the allelic profiles of the different strains.

3. RESULTS

3.1 Antibiotics Susceptibility

All strains showed resistance 100% to rifampicin. For the resistance to amoxicillin alone, it was 100%, while the resistance rate to amoxicillin/ clavulanic acid was 99.3%. The susceptibility test showed high resistance to third-generation cephalosporins, cefotaxime (85.6%), ceftriaxone (81%) and cefoxitin (80.4%) respectively. The trimethoprim-sulfamethoxazole and fosfomycin resistance levels were 86.3% and 16.3%, respectively. The aminoglycoside resistance rate was 80.4% and 81% of the strains resistant to ciprofloxacin. However, all strains were sensitive to imipenem and colistin.

3.2 Distribution of Rifampicin Resistance Genes and MLST

The arr2 gene was detected in four strains, 1 E. coli and 3 K. pneumoniae (Fig. 1). Table 3 presents the epidemiological profile of the 4 strains carrying the arr-2 gene. Fig. 2 shows the visualization of the 7 house-keeping genes of the E. coli and K. pneumoniae species after electrophoresis. Strain typing by MLST analysis showed that E. coli strain had ST 5 and all three strains of K. pneumoniae had ST 273, ST 307 and ST 309 respectively.

Table 1. Primers used in MLST for E. coli

Gene (function) Primer sequence (5’ 3’) Amplicon size (bp)

adk (adenylate kinase) ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG (F) CCGTCAACTTTCGCGTATTT (R)

583

fumC (fumarate hydratase)

TCACAGGTCGCCAGCGCTTC (F) GTACGCAGCGAAAAAGATTC (R)

806

icd isocitrate/isopropylmalate déshydrogénase)

ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA (F) GGACGCAGCAGGATCTGTT (R)

878

purA (adenylosuccinate déshydrogénase)

CGCGCTGATGAAAGAGATGA (F) CATACGGTAAGCCACGCAGA (R)

816

gyrB (DNA gyrase) TCGGCGACACGGATGACGGC (F) ATCAGGCCTTCACGCGCATC (R)

911

recA (ATP/GTP binding motif)

CGCATTCGCTTTACCCTGACC (F) TCGTCGAAATCTACGGACCGGA (R)

780

mdh (malate déshydrogénase)

ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG (F) TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTT (R)

932


4

Table 2. Primers used in MLST for K. pneumoniae

Gene (function) Primer sequence(5’ 3’) Amplicon size (bp) rpoB (beta-subunit of RNA polymerase) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGGCGAAATGGCWGAGAACCA(F) 501

TTGTGAGCGGATAACAATTTCGAGTCTTCGAAGTTGTAACC (R) gapA (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)

GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTATGAAATATGACTCCACTCACGG (F) 450 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT (R)

mdh (malate dehydrogenase) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACCCAACTCGCTTCAGGTTCAG (F) 477 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCCGTTTTTCCCCAGCAGCAG (R)

pgi (phosphoglucose isomerase) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC (F) 432 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT (R)

phoE (phosphorine E) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG (F) 420 TTGTGAGCGGATAACAATTTCTGATCAGAACTGGTAGGTGAT (R)

inf B (translation initiation factor 2) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTCGCTGCTGGACTATATTCG (F) 318 TTGTGAGCGGATAACAATTTCCGCTTTCAGCTCAAGAACTTC (R)

tonB (periplasmic energy transducer) GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACTTTATACCTCGGTACATCAGGTT (F) 414 TTGTGAGCGGATAACAATTTCATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG (R)

Table 3. Epidemiologic profile of the 4 strains carrying the arr-2 gene

Strains Services Biological sample Typical sequences E. coli 725YO/15 Neurology Blood ST 5 K. pneumoniae 868Y/13 Pediatrics Suppuration ST 307 K. pneumoniae 1141Y/15 Neonatal maternity Urine ST 309 K. pneumoniae 654UB/15 pneumonology sputum ST 273


5

Fig. 1. Electrophoresis of arr2 genes M: Molecular weight marker T-: negative control S1: K. Pneumoniae 868Y/13 S2 : K. Pneumoniae 1141Y/15 S3 : E. coli 725YO/15 S4 : K. Pneumoniae 654UB/15

Fig. 2. Visualization of 7 house-keeping genes of E. coli and K. peumoniae E.c1 : E. coli 725YO/15 K.pn1 : K. Pneumoniae 868Y/13 K.pn2 : K. Pneumoniae 1141Y/15; K.pn3 : K. Pneumoniae 654UB/15

4. DISCUSSION

Resistance to rifampicin is a serious public health problem [19] because it is the first-line drug for the treatment of tuberculosis [20] and the prevention of meningitis [2]. Rifampicin resistance induced by the arr-2 gene has been described in several bacterial strains including P. aeruginosa [16], E. coli [17], K. pneumoniae [13]

and A. baumannii [18]. Detection of the arr-2 gene in strains of K. pneumoniae and E. coli is the first of its kind in Côte d'Ivoire could explain rifampicin resistance observed in strains. However, the presence of this gene only in four strains while the resistance rate was 100%, suggests that strains use others mechanisms of resistance to rifampicin such as efflux systems [7], glycosylation [8,9], phosphorylation [10] or


6

resistance may be due to other resistance genes such as arr-3 [13].

Moreover, the typing of strains with the arr-2 gene by MLST analysis showed that an E. coli strain had ST 5. This sequence (ST 5) was found in an E. coli strain isolated from stool from a patient in Douala, Cameroon, which also carried the β-lactam resistance genes blaNDM-1 and blaOXA-1. The patient had been hospitalized for a month in Douala for an inflammatory syndrome associated with renal failure before his transfer to Paris [21]. Also, the three strains of K. pneumoniae carrying the arr-2 gene had ST 273, ST 307, and ST 309, respectively. These different standard sequences have also been obtained elsewhere in the world. The type 273 sequence was found in a strain of K. pneumoniae, isolated from a patient with pneumonia in the Philippines, which carried the blaNDM-7 gene [22]. K. pneumoniae ST 273 has been reported in Italy, Norway, Russia and the United Kingdom. These studies reported that ST273 isolates carried various carbapenemase genes including blaKPC, blaNDM-1 and blaVIM, and ST 273 is known to have the epidemic potential [23,24]. Regarding the ST 307 sequence, work done in Italy showed that strains of K. pneumoniae isolated from three Italian hospital centers and which carried the KPC-2, KPC-3 and blaCTXM-15 genes had ST 307 [25]. ST 307 was first described in 2008 in the multi-locus sequence typing database (MLST) (an unpublished isolate) and has since been described in 2013 in the United States [26]. It was initially associated with CTX-M-15 expanded spectrum β-lactamase production. The acquisition of a KPC enzyme is posterior to that of CTX-M-15, as Kp ST 307 CTX-M-15 producer was previously reported at a high rate in Italy, Korea, Pakistan, Morocco and in domestic animals from Japan [27-28]. As for the type 309 sequence, it was found in strains of K. pneumoniae isolated from hospitalized patients in northern China [29].

4. CONCLUSION This study has highlighted the high resistance to rifampicin in enterobacteria of clinical origin in Côte d’Ivoire. The arr-2 resistance gene was detected in only four strains, suggesting that there would be other mechanisms of rifampicin resistance used by the strains that should be

explored. Multilocus sequence typing (MLST) has made it possible to genetically characterize resistant strains and highlight the circulation of various clones around the world.

COMPETING INTERESTS Authors have declared that no competing interests exist. REFERENCES

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_________________________________________________________________________________ © 2018 Gadou et al.; This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Peer-review history: The peer review history for this paper can be accessed here:

http://www.sciencedomain.org/review-history/24106

PUBLICATION 2

|| Bioinfo Publications || 1171 International Journal of Microbiology Research

ISSN: 0975-5276 & E-ISSN: 0975-9174, Volume 10, Issue 5, 2018

Research Article

FIRST DETECTION OF AMINOGLYCOSIDES RESISTANCE GENES AAC(6)-IB, ANT(2")-I AND AAD IN ENTEROBACTERIACEAE PRODUCING EXTENDED-SPECTRUM BETA-LACTAMASES IN ABIDJAN (CÔTE D’IVOIRE)

VICTOIRE GADOU1,2*, NATHALIE KOUADIO GUESSENND2,3, ABALE A. TOTY2, SEYDINA M. DIENE4, JEAN-MARC ROLAIN4, JOSEPH ALLICO DJAMAN1,2, MIREILLE DOSSO2,3

1Laboratory of Biochemical Pharmacodynamics, Department of Biosciences, Felix Houphouët-Boigny University, Abidjan, 22 BP 582 Abidjan 22 Côte d’Ivoire 2Pasteur Institute of Côte d’Ivoire, 08 BP 1563 Abidjan 08 3Department of Medical Sciences of Felix Houphouët-Boigny University, Abidjan, Côte d'Ivoire 4Research unit on emerging tropical infectious diseases of Aix-Marseille University, IHU Mediterranee Infection, Faculty of Medicine and Pharmacy, Aix-Marseille-University, 27 Bd Jean Moulin, 13385 Marseille Cedex 5, France*Corresponding Author: Email - [email protected]

Received: April 19, 2018; Revised: May 07, 2018; Accepted: May 08, 2018; Published: May 30, 2018

Citation: Victoire Gadou, et al., (2018) First Detection of Aminoglycosides Resistance Genes AAC(6)-IB, ANT(2")-I and AAD in Enterobacteriaceae Producing Extended-Spectrum Beta-Lactamases in Abidjan (Côte d’Ivoire). International Journal of Microbiology Research, ISSN: 0975-5276 & E-ISSN: 0975-9174, Volume 10, Issue 5, pp.-1171-1174.

Copyright: Copyright©2018 Victoire Gadou, et al., This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.

Introduction Beta-Lactams, aminoglycosides and fluoroquinolones are the main antibiotics of choice prescribed in the treatment of bacterial infections, especially in enterobacteriaceae [1]. However, their abusive and uncontrolled use has led to the gradual development of resistance to these microorganisms [2]. The production of β-lactamases in enterobacteria is the major mechanism for β-lactam resistance. Starting from the first β-lactamases (TEM, SHV) described the extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) have been derived and their spectrum of action now extends to third-generation cephalosporins [3]. These β-lactamases have diversified with the explosion of type CTX-M particularly CTXM-15, which is responsible for epidemics of colonization and nosocomial infections worldwide [4]. As regards to resistance to fluoroquinolones, it is chromosomal or plasmidic. Chromosomal resistance is manifested by the alteration in the target enzymes DNA-gyrase and topoisomerase IV or by reduction of the production of porins, which may lead to a decrease in the intracellular concentration of the antibiotic [5]. The genetic determinant of the plasmid resistance of enterobacteria to fluoroquinolones is the qnr gene whose main characteristic is to be carried by a class 1 integron, highly mobile between different plasmids, and which causes an acceleration of the diffusion of résistance [6]. As for aminoglycoside resistance, it has been attributed mainly to the inactivation of the target enzymes by the modifying enzymes (acetyl transferases, nucleotidyl transferases and phospho-

transferases [7]. However, the methylation of 16S rRNA within the 30S sub-unit of bacterial strains by genes methylation has recently emerged as a mechanism of high resistance rate to aminoglycoside (Arbekacin, Amikacin, Tobramycin, And Gentamicin) [8]. The dissemination of resistance genes between bacteria has led to the appearance of bacteria that are resistant to several antibiotics (multidrug-resistant bacteria or MDR), particularly in broad-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae [9]. The presence of ESBLs is frequently associated with certain genes that confer resistance to other classes of antibiotics [10]. This situation is the cause of therapeutic failures and an increase in morbidity and mortality [11]. In Côte d'Ivoire the presence and spreading of ESBLs strains has been reported in enterobacteria of human origin [12, 13]. The ESBL of the type TEM, SHV, CTXM have been described and often associated with quinolone resistance genes [14]. However very little data are available on the resistance to aminoglycosides in Enterobacteriaceae, hence our interest. The objective of this study was to highlight the presence of aminoglycoside resistance genes in clinical strains of enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum Beta-Lactamases isolated in Abidjan. Materiel and methods Bacterial isolates: The strains included in this study were enterobacteriaceae isolated from January 2012 to December 2015.

International Journal of Microbiology Research ISSN: 0975-5276 & E-ISSN: 0975-9174, Volume 10, Issue 5, 2018, pp.-1171-1174.

Available online at https://www.bioinfopublication.org/jouarchive.php?opt=&jouid=BPJ0000234

Abstract- The aim of this study was to highlight the presence of aminoglycoside resistance genes in enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases isolated in Abidjan. The study involved 153 enterobacteriaceae of human origin and whose identification has been confirmed by Maldi Tof-type Mass Spectrometry. The antibiotic susceptibility testing was performed by diffusion on Mueller-Hinton E agar. The beta-lactams resistance genes were characterized by real-time PCR, conventional PCR and sequenced. While the aminoglycoside resistance genes were detected through conventional PCR directly. Of these strains 90 (58.8%) were producing broad-spectrum beta-lactamase. A high resistance rate to aminoglycosides (90%), cefotaxime (95.6%), ceftriaxone (96.7%), and cefoxitin (72.2%) wa s observed in enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases. The aminoglycoside resistance genes found were aac (6) -Ib, ant (2 ") –I and aad at the rate of 58.9%, 8.9% and 7.8% respectively. Resistance genes to β -lactams detected were blaCTX-M (96.7%), blaTEM (67.8 %) and blaSHV (27.8%). This study is the first to describe the aminoglycoside resistance genes in clinical strains of enterobacteriaceae in Abidjan. Keywords- Enterobacteriaceae, ESBL, aminoglycosides, resistance, Abidjan



First Detection of Aminoglycosides Resistance Genes AAC(6)-IB, ANT(2")-I and AAD in Enterobacteriaceae Producing Extended-Spectrum Beta-Lactamases in Abidjan (Côte d’Ivoire)

These strains were isolated from urine, blood, sputum, pleural fluid and ascites from different Hospital Centres in Abidjan. These strains were previously pre-identified and stored at the Biological Resources Centre of the Pasteur Institute of Côte d’Ivoire. Identification of strains was confirmed by matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) (Brucker). Antibiotic susceptibility test and phenotypic detection of ESBL The susceptibility testing was performed using Mueller-Hinton E agar (BioMérieux SA, France) by the standard method of diffusion in agar medium described by the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology (CA-SFM, 2013). The antibiotics used to perform the antibiogram were: amoxicillin (25μg), amoxicillin + clavulanic acid (20μg + 10μg), ticarcillin + clavulanic acid (75μg + 10μg), cefotaxime (30μg), cefoxitin (30μg), ceftriaxone (30μg), aztreonam (30μg), imipenem (10μg), ertapenem (10μg), amikacin (30μg), gentamicin (15μg), ciprofloxacin (5μg), fosfomycin (50μg), colistin (50μg), cotrimoxazole (25μg), rifampicin (30μg). The phenotypic detection of ESBLs was carried out by the double synergy test comprising clavulanic acid, cefotaxime, ceftriaxone, aztreonam [15]. Detection of resistance genes The kit "EZ1 DNA Tissue" (Qiagen) was used to extract the total bacterial DNA of each resistant strains. The beta-lactams resistance genes were detected through real-time PCR and conventional PCR. Aminoglycoside resistance genes were searched directly by conventional PCR. Real-time PCR for detection of beta-lactams (bla) resistance genes The reaction was carried out in a reaction volume of 20 μL composed of 10 μL of Master Mix (Qiagen Quantitect Probe PCR master mix), 2 μL of Forward and Reverse primers (Eurogentec), 2 μL of DNase-free water (Invitrogen), 1 μL probe (Life Technologies) and 5μL of total DNA diluted to 10%. The amplification procedure consisted of an initial denaturation step of the double-stranded DNA for 15 min at 95°C, followed by 35 cycles of amplification of the target DNA including denaturation at 95°C for 1s., hybridization and elongation at 60°C for 35s. Primers and specific probe for real-time PCR were summarized in [Table-1]. Conventional PCR amplification and electrophoresis The target genes for beta-lactams were blaCTXM-1, blaSHV, blaTEM, for the aminoglycoside aac(6)-Ib, ant (2")-I, aad. The reaction was carried out in a reaction volume of 25 μL composed of 12.5 μl of Master Mix (Quantitect Probe PCR master mix, Qiagen), 1 μL of Forward and Reverse primers (Eurogentec) [Table-2], 6.5 μL of DNase-free water (Invitrogen) and 5 μL of total DNA. The amplification consisted of an initial denaturation step of the DNA for 15 min at 95°C. This step was followed by 35 amplification cycles comprising denaturation at 94°C for 1 min, hybridization at 55°C for 50 sec, elongation at 72°C for 2 min and a final elongation step of 7 min at 72°C. The amplification products were analyzed by electrophoresis on 1.5% agarose gel prepared with 0.5% Tris-Borate-EDTA. The DNA bands of the amplicons were visualized on a transilluminator. DNA sequencing The purified amplification products were sequenced using the BigDye® kit (Life Technologies) in an automate ABI PRISM 3730xl DNA Analyzer. The same primers used for the detection of resistance genes by conventional PCR were used to sequence some resistance genes. The obtained nucleotide sequences were analysed by local BLAST in the ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation) database of IHU-Marseille. Results Identification and susceptivity to antibiotics A total of 153 enterobacteriaceae composed of 71 Escherichia coli, 57 Klebsiella pneumoniae, 22 Enterobacter cloacae, 2 Citrobacter freundii, and 1 Morganella morganii were identified. Of these strains 90 (58.8%) were producing ESBL and the ESBL distribution by species was 44 E. coli, 31 K. pneumoniae and 15 E.

cloacae. The susceptivity test showed a high third-generation cephalosporins resistance rate respectively 95.6% to cefotaxime, 96.7% to ceftriaxone and 72.2% to cefoxitin in enterobacteriaceae producing extended-spectrum beta-lactamases. The aztreonam and ertapenem resistance levels were 95.6% and 31.1% respectively. Among the ESBL 90% (81 strains) were resistant to gentamicin while 10% (9 strains) were resistant to amikacin [Table-3]. Types of β-lactamases genes Detection of bla genes showed the presence of blaTEM (67.8 %), blaSHV (27.8%), blaCTXM-1 (96.7%) genes. Sequencing of blaTEM genes revealed the presence of blaTEM-191 (13.3%), blaTEM-104 (11.1%) and blaTEM-198 (3.3%). The distribution of the blaSHV gene as follows: blaSHV-12 (2.2%), blaSHV-27 (1.1%), blaSHV-100 (8.9%), blaSHV-83 (1.1%), blaSHV-89 (2.2%), blaSHV-106 (2.2%) and blaSHV-150 (1.1%). For blaCTX-M gene, the distribution showed the presence of blaCTX-M-15 (44.4%) and blaCTX-M-1 (1.1%). Distribution of aminoglycoside resistance genes The detection of aminoglycoside resistance genes has shown the presence of the aac (6')-Ib, ant (2'')-I and aad genes at variable rates in Enterobacteriaceae producing ESBL. The aac(6’)Ib gene was detected in 53 strains (58.9%) against 8 strains (8.9%) for the ant (2")-I gene. The aad gene was detected in 7 strains (7.8%) and sequencing identified the aad1 gene in one strain (1.1%) and aad2 in 6 strains (6.7%). Discussion The aim of this study was to highlight the presence of aminoglycoside resistance genes in clinical strains of enterobacteriaceae producing Extended-Spectrum Beta-Lactamases isolated in Abidjan. We determined the prevalence of ESBL producing enterobacteria at 58.8%. This rate is higher than those of previous studies that reported prevalences of 9 and 56.2% respectively in ESBL-producing enterobacteria in Côte d'Ivoire [13, 16]. The significant increase in the prevalence of ESBL could be explained due to the abuse and inappropriate use of antibiotics, the main cause of the emergence of antibiotic resistance [17]. Detection of β-lactam resistance genes has also enable detection of several resistance genes. The blaCTX-M gene was the most represented with predominance of the blaCTX-M-15.

The latter is involved in many epidemiological situations and nosocomial infections worldwide as a result of epidemic plasmid transfer [18]. Its strong presence in the strains could be the origin of the high resistance to C3G observed in this study. Indeed, a recent study conducted in Tunisia in 2014 revealed that 88% of E. coli strains, isolated from the urine of patients in a Tunisian hospital, were resistant to cefotaxime, they harbored the blaCTX-M-15 gene. The increased consumption of cefotaxime may have contributed to the emergence of ESBL, and in particular CTX-M [19]. Earlier work in Côte d'Ivoire has also reported the presence of this gene [20]. Moreover, the ESBLs genes of the type TEM (blaTEM-191, blaTEM-104, blaTEM-198) obtained in this study are new genes described in Côte d'Ivoire. They were detected in Klebsiella pneumoniae strains in Switzerland and Iran [21,22]. In addition to these genes, several variants of the blaSHV gene have been highlighted in this study. The blaSHV-12 gene was first identified in Switzerland in 1997 [23] and later reported in various continents, including Africa in Mali and Nigeria [24,25], indicating a high endemicity of Enterobacteriaceae in West Africa. In Côte d'Ivoire, blaSHV-12 has been described in previous work and associated with qnr genes [14]. The other genes detected namely blaSHV-27, blaSHV-83, blaSHV-89, blaSHV-100, blaSHV-106, blaSHV-150 are new genes described in Côte d'Ivoire. The blaSHV-27 gene was detected in different plasmids isolated from E. coli, K. pneumoniae and Enterobacter cloacae and associated with the resistance genes of certain antibiotics (blaDHA-1, blaTEM-1, blaTEM-1b, blaCMY-2, blaIMP, blaCTX-M-14, blaCTX-M-15, blaSHV-12, blaSHV-45, blaOXA-1, dfrA5, ereA2) [26-28]. The blaSHV-89, blaSHV-100, blaSHV-150, blaSHV-83 and blaSHV-106 genes were also detected in Klebsiella pneumoniae strains in various parts of the world, in China, Algeria, USA and Portugal [29-32]. The β-lactamases of the type SHV-83, SHV-89 belong to phenotype 2b and are capable of hydrolyzing the penicillin and cephalosporins (cephaloridine and cephalothin) while the beta-lactamases of the type SHV-12, SHV-27, SHV-100, SHV-106, belonging to phenotype 2be are capable of hydrolysing third-generation cephalosporins (cefotaxime, ceftazidine) and aztreonam [33].



Victoire Gadou, Nathalie Kouadio Guessennd, Abale A Toty, Seydina M Diene, Jean-Marc Rolain, Joseph Allico Djaman and Mireille Dosso

Table-1 Primers used in this study for real-time PCR Gene name Primer name Primer sequence (5'->3') Amplicon

size (bp)

BlaTEM

TEM_RT_F TTCTGCTATGTGGTGCGGTA 213

TEM_RT_R GTCCTCCGATCGTTGTCAGA

TEM_RT_Probe AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGA

BlaCTX-M

CTXM_groupA_RT_F CGGGCRATGGCGCARAC 105 CTXM_groupA_RT_R TGCRCCGGTSGTATTGCC

CTXM_groupA_RT_Probe CCARCGGGCGCAGYTGGTGAC

CTXM_groupB_RT_F ACCGAGCCSACGCTCAA 221

CTXM_groupB_RT _R CCGCTGCCGGTTTTATC

CTXM_groupB_RT_Probe CCCGCGYGATACCACCACGC

Bla

SHV

SHV_RT_F TCCCATGATGAGCACCTTTAAA 105 SHV_RT_R TCCTGCTGGCGATAGTGGAT

SHV_RT_Probe TGCCGGTGACGAACAGCTGGAG

Table-2 Primers used for conventional PCR

Gene name

Primer name Primer sequence (5'->3') Amplicon size (bp)

BlaTEM

TEM_F ATGAGTATTCAACATTTCCGTG

861 TEM_R TTACCAATGCTTAATCAGTGAG

BlaCTX-M

CTX-M1_F CCCATGGTTAAAAAATCACTGC 944

CTX-M1_R CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG

BlaSHV

SHV_F

ATTTGTCGCTTCTTTACTCGC 1051

SHV_R

TTTATGGCGTTACCTTTGACC

aac(6΄)-Ib

Aac6-1B_F TATGAGTGGCTAAATCGAT 395

Aac6-1B_R CCCGCTTTCTCGTAGCA

ant(2΄΄)-I

Ant(2΄΄)-I_F GACACAACGCAGGTCACATT 524

Ant(2΄΄)-I_R CGCATATCGCGACCTGAAAGC

aad Aad_F TTGTACGGCTCCGCAGTG 812

Aad_R CCCAATTTGTGTAGGGCTTA

Table-3 Resistance profile of Enterobacteriaceae producing ESBL to antibiotics

Antibiotics

Critical diamètres

Resistance rate n (%)

Amoxicillin/ clavulanic acid 16-21 90 (100)

Cefotaxime 23-26 86 (95.6)

Ceftriaxone 23-26 87 (96.7)

Cefoxitin 15-22 65 (72.2)

Ertapenem 26-28 28 (31.1)

Aztreonam 21-27 86 (95.6)

Amikacin 15-17 9 (10)

Gentamicin 16-18 81 (90)

In our study, aminoglycoside resistance was described with the detection of aac (6') - Ib, ant (2' ') - I, aad1 and aad2 genes. It is the first report of these genes in Côte d'Ivoire. The aac (6 ')-Ib gene is a plasmid and chromosomal gene that confers resistance to amikacin and gentamicin [34]. It was most represented in aminoglycoside-resistant strains (56%), which is superior to the results of a study conducted in the United States where aac (6 ')-Ib was found in 50.5% of enterobacteria [35]. This gene has also been detected in some countries like Belgium, Greece, France, India [36- 38]. The ant (2 ") -I gene induces resistance to Gentamicin, Tobramycin, Dibekacin, Sisomicin, Kanamycin, and is generally transported by plasmids and transposons [39]. It was found in 8.9% of the aminoglycoside-resistant strains, this rate is lower than that found in Turkey where 46.2% of the aminoglycoside resistant strains had the ant(2”)-I gene [40]. The aad1 and aad2 genes encode an aminoglycoside-3 "adenylyltransferase labeled ant (3")-I or aad (3") (9) [41]. The aad1 gene was detected for the first time in Shigella Isolated flexneri in Japan in the late 1950s [42]. In 1989 when integrons

were first described, this gene was found to be associated with a class 1 integron [43]. The aad2 gene was first detected in Japan in 1965 in a clinical strain of Pseudomonas aeruginosa [44]. In addition to the class 1 integron, the aad2 gene is also present in Class 1 complex integrons [45, 46]. Conclusion The aminoglycoside resistance shown in this study, the first of its kind to be carried out in this country, showed a high rate of the aac (6) -1b, ant (2 '')-I and aad genes among clinical strains of Enterobacteriaceae producing ESBL. New resistance genes to β-lactamase have been described and associated with resistance to aminoglycosides. Since these antibiotics (beta-lactams, aminoglycosides) are used in the treatment of many bacterial infections, the presence of resistance genes gives a cause for concern. Therefore, monitoring the prescription of these antibiotics is very necessary given the easy spreading of resistance genes between bacteria.



First Detection of Aminoglycosides Resistance Genes AAC(6)-IB, ANT(2")-I and AAD in Enterobacteriaceae Producing Extended-Spectrum Beta-Lactamases in Abidjan (Côte d’Ivoire)

Application of research: This study should lead the authorities and health workers to a relevant policy of monitoring the prescription of antibiotics such as beta-lactams and aminoglycosides as well as a continuous monitoring of the resistance for a better control of the circulation of the resistant strains. Research Category: Aminoglycosides Resistance Abbreviation: ESBL: Extended-Spectrum Beta-Lactamases; Bla : beta-lactam Acknowledgement / Funding: We are grateful to the Ministry of Higher Education and Scientific Research of Côte d'Ivoire for having given a scholarship in France (No. 912 / MESRS / DB / SD-BHCI / SD / CBK). We also thank Mr. Jean Marc Rolain in Research unit on emerging tropical infectious diseases for his grateful assistance and technical support. Author Contributions: All author equally contributed Author statement: All authors read, reviewed, agree and approved the final manuscript Conflict of Interest: None declared Ethical approval: This article does not contain any studies with human participants or animals performed by any of the authors. References

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PUBLICATION 3

_____________________________________________________________________________________________________ *Corresponding author: Email: [email protected];

South Asian Journal of Research in Microbiology

3(2): 1-6, 2019; Article no.SAJRM.48002

First Case of Qnr B6 and Qnr B7 Genes in Enterobacteriaceae Producing Extended-Spectrum

Beta-Lactamases in Abidjan, Côte D'ivoire

Gadou Victoire1,2*, Toty Abalé Anatole2, Konan Fernique2, Tiékoura Konan Bertin2, Ouattara Mohamed Baguy2,

Guessennd Kouadio Nathalie2,3 and Djaman Allico Joseph1,2

1Department of Biosciences, Laboratory of Biochemical Pharmacodynamics, Felix Houphouët-Boigny University, Abidjan, 22 BP 582 Abidjan 22, Côte d’Ivoire.

2Pasteur Institute of Côte d’Ivoire, 08 BP 1563 Abidjan 08, Côte d'Ivoire.

3Department of Medical Science, Felix Houphouët-Boigny University, Abidjan, Côte d'Ivoire.

Authors’ contributions

This work was carried out in collaboration among all authors. Authors GV, GKN and DAJ designed the study, drafted the protocol and provided the material and equipment. Authors TAA, KF, OMB and TKB

contributed to the writing and editing of the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Article Information

Editor(s):

(1) Eliton da Silva Vasconcelos, Department of Physiological Sciences, Federal University of Sao Carlos – UFSCar, Rod. Washington Luiz, Sao Carlos, Brazil.

Reviewers: (1) Kaunara A. Azizi, Tanzania. (2) Vivek Kumar Singh, Nepal.

(3) Pinar Sanlibaba, Ankara University, Turkey. Complete Peer review History: http://www.sdiarticle3.com/review-history/48002

Received 03 January 2019 Accepted 11 March 2019 Published 11 April 2019

ABSTRACT

Aims: The aim of this study was to characterize fluoroquinolone resistance genes in enterobacteriaceae that produce extended-spectrum β-lactamases, isolated in Abidjan. Place and Duration of Study: Pasteur Institute of Côte d'Ivoire and research unit on emerging tropical infectious diseases of Aix-Marseille University from January 2017 at July 2017. Methodology: The study included 90 enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases isolated from biological products from various hospital services in Abidjan. These strains have been pre-identified and stored at the Center for Biological Resources (CeReB) of Pasteur Institute of Côte d'Ivoire. The identification of the strains was confirmed using the mass

Original Research Article

Victoire et al.; SAJRM, 3(2): 1-6, 2019; Article no.SAJRM.48002

2

spectrometry MALDI-TOF (MS) and the antibiotic sensitivity test was performed using Müeller Hinton's agar diffusion method. The fluoroquinolone resistant genes were detected by conventional PCR and then, sequenced. Results: The strains studied were Escherichia coli (44), Klebsiella pneumoniae (31) and Enterobacter cloacae (15). High resistance rates to ceftriaxone (96.7%), cefotaxime (95.6%), aztreonam (95.6%) and cefoxitin (72.2%) were observed in all strains producing broad spectrum β-lactamases. The resistance rate to fluororquinolones represented by ciprofloxacin was 86.7%. The fluoroquinolone resistance genes detected were qnr A (3.3%) and qnr B (42.2%). Sequencing identified the qnr A1 (3.3%), qnr B1 (31.1%), qnr B6 (2.2%) and qnr B7 (1.1%) genes. Conclusion: This study made it possible to identify fluoroquinolone resistance genes in enterobacteriaceae producing β-lactamases which have an extended spectrum in Abidjan.

Keywords: Enterobacteriaceae; fluoroquinolones; qnr B6; qnr B7; Abidjan.

ABBREVIATIONS ESBL : Extended-Spectrum Beta-Lactamases Qnr : Quinolone resistance

1. INTRODUCTION

Quinolones are widely used antibiotics in the treatment of various infections [1]. Quinolones are generally characterized by a broad spectrum of activity, a good oral bioavailability and a good tissue penetration [2] while fluoroquinolones, are characterized by the presence of a fluorine atom in position 6 and a nitrogen ring, and most often by the presence of a piperazine in position 7 [3]. Their main targets are DNA gyrase and topoisomerase IV DNA [4]. Fluoroquinolones interact with the DNA-enzyme complex, i.e. with the DNA gyrase which is bound to bacterial DNA or with the topoisomerase IV, bound to bacterial DNA to create conformational changes. The new fluoroquinolone-enzyme-DNA complex blocks the progression of the replication fork, resulting in the inhibition of enzymatic activity and DNA synthesis [5,6]. Several mechanisms are involved in fluoroquinolone resistance. These are the mutational modifications of target enzymes, the reduction of membrane’s permeability, the reduction of intracellular antibiotic concentration by efflux systems and the action of the QNR protein [7]. The qnr gene that codes for the QNR protein is the genetic determinant of plasmid resistance to fluoroquinolones [8]. The importance of this genetic support is its transferability and its ability to accelerate the spread of fluoroquinolone resistance. Qnr genes have been identified in different strains of enterobacteriaceae and often associated with the production of extended-spectrum beta-lactamases [4]. This situation is at the root of

therapeutic failures and the increase in morbidity and mortality rates worldwide [9]. The objective of this study was to characterise fluoroquinolone resistance genes in enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases isolated in Abidjan, Côte d'Ivoire.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1 Selection of Strains This study included 90 strains of enterobacteriaceae producing broad spectrum β-lactamases. The 90 strains were distributed as follows: 44 Escherichia coli, 31 Klebsiella pneumoniae and 15 Enterobacter cloacae. They were taken from a collection of 153 enterobacteriaceae isolated from various biological products (urine, blood, suppurations, saliva) from various hospital services in the city of Abidjan. These strains were pre-identified and stored at Biological Resource Center of Pasteur Institute of Côte d'Ivoire from 2012 to 2015.

2.2 Confirmation of the Identity of Strains by MALDI-TOF

The strains preserved in deep agars were revived using a enrichment broth which were incubated at 37°C for 24 hours in an oven (Thermo Fisher). The strains’ isolation was performed on Mac-Conkey agar and their re-identification was confirmed by mass spectrometry (MALDI-TOF) at the laboratory of the Emerging Tropical Infectious Diseases Research Unit at Aix-Marseille University in France.

2.3 Strains’ Sensitivity to Antibiotics

The antimicrobial susceptibility test was performed using Müeller-Hinton agar (BioMérieux SA, France) by the standard method


3

of diffusion in agar described by the Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology (CA-SFM, 2013). The strain of Escherichia coli ATCC 25922 was used as control strain. The antibiotics tested were: amoxicillin (25 μg), amoxicillin + clavulanic acid (20 μg + 10 μg), cefotaxime (30 μg), cefoxitin (30 μg), ceftriaxone (30 μg), aztreonam (30 μg), imipenem (10μg), ertapenem (10 μg), ciprofloxacin (5 μg). The phenotypic detection of extended-spectrum β-lactamases was carried out by the synergy test comprising amoxicillin+clavulanic acid, cefotaxime, ceftriaxone, aztreonam [10].

2.4 Research of Fluoroquinolone Resistance Genes by PCR

The strains’ DNA was extracted using the EZ1 extraction kit (Qiagen) as recommended by the manufacturer. The search for the qnr A and qnr B genes was carried out by conventional PCR. The amplification reaction was performed in a reaction volume of 25 μL composed of 12.5 μL Master Mix (Quantitect Probe PCR Master mix, Qiagen), 1 μL forward and reverse primer (Eurogentec), 5 μL total DNA and 6.5 μL ultra-pure water (Invitrogen).The primers of the fluoroquinolone resistance genes used in this work have been summarized in Table 1.

The amplification of genes by conventional PCR consisted of an initial DNA denaturation step at 95°C for 15 min. This step was followed by 35 amplification cycles including a denaturation at 94°C for 1 min, a hybridization at 55°C for 50 s, an elongation at 72°C for 2 min and a final elongation step of 7 min at 72°C. The amplification products were analyzed by 1.5% agarose gel electrophoresis prepared with 0.5% Tris-Borate-EDTA (TBE) and 3.75% SYBR SAFE. The DNA bands of the amplicons were visualized on a transilluminator.

2.5 DNA Sequencing

The amplicons were purified and sequenced using the BigDye® kit (Life technologies) as recommended the manufacturer in an automate

ABI PRISM 3730xl Genetic Analyser PLC. In addition, genes’ identification was carried out in the ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene Annotation) database of the IHU-Marseille in France.

3. RESULTS 3.1 Antibiotics Susceptibility A high resistance rates to ceftriaxone (96.7%), cefotaxime (95.6%), aztreonam (95.6%) and cefoxitin (72.2%) were observed in all strains producing broad spectrum β-lactamases. The resistance rate to fluoroquinolones represented by ciprofloxacin was 86.7%.

The analysis of the results of the susceptibility testing of Escherichia coli strains to antibiotics showed that for antibiotics of the β-lactam family, 100% of the strains were resistant for amoxicillin and for amoxicillin-clavulanic acid. The cephalosporin resistance rate was 98% and 100% for cefotaxime and ceftriaxone respectively. All strains were susceptible to imipenem, however 27.3% of strains were resistant to ertapenem. The ciprofloxacin resistance rate was 95.4%. In Klebsiella pneumoniae strains, cephalosporins resistance rate was 71% for cefoxitin, 96.8% for cefotaxime and ceftriaxone respectively. In this species too, all strains were sensitive to imipenem, however 35.5% of strains were resistant to ertapenem. The resistance rate of K. pneumoniae strains was 100% to amoxicillin clavulanic acid. In addition, the ciprofloxacin resistance rate was 74.2%. For Enterobacter cloacae strains, the resistance rate to amoxicillin clavulanic acid and cefoxitin was 100% while 86.7% of strains were resistant to cefotaxime and ceftriaxone. All strains of E. cloacae were susceptible to imipenem, however 33.3% of the strains were resistant to ertapenem. Table 2 summarizes the antibiotic resistance rates in the different species studied.

Table 1. Primers used for the detection of fluoroquinolone resistance genes

Gene name Primer name Primer sequence (5’ 3’) Amplicon size (bp)

qnr A QnrA_F QnrA_R

GATAAAGTTTTTCAGCAAGAGG ATCCAGATCGGCAAAGGTTA

542

qnr B QnrB_F QnrB_R

GACAGAAACAGGTTCACCGGT CAAGACGTTCCAGGAGCAACG

594


4

3.2 Resistance Genes Identified The search for fluoroquinolone resistance genes showed the presence of qnr B genes in 38 strains, thus, representing a rate of 42.2% and qnr A in 3 strains, representing a rate of 3.3%.

The distribution of fluoroquinolone resistance genes by species showed that 3 strains of E. coli (6.8%), hosted the qnr A gene and 7 strains (15.9%) the qnr B gene. The qnr A gene was not detected in any of the K. pneumoniae and E. cloacae strains. However, 19 strains of K. pneumoniae, i.e. about 61.3%, and 12 strains of E. cloacae (80%) hosted the qnr B gene. The sequencing technique helped to identify the qnr A1 genes in 3 strains of E. coli at a rate of 3.3%. qnr B1 was identified in 28 strains (31.1%) including 13 strains of K. pneumoniae (14.4%), 11 strains of E. cloacae (12.2%) and 4 strains of E. coli (4.4%). The qnr B6 gene was identified in 2 strains of K. pneumoniae (2.2%) and the qnr B7 gene in 1 strain of K. pneumoniae (1.1%).

4. DISCUSSION Fluoroquinolones act at the time of DNA replication. Their targets are DNA gyrase and

topoisomerase IV, which regulate the topology of DNA to allow replication [11]. The resistance to fluoroquinolones in enterobacteriaceae is generally the result of a chromosomal mutation causing the alteration of bacterial target enzymes [4]. However, resistance caused by plasmids has also been reported as a result of the acquisition of resistance genes qnr, qepA, and aac(6')-Ib-cr [12,13]. Plasmids carrying the qnr A and qnr B genes frequently carry resistance genes to β-lactam, aminoglycosides, and tetracycline [4].

In this work, the fluoroquinolones resistance rate represented by ciprofloxacin in enterobacteriaceae producing extended spectrum β-lactamases was 86.7%. This rate is higher than that reported by Guessennd et al. [14] who, in their work, showed that70.2% of the strains producing extended spectrum β-lactamases were resistant to ciprofloxacin. Ouattara et al. [15] reported a 93.2% ciprofloxacin resistance rate in strains producing broad spectrum β-lactamases.

The high resistance rates could be explained by the fact that fluoroquinolones are the most prescribed molecules after β-lactam in Africa and particularly in Côte d’Ivoire [16]. These results are agree with those obtained by some authors in Africa. Indeed, in the Central African Republic, the results of the work of Rafai et al. [17] showed that 84.8% of the broad spectrum strains, producing β-lactamases tested were

Table 2. Antibiotic resistance rate

Antibiotics Strains producing ESBL (%) E. coli n= 44

K. pneumoniae n= 31

E. cloacae n= 15

Amoxicillin 44 (100) 31 (100) 15 (100) Amoxicillin- clavulanic acid 44 (100) 31 (100) 15 (100) Aztreonam 44 (100) 29 (93.5) 13 (86.7) Cefotaxime 43 (98) 30(96.8) 13 (86.7) Cefoxitin 28 (63.6) 22 (71) 15 (100) Ceftriaxone 44 (100) 30 (96.8) 13 (86.7) Ciprofloxacin 42(95.4) 23 (74.2) 13 (86.7) Ertapenem 12 (27.3) 11 (35.5) 5 (33.3) Imipenem 0 0 0

* ESBL: extended-spectrum beta-lactamase, n: number

Table 3. Distribution of genes between strains

Detected genes Strains producing ESBL (%) E. coli n= 44

K. pneumoniae n= 31

E. cloacae n= 15

Qnr A 3 (6.8) 0 0 Qnr B 7 (15.9) 19 (61.3) 12 (80)

* ESBL: extended-spectrum beta-lactamase, n: number


5

resistant to ciprofloxacin. Similarly, in Burkina Faso, Ouedraogo et al. [18] reported that 80% of the strains producing broad spectrum β-lactamases were resistant to ciprofloxacin. In Algeria, Mathlouthi et al. [19] reported that 80% of strains producing extended spectrum β-lactamases tested in their work were resistant to ciprofloxacin.

The qnr genes detected included qnr B gene which was detected at a rate of 42.2% followed by the qnr A gene (3.3%) in strains producing extended spectrum β-lactamases. The sequencing carried out made it possible to identify in addition to the qnr A1 (3.3%) and qnr B1 (31.1%) genes, the qnr B6 (2.2%) and qnr B7 (1.1%) genes which are involved in the resistance to fuoroquinolone. Moreover, the qnr A1 and qnr B1 genes were reported in 2008 in Côte d’Ivoire [14]; however, this study is the first to report the presence of the qnr B6 and qnr B7 genes involved in fluoroquinolone resistance.

Elsewhere in the world, the qnr B6 gene has been detected in South Korea in a strain of Enterobacter aerogenes producing broad spectrum β-lactamases from a collection of 644 enterobacteriaceae from 12 clinical laboratories [20]. Similarly, in Argentina, Cruz et al. [21] reported the presence of qnr B6 in 5% of enterobacteriaceae that produce broad spectrum β-lactamase. Also, in Morocco, the qnr B6 gene was detected in 0.9% of strains producing extended spectrum β-lactamasess tested in the work of Jamali et al. [22]. The qnr B6 and qnr B7 genes were found in South Korea in a study of 347 entero-bacteriaceae from two hospitals. These genes were detected respectively in a strain of K. pneumoniae and a strain of Citrobacter freundii [23].

5. CONCLUSION

This study showed a high level of resistance to fluoroquinolones in enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases. The qnr B gene was the most detected (42.2%) followed by the qnr A gene (3.3%). The study showed as well the presence of the qnr B6 and qnr B7 genes for the first time in Côte d'Ivoire. Given the importance of fluoroquinolones in the treatment of many bacterial infections, the presence of resistance genes is a concern. Therefore, monitoring the prescription of antibiotic is necessary to limit the risk of spreading resistance genes.

COMPETING INTEREST

Authors have declared that no competing interests exist.

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© 2019 Victoire et al.; This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Peer-review history: The peer review history for this paper can be accessed here:

http://www.sdiarticle3.com/review-history/48002

RESUME

La résistance des entérobactéries aux antibiotiques connaît une évolution mondiale

préoccupante du fait de la production de β-lactamases à spectre élargi (BLSE). Ces

microorganismes, responsables d’infections nosocomiales se retrouvent résistants à plusieurs

familles d’antibiotiques comme les aminosides et les fluoroquinolones. Le but de cette étude

était de caractériser des gènes de résistance aux aminosides et aux fluoroquinolones codant pour

les acétyltransférases, les nucléotidyltransférases, les phosphotransférases et les protéines QNR

chez des entérobactéries productrices de BLSE dans le district d’Abidjan. Au total, 153 souches

d’entérobactéries ont été testées et 90 souches (58,8%) ont été productrices de BLSE. La

répartition était comme suite: 44 E. coli, 31 K. pneumoniae, 15 E. cloacae. Excepté

l’imipénème, le test de sensibilité aux β-lactamines a montré des taux de résistance élevés au

ceftriaxone (96,7 %), à la céfotaxime (95,6 %) et à la céfoxitine (72,2 %). Egalement, des taux

de résistance élevés aux aminosides (90 %) et fluoroquinolones (86,7 %) ont été constatés. Les

β-lactamases de type CTX-M-15 étaient prédominantes (44,4 %) suivi de nouveaux gènes tels

que TEM-191 (13,3%) et de SHV-100 (8,9%). Des gènes de résistance aux aminosides ont été

détectés pour la première fois dans notre pays à des taux variables ainsi que de nouveaux gènes

de résistance aux fluoroquinolones. Ce sont : aac(6′)-Ib (58,9%), ant(2′′)-I (8,9%) et aad (7,8%)

qnr B6 (2,2 %), qnr B7 (1,1%). La coexpression des gènes blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, aac(6′)-Ib,

qnrB chez les souches BLSE avait le taux le plus élevé c’est-à-dire 14,4 %. Le transfert de la

résistance bactérienne par conjugaison a été confirmé par le transfert des gènes blaCTXM-1 et

aac(6′)-Ib. Le typage moléculaire de 4 souches résistantes à la rifampicine par la technique

MLST a montré que les souches avaient les ST 5, ST 273, ST 307 et ST 309.

Mots clés: Entérobactéries, BLSE, résistance, aminosides, fluoroquinolones.

ABSTRACT

The resistance of enterobacteriaceae in antibiotics knows a worrisome world evolution due to

the production of extended spectrum β-lactamases (ESBL). These microorganisms, responsible

for nosocomial infections, are resistant to several families of antibiotics such as

aminoglycosides and fluoroquinolones. The aim of this study was to characterize

aminoglycoside and fluoroquinolone resistance genes encoding acetyltransferases,

nucleotidyltransferases, phosphotransferases and QNR proteins in ESBL-producing

enterobacteria in Abidjan District. A total of 153 strains of enterobacteria were tested and 90

strains (58.8%) were producing ESBL. The distribution was as follows: 44 E. coli, 31 K.

pneumoniae, 15 E. cloacae. Except for imipenem, the β-lactam sensitivity test showed high

levels of resistance to ceftriaxone (96.7%), cefotaxime (95.6%) and cefoxitin (72.2%). Also,

high levels of resistance to aminoglycosides (90%) and fluoroquinolones (86.7%) were

observed. CTX-M-15 β-lactamases were predominant (44.4%) followed by new genes such as

TEM-191 (13.3%) and SHV-100 (8.9%). Aminoglycoside resistance genes have been detected

for the first time in our country at variable rates as well as new fluoroquinolone resistance genes.

They are: aac(6 ')-Ib (58.9%), ant(2'')-I (8.9%), aad (7.8%) qnr B6 (2.2%) and qnr B7 (1.1%).

The coexpression of the blaCTXM-1, blaTEM, blaSHV, aac(6')-Ib, qnrB genes in the ESBL strains

had the highest level that is 14.4%. The transfer of bacterial resistance by conjugation was

confirmed by the transfer of the genes blaCTXM-1 and aac(6 ')-Ib. Molecular typing of 4

rifampicin resistant strains by the MLST technique showed that strains had ST 5, ST 273, ST

307 and ST 309.

Key words: Enterobacteriaceae, ESBL, resistance, aminoglycosides, fluoroquinolon

mlle gadou victoire - tel

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