MODELIRANJE VPLIVA CIKLIČNEGA

GVANOZIN MONOFOSFATA NA MEHANIZME

IZMENJAVE KALCIJA MED CITOPLAZMO IN

SARKOPLAZEMSKIM RETIKULUMOM TER

NA RAZVOJ SILE V GLADKI MIŠICI ARTERIJ

Diplomski seminar na študijskem programu 1. stopnje Fizika

Tanja Vajs

Mentor: doc. dr. Aleš Fajmut

Maribor, 2017

ii

ZAHVALA

Iskreno se zahvaljujem mentorju doc. dr. Alešu Fajmutu za vso znanje, trud, potrpežljivost in

za ves čas, ki mi ga je posvetil pri izdelavi diplomskega seminarja.

Zahvaljujem se staršema Nadi in Milanu, ki sta mi omogočila študij in me pri tem ves čas

podpirala ter mi stala ob strani. Hvala tudi Lorisu, sestri Bernardi in babici Angeli za vso

podporo in vzpodbudo.

iii

VAJS, T.: Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata na mehanizme izmenjave

kalcija med citoplazmo in sarkoplazemskim retikulumom ter na razvoj sile v gladki mišici

arterij

Diplomski seminar, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek

za fiziko, 2017.

POVZETEK

V delu predstavimo nadgradnjo fizikalno-matematičnega modela za razlago od cikličnega

gvanozin monofosfata (cGMP) odvisno relaksacijo gladke mišične celice arterije pod vplivom

holinergične stimulacije. Model, ki ga v tem delu nadgrajujemo, je ustrezno napovedal

relaksacijo pri nizkih, ne pa tudi pri visokih vrednostih koncentracije cGMP. Model

nadgradimo tako, da upoštevamo še vpliv cGMP na aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme celice

v sarkoplazemski retikulum (SR) skozi črpalke Ca2+-ATP-aze (SERCA), vpliv cGMP na od

Ca2+ in inozitol 1,4,5-trifosfata (IP3) odvisen izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo celice skozi IP3

receptorske kanale (IP3-R) oz. t.i. kanale tipa ICICR ter vpliv cGMP na aktivnost encima

fosfataze lahkih verig miozina. Izkaže se, da je najbolj ključna prva nadgradnja, saj izniči

neželeni porast sile pri visokih vrednostih koncentracije cGMP, tretja nadgradnja pa dodatno

prispeva k izničenju koničastih porastov sile v področju fizioloških koncentracij cGMP. Vpliv

druge nadgradnje je zanemarljiv.

Ključne besede: fizikalno-matematični model, ciklični gvanozin monofosfat, kalcij, dušikov

oksid, znotrajcelična signalizacija, kontrakcija, relaksacija, gladke mišične celice žil, arterija.

ABSTRACT

In this work we present an upgrade of the mathematical model for the interpretation of the cyclic

guanosine monophosphate (cGMP)-dependent relaxation of the arterial smooth muscle cells

under the influence of cholinergic stimulation. The model, which is being upgraded in this

work, properly predicted relaxation at low, but not at high concentration of cGMP. In the

upgraded model we additionally consider the effect of cGMP on the activity of Ca2+ pumping

from the cytoplasm into the sarcoplasmic reticulum (SR) through the Ca2+-ATPases (SERCA),

the effect of cGMP on the Ca2+ and the inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) dependent release of

Ca2+ from the SR into the cytoplasm through the IP3 receptor channels (IP3-R) or the so called

ICICR channels as well as the effect of cGMP on the myosin light chain phosphatase activity.

It turns out that the first upgrade is the most important one since it eliminates the unwanted

increase of force at high cGMP concentrations, while the third upgrade additionally smooths

sharp peaks in the force dependency within the interval of physiological cGMP concentrations.

The effect of the second upgrade is negligible.

Key words: mathematical model, cyclic guanosine monophosphate, calcium, nitric oxide,

intracellular signalling, contraction, relaxation, vascular smooth muscle cells, artery.

iv

POGOSTO UPORABLJENE OKRAJŠAVE

OKRAJŠAVA POLNO IME OPIS

ACh acetilholin nevrotransmiter v holinergičnih

sinapsah

CaM kalmodulin beljakovina z visoko afiniteto za

Ca2+ ione

cAMP ciklični adenozin monofosfat nukleotidni sekundarni prenašalec

cGK

od cGMP odvisne proteinske kinaze

(ang. cGMP-dependent protein

kinases)

družina encimov od cGMP

odvisnih proteinskih kinaz

cGMP ciklični gvanozin monofosfat nukleotidni sekundarni prenašalec

eNOS endotelijska sintaza dušikovega

oksida

encim, ki v endoteliju proizvaja

dušikov oksid NO

iNOS inducibilna sintaza dušikovega

oksida

oblika encima NOS, ki se inducira

v celicah in ni konstitutivno

izražena

nNOS nevronska sintaza dušikovega oksida encim, ki v nevronih proizvaja

dušikov oksid NO

ER/SR endoplazemski/sarkoplazemski

retikulum celični organel, shramba za Ca2+

GMC gladka mišična celica

GTP gvanozin trifosfat nukleotid

ICICR/IP3-R

IP3-receptorski kanal;

(ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+

release)

receptorski kanal na membrani

ER/SR, katerega odprtost

modulira količina IP3 in Ca2+ v

celici

IP3 inozitol 1,4,5-trifosfat sekundarni prenašalec, ki se veže

na IP3-R receptor kanalov ICICR

IRAG z IP3-R-povezan substrat za encim

PKG

protein, ki je povezan s kanalom

IP3-R in se fosforilira pod

vplivom encima PKG

L-Arg L-arginin aminokislina, ki je substrat za

encim NOS, ki proizvaja NO

MLC lahke verige miozina;

(ang. myosin light chain)

del proteina miozina, ki

predstavlja mesto fosforilacije

miozina

MLCK encim kinaza lahkih verig miozina fosforilira lahke verige miozina

(MLC)

MLCP encim fosfataza lahkih verig miozina defosforilira lahke verige miozina

NO dušikov oksid signalna molekula v celicah

evkariotov (plin)

v

PKA proteinska kinaza A od cAMP odvisna proteinska

kinaza

PKG proteinska kinaza G od cGMP odvisna proteinska

kinaza

PLB fosfolamban protein v pentamerni obliki, ki je

povezan s črpalkami SERCA

SERCA

Ca2+-ATP-aza sarkoplazemskega/

endoplazemski retikuluma;

(ang. sarco-endoplasmic reticulum

calcium ATPase)

črpalka za Ca2+ ione v SR/ER

sGC v vodi topna gvanilat ciklaza encim, ki ob aktivaciji z NO

producira cGMP

vi

Kazalo vsebine

1 Uvod ........................................................................................................................................ 1

2 Teoretično ozadje obravnavane teme ...................................................................................... 3

3 Izhodiščni model za od kalcija odvisni razvoj sile v gladkih mišicah celic arterij pod vplivom

cGMP ...................................................................................................................................... 5

3.1 Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma ...................................... 8

3.2 Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici arterij .................................................. 10

4 Nadgrajeni model .................................................................................................................. 11

4.1 Tok kalcija skozi črpalke SERCA .................................................................................. 11

4.2 Tok kalcija skozi od IP3 odvisne kanale ICICR ............................................................. 14

4.3 Razvoj sile v gladki mišični celici - vpliv na encim MLCP oz. defosforilacijo ............ 17

5 Rezultati in razprava .............................................................................................................. 19

6 Zaključek ............................................................................................................................... 24

1

1 Uvod

Stene arterij v grobem sestavljajo tri plasti (slika 1). Zunanja plast vsebuje pretežno vezivno

tkivo, katerega glavni gradnik je kolagen, srednja plast je sestavljena pretežno iz gladke

mišičnine in elastičnega tkiva, na lumen žile, po katerem se pretaka kri, pa meji plast endotelnih

celic. Že v začetku druge polovice prejšnjega stoletja so ugotovili, da endotelna plast ključno

prispeva k regulaciji tonusa žile. Ugotovili so, da odstranjena endotelna plast onemogoča

relaksacijo žilne stene. Molekul, ki jih tvori endotelna plast in ki najbolj bistveno vplivajo na

regulacijo tonusa žile, dolgo časa niso poznali. Poimenovali so jih kar endotelijsko pridobljeni

relaksacijski faktor (ang. endothelial-derived relaxing factor, EDRF). Šele v 80-ih letih

prejšnjega stoletja pa so odkrili, da je ključna molekula, ki je odgovorna za relaksacijo žilnih

sten, plin dušikov oksid (NO). Produkcijo molekule NO lahko sprožijo mehanska stimulacija

ob spremembi strižne napetosti krvi na stene žile, hormoni, živčni prenašalci in drugi

biokemijski stimuli. NO je ena izmed najmanjših, najbolj enostavnih, najhitreje difundirajočih,

a razmeroma kratkoživih biološko aktivnih molekul. Ima vlogo nadziranja in reguliranja

mnogih funkcij in mehanizmov v celicah. V endotelnih celicah žil nastaja v encimski reakciji

iz aminokisline L-arginin, ki jo katalizirata encima endotelijska sintaza dušikovega oksida

(eNOS) in inducibilna sintaza dušikovega oksida (iNOS). Obstaja še tretja izoforma tega

encima, ki se nahaja v nevronih (nNOS). NO nato iz endotelne plasti z difuzijo prehaja v gladke

mišične celice (GMC) žilne stene, kjer učinkuje kot njihov relaksant [1, 2].

Slika 1. Prečni prerez človeške arterije [3]

Motnje v produkciji in signalizaciji molekule NO povezujejo z razvojem številnih srčno-žilnih

bolezni, kot so hipertenzija, ateroskleroza, srčna in možganska kap, pljučna hipertenzija,

erektilna motnja idr. [1]. V zadnjem času pa spoznavajo tudi velik potencial v molekuli NO pri

diagnosticiranju in zdravljenju raznih drugih kroničnih bolezni, kot sta npr. astma in sladkorna

bolezen.

2

Vpliv molekule NO na mehanizem relaksacije gladke mišičnine žilnih sten večinoma ni

direkten, temveč poteka preko aktivacije encima topne gvanilat ciklaze (sGC), ki v GMC

producira posrednega prenašalca ciklični gvanozin monofosfat (cGMP). Slednji ima številne

učinke na mehanizme, ki regulirajo kontrakcijo/relaksacijo gladke mišičnine v steni arterije.

Učinki so lahko direktni ali posredni preko številnih fosforilacij drugih proteinov, ki jih

regulirajo različne izoforme encima - od cGMP odvisne proteinske kinaze (cGK). Te

mehanizme bomo z modelom teoretično proučevali in analizirali v diplomskem seminarju.

Prvi znanstveniki, ki so se ukvarjali z raziskovanjem signalne poti molekule NO, so leta 1968

odkrili strukturo in vlogo prvega nukleotidnega sekundarnega prenašalca cAMP, ki ima zelo

pomembno signalizacijsko vlogo, saj aktivira proteinsko kinazo (PKA), ki ima ključno vlogo

pri različnih presnovnih in kontraktilnih mehanizmih, med drugim tudi v srcu. Za to odkritje je

bila podeljena Nobelova nagrada. Leto kasneje so odkrili še drugi ciklični nukleotid cGMP, ki

aktivira drugi tip proteinske kinaze (PKG oz. cGK). Istega leta je bil odkrit in delno opisan tudi

encim, ki katalizira produkcijo cGMP iz gvanozin trifosfata (GTP), t. j. topna gvanilat ciklaza.

Leta 1979 so izvedli prvi eksperiment, s katerim so pokazali direkten vpliv NO na relaksacijo

GMC žil. Relaksacija je bila povezana z aktivacijo sGC in tvorbo cGMP. Ugotovili so, da lahko

kajenje tobaka, katerega dim vsebuje 800 ppm NO, aktivira sGC in povzroči relaksacijo gladke

mišičnine žil. Leta 1981 so pokazali, da izoliran NO aktivira sGC, kar je povzročilo povišanje

koncentracije cGMP in posledično relaksacijo gladkih mišic žil [1]. Za ta odkritja je bila

raziskovalcem Robertu F. Furchgottu, Louisu J. Ignarru in Feridu Muradu leta 1998 podeljena

Nobelova nagrada.

Do sedaj s fizikalno-matematičnimi modeli še ni bilo moč v celoti razložiti vseh mehanizmov,

ki bi ob povišani koncentraciji NO ([NO]) in s tem posledično tudi ob povišani koncentraciji

cGMP ([cGMP]) v GMC napovedali relaksacijo GMC, kar je bilo eksperimentalno nedvomno

potrjeno [1]. Zato v tem delu obravnavamo nadgradnjo obstoječega modela, ki ga je v

magistrskem delu, ki je nastalo na Oddelku za fiziko FNM UM, obravnavala Nina Šutar [4]. Ta

model pa temelji na do sedaj najbolje poznanih mehanizmih učinka cGMP na regulacijo

koncentracije znotrajceličnega kalcija ([Ca2+]) (Jacobsen in sod. [5] ter Kapela in sod. [6]), pri

čemer ta dva modela za razliko od modela v [4] ne opisujeta vseh mehanizmov in tudi ne učinka

cGMP na razvoj sile. Tudi model [4] ni popoln, saj ustrezno napove relaksacijo zgolj pri nizkih

ne pa tudi pri visokih vrednostih [cGMP]. Razlog za to je, da tako modela Jacobsena in Kapele

kot tudi obstoječi model, opisan v [4], ne upoštevajo nekaterih manj raziskanih mehanizmov

vpliva cGMP na regulacijo koncentracije znotrajceličnega kalcija ([Ca2+]) in na regulacijo

kontraktilnega mehanizma v GMC. Zato se v tem delu osredotočimo na modeliranje le-teh. Prvi

izmed mehanizmov, ki ga omenja literatura [7], a še ni bil eksplicitno modeliran, je vpliv cGMP

na aktivnost črpanja kalcija (Ca2+) iz citoplazme celice v sarkoplazemski retikulum (SR), ki je

znotrajcelična shramba za Ca2+ v GMC. Drugi tak mehanizem [8] je vpliv cGMP na od Ca2+ in

inozitol 1,4,5-trifosfata (IP3) odvisen izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo celice skozi IP3 receptorske

kanale (IP3-R) oz. t.i. kanale tipa ICICR (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release). Tretji

mehanizem, ki ga omenja literatura [2], in še tudi ni bil eksplicitno upoštevan v tovrstnih

modelih, pa je vpliv cGMP na aktivnost encima fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), ki

defosforilira miozinske molekule in s tem zmanjšuje število na aktin pripetih in aktivnih prečnih

3

mostičkov, ki generirajo silo v GMC. Prva dva izmed treh opisanih učinkov cGMP vplivata na

regulacijo koncentracije znotrajceličnega Ca2+ in se nahajata na ravni kodacije signala Ca2+,

medtem ko je tretji učinek na ravni kontraktilnega mehanizma, kjer poteka dekodacija signala

Ca2+.

Cilj diplomskega seminarja je ugotoviti, kateri izmed teh treh predlaganih mehanizmov lahko

dodatno pojasni relaksacijo GMC pri višjih koncentracijah cGMP. V ta namen bomo obstoječi

model postopno nadgrajevali s posameznimi mehanizmi, t. j. z nadgradnjo opisov tokov Ca2+

preko črpalk Ca2+-ATP-az v SR (SERCA; ang. Sarco-Endoplasmic reticulum calcium ATPase)

in skozi kanale IP3-R v odvisnosti od cGMP ter z dodatnim opisom posredne regulacije

aktivnosti encima MLCP preko cGMP. Nadgrajeni model, ki bi v celoti pojasnil relaksacijsko

vlogo cGMP, bi omogočil izgradnjo celostnega modela signalne poti NO v stenah arterij.

V nadaljevanju najprej opišemo signalno pot NO (poglavje 2). Sledi kratek povzetek tistega

dela obstoječega fizikalno-matematičnega modela [4], ki ga bomo tukaj nadgradili (poglavje

3), in opis nadgradnje tega modela (poglavje 4). Nato sledijo prikaz in analiza rezultatov

nadgrajenega modela ter primerjava s predhodnim modelom (poglavje 5) ter zaključek

(poglavje 6).

2 Teoretično ozadje obravnavane teme

Sintezo molekule NO v endotelnih celicah žil sprožijo kemični (npr. hormoni, acetilholin

(ACh), bradikinin) ali mehanski stimuli (npr. strižna napetost krvi na površini endotelne plasti

žil). Le-ti vplivajo na aktivacijo encima eNOS, ki poteka ali preko vezave kompleksa

Ca2+/kalmodulin (Ca2+/CaM) nanj ali preko njegove fosforilacije z od cAMP odvisno

proteinsko kinazo (PKA) (slika 2). NO nastaja kot stranski produkt encimske reakcije, v kateri

se aminokislina L-arginin (L-Arg) s pomočjo aktivne oblike eNOS pretvarja v citrulin.

Molekula NO nato difundira preko membran v GMC, kjer aktivira encim sGC. Aktivna oblika

tega encima pa katalizira pretvorbo GTP v cGMP in pirofosfat (slika 2) [2].

NO preko sekundarnega prenašalca cGMP posredno regulira delovanje cGK in proteinov

ionskih kanalov, ki regulirajo pretok različnih ionov (Ca2+, Na+, K+, Cl-) preko celične

membrane [2].

Po pregledu različnih virov naj bi sekundarni prenašalec cGMP sam ali pa posredno preko

aktivne oblike encima PKG in deloma tudi preko encima PKA vplival na regulacijo

prepustnosti od Ca2+ odvisnih kanalov za K+ in Cl- na celični membrani, na aktivnost

izmenjevalcev Na+/Ca2+ in aktivnosti črpalk Na+/K+-ATP-az na celični membrani. Vpliva pa

tudi na regulacijo prepustnosti kanalov tipa L za Ca2+ na celični membrani (posredno preko

encima PKA – kontraktilni učinek), na aktivnost encima MLCK (posredno preko encima PKA

– relaksacijski učinek) in encima MLCP, na prepustnost kanalov ICICR v SR in aktivnosti

črpalk SERCA na SR. Z regulacijo vseh navedenih mehanizmov se zmanjša koncentracija Ca2+

4

v citoplazmi in odzivnost kontraktilnega mehanizma na Ca2+, kar oboje posledično vodi do

relaksacije GMC arterij (slika 2) [1, 2, 5, 6].

Slika 2. Signalna pot dušikovega oksida (NO). Pomen oznak: acetil holin (ACh), ciklični adenozin monofosfat

(cAMP), ciklični gvanozin monofosfat (cGMP), črpalka Ca2+-ATP-aza v celični membrani (PMCA; ang. plasma

membrane Ca2+-ATPase), črpalka Ca2+-ATP-aza v membrani sarkoplazemskega retikuluma (SERCA), encim

fosfataza lahkih verig miozina (MLCP), encim kinaza lahkih verig miozina (MLCK), endotelijska sintaza

dušikovega oksida (eNOS), fosfolamban (PLB), gvanozin trifosfat (GTP), inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3), IP3-

receptorski kanal (IP3-R) oz. t.i. kanal tipa ICICR (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release), kompleksi

Ca2+/kalmodulin (Ca2+/CaM), L-arginin (L-Arg), molekula kisika (O2), napetostno odvisni Ca2+ kanali (VOCC;

ang. voltage-operated calcium channels), protein kinaza A (PKA), protein kinaza G (PKG) in topna gvanilat

ciklaza (sGC), ioni natrija (Na+), klora (Cl-), kalcija (Ca2+) in kalija (K+) [2, 7, 9].

Vsi učinki cGMP oz. PKG na ionske kanale, izmenjevalce in črpalke bodisi na membrani celice,

bodisi na membrani SR naj bi vodili do znižanja koncentracije znotrajceličnega Ca2+. S

koncentracijo Ca2+ je namreč povezana magnituda sile v GMC. Če je koncentracija Ca2+ višja,

5

se razvije večja sila (do saturacije). Od količine Ca2+ je namreč odvisna količina aktivne oblike

encima MLCK, na katerega se vežejo kompleksi Ca2+/CaM in ga aktivirajo. Encim MLCK pa

fosforilira lahke verige miozina (MLC) oz. poenostavljeno kar miozin. Le fosforiliran miozin

pa lahko aktivno generira silo v GMC. Vsi mehanizmi, ki torej zmanjšujejo količino Ca2+ v

celici, vodijo do relaksacije GMC (če ni drugih mehanizmov, ki bi vplivali na kontrakcijo

GMC).

V manjši meri lahko cGMP aktivira tudi encim PKA, ki ga sicer primarno aktivira cAMP.

Aktivna oblika encima PKA fosforilira encim MLCK, kar zmanjša afiniteto do kompleksov

Ca2+/CaM in posledično se zmanjša hitrost fosforilacije miozina, kar vodi do relaksacije

(slika 2) [3, 10]. Ker pa naj bi aktivna oblika encima PKA povečevala prepustnost kanalov tipa

L za Ca2+ na celični membrani, bi se naj ta dva mehanizma nekako izničila. Drugače pa je v

GMC dihalnih poti, kjer kanali tipa L niso tako izraženi. Tam ima aktivacija encima PKA

močan relaksacijski učinek, kar se s pridom izkorišča za bronhodilacijo z beta-adrenergičnimi

agonisti.

Aktivna oblika encima PKG na specifičnih mestih fosforilira encim MLCP. Razlika med

fosforilacijo encimov MLCK in MLCP je v tem, da se ob fosforilaciji aktivnost encima MLCP

poviša, medtem ko se aktivnost encima MLCK zniža. Oba procesa pa vodita do relaksacije.

Mehanizem tovrstne aktivacije encima MLCP je precej zapleten, pa vendar ga z nekaj besedami

opišimo. Encim MLCP je v času holinergične stimulacije, ki je najpogostejša vrsta stimulacije

GMC žil, delno inhibiran. Ob tovrstni stimulaciji se namreč aktivirajo različni encimi (RhoK,

ZipK, PKC…), ki fosforilirajo encim MLCP na specifičnih mestih, ta fosforilirana mesta na

encimu MLCP pa zaradi konformacijskih značilnosti encima predstavljajo substrat za

katalitično podenoto encima samega. To pomeni, da encim defosforilira samega sebe, namesto

da bi defosforiliral miozin oz. MLC. S tem je zmanjšana hitrost defosforilacije miozina, kar

vodi do razvoja večje sile v GMC. Vloga encima PKG v tem procesu pa je, da aktivna oblika

encima PKG fosforilira encim MLCP na takih specifičnih mestih na encimu, ki onemogočajo

fosforilacijo encima MLCP na avtoinhibitornih mestih. Na ta način se zviša aktivnost encima

MLCP in posledično zviša tudi hitrost defosforilacije miozina, kar vodi do relaksacije.

V tem delu se bomo osredotočili na modeliranje vpliva cGMP na prepustnost kanalov ICICR

za izpust Ca2+ iz SR, na aktivnost SERCA za črpanje Ca2+ v SR in na aktivnost encima MLCP,

ki fosforilira miozin in vpliva na količino na aktin pripetih miozinskih glav, ki aktivno

generirajo silo.

3 Izhodiščni model za od kalcija odvisni razvoj sile v gladkih mišicah celic

arterij pod vplivom cGMP

Model [4], obravnavan v magistrskem delu Nine Šutar, je bil delno povzet po modelu Jacobsena

in sod. [5] ter Kapele in sod. [6], nekatere mehanizme pa so v magistrskem delu modelirali

sami. Modela Jacobsena in sod. ter Kapele in sod. obravnavata zgolj znotrajcelično kalcijevo

6

signalizacijo, model v magistrskem delu Nine Šutar, ki ga v tem delu vzamemo za izhodiščni

model, ki ga bomo nadgradili, pa vključuje tudi model za razvoj sile. Enačbe bomo reševali

numerično z metodo Runge Kutta 4. reda v programu Berkely Madonna 8.3.18 [4].

Razlog za nadgradnjo izhodiščnega modela je, da le-ta ne napove ustrezno magnitude sile pri

visokih koncentracijah cGMP v celici. Model ustrezno napove padec sile z višanjem

koncentracije cGMP zgolj v področju nizkih vrednosti, tj. med približno 0,01 in 6 mmol/m3, ne

pa tudi pri visokih vrednostih, tj. med približno 6 in 100 mmol/m3 (slika 3) [4]. Za enoto

koncentracije v nadaljevanju ves čas uporabljamo zapis mol/m3, pri čemer je 1 mmol/m3 enako

1 µmol/L, kar se krajše zapiše kot 1 µM. V nadaljevanju bomo opisali model v [4].

Slika 3. Odvisnost velikosti sile v GMC (FGMC_final) od znotrajcelične koncentracije cGMP ([cGMP]), kot jo napove

izhodiščni model [4].

V modelu upoštevamo električne tokove preko celične membrane, molarne tokove Ca2+ preko

membrane SR ter izmenjavo Ca2+ s proteini v citoplazmi in SR. Seznam tokov vključno z

oznakami, ki jih bomo uporabljali v nadaljevanju, je v tabeli 1.

Tri glavne modelne spremenljivke so: koncentracija Ca2+ v citoplazmi 2

CCa ,

koncentracija Ca2+ v SR ( 2

SRCa in membranska napetost oz. membranski potencial (Vm). V

model pa so vključene še naslednje spremenljivke: koncentracijo prostih vezavnih proteinov v

citoplazmi ([Pr]C) in v SR ([Pr]SR), koncentracija proteinov, na katere je vezan Ca2+ v

citoplazmi ([PrCa]C) ter koncentracija proteinov, na katere je vezan Ca2+ v SR ([PrCa]SR). Za

vse modelne spremenljivke so zapisali diferencialno enačbo prvega reda, ki opisuje hitrost

spremembe posamezne spremenljivke. Poleg tega je model za opis znotrajcelične kalcijeve

signalizacije sklopljen še z modelom za od Ca2+/CaM odvisno aktivacijo encima MLCK in

7

razvojem sile v GMC, ki je v celoti povzet po modelu Fajmuta in sod. [11] in temelji na modelu

Haia in Murphyja [10]. Celoten model vsebuje 21 diferencialnih enačb prvega reda, prav toliko

spremenljivk in 151 parametrov.

Vrsta tokov Oznaka Opis

električni tokovi preko

celične membrane

VOCCI tok Ca2+ skozi napetostno regulirane Ca2+ kanale

(VOCC; ang. voltage-operated calcium channels)

CaClI tok Cl- skozi od Ca2+ odvisne Cl- kanale

CaKI tok K+ skozi od Ca2+ odvisne K+ kanale

NCXI tok Na2+ in Ca2+ skozi izmenjevalce Na+ in Ca2+ (NCX)

Na/KI tok Na+ in K+ skozi črpalke Na+/K+-ATP-aze

PMCAI tok Ca2+ skozi črpalke Ca2+-ATP-aze (PMCA; ang.

plasma membrane Ca2+-ATPase

pas_NaI , pas_KI ,

pas_ClI , pas_CaI pasivni tokovi ionov: Na+, K+, Cl- in Ca2+

molarni tokovi Ca2+ preko

membrane SR

ICICRJ tok Ca2+ skozi od IP3 in od Ca2+ odvisne kanale ICICR

oz. IP3-R

SERCAJ tok Ca2+ skozi črpalke SERCA

pas_SRJ pasivni tok Ca2+ v citoplazmo skozi pore v membrani

SR (t. i. pasivni tok)

izmenjava Ca2+ s proteini v

citoplazmi in SR

PrCJ neto tok vezave/disociacije Ca2+ na/z vezavnih

proteinov (PrC)

PrSRJ neto tok vezave/disociacije Ca2+ na/z vezavnih

proteinov (PrSR) v SR

Tabela 1. Električni tokovi preko celične membrane, molarni tokovi Ca2+ preko membrane SR ter izmenjava Ca2+

s proteini v citoplazmi in SR [4].

Z modelom obravnavamo pritekajoče in odtekajoče tokove Ca2+ v oz. iz citoplazme. Pritekajoči

tokovi so: neto molarni tok Ca2+ preko celične membrane (JPM), tok Ca2+ preko kanalov ICICR

na membrani SR (JICICR), pasivni tok Ca2+ preko membrane SR (JpasSR) in tok sproščanja z

vezavnih proteinov v citoplazmi (JPrC_OFF). Odtekajoča tokova pa sta: tok vezave Ca2+ na

vezavne proteine v citoplazmi (JPrC_ON) in tok Ca2+ preko črpalk SERCA (JSERCA).

Hitrost spremembe koncentracije Ca2+ v citoplazmi 2

C

d Ca dt je enaka razliki vsote

pritekajočih in odtekajočih tokov Ca2+ v citoplazmo celice in iz nje, kar opišemo z navadno

diferencialno enačbo 1. reda:

OFF ON

2

CPM ICICR pasSR PrC PrC SERCA( ) ( )

d CaJ J J J J J

dt. (1)

8

V modelu je privzeto, da je Vm po celotni membrani celice enak, hitrost spreminjanja

membranskega potenciala na celični membrani mdV dt pa je odvisna od vsote električnih

tokov ionov v celico in iz nje:

Ca CaNa/K PMCA NCX VOCC Cl K pas

m

m 1(

x

x

dVI I I I I I I

dt C ,

(2)

pri čemer pasxI označuje pasivne ionske tokove, kjer x označuje vrsto posameznega iona,

mC

pa je kapaciteta celotne celične membrane.

V izhodiščnem modelu je SR privzet kot enovita shramba, ki predstavlja 5 % volumna celice

in vsebuje kanale ICICR ter črpalke SERCA, ki pričnejo ob povišani koncentraciji Ca2+ v

citoplazmi le-tega črpati nazaj v SR in s tem poskrbijo, da se kalcijeva shramba SR povsem ne

izprazni. Vendar pa izhodiščni model ne upošteva vpliva cGMP na izmenjavo Ca2+ med

citoplazmo in shrambami za Ca2+. Z izhodiščnim modelom torej ne opišemo toka Ca2+ preko

črpalk SERCA in kanalov ICICR v odvisnosti od cGMP ter ne upoštevamo vpliva cGMP na

aktivnost encima MLCP.

V nadaljevanju bomo zapisali zgolj tiste enačbe izhodiščnega modela, ki jih bomo v seminarju

nadgradili (glej poglavje 4).

3.1 Tokovi kalcija preko membrane sarkoplazemskega retikuluma

Neto molarni tok Ca2+ iz SR v citoplazmo je v izhodiščnem modelu zapisan kot razlika vsote

pritekajočih tokov (ICICRJ , pas_SRJ ) in odtekajočega toka (

SERCAJ ):

SR ICICR pas_SR SERCAJ J J J . (3)

V našem delu bomo nadgradili izraza za tok skozi črpalke SERCA in tok skozi kanale tipa

ICICR. Tok Ca2+ skozi črpalke SERCA je v izhodiščnem modelu modeliran z izrazom:

2

CSERCA SR,V SERCA

2

SERCAC

n

nn

CaJ R r

Ca k

,

(4)

pri čemer je SERCAr maksimalna hitrost črpanja Ca2+ skozi črpalke SERCA, n je Hillov

koeficient, SERCAk je konstanta polovične zasičenosti in SR,VR je razmerje volumnov SR in

citoplazme.

Tok skozi kanale tipa ICICR je v izhodiščnem modelu modeliran z izrazom:

9

2 2

ICICR SR,V ICICR ICICR SR C( )J R r P Ca Ca , (5)

kjer je ICICRr hitrostna konstanta za izpust Ca2+ iz SR v citoplazmo skozi kanale tipa ICICR.

ICICRP je verjetnost za odprtost kanalov ICICR, ki je direktno odvisna od koncentracij IP3 v

citoplazmi ([IP3]) in Ca2+ v SR ([Ca2+]SR) ter od deleža odprtih kanalov s hitro kinetiko (Af ) in

deleža aktivnih kanalov s počasno kinetiko (I1 f ):

SRIP3

IP SRIP3 3 SR

3

2

3

ICICR A 12

3 IP SRSR

(1 )

nn

SR

n nn n

CaIPP f f

IP k Ca k

,

(

(6)

kjer sta 3IPk in

SRk konstanti polovične zasičenosti, SRn in

3IPn pa Hillovi konstanti.

Delež odprtih kanalov s hitro kinetiko se s časom skoraj ne spreminja, zato privzamemo, da je

kar enak ravnovesni vrednosti ( Af ), ki pa je odvisna od koncentracije Ca2+ v citoplazmi:

A

AA

2

CA

2

C

x

xx

A

Caf

Ca k

,

(7)

kjer je Ak konstanta polovične zasičenosti za 2

CCa in

Ax Hillov koeficient v mehanizmu

aktivacije kanala v odvisnosti od 2

CCa .

Delež odprtih kanalov s počasno kinetiko je izražen z deležem zaprtih kanalov (If ). Ker je

proces zapiranja teh kanalov počasnejši, se delež zaprtih kanalov počasi spreminja s časom,

zaradi česar je ta spremenljivka izražena z diferencialno enačbo:

I I I

I

df f f

dt

,

(8)

kjer je I karakteristični čas inhibicije kanala ICICR, delež zaprtih kanalov v ravnovesnem

stanju ( If ) pa je podan z izrazom:

I2

CI

2

C

II

x

xx

I

Caf

Ca k

,

(9)

10

kjer je Ix Hillov koeficient v mehanizmu inhibicije kanala v odvisnosti od 2

CCa in

Ik

konstanta polovične zasičenosti za 2

CCa v procesu inhibicije.

V obeh izrazih (enačba (7) in enačba (9)) nastopa koncentracija 2

CCa kot spremenljivka, pri

čemer se mehanizem zapiranja kanalov aktivira pri višjih, mehanizem za odpiranje pa pri nižjih

koncentracijah 2

CCa . To razliko ustvarjata različni vrednosti konstante polovične

zasičenosti v Hillovi funkciji Ik oz.

Ak ter različna Hillova koeficienta Ix oz.

Ax . I predstavlja

karakteristični čas za zaprtje kanalov s počasnejšo kinetiko. Na ta način je graf odprtih kanalov

ICICRP v odvisnosti od 2

CCa ˝zvonasta˝ krivulja.

3.2 Modeliranje razvoja sile v gladki mišični celici arterij

Kontrakcija oz. relaksacija gladkih mišic je direktno odvisna od interakcij med aktinom in

miozinom, kar je regulirano s procesoma fosforilacije MLC z encimom MLCK in

defosforilacije MLC z encimom MLCP [2].

Do skrčitve mišic pride po tem, ko se različni kompleksi Ca2+/CaM vežejo na encim MLCK in

ga aktivirajo. Aktivna oblika tega encima, na katerega mora biti vezan Ca4CaM, nato fosforilira

MLC (oz. miozin (M) na sliki 4), s čimer se vzpostavi interakcija med aktinom (A) in miozinom

(slika 4) [12]. Istočasno poteka tudi proces defosforilacije MLC z encimom MLCP, ki pa je od

Ca2+ neodvisen. V primeru, ko je koncentracija Ca2+ v citoplazmi visoka, je hitrejši proces

fosforilacije, kar vodi do razvoja sile, v nasprotnem primeru pa je hitrejši proces defosforilacije,

kar vodi do relaksacije.

Slika 4. Dopolnjeni 4-stanjski model Hai-a in Murphy-a za razvoj aktivne sile v gladki mišični celici. A in M sta

prosti nepovezani obliki aktina in miozina, Mp je fosforiliran prost miozin, AMp je fosforiliran miozin, ki je pripet

na aktinski filament, AM pa predstavlja kompleks defosforiliranega miozina pripetega na aktin (t. i. zaskočeni

prečni mostiček). MLCK je encim kinaza lahkih verig miozina, MLCP je encim fosfataza lahkih verig miozina,

PKG je protein kinaza G, Ca2+/CaM pa predstavlja različne komplekse kalcija in kalmodulina. Povzeto po [12].

11

Pri opisu od Ca2+ odvisnega razvoja sile v GMC je pri izhodiščnem modelu uporabljen model

Fajmuta in sod. [11], ki opisuje aktivacijo MLCK in je nadgrajeni 4-stanjski model Haia in

Murphyja [10]. Pri izhodiščnem modelu sta hitrosti defosforilacije fosforiliranega miozina, ki

je vezan na aktin (AMp) *

2k , ali pa je prost (Mp) *

5k enaki in opisani z enačbo:

catD_mlcp tot*

2

mD

k MLCPk

K Mp AMp

,

(10)

pri čemer je catD_mlcpk hitrostna katalitična konstanta, mDk Michaelis-Mentenina konstanta,

totMLCP totalna koncentracija encima MLCP, [Mp] in [AMp] pa sta koncentraciji

fosforiliranega miozina, pri čemer je prvi prost, drugi pa vezan na aktinski filament.

4 Nadgrajeni model

V modelu, ki smo ga opisali v prejšnjem poglavju, nadgradimo izraze za JSERCA in JICICR v

odvisnosti od cGMP ter z vplivom cGMP na aktivnost encima MLCP ( *

2k oz. *

5k ). V tem

poglavju so v podpoglavjih opisane posamezne komponente, ki smo jih dodali v izhodiščni

model.

Pri nadgradnji modela se soočimo z nekaterimi omejitvami. Z modelom namreč opišemo manj

raziskane procese, zato v modelu uporabljene vrednosti parametrov niso natančno definirane.

Prav tako model ne upošteva difuzije ionov in v vseh primerih modeliramo direktni vpliv cGMP

na tarčne mehanizme, čeprav vemo, da v več primerih cGMP deluje posredno preko aktivacije

encima PKG, ki s fosforilacijo tarčnih proteinov vpliva na njihovo delovanje.

4.1 Tok kalcija skozi črpalke SERCA

Črpalke SERCA regulirajo prehod Ca2+ ionov iz citoplazme v SR. Že v 80. in 90. letih 20.

stoletja so ugotovili, da encima PKG in PKA fosforilirata fosfolamban (PLB). PLB je protein,

ki je vezan na SERCA in vpliva na njegovo strukturo in s tem tudi na hitrost prečrpavanja Ca2+

v SR. Encima PKA ali PKG fosforilirata PLB na aminokislini Ser-16 in s tem povzročita ločitev

PLB od SERCA, s čimer se zviša aktivnost črpanja Ca2+ v SR (slika 2) [1]. Dosedanji modeli

tega vpliva niso upoštevali.

PLB je membranski protein z atomsko maso 5 kDa in pentamerno obliko in je vezan na črpalke

SERCA tipa II, ki so pretežno izražene v mišičnih celicah srca in gladkih mišičnih celicah ter

še nekaterih drugih tkivih. Vezava PLB na SERCA alosterično inhibira SERCA, s čimer se

zmanjša transport Ca2+ iz citoplazme v SR. To naj bi vodilo do zvišanja koncentracije

znotrajceličnega kalcija in posledično do skrčitve mišičnih celic [7, 13].

12

Leta 2002 so naredili podrobno raziskavo na GMC govejih trahej, pri čemer so ugotovili, da je

SERCA II v membrani SR povezana še z nekaterimi drugimi proteini in sicer z α-aktinom,

kalponinom H1 in PLB. Prav tako so ugotovili, da od cGMP odvisna proteinska kinaza (PKG)

fosforilira PLB, kar vodi do ločitve proteina PLB od SERCA II [13].

V raziskavi iz leta 2013 so na umetnih membranah in na membranah izvzetih iz SR srčnih

miocitov preučevali vpliv povezave med SERCA in PLB, t. i. kompleksa SERCA/PLB, na

hitrost prečrpavanja Ca2+. Ugotovili so, da je aktivnost SERCA odvisna od molarnega razmerja

SERCA:PLB (slika 5), ki določa konformacijsko obliko črpalk SERCA in s tem njihovo

aktivnost [7].

Molarno razmerje SERCA:PLB, ki znaša 1:0, predstavlja stanje SERCA z najvišjo hitrostjo

prečrpavanja Ca2+ iz citoplazme v SR (SERCAv ). Temu stanju ustreza krivulja SERCA_1:0v ,

označena s črno barvo na sliki 5. Molarno razmerje SERCA:PLB, enako 1:5, pa predstavlja

stanje SERCA z najmanjšo aktivnostjo. Temu ustreza krivulja SERCA_1:5v , označena z modro

barvo na isti sliki, povzeti po viru [7]. V raziskavi so ugotovili, da se razmerje SERCA:PLB

spremeni pri β-adrenergični stimulaciji srčnih miocitov. Tovrstna stimulacija v preučevanih

celicah sproži produkcijo sekundarnega prenašalca cAMP, ki aktivira encim PKA, ta pa

fosforilira PLB na Ser-16 in s tem povzroči spremembo njegove konformacije v t. i. stanje B,

v katerem PLB disociira s SERCA. Na ta način se zmanjša inhibicija SERCA, kar poveča hitrost

črpanja Ca2+ v SR [7].

Slika 5. Normalizirana aktivnost črpalk SERCA oz. hitrost črpanja Ca2+ ( SERCAv ) v odvisnosti od koncentracije

Ca2+ ([Ca2+]), pri različnih molarnih razmerjih kompleksa SERCA:PLB; točke: eksperimentalne meritve [7];

krivulje: prilagojene Hillove funkcije (enačba (11)). Parametri so podani v tabeli 2.

Izmerjenim vrednostim na sliki 5 prilagodimo Hillovo funkcijo:

13

2

SERCA max2

m

n

nn

Cav v

k Ca

,

(11)

ki opisuje aktivnost encima, izmerjenim vrednostim na sliki 5 in določimo parametre vmax

(maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi SERCA), km (Michaelis-Mentenina konstanta

polovične zasičenosti za 2

CCa ) in n (Hillov koeficient). Parametre določimo za vse tri

meritve posebej. Vrednosti so podane v tabeli 2.

razmerje

SERCA:PLB

vmax km [mmol/m3] n

1:0 1,02 0,34 1,43

1:1 1,03 0,68 1,49

1:5 1,03 0,84 1,55

Tabela 2. Vrednosti Hillovega koeficienta (n), Michaelis-Mentenine konstante polovične zasičenosti za 2

CCa

(km) in maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi SERCA (vmax), ki jih pri različnih molarnih razmerjih

SERCA:PLB dobimo s prilagoditvijo Hillove funkcije (enačba (11)) izmerjenim vrednostim vSERCA v odvisnosti

od koncentracije 2Ca [7].

Ugotovimo, da se parametra vmax in n pri različnih molarnih razmerjih SERCA:PLB bistveno

ne razlikujeta, se pa bistveno spremeni parameter km, ki se v primerih molarnih razmerij 1:0 in

1:5 razlikuje za faktor približno 2 (tabela 2). Da bi v razponu fizioloških koncentracij cGMP,

ki so tipično med 0,1 in 1 mmol/m3, dosegli znižanje parametra kSERCA za faktor 2 in približno

linearen odziv v logaritemski skali, določimo vrednosti kSERCA tako, da se z vsako spremembo

cGMP za faktor 10, kSERCA spremeni za približno faktor 2 (tabela 3). Tem točkam prilagodimo

Hillovo funkcijo, ki ima naslednjo obliko:

_

SERCA SERCA_init SERCA_end SERCA_init __

d_cGMP

n c

n cn c

cGMPk k k k

K cGMP

,

(12)

pri čemer je kSERCA_init začetna, kSERCA_end pa končna vrednost parametra kSERCA, _n c Hillova

konstanta in Kd_cGMP konstanta polovične zasičenosti. Pri tem za vrednost kSERCA_init uporabimo

enako vrednost kot v izhodiščnem modelu (poglavje 3), končna vrednost kSERCA_end pa je

približno za velikostni razred manjša. Na prvi pogled se sicer zdi, kot da je modelna odvisnost

kSERCA od [cGMP] nekoliko prevelika v primerjavi z izmerjenimi vrednostmi, vendar je

potrebno omeniti, da je bil v eksperimentu [7] uporabljen modificiran PLB (zgolj peptid), ki je

raziskovalcem omogočal, da so sploh izvedli meritve. V takih primerih so odzivi sistema

navadno veliko manjši kot v primerih, ko bi učinkovale nemodificirane molekule.

14

3

mmol/mcGMP 3

SERCAmmol/mk

0,01 7,0·10-2

0,1 3,5·10-2

1 1,5·10-2

10 0,7·10-2

Tabela 3. Izbrane vrednosti polovične zasičenosti za koncentracijo Ca2+ v citoplazmi (kSERCA) pri izbranih

fizioloških vrednostih kocentracije cikličnega gvanozin monofosfata ([cGMP]).

Slika 6. Odvisnost polovične zasičenosti za koncentracijo Ca2+ v citoplazmi (kSERCA) od koncentracije cikličnega

gvanozin monofosfata ([cGMP]); točke: eksperimentalne meritve [5]; krivulja: prilagojena Hillova funkcija

(enačba (12)). Parametri: začetna polovična zasičenost za 2

CCa (kSERCA_init = 7,0·10-2 mmol/m3), končna

polovična zasičenost za koncentracijo 2

CCa (kSERCA_end = 1,0·10-3 mmol/m3), Hillov koeficient v odvisnosti

aktivnosti črpalke SERCA od koncentracije 2

CCa ( _n c = 1,2), disociacijska konstanta polovične zasičenosti

za cGMP (Kd_cGMP = 9,0·10-2 mmol/m3).

Enačbo (12), s parametri zapisanimi v opisu slike 6, vstavimo v nadgrajeni model, pri čemer je

parameter kSERCA po novem izražen kot funkcija [cGMP].

4.2 Tok kalcija skozi od IP3 odvisne kanale ICICR

Ob holinergični stimulaciji se Ach veže na muskarinske receptorje, ki se nahajajo v plazemski

membrani in so povezani z G-proteinom, kar pospeši proizvodnjo sekundarne signalne

molekule IP3, ki se veže na IP3-R receptor kanalov ICICR. Le-ta se nato veže na receptorje v

membrani SR, kar povzroči odprtje kanalov za izpust Ca2+ v citoplazmo, koncentraciji Ca2+ v

citoplazmi in SR pa nadalje regulirata odprtost teh kanalov. Od tod tudi ime za te kanale »z IP3

15

in s Ca2+ inducirani kanali za izpust Ca2+« (ang. IP3 and Ca2+ induced Ca2+ release, ICICR), ki

jih nekateri imenujejo tudi kanali IP3-R (slika 2) [4].

Leta 2000 so naredili raziskavo, s katero so pokazali, da sta signalna pot NO in signalna pot

IP3, ki se veže na kanale IP3-R med seboj povezani. Regulacija naj bi potekala posredno preko

od NO odvisne fosforilacije oz. defosforilacije proteina, ki je povezan s kanalom IP3-R in se

fosforilira pod vplivom encima PKG (IRAG), kar posledično vpliva na prepustnost kanalov

IP3-R. Encim, ki fosforilira protein IRAG je PKG (oz. natančneje izoforma cGKI-β), katerega

aktivna količina je odvisna od cGMP, le-ta pa od količine NO. Raziskovalci so ugotovili, da je

ob fosforiliranem proteinu IRAG prepustnost Ca2+ skozi kanale IP3-R veliko manjša kot ob

nefosforiliranem proteinu IRAG. Z rezultati raziskav, ki so jih opravili na GMC aorte, sapnika

in maternice, so pokazali, da je bila fosforilacija proteina IRAG deloma odgovorna za znižanje

znotrajceličnega Ca2+, kar je vodilo do relaksacije GMC v teh tkivih [14].

Leta 2002 so opravljali študije [8] na gladkih mišicah žil. Ugotovili so, da encima PKG in PKA

fosforilirata kanale IP3-R in jih s tem posledično inhibirata. Opravljeni eksperimenti »in vitro«

pa so pokazali, da samo encim PKG (oziroma njegovi izoformi cGKI-α in cGKI-β) fosforilirata

kanale IP3-R, pri čemer izoforma cGKI-β spoji protein IRAG s kanalom IP3-R tipa I. cGKI-α

najdemo v človeških, govejih, zajčjih in mišjih tkivih in je 10-krat bolj občutljiv za aktivacijo

s cGMP kot cGKI-β in je tudi bolj dovzeten za aktivacijo s prenašalcem cAMP [8].

Z opravljenimi eksperimenti na mikrosomih gladkih mišic želodca [8] so kot rezultat predstavili

normirani tok Ca2+ skozi kanale IP3-R tipa I v odvisnosti od koncentracije IP3 [IP3] v kontrolni

skupini in ob dodani aktivni obliki encima PKG oz. njegove izoforme cGKI-α [8].

Slika 7. Normirani tok Ca2+ skozi kanale IP3-R tipa I ICICR( )J v odvisnosti od koncentracije prenašalca [IP3] v

kontrolni skupini (črna krivulja) in ob dodani aktivni obliki encima PKG oz. njegove izoforme cGKI-α (rdeča

krivulja). Eksperiment je bil izveden na mikrosomih gladkih mišic želodca [8]. Vrednosti parametrov, ki jih

dobimo, če meritvam prilagodimo Hillovo funkcijo: črna krivulja: vmax = 105, 3d_IP _cGMPk = 1,49·10-3 mmol/m3 in

m = 0,45, rdeča krivulja: vmax = 100, 3d_IP _cGMPk = 2,39 mmol/m3 in m = 0,41.

16

Meritvam prikazanim na sliki 7, prilagodimo Hillovo funkcijo oblike

3

3

ICICR max

d_IP _cGMP 3

m

mm

IPv v

k IP

,

(13)

kjer je vmax normirana maksimalna hitrost prenosa Ca2+ ionov skozi kanal, kd_IP3_cGMP konstanta

polovične zasičenosti in m Hillov koeficient. Vrednosti parametrov za krivulji, ki jih dobimo,

če meritvam prilagodimo Hillovo funkcijo so podani pri sliki 7.

Vidimo, da se je konstanta polovične zasičenosti kd_IP3_cGMP ob prisotnosti aktivne oblike

cGKI-α spremenila za faktor več kot 1000. V modelu zato uvedemo normirni faktor Rk_IP3, ki

bo konstanto polovične zasičenosti kIP3 v enačbi (6) spremenil z začetne vrednosti za faktor

1000. Glede na to, da v viru [11] ni natančnega podatka o koncentraciji encima cGKI-α, pri

kateri je bil izveden eksperiment, sklepamo, da je bila količina uporabljenega aktivnega encima

na zgornji meji fizioloških koncentracij, kar posledično velja tudi za cGMP. Privzamemo, da je

vrednost normirnega faktorja 1000 dosežena pri vrednosti [cGMP] = 10 mmol/m3. Izhodiščna

vrednost normirnega faktorja 1 pa je dosežena pri koncentraciji, ki je za velikostni razred pod

normalno fiziološko koncentracijo cGMP, t. j. pri 0,01 mmol/m3. Da bi imeli tri točke, kar je

minimum, če želimo prilagoditi Hillovo funkcijo, ki ima tri parametre, tretjo točko izberemo na

sredini intervala fizioloških vrednosti koncentracije cGMP, ki je med 0,1 in 1 mmol/m3 (t. j. pri

0,5 mmol/m3) ter tej točki pripišemo polovično vrednost normirnega faktorja (glej tabelo 4).

Na ta način je odzivnost sistema v področju fizioloških koncentracij cGMP največja.

3

mmol/mcGMP k_IP3R

0,01 1

0,5 500

10 1000

Tabela 4. Izhodiščne vrednosti za izračun normirnega faktorja za polovično zasičenost odprtosti kanalov tipa

ICICR od količine prenašalca IP3 v enačbi (6) (Rk_IP3) v odvisnosti od koncentracije [cGMP].

S prilagoditvijo Hillove funkcije oblike:

3 3

3

k_IP k_IP max

d_IP

h

h h

cGMPR R

cGMP k

(14)

točkam iz tabele 4 (glej sliko 8) določimo parametre te funkcije. To so: maksimalna vrednost

Rk_IP3 (Rk_IP3max), konstanta polovične zasičenosti kd_IP3 in Hillov koeficient h. Vrednosti teh

parametrov so: Rk_IP3max = 1000, h = 3,2 in 3d_IP _cGMPk = 0,5 mmol/m3.

17

Slika 8. Funkcijska odvisnost normirnega faktorja za polovično zasičenost odprtosti kanalov tipa ICICR od

količine IP3 v enačbi (6) (Rk_IP3) v odvisnosti od [cGMP]. Krivulja je prilagojena Hillova funkcija (14), s parametri:

Rk_IP3max = 1000, h = 3,2 in 3d_IP _cGMPk = 0,5 mmol/m3.

Parameter polovične zasičenosti kIP3 v enačbi (6) izrazimo kot:

3 3 3IP IP _init k_IP k k R , (15)

pri čemer je vrednost parametra kIP3_init enaka vrednosti parametra kIP3 iz izhodiščnega modela

in znaša 6,5 mmol/m3.

4.3 Razvoj sile v gladki mišični celici - vpliv na encim MLCP in posledično na

hitrost defosforilacije miozina

Magnituda razvoja sile v gladkih mišicah žil je predvsem odvisna od količine fosforiliranih, na

aktinski filament vezanih miozinskih glav (prečnih mostičkov). Količina le-teh je uravnavana

s stopnjo fosforilacije dela proteina miozina MLC, ki pa jo regulirata encima MLCK in MLCP

[2]. Količino aktivnega encima MLCK regulira koncentracija znotrajceličnega Ca2+ preko

vezave na protein CaM, aktivnost encima MLCP pa je tudi odvisna od različnih specifičnih

fosforilacij na samem encimu MLCP. Eno izmed fosforilacij katalizira tudi od cGMP odvisen

encim PKG, kar zviša aktivnost encima MLCP.

Učinek cGMP na encim MLCP v našem nadgrajenem modelu povzamemo po modelu Yanga

in sod. [2]. To naredimo z uporabo normalizacijskega faktorja, ki je odvisen od koncentracije

prenašalca cGMP (RcGMP), ki modulira katalitično aktivnost encima MLCP (kcatD).

Normalizacijski faktor RcGMP mora zadoščati dvema pogojema. Ko je koncentracija cGMP

majhna, aktivnosti encima PKG ni, pri čemer tudi ni učinkov na aktivnost encima MLCP. Zato

sem mora v primeru manjšanja koncentracije cGMP vrednost R približevati 0. Ko je

koncentracija cGMP velika, je aktivnost encima PKG maksimalna, pri čemer je tudi učinek na

18

aktivnost encima MLCP maksimalen. Pri velikih koncentracijah [cGMP] gre torej vrednost R

proti 1. Na ta način obravnavamo cGMP kot molekularno stikalo, ki preko vpliva na aktivnost

encima PKG učinkuje na tarčne proteine. Pri tem je upoštevano, da je od cGMP odvisen proces

aktivacije encima PKG hiter proces v primerjavi s procesi v kontraktilnem aparatu, zaradi česar

v enačbah ne nastopa količina aktivnega encima PKG temveč kar koncentracija prenašalca

cGMP.

Odvisnost normalizacijskega faktorja RcGMP opišemo s Hillovo enačbo [2]:

H

H HcGMP

m_cGMP

n

n n

cGMPR

cGMP K

,

(16)

kjer je Km_cGMP konstanta polovične zasičenosti in Hn Hillov koeficient. Vrednosti teh dveh

parametrov (tabela 5) sta povzeti po [2].

Parameter Vrednost

m_cGMPK 31 mmol/m

Hn 2

Tabela 5. Vrednosti parametrov m_cGMPK (konstanta polovične zasičenosti) in Hn (Hillov koeficient) v enačbi

(16) povzamemo po viru [2].

Katalitična hitrostna konstanta encima MLCP (kcatD_mlcp) se izraža na sledeč način:

catD_mlcp catD_mlcpB catD_mlcpC cGMPk k k R ,

(17)

pri čemer je kcatD_mlcpB bazalna katalitična hitrostna konstanta ob odsotnosti prenašalca cGMP

oz. aktivnega encima PKG in kcatD_mlcpC variabilni del hitrostne katalitične konstante, za

katerega se lahko maksimalno poveča celotna katalitična hitrostna konstanta ob prisotnosti

aktivne oblike encima PKG. Enačbo (17) vstavimo v enačbo (10) izhodiščnega modela in

dobimo:

catD_mlcpB catD_mlcpC cGMP tot*

2

mD

k k R MLCPk

K Mp AMp

, (18)

pri čemer je * *

2 5k k .

Vrednost za KmD je povzeta po izhodiščnem modelu, vrednosti za kcatD_mlcpB in kcatD_mlcpC pa sta

enaki prepolovljeni vrednosti parametra kcatD_mlcp iz izhodiščnega modela. Primerljive vrednosti

so bile izbrane že v enem od predhodnih modelov [15], na katerem temelji izhodiščni model.

19

Model [15] na podoben način obravnava inhibitorni vpliv RhoK na aktivnost encima MLCP

kot je bilo predlagano v tej nadgradnji.

Parameter Vrednost parametra in

enota

Opis parametra

catD_mlcpBk -18 s bazalna katalitična hitrostna

konstanta ob odsotnosti

cGMP oz. aktivnega encima

PKG

catD_mlcpCk -18 s variabilni del hitrostne

katalitične konstante

mDK 310 mmol/m Michaelis-Mentenina

konstanta za encim MLCP

Tabela 6. Vrednosti parametrov v enačbah (17) in (18) [4].

5 Rezultati in razprava

V tem poglavju bomo analizirali rezultate, dobljene z nadgrajenim modelom. Kot glavni

rezultat predstavimo magnitudo sile (FGMC_final), t. j. maksimalno silo, ki se razvije v GMC po

daljšem času (v našem primeru t = 300 s), oziroma po tem, ko sistem že preide v stacionarno

stanje ali pa niha okrog njega s konstanto amplitudo, v odvisnosti od [cGMP] v celci. Simulacije

so izvedene za primer holinergične stimulacije srednje jakosti pri tipični koncentraciji

sekundarnega prenašalca [IP3] = 2 mmol/m3 [8]. Vse simulacije so izvedene s programom

Berkeley Madonna 8.3.18, ki sta ga razvila Robert I. Macey in George F. Oster iz Univerze v

Kaliforniji.

Izhodiščni model [4] ni ustrezno napovedal padca magnitude sile v področju visokih [cGMP]

(črna krivulja na sliki 9), t. j. med vrednostmi 10 in 100 3mmol/m , zato smo model postopno

nadgrajevali z enačbami, opisanimi v poglavju 4. Simulacijo z izhodiščnim modelom [4] smo

izvedli pri originalnih vrednostih parametrov rSERCA = 3 mol/m3s in rICICR = 30 s-1. Pri

simulacijah z nadgrajenim modelom pa smo vrednosti teh dveh parametrov bili primorani

spremeniti že pri prvi nadgradnji, to je nadgradnji toka Ca2+ skozi črpalke SERCA. Spremembi

smo uvedli, ker v modelu nismo dobili oscilacij in fizioloških znotrajceličnih koncentracij Ca2+.

Uporabili smo vrednosti parametrov rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1, pri katerih so bile

ob nadgradnji parametra kSERCA lastnosti signala Ca2+ podobne referenčnim iz izhodiščnega

modela v širokem razponu [cGMP]. Pri ostalih nadgradnjah se je nato sicer izkazalo, da pri teh

dveh vrednostih parametrov v modelu izgubimo oscilacije, vendar so koncentracije Ca2+ vrha

in platoja v dvofaznem signalu ostale na fizioloških ravneh. Zaradi tega smo ohranili enako

vrednost teh dveh parametrov pri vseh nadaljnjih nadgradnjah.

Najprej smo torej model nadgradili z dodatkom v matematičnem opisu za črpalke SERCA

(enačba (12)) (rdeča pikčasta krivulja na sliki 9), pri čemer se je odvisnost sile od cGMP pri

20

visokih koncentracijah cGMP vidno izboljšala, kljub vsemu pa je še bil viden majhen koničast

porast sile pri [cGMP] = 1 mmol/m3.

Slika 9. Magnituda sile v GMC, razvita po daljšem času (FGMC_final), v odvisnosti od koncentracije cikličnega

gvanozin monofosfata ([cGMP]) v izhodiščnem modelu [4] (črna krivulja) in po različnih nadgradnjah: s konstanto

polovične zasičenosti za 2

CCa (kSERCA) kot funkcijo [cGMP] v izrazu za aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme

v SR (enačba (12)) (rdeča pikčasta krivulja), s konstanto polovične zasičenosti za [IP3] (kIP3) kot funkcijo [cGMP]

v izrazu za prepustnost kanalov ICICR na membrani SR (enačba (15)) (modra krivulja), s konstanto katalitične

aktivnosti encima MLCP (kcatD) kot funkcije [cGMP] (enačba (17)) (vijolična krivulja) in z vsemi tremi zgoraj

opisanimi spremembami (kSERCA, kIP3, kcatD) (zelena krivulja).

Nato smo izhodiščni model nadgradili zgolj v delu, ki se nanaša na vpliv [cGMP] na tok Ca2+

skozi kanale ICICR (enačba (15)) (modra krivulja na sliki 9). Pri tej nadgradnji so izginile

oscilacije Ca2+ v področju fizioloških koncentracij cGMP. Odvisnost sile od [cGMP] pa se je

zaradi tega v tem področju »zgladila«. Pri vrednosti [cGMP] = 10 mmol/m3 pa je bil prisoten

še večji relativni porast sile.

Pri tretji nadgradnji smo v modelu simulirali še vpliv [cGMP] na aktivnost encima MLCP

(enačba (17)) (vijolična krivulja na sliki 9). Ta nadgradnja načeloma ne vpliva na signal Ca2+,

saj je nadgradnja na strani dekodacije signala Ca2+. Ker pa smo pri tej nadgradnji uporabili nove

vrednosti parametrov rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1, so oscilacije v modelu izginile.

Zaradi tega je odvisnost sile od koncentracije [cGMP] v področju fizioloških [cGMP] zglajena,

pri [cGMP] = 10 mol/m3 pa je še vedno prisoten vrh v tej odvisnosti. S spremembo aktivnosti

encima MLCP se je spremenila tudi magnituda pri nizkih vrednostih [cGMP], vendar je to

predvsem zato, ker se normalizacijski faktor v izračunu relativne sile, ki jo prikazujemo na

grafu, ni spremenil.

21

Če v modelu upoštevamo vse tri zgoraj opisane spremembe (zelena krivulja), dobimo glede na

izhodiščni model pri nizkih [cGMP] nekoliko večjo magnitudo sile, ki je pretežno posledica

normalizacije sile, v področju fizioloških [cGMP] je odvisnost sile nekoliko bolj zglajena,

oziroma je koničasti porast relativno nižji glede na okolico, v področju visokih [cGMP] pa ni

dodatnega porasta. V področju fizioloških [cGMP] pa so zopet prisotne oscilacije

znotrajceličnega Ca2+. Majhen koničast porast je ravno posledica pojava oscilacij.

Povprečna vrednost koncentracije Ca2+ 2

CCa v citoplazmi 2

C,pov.Ca dokaj dobro

korelira s FGMC_final. Pri višji 2

C,pov.Ca je sila višja in obratno. Obe spremenljivki pa se z

višanjem [cGMP] znižujeta (slika 10). Do majhnega odstopanja prihaja le pri vrednosti 2

C,pov.Ca okrog 31 mmol/m , česar trenutno še ne znamo natančno pojasniti. Možno pa je, da

izračuna vrednosti 2

C,pov.Ca in FGMC_final nista povsem natančni, saj je izračun numerično

zelo zamuden in smo zato model zaganjali le za manjše število točk. Hkrati pa je izračun

2

C,pov.Ca tudi manj natančen, saj je v izračun povprečne vrednosti vključena celotna

časovna odvisnost signala Ca2+, ki vsebuje intervale mirovnega stanja, interval porasta 2

CCa

v trenutku stimulacije in interval oscilacij s konstantno amplitudo oziroma stacionarne

vrednosti v primeru, ko oscilacij ni. Za bolj pravilen izračun bi morali upoštevati samo interval

oscilacij s konstantno amplitudo oz. interval stacionarnega stanja, ki imata po dolgem času

edina vpliv na magnitudo sile. Za ta primer pa bi morali samostojno izdelati računalniški

program, kar pa bi ob velikem številu spremenljivk presegalo vsebino tega diplomskega

seminarja.

Slika 10. Odvisnost magnitude sile, razvite po daljšem času v GMC (FGMC_final) in povprečne vrednosti

koncentracije kalcija (Ca2+) v citoplazmi 2

C,pov.Ca od koncentracije cikličnega gvanozin monofosfata

([cGMP]) v nadgrajenem modelu.

22

Primerjava odvisnosti koncentracije 2

C,pov.Ca od [cGMP] med izhodiščnim [4] in

nadgrajenimi verzijami modela pokaže, da se z nadgradnjami 2

C,pov.Ca pri nizkih [cGMP]

zmanjša za faktor 3 (slika 11). To je s fiziološkega stališča bolj pravilno, saj so povprečne

vrednosti koncentracij nad vrednostjo 2 μM v celicah zelo redke in celo citotoksične. K tej

spremembi je zagotovo vplivalo tudi znižanje parametrov SERCAr = 1,5 mol/m3s in 115 s ,ICICRr

ki smo jih uporabili ravno zaradi tega, ker se je z nadgradnjo parameter SERCAk signal Ca2+ tako

spremenil, da ni bil več fiziološko ustrezen.

Slika 11. Povprečna koncentracija Ca2+ v citoplazmi 2

C,pov.Ca

v odvisnosti od koncentracije cikličnega

gvanozin monofosfata ([cGMP]) v izhodiščnem modelu [4] (črna krivulja) in po različnih nadgradnjah: s konstanto

polovične zasičenosti za 2

CCa (kSERCA) kot funkcijo [cGMP] v izrazu za aktivnost črpanja Ca2+ iz citoplazme

v SR (enačba (12)) (rdeča krivulja), s konstanto polovične zasičenosti za [IP3] (kIP3) kot funkcijo [cGMP] v izrazu

za prepustnost kanalov ICICR na membrani SR (enačba (15)) (modra krivulja) in z obema dvema zgoraj opisanima

spremembama (kSERCA, kIP3) (vijolična krivulja). V simulaciji z izhodiščnim modelom [4] so uporabljene vrednosti

parametrov rSERCA = 3 mol/m3s in rICICR = 30 s-1, v vseh ostalih primerih pa rSERCA = 1,5 mol/m3s in rICICR = 15 s-1.

Pri različnih koncentracijah [cGMP] se časovna odvisnost koncentracije Ca2+ v citoplazmi

2

CCa oz. signal Ca2+ spreminja. Spremembe so vidne v obliki, amplitudi in frekvenci

signala. Na sliki 12 so prikazane tri različne časovne odvisnosti 2

CCa s področja oscilacij.

Le-te se začnejo pri vrednosti [cGMP] = 0,56 mmol/m3 (slika 12a), kar je v področju tipičnih

fizioloških vrednosti [cGMP]. Z naraščanjem [cGMP] se amplituda oscilacij zmanjšuje

(slika 12b,c), o frekvenci oscilacij pa je težko govoriti, saj so oscilacije kompleksne in so

23

superpozicija oscilacij z različnimi frekvencami, kar je razvidno s slik 12 a) in c). V teh primerih

oscilacije Ca2+ imenujemo brstične oscilacije, v primeru slike 12 b) pa navadne oscilacije.

a)

b)

c)

Slika 12. Odvisnost koncentracije kalcija v citoplazmi 2

CCa od časa (t) pri različnih koncentracijah

cikličnega gvanozin monofosfata [cGMP]: a) [cGMP] = 0,85 mmol/m3, b) [cGMP] = 1 mmol/m3,

c) [cGMP] = 10 mmol/m3.

24

6 Zaključek

Namen diplomskega seminarja je bil nadgraditi model za razvoj sile v GMC arterij pod vplivom

cGMP, ki bi odprl nadaljnje možnosti za celostno modeliranje signalne poti NO v stenah arterij.

Izhodiščni model [4], ki smo ga tukaj nadgrajevali, je ustrezno napovedal padec magnitude sile

z višanjem [cGMP] zgolj v področju nizkih vrednosti, tj. med približno 0,01 in 6 mmol/m3, ne

pa tudi pri visokih vrednostih, tj. med približno 6 in 100 mmol/m3 (slika 3). Najverjetnejši vzrok

zato je, da v njem niso upoštevali vseh vplivov cGMP na kodacijo signala Ca2+ in njegovo

dekodacijo v silo, ki se razvije v GMC. Zaradi tega smo izhodiščni model [4] nadgradili s tremi

poznanimi vplivi cGMP, ki pa še niso bili upoštevani v modelu. Pri prvi nadgradnji smo v izrazu

za tok Ca2+ preko črpalke SERCA (JSERCA) konstanto polovične zasičenosti kSERCA zapisali kot

funkcijo [cGMP] (enačba (12)). Podobno smo storili pri drugi nadgradnji, kjer smo v izrazu za

tok Ca2+ skozi kanale ICICR (JICICR) konstanto polovične zasičenosti kIP3 zapisali kot funkcijo

[cGMP] (enačba (15)). V tretji nadgradnji pa smo upoštevali, da cGMP vpliva na katalitično

aktivnost encima MLCP in s tem na hitrost defosforilacije MLC. Pri tem smo katalitično

hitrostno konstanto encima MLCP (kcatD_mlcp) zapisali kot funkcijo [cGMP] (enačba 18).

Podatke za prvi dve nadgradnji smo samostojno pridobili z analizo meritev [7,8,13,14], pri tretji

nadgradnji pa smo se zgledovali po drugem podobnem modelu [2].

Ugotovili smo, da ima zgolj prva izmed uporabljenih nadgradenj vpliv na znižanje magnitude

sile v področju visokih koncentracij cGMP. Kljub vsemu pa je v odvisnosti magnitude sile od

[cGMP] še vedno viden majhen koničast porast sile pri približno 31 mmol/m .cGMP Druga

nadgradnja ima sicer navidezen vpliv na zgladitev odvisnosti sile v področju fizioloških

vrednosti [cGMP], kar pa je zgolj posledica tega, da v modelu pri izbranih vrednostih

parametrov ni oscilacij Ca2+. Ta nadgradnja nima nobenega učinka na znižanje sile pri visokih

vrednostih [cGMP]. Tretja nadgradnja vpliva zgolj na hitrost defosforilacije miozina, kar

nekoliko vpliva na magnitudo sile, nima pa vpliva na signal Ca2+. Tudi v tem primeru je videti,

kot da ima ta nadgradnja močan zglajevalni učinek na odvisnost sile v področju fizioloških

[cGMP], kar pa je, enako kot pri drugi nadgradnji, zgolj posledica odsotnosti oscilacij. Podobno

kot druga tudi tretja nadgradnja nima učinka na porast sile pri visokih [cGMP]. Ob uporabi vseh

treh nadgradenj hkrati se koničasti porast sile v območju fizioloških koncentracij cGMP delno

zgladi, pri visokih [cGMP] pa se v celoti odpravi.

Rezultati nadgradenj kažejo na to, da je najbolj ključna prva nadgradnja, saj izniči neželeni

porast v odvisnosti sile pri visokih [cGMP]. Kljub vsemu pa ob tej nadgradnji ostaja v

odvisnosti sile od [cGMP] še en koničast porast v področju fizioloških vrednosti [cGMP]. Tretja

nadgradnja deloma prispeva k zgladitvi te konice, medtem ko druga nadgradnja nima

bistvenega vpliva na silo. Zgladitev koničastih porastov v odvisnosti sile in približanje h kar se

da fiziološkim odzivom sistema ostaja še izziv za nadaljnje delo.

25

LITERATURA IN VIRI

[1] L. J. Ignarro, Nitric oxide: biology and pathobiology (Academic Press, San Diego,

London, 2000).

[2] J. Yang, J. W. Clark, R. M. Bryan in C. S. Robertson, Mathematical modeling of the

nitric oxide/cGMP pathway in the vascular smooth muscle cell, Am. J. Physiol. Heart.

Circ. Physiol. 289, H886-897 (2005).

[3] DDclinic S.n.c., Metabolismo Lipidico. Pridobljeno 20.8.2017, iz

http://www.ddclinic.it/test-diagnostici/nutrigenetica/metabolismo-lipidico/.

[4] N. Šutar, Modeliranje vpliva cikličnega gvanozin monofosfata (cGMP) na od kalcija

odvisen tonus gladkih mišičnih celic arterij, Magistrsko delo (Fakulteta za naravoslovje

in matematiko Univerze v Mariboru, Maribor, 2015).

[5] J. C. B. Jacobsen, C. Aalkjaer, H. Nilsson, V. V. Matchkov, J. Freiberg in N. H.

Holstein-Rathlou, Activation of a cGMP-sensitive calcium-dependent chloride channel

may cause transition from calcium waves to whole cell oscillations in smooth muscle

cells, Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 293, H215-228 (2007).

[6] A. Kapela, A. Bezerianos in N. M. Tsoukias, A mathematical model of Ca2+ dynamics

in rat mesenteric smooth muscle cell: agonist and NO stimulation, J. Theor. Biol. 253,

238-260 (2008).

[7] M. Gustavsson, R. Verardi, D. G. Mullen, K. R. Mote, N. J. Traaseth, T. Gopinath in G.

Veglia, Allosteric regulation of SERCA by phosphorylation-mediated conformational

shift of phospholamban, PNAS 110, 17338-17343 (2013).

[8] K. S. Murthy in H. Zhou, Selective phosphorylation of the IP3-R-I in vivo by cGMP-

dependent protein kinase in smooth muscle, Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol.

284, G221-G230 (2002).

[9] A. Fajmut, M. Brumen in S. Schuster, Theoretical model of the interactions between

Ca2+, calmodulin and myosin light chain kinase, FEBS Lett. 579, 4361-4366 (2005).

[10] C. M. Hai in R. A. Murphy, Cross-bridge phosphorylation and regulation of latch state

in smooth muscle, Am. J. Physiol. 254, C99-106 (1988).

[11] P. Mbikou, A. Fajmut, M. Brumen in Etienne Roux, Theoretical and experimental

investigation of calcium-contraction coupling in airway smooth muscle, Cell. Biochem.

Biophys. 46, 233-251 (2006).

[12] A. Fajmut, Modeliranje biokemijskih procesov kot sestavnih elementov kalcijeve

signalizacije v procesu skrčitve gladkih mišičnih celic dihalnih poti, Doktorska

disertacija (Pedagoška fakulteta Univerze v Mariboru, Maribor, 2006).

[13] A. Koller, J. Schlossmann, K. Ashman, S. Uttenweiler-Joseph, P. Ruth in F. Hofmann,

Association of phospholamban with a cGMP kinase signaling complex, Biochem.

Biophys. Res. Commun. 300, 155-160 (2003).

[14] J. Schlossmann, A. Ammendola, K. Ashman, X. Zong, A. Huber, G. Neubauer, G.

Wang, H. Allescher, M. Korth, M. Wilm, F. Hofmann in P. Ruth, Regulation of

intracellular calcium by a signalling complex of IRAG, IP3 receptor and cGMP kinase

Iβ, Nature 404, 197-201 (2000).

26

[15] P. Mbikou, A. Fajmut, M. Brumen in E. Roux, Contribution of Rho kinase to the early

phase of the calcium–contraction coupling in airway smooth muscle, Exp. Physiol.

96(2), 240-258 (2010).