modificarea genetică a plantelor: principii generale de...

Modificarea genetică a plantelor: Principii generale de realizare. Aplicaţii şi controverse

C. P. Cornea

Facultatea de Biotehnologii, Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară Bucureşti, B-dul Mărăşti 59, România Intr-o lume în care creşterea populaţiei este accelerată (se preconizează că până în anul 2050 populaţia globului va număra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producţia agricolă creşte într-un ritm mai lent este necesară găsirea unor soluţii moderne prin care agricultura să asigure cantităţi suficiente de hrană, cu o calitate corespunzătoare. Agricultura tradiţională se confruntă în prezent cu o serie de limitări extrem de serioase: - limitări ce ţin de piaţă: în condiţiile globalizării, regulile unei pieţe libere îngrădesc

politicile locale de preţuri, acestea fiind dictate de tendinţele şi politicile internaţionale - resursele naturale devin, din ce în ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltării agriculturii

tradiţionale datorită modificărilor climatice, a industrializării şi urbanizării care determină deteriorări ale solului, apei şi a calităţii aerului.

- resursele biologice (genetice) sunt, în mod inevitabil, limitate. Astfel, deşi considerată la început foarte eficientă, obţinerea şi eliberarea în mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiţionale a devenit extrem de înceată, nu fac faţă cerinţelor, iar numărul de însuşiri naturale care pot fi îmbunătăţite prin aceste metode este foarte mic.

Specialiştii consideră că pentru depăşirea acestor probleme, pe lângă îmbunătăţirea continuă a practicii agricole, există două soluţii: găsirea unor surse alternative de hrană (de exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999). Cu toate că pentru unii oameni biotehnologia reprezintă un domeniu oarecum controversat, prin integrarea metodelor biotehnologice cu metodele clasice de ameliorare (atât la plante cât şi la animale) se pot obţine rezultate care să mulţumească pe toată lumea, declanşându-se o adevărată revoluţie „verde” în agricultură. „Prima generaţie” de cercetări în domeniul biotehnologiei vegetale a fost axată pe transferul de gene în plante de interes economic care să permită obţinerea unor beneficii mai mari în urma cultivării lor. De exemplu, au fost obţinute plante rezistente la atacul unor insecte sau la acţiunea unor erbicide ceea ce a condus la reducerea pierderilor datorate buruienilor sau dăunătorilor precum şi a cantităţilor de compuşi chimici aplicaţi culturilor de plante.

Utilizarea plantelor transgenice, limitată iniţial doar la loturi experimentale, s-a extins în ultimii ani la suprafeţe semnificative mai ales în SUA, Canada, Argentina, China şi mai puţin în Europa.

Deşi cercetările privind introducerea de noi gene de interes la plante va continua, este de aşteptat ca „noua generaţie” de cercetări în domeniul biotehnologiilor vegetale să aibă drept principal scop obţinerea de plante transgenice „sigure” pentru utilizarea lor în alimentaţia omului, cu rezistenţă la atacul fungilor astfel încât să nu se acumuleze compuşi toxici pentru om (compuşi de tipul aflatoxinelor), cu valoare nutritivă superioară (cum ar fi

83

C. P. Cornea

84

îmbogăţirea lor în vitamine, în uleiuri sau proteine care nu să nu determine reacţii alergice la persoanele sensibile) sau capabile să producă substanţe de interes medical (de exemplu vaccinuri „comestibile”). De asemenea, cercetările privind obţinerea şi utilizarea plantelor transgenice trebuie să fie corelate cu studii care să lămurească opinia publică asupra beneficiilor şi eventual a riscurilor pe care aceste plante şi mai ales produsele alimentare derivate de la ele le presupun.

1. Principii generale privind obţinerea plantelor transgenice

Aşa cum se cunoaşte, plantele transgenice sunt obţinute în urma experimentelor „in vitro” de transfer de material genetic exogen: la nivelul lor s-au integrat în mod stabil secvenţe de ADN provenite de la alte organisme, care le conferă anumite însuşi fenotipice noi sau modificate. Obţinerea plantelor transgenice presupune o metodologie specifică, cu etape distincte, care prezintă elemente comune pentru toate tipurile de plante cu care se lucrează. In cazul anumitor specii vegetale metodologia utilizată este modificată conform particularităţilor acestora astfel încât rezultatul să fie cel dorit. Transferul de gene la plante a devenit posibil datorită descoperirii şi a utilizării sistemului de transformare genetică prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens şi A.rhizogenes). Rezultatele cercetărilor din domeniul geneticii vegetale, bazate în primul rând pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie într-un material faptic deosebit de bogat.

Vectorii de clonare derivaţi de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetică, structura şi exprimarea genelor în plantele transgenice au determinat obţinerea unor noi cunoştinţe importante atât pentru cercetarea fundamentală, cât şi pentru îmbunătăţirea însuşirilor unor plante de cultură.

1.1. Clonarea genelor în celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul

Agrobacterium Pentru evidenţierea particularităţilor procesului de clonare în celulele vegetale vor fi

prezentate în continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum şi elementele specifice ale vectorilor de clonare şi a markerilor de selecţie pentru celulele vegetale.

1.1.1. Particularităţile bacteriilor din genul Agrobacterium A.tumefaciens şi A.rhizogenes sunt bacterii ce trăiesc în sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate şi gimnosperme. S-a dovedit că tulpinile de A.tumefaciens determină apariţia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rănite ale unor plante (în special la nivelul coletului), în timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de rădăcini adventive (de tip "hairy") la nivelul ţesuturilor vegetale rănite (Figura 1).

Figura 1. Tumori induse experimental la plante test prin infecţie

cu Agrobacterium tumefaciens.

Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare; Aplicaţii; Controverse

85

Modificările morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens sau A.rhizogenes se datorează transferului unor gene de origine bacteriană în celulele vegetale. Bacteriile din genul Agrobacterium prezintă un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi în celula vegetală, graţie prezenţei în celula lor a unei plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"), ce reprezintă factorul determinant al producerii tumorilor, respectiv rădăcinilor anormale, la plante. Transferul unei porţiuni din aceste plasmide în genomul celulei vegetale determină modificări funcţionale, ce se concretizează prin apariţia fenomenului tumoral. Aceste plasmide constituie, aşadar, un sistem organizat şi complex de transfer de informaţie genetică naturală în celula vegetală, fără influenţă asupra echilibrului ecologic. Cele mai multe studii referitoare la structura plasmidelor de la Agrobacterium au fost realizate cu plasmidele Ti, izolate din tulpini de A.tumefaciens. Acestea sunt de dimensiuni mari (peste 200 kb)(Van Larebecke şi col., 1974), cu număr mic de copii/celulă bacteriană, transferabile dintr-o celulă în alta, dar numai în condiţii speciale.

În principiu, plasmidele Ti conţin mai multe regiuni, cu funcţii distincte: regiunea ADN-T (conţinând genele de tumorigeneză), regiunea de virulenţă (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controlează transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc, primele două fiind însă cele mai importante pentru procesul de transformare a celulelor vegetale. Regiunea de virulenţă cuprinde gene esenţiale pentru transferul de ADN bacterian în celulele vegetale, fără a fi însă ele însele transferate. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40 kb (în funcţie de tulpina bacteriană), fiind formată din mai mult de 20 gene organizate în cel puţin 6 unităţi transcripţionale (operoni): virA (o genă), virB (11 gene), virC (2 gene), virD (4 gene), virE (2 gene) şi virG (o genă)(Weising şi Kahl, 1996). Dintre aceste unităţi transcripţionale, virA, virB, virD şi virG sunt esenţiale pentru transferul ADN-T, iar virC şi virE asigură o creştere a eficienţei transferului (de la Riva şi colab., 1998). Toţi aceşti operoni sunt induşi în prezenţa celulelor vegetale rănite (care produc o serie de compuşi fenolici cu rol inductor), funcţiile lor fiind următoarele: - virA şi virG codifică proteine responsabile de recunoaşterea celulelor vegetale rănite şi de inducerea celorlalte funcţii vir; - virC şi vir D codifică proteine ce asigură formarea unei copii de ADN-T monocatenar, transferabil în celula vegetală; - virD şi virE codifică proteine ce formează un complex împreună cu ADN-T ghidându-l spre nucleul celulei vegetale; ele se pare că sunt implicate şi în procesul de integrare al ADN-T în genomul noii gazde; - virB codifică proteine care răspund de transportul complexului ADN-T-proteine prin membrana plasmatică bacteriană. Studiile efectuate prin analiza heteroduplexurilor ADN ale regiunilor vir provenite de la diferite tipuri de plasmide Ti au evidenţiat o omologie extinsă a acestei regiuni, deşi apar şi unele mici zone neomoloage (care s-ar putea datora inserţiilor sau deleţiilor apărute în structura plasmidelor în cursul evoluţiei). Spre exemplu, prin compararea regiunii vir a unei plasmide Ti nopalinice cu cea a uneia octopinice s-a observat ca există unele deosebiri: prima nu prezintă locusul virF, conţinând în schimb gena tsz, ceea ce dă posibilitatea bacteriei să producă fitohormonul transzeatină. Această genă este localizată în cazul plasmidei Ti octopinice la nivelul extremităţii stângi a regiunii, alături de virA. Exprimarea genelor localizate în regiunea de virulenţă a plasmidelor Ti este inductibilă, fiind reglată de acţiunea unor factori din exterior. Experimental s-a demonstrat că, sub acţiunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la nivelul rănilor produse la plante, are loc o puternică activare a acestor gene. Aceste molecule semnal sunt compuşi fenolici, de tipul acetosiringonei sau a α-hidroxiacetosiringonei, care au acţiune asupra

C. P. Cornea

86

genelor reglatoare virA şi virG. Produşii acestor gene sunt asemănători cu alte proteine membranare bacteriene cu rol în reglare (Env Z, Omp R etc). Alături de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene, localizate la nivelul cromosomului bacterian, implicate, se pare, într-o mai mică măsură în procesul de transformare genetică. Dintre aceste gene menţionăm: genele chvA şi chvB implicate în sinteza şi secreţia β–1,2 glucanului; gena chvE necesară pentru inducerea regiunii vir şi pentru chemotactismul bacterian; locusul cel responsabil de sinteza fibrilelor de celuloză implicate în ataşarea bacteriilor la celulele vegetale; gena pscA (exoC) implicat în sinteza glucanului ciclic şi a acidului succinoglicanic; locusul att implicat în sinteza unor proteine celulare de suprafaţă (Matthysse, 1987; Cangelosi şi colab.,1991) Funcţiile de recunoaştere şi ataşare a bacteriilor la peretele celulei vegetale nu sunt codificate de gene plasmidiale ci de gene cromosomale. Aceste gene determină, între altele, structura exopolizaharidelor de la suprafaţa bacteriilor, implicate în procesele de recunoaştere.

Regiunea ADN-T reprezintă o porţiune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferată în celula vegetală, integrându-se stabil în genomul celular. Această regiune ADN-T (de la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (în funcţie de tulpina bacteriană gazdă) şi conţine toate genele (oncogenele) care transferate în celula vegetală vor determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. Genele localizate pe ADN-T determină două proprietăţi caracteristice pentru celulele vegetale tumorale: creşterea pe medii de cultură în absenţa fitohormonilor; sinteza şi secreţia de opine, substanţe specifice pentru aceste tipuri de celule. Nester şi colab. (1984) au reuşit identificarea şi cartarea a opt gene aflate la nivelul ADN-T: aux1, aux2, iaaM, iaaH, toate fiind implicate în codificarea sintezei de auxine, ipt ce codifică sinteza de citochinine, ops ce determină sinteza opinelor de către celulele transformate (de exemplu, gene ocs sau nos, în funcţie de tipul de plasmidă Ti) şi o a opta genă ce interacţionează cu celelalte, mărind se pare, sensibilitatea celulelor transformate la auxină. De remarcat că, ADN-T conţinut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte secvenţe de nucleotide, de aproximativ 25 pb, repetate direct, esenţiale pentru procesul de transfer în celulele vegetale. Analiza acestor secvenţe terminale a arătat că acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium, ele fiind recunoscute de echipamentul enzimatic implicat în transferul ADN-T din celula bacteriană în celula vegetală. În cazul plasmidelor Ri, analiza regiunii ADN-T a dovedit că aceasta conţine o serie de gene, responsabile de fenotipul de tip "hairy" al ţesuturilor vegetale transformate. De remarcat că, genele ce se transferă în celulele vegetale sunt grupate la marginile regiunii ADN-T. Astfel, în partea stângă a ADN-T sunt localizate genele rolA, B, C şi D care sensibilizează celulele vegetale la acţiunea auxinelor. S-a dovedit că, la anumite specii vegetale, simpla prezenţă a genelor rol, chiar în absenţa celorlalte gene din ADN-T, determină apariţia fenotipului caracteristic ("hairy root"). În partea dreaptă a ADN-T din plasmidele Ri se află două gene ce codifică sinteza de auxine (acid indolilacetic) în celulele transformate; de asemenea, alături de aceste gene se află cele responsabile de sinteza unor opine (manopina şi agropina)(Tepfer şi Casse-Delbart, 1987). Plantele regenerate din ţesut vegetal transformat cu acestă bacterie prezintă un aspect modificat, comparativ cu plantele regenerate dinţesut normal (figura 2). 1.1.2. Mecanismul transferului ADN-T în celula vegetală Mecanismul mobilizării şi transferului ADN-T din celula bacteriană în celula vegetală a fost intens studiat în ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces. Cu toate acestea rămân de elucidat unele aspecte ale sale, mai ales cele ce au loc în celula vegetală.


87

1 2 3

Figura 2. Aspectul plantelor de tutun regenerate din ţesut vegetal transformat cu A. rhizogenes (poziţiile 2 şi 3) comparativ cu plantele normale (poziţia 1).

Primele etape ale interacţiunii dintre plante şi celulele de Agrobacterium sunt următoarele: - celulele vegetale rănite eliberează o serie de compuşi fenolici (cum este acetosiringona), aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic), care servesc drept chemoatractanţi pentru agrobacterii; - recunoaşterea celulelor rănite şi ataşarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimării constitutive a genelor vir cromosomale, procesul fiind denumit colonizare bacteriană; - inducerea funcţiilor vir plasmidiale şi începerea procesului de transfer al ADN-T. Procesul de transfer al ADN-T poate fi împărţit în două etape: una ce se desfăşoară în celula bacteriană şi o alta ce are loc în celula vegetală (Figura 3).

Figura 3. Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene în celulele vegetale rănite (adaptare după

Weising şi Kahl, 1996).

C. P. Cornea

88

Etapa bacteriană include toate evenimentele ce conduc la producerea şi exportul ADN-T, începând cu activarea funcţiilor vir plasmidiale de către compuşii fenolici sau glucidici eliberaţi din celulele vegetale rănite. Primele gene vir ce intră în acţiune sunt cele din operonii virA şi virG, fiind sintetizate proteinele corespunzătoare, VirA şi VirG. Se pare că proteina VirA este produsă într-o formă inactivă ce este activată (fosforilată) de inductorii vegetali (compuşii fenolici sau glucidici), ea prezentând trei domenii funcţionale: un domeniu periplasmic important pentru detectarea monoglucidelor inductoare şi două domenii transmembranare care recepţionează şi transmit semnalele inductoare. (Parkinson, 1993). La rândul său, proteina VirG este activată (fosforilată) de proteina VirA (Zambryski, 1988). Cele două proteine interacţionează şi determină activarea celorlalţi operoni vir (virB, virC, virD, virE).

De remarcat că, ADN-T conţine toate genele onc necesare transformării celulelor vegetale dar nici una dintre aceste gene nu este implicată în excizia şi transferul ADN-T. In esenţă, pentru ca ADN-T să fie transferat este necesară prezenţa secvenţelor marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau TR) şi, cel puţin în cazul unor anumite plasmide Ti, existenţa unui element suplimentar localizat în afara ADN-T (în partea dreaptă). Acest element, denumit în limba engleză "overdrive", stimulează procesul de transformare (are funcţie de "enhancer"). Excizia ADN-T este iniţiată de acţiunea combinată a proteinelor VirD1 şi VirD2, codificate de operonul virD precum şi a proteinelor VirC1 şi VirC2, codificate de operonul virC (Lessl şi Lanka, 1994).

Dintre aceste proteine, rolul cel mai important îl are proteina VirD2 care este o endonuclează de restricţie (situs-specifică). Ea recunoaşte marginile ADN-T şi le clivează (de obicei are loc mai întâi secţionarea uneia dintre catenele ADN-T la nivelul marginii din dreapta) generând un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb, simultan având loc sinteza catenei lipsă. Proteina VirD2 rămâne ataşată la nivelul capătului 5' al ADN-T monocatenar protejându-l, probabil, de acţiunea exonucleazelor. De asemenea, la ADN-T se ataşează proteina VirE2 (aproximativ 600 molecule per ADN-T de 20kb) care, nu numai că protejează segmentul monocatenar ci îl şi converteşte la o formă corespunzătoare pentru transport (Figura 4).

Figura 4. Reprezentarea schematică a etapelor formării complexului ADN-T-proteine (după Weising şi Kahl, 1996).


89

Pentru a ajunge în nucleul celulei vegetale, complexul ADN-T-proteine (complex T de 2nm în diametru şi aproximativ 3 µm în lungime) trebuie să traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatică şi spaţiul periplasmic bacterian, peretele celular vegetal, plasmalema celulei vegetale şi membrana nucleară. In etapa transportului prin membrana plasmatică bacteriană sunt implicate cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este încă elucidat. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte, protejează ADN-T de atacul exonucleazelor şi asigură transportul într-o formă corespunzătoare. De asemenea, se pare că proteinele Vir participă şi la formarea unor pori la nivelul membranei plasmatice şi a membranei externe a bacteriei.

În ceea ce priveşte translocarea prin membrana plasmatică vegetală nu există o explicaţie satisfăcătoare. Se pare că proteina bacteriană virE2 care însoţeşte complexul virD2-ADN-T conţine două semnale pentru localizare nucleară (NLS = „nuclear location signals”), iar proteina virD2 prezintă doar un singur asemenea semnal. La procesul de translocare ar mai participa şi proteinele codificate de operonii suplimentari virF şi virH al căror rol ar fi legat de direcţionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale şi de specificitatea de gazdă a tulpinilor bacteriene implicate în procesul de transfer de ADN.

Se consideră doar că, odată pătruns în citoplasma celulelor vegetale, complexul T (ADN şi proteine) este preluat de proteinele vegetale şi transportat în nucleu, unde ADN-T este integrat în genom.

1.1.3. Integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale Ultima etapă a procesului de transformare genetică a plantelor este integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale.

Analiza genetică a plantelor transformate cu ajutorul bacteriilor din genul Agrobacterium a evidenţiat prezenţa uneia sau a mai multor copii ale ADN-T la nivelul unor cromosomi diferiţi. S-a dovedit că, cel puţin pentru speciile studiate Crepis capillaris, Lycopersicon esculentum, Petunia hybrida, Nicotiana tabacum), nu există o preferinţă pentru un anumit cromosom, procesul de integrare realizându-se randomic. Spre exemplu, la Crepis capilaris s-a evidenţiat posibilitatea integrării ADN-T în oricare dintre cele trei perechi de cromosomi, în timp ce la tomate au fost cartate şapte segmente de ADN-T pe cinci cromosomi diferiţi. Date recente au evidenţiat că, după integrare, ADN-T adoptă trăsăturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi şi sensibilitatea la acţiunea DN-azei I. Acest din urmă aspect sugerează o integrare preferenţială la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl şi col., 1987). Această observaţie este susţinută şi de alte date experimentale. Astfel, prin clonarea la nivelul ADN-T a unei gene marker (pentru β-glucuronidază) lipsită de promotor, linkată cu o genă selectabilă şi utilizarea pentru transformare a acestui "construct" s-a reuşit exprimarea eficientă (în 30% din cazuri) a genelor clonate, deşi acestea nu aveau promotor propriu. Explicaţia acestor rezultate este aceea că integrarea a avut loc la nivelul unor regiuni active ale genomului vegetal (care sunt transcrise)(Cucu şi colab., 1998).

De asemenea, o serie de date experimentale au condus la concluzia că integrarea ADN-T are loc atât la nivelul exonilor cât şi la nivelul intronilor fără a fi observată vreo preferinţă pentru una sau alta dintre secvenţe. Mai mult, cercetări recente au arătat că integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor "puncte fierbinţi" din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN a suferit unele modificări şi unde este necesară intervenţia enzimelor implicate în procesul reparator (Tinland, 1996). În ceea ce priveşte mecanismul molecular al integrării ADN-T în genomul vegetal au fost elaborate mai multe modele. Spre deosebire de alte elemente genetice mobile cum sunt transpozonii sau retrovirusurile animale, ADN-T nu codifică nici o proteină care să fie

C. P. Cornea

90

implicată în integrarea sa în cromosomii vegetali. În acest fel, singurele proteine bacteriene care pot ajuta procesul de integrare sunt proteinele VirD2 şi Vir E2. Deoarece proteina Vir D2 este ataşată covalent la capătul 5' al ADN-T monocatenar, rolul său ar putea fi acela al protejării secvenţei terminale de 25 pb (marginea dreaptă a ADN-T), necesară procesului de recunoaştere şi integrare. Este posibil ca legătura fosfotirozinică prin care Vir D2 este ataşată la ADN-T să fie preferată de enzimele gazdei (cum ar fi ligaza) implicate în integrare. Proteina Vir E2 (posibil şi alte proteine) "acoperă" molecula de ADN-T monocatenar dar eficienţa procesului de integrare pare să fie independentă de proteina Vir E2. Analizându-se structura ADN-T integrat s-a evidenţiat faptul că, în prezenţa proteinei Vir E2, capătul 3' al secvenţei de interes prezintă scurte deleţii; în absenţa acestei proteine ADN-T suferă deleţii majore. Aceste rezultate sugerează faptul că proteina Vir E2 protejează ADN-T de acţiunea nucleazelor plantei, ea nefiind implicată direct în procesul de integrare. În acest fel, se poate concluziona că, majoritatea enzimelor implicate în integrare sunt furnizate de către celula vegetală (ADN-polimeraza, ligaza, topoizomeraza, helicaza). Spre exemplu, pe baza experimentelor efectuate cu mutante de Arabidopsis thaliana hipersensibile la radiaţii care erau incapabile de a realiza integrarea ADN-T, s-a putut evidenţia rolul în integrare a proteinelor implicate în procesul reparator.

Aşa cum s-a menţionat deja, pătrunderea complexului ADN-T în nucleu este facilitată de proteinele însoţitoare Vir D2 şi VirE2 (prin intermediul regiunilor NLS ce interacţionează cu proteine vegetale de legare) la care se adaugă şi proteina VirF, cu rol mai mic în acest proces. Mecanismul exact al integrării ADN-T în genomul vegetal nu a fost clarificat dar se consideră că integrarea se realizează prin recombinare nelegitimă (Finberg şi colab., 1995; Puchta, 1998). Observaţiile discutate sugerează faptul că asocierea dintre ADN vegetal şi ADN-T este iniţiată la capătul 3' al ADN-T monocatenar.

Conform acestui model, există zone foarte restrânse de omologie (micro-omologie)(secvenţele terminale de 25 pb) între ADN-T şi ADN vegetal care asigură un minim de specificitate pentru procesul de recombinare prin poziţionarea VirD2 pentru legare. Extremitatea 3’ a ADN-T sau secvenţele adiacente prezintă o slabă omologie cu ADN al plantei, consecinţa fiind formarea unei sinapse între catena transferată şi ADN al plantei şi a unei „deschizături” la nivelul catenei 3’-5’ a ADN vegetal. ADN vegetal înlocuit este clivat la extremitatea sa 3’ cu ajutorul unei endonucleaze, iar prima nucleotidă de la capătul 5’ al complexului VirD2-ADN-T se împerechează cu o nucleotidă corespunzătoare de la nivelul catenei 5’-3’ din ADN vegetal. Are loc apoi degradarea fragmentului din catena de ADN vegetal îndepărtat de la nivelul crestăturii (cu ajutorul unor endonucleaze sau exonucleaze cu acţiune 3’-5’), iar ADN-T monocatenar îi ia locul (Figura 5). Procesul este însoţit de crestarea catenei opuse şi, în plus activează mecanismele reparatorii ale celulei vegetale astfel că, în final este sintetizată o catenă complementară prin folosirea ADN-T inserat drept matriţă (Tinland, 1995).

Figura 5. Model ipotetic al integrării ADN-T în genomul vegetal (după Tinland, 1995)


91

Sintetizând datele de până acum se pot enunţa câteva concluzii referitoare la procesul de integrare:

- integrarea ADN-T nu este situs-specifică şi nu necesită prezenţa în ADN vegetal a unor secvenţe omoloage, fiind deci vorba de un proces de recombinare "nelegitimă";

- integrarea ADN-T conduce la apariţia unor mici deleţii (13-73 pb) ale ADN vegetal, la nivelul situsului de inserţie;

- capătul 3' al ADN-T este mai puţin conservat, el suferind unele scurtări cu 3-100 nucleotide. Acest capăt are o scurtă regiune de omologie (cel puţin 5 nucleotide) cu situsul la care va avea loc integrarea;

- capătul 5' al ADN-T monocatenar este mai puternic conservat în genomul celulei vegetale, iar regiunea de omologie cu situsul de inserţie se reduce la o singură nucleotidă;

- asimetria dintre capetele ADN-T sugerează că integrarea implică procese diferite. Recombinarea capătului 3' presupune implicarea unei foarte scurte regiuni de

omologie fiind asemănătoare recombinării plasmidiale din celulele animale, fiind în acest fel un exemplu de recombinare nelegitimă tipică. În cazul capătului 5', recombinarea sa presupune existenţa unui mecanism mult mai specific. 1.2. Vectori de clonare pentru celula vegetală Pentru realizarea transferului eficient de gene în celulele vegetale ţintă au fost construiţi vectori de clonare specifici, de obicei derivaţi de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale. 1.2.1. Vectori plasmidiali Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat, ca atare, în scopul ameliorării plantelor. Pentru a putea fi aplicat, plasmidele Ti au fost modificate drastic, prin eliminarea genelor ce determină producerea tumorilor, prin menţinerea şi clonarea în alte plasmide, mai mici, doar a regiunilor marginale şi a unor promotori ce sunt recunoscuţi de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. De asemenea, între extremităţile ADN-T prelucrat, au fost introduse gene marker specifice (nptII, gus, cat, gfp) sub controlul unor promotori corespunzători (Pnos, P35S), obţinându-se vectori de clonare foarte eficienţi. Pornindu-se de la constatarea că, pentru a se realiza transferul de material genetic în celula vegetală este suficient să existe extremităţile de 25 pb ale ADN-T, au fost făcute diferite încercări de înlocuire a genelor din interiorul ADN-T cu alte gene, de provenienţă străină. Primele realizări în acest sens au fost cele privind obţinerea unor vectori co-integraţi. Aceştia conţin la nivelul regiunii ADN-T modificate a unei plasmide Ti o plasmidă de la E.coli ce conţine, la rândul ei, mai multe elemente genetice: originea replicării (nefuncţională în Agrobacterium), un marker de selecţie pentru celulele bacteriene purtătoare (de obicei rezistenţa la un anumit antibiotic) şi gena (genele) străină clonată. Un asemenea vector de clonare duce însă la obţinerea unui ţesut tumoral deoarece genele implicate în producerea fitohormonilor nu sunt inactivate. Existenţa acestor gene în stare activă împiedică regenerarea de plante întregi, sau dacă ea se realizează eficienţa este foarte redusă iar plantele obţinute prezintă unele anomalii (Vatafu şi colab., 1989). Pentru depăşirea acestui inconvenient s-au realizat plasmide Ti "dezarmate" (cum este, de exemplu, plasmida pGV3850) la nivelul cărora regiunile interne ale ADN-T răspunzătoare de oncogeneză au fost eliminate. In plus, în locul acestora pot fi inserate alte secvenţe de ADN. De exemplu, clonarea la nivelul regiunii ADN-

C. P. Cornea

92

T dezarmate a plasmidei pBR322 permite, ulterior, co-integrarea la acest nivel a celor mai multe plasmide folosite în tehnicile de clonare în E.coli, printr-o singură treaptă de recombinare (Figura 6).

Figura 6. Obţinerea unei plasmide co-integrate, în care gena clonată iniţial în pBR322 este introdusă în pGV3850 (după Schell şi colab., 1985).

O problemă mai dificilă este selecţia celulelor vegetale transformate cu un asemenea tip de vectori. Genele de rezistenţă la antibiotice, provenite din transpozoni bacterieni, nu sunt exprimate prin mecanismul de transcriere al celulelor vegetale. Pentru depăşirea acestui impas s-au construit gene himerice care combină un promotor al unei gene care este funcţională în celula vegetală (cum ar fi promotorii genelor pentru sinteza nopalin-sintetazei sau octopin-sintetazei, promotori virali de la CaMV etc) cu regiunea ce codifică un marker de rezistenţă la un antibiotic şi o secvenţă de terminare a mesajului genetic, tot din ADN-T. Integrarea şi exprimarea acestor gene himerice, după transferul lor mediat de vectorii derivaţi de la plasmidele Ti, au permis selecţia celulelor vegetale transformate pe medii de cultură ce conţin antibioticul respectiv (de exemplu, kanamicină). Prin inserarea unor asemenea gene "marker" în vectori dezarmaţi a fost posibilă transformarea celulelor vegetale, urmată de regenerarea unor plante în care se exprimă gena respectivă. O altă strategie în transferul de gene în celula vegetală o constituie utilizarea vectorilor "binari", în care regiunile vir şi ADN-T (respectiv extremităţile de 25 pb repetate direct) sunt separate fizic pe plasmide diferite. S-au obţinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide, ambele capabile de replicare în Agrobacterium: - o plasmidă Ti modificată, dezarmată total (fără ADN-T) ce conţine genele vir;

- o plasmidă cu spectru larg de gazdă (o plasmidă de tip "navetă", capabilă de replicare în E.coli şi în A.tumefaciens), ce conţine gena ce trebuie introdusă în celula vegetală, împreună cu un marker de selecţie pentru celulele vegetale transformate (Figura 7).


93

Figura 7. Tehnica utilizării vectorilor binari (după Tourte, 1998).

Toate aceste gene sunt situate între extremităţile unui ADN-T, sub controlul unor

secvenţe promotor şi terminator adecvate (Figura 8). De asemenea, aceasta plasmidă mai conţine un marker de selecţie bacteriană, funcţii de replicare şi, eventual, mobilizare prin conjugare.

Figura 8. Reprezentarea schematică a vectorului binar Bin19 (după Tourte, 1998).

1.2.2. Vectori virali Deşi se cunoaşte că Agrobacterium tumefaciens nu infectează monocotiledonatele (cu foarte rare excepţii), prin prelucrarea plasmidei Ti a ADN-T, în sensul introducerii între marginile acestei regiuni a genomului virusului variegării porumbului, sau a CaMV, s-a reuşit transferul respectivelor gene la cereale. Acest tip de infecţie a primit denumirea de agroinfecţie. În ultimii ani, pentru obţinerea de plante transgenice au fost testaţi şi vectori derivaţi de la diferite virusuri specifice plantelor. Deşi la animale cei mai utilizaţi vectori sunt cei derivaţi de la retrovirusuri, la plante acest lucru nu s-a realizat pentru că virusurile ce infectează plantele sunt mai puţin cunoscute la nivel molecular. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numără: virusul mozaicului conopidei (CaMV), virusul latent al maniocului (CLV), virusul piticismului la grâu (WDV), virusul mozaicului galben al

C. P. Cornea

94

tomatelor (TGMV) etc. Mai mult, dintre virusurile vegetale, asemănătoare ca organizare retrovirusurilor animale, cel mai cunoscut este CaMV. Cu toate acestea, deşi funcţiile genelor CaMV sunt asemănătoare celor ale retrovirusurilor, spre deosebire de acestea, ele nu se integrează în genomul celulei vegetale. Un alt exemplu este cel al virusului mozaicului tutunului (VMT), virus cu genom ARN, a cărui lungime este 6,5kb, ce codifică patru polipeptide: cele două subunităţi ale replicazei, o proteină de înveliş şi o proteină importantă în procesul de infecţie al celulelor vegetale învecinate. Genomul viral a fost prelucrat "in vitro", înlocuindu-se genele pentru proteinele capsidale cu gene marker a căror exprimare s-a urmărit la plantele inoculate. Dezavantajul constă în faptul că se pot transfera doar fragmente de ADN cu dimensiuni mici. În orice caz, chiar şi în absenţa unor vectori derivaţi de la virusuri, o serie de elemente virale sunt deja utilizate pentru construirea vectorilor de exprimare pentru celula vegetală. Este cazul promotorilor genelor pentru ARN 19S şi 35S de la CaMV care sunt foarte eficienţi, mai ales pentru cereale. 1. 3. Modalităţi de introducere a genelor de interes în celulele vegetale Pentru introducerea vectorilor de clonare recombinaţi în celulele vegetale ţintă au fost elaborate numeroase metode, a căror eficienţă variază în funcţie de specia vegetală testată sau de tipul de ţesut utilizat în experimente. Dintre acestea menţionăm: - metoda co-cultivării celulelor bacteriene (A.tumefaciens sau A.rhizogenes ce conţin vectorii de clonare specifici) cu fragmente de ţesut vegetal (discuri foliare sau fragmente de tulpină), cu suspensii celulare vegetale, cu protoplaşti vegetali, cu lăstari sau chiar cu seminţe; - electrotransformarea celulelor vegetale (ţesut intact, celule întregi sau protoplaşti) folosindu-se ADN plasmidial modificat; - transformarea directă a protoplaştilor vegetali cu ADN plasmidial purificat dintr-o gazdă bacteriană; transformarea se realizează în prezenţa CaCl2 şi a polietilenglicolului (PEG); - microinjectarea ADN în celule sau în ţesutul conducător (macroinjectarea); - metoda biolistică (bombardarea celulelor vegetale cu microproiectile reprezentate de particule de tungsten sau aur coloidal acoperite cu ADN de interes); - utilizarea lipozomilor care să asigure protejarea ADN de interes faţă de acţiunea nucleazelor celulelor transformate.

1.4. Markeri genetici pentru selecţia şi caracterizarea celulelor vegetale transformate Pentru a se putea evalua rapid transferul şi, mai ales, integrarea genelor clonate în celulele vegetale, este absolut necesar ca, odată cu gena de interes, în celulele vegetale să se integreze şi anumite gene marker specifice. In prezent, genele utilizate drept markeri pentru celulele vegetale transformate sunt de două tipuri: markeri de selecţie care asigură doar diferenţierea între celulele vegetale normale şi cele modificate genetic şi markeri cuantificabili care permit şi determinarea nivelului exprimării genelor clonate.

Dintre cele mai utilizate gene marker de selecţie pentru celulele vegetale transformate menţionăm: gena pentru neomicin fosfotransferază (gena nptII ce determină rezistenţă la kanamicină, gena pentru cloramfenicol-acetiltransferază (gena cat ce conferă rezistenţă la cloramfenicol); gena pentru sinteza nopalinei (gena nos) sau octopinei (gena ocs); gena pentru luciferază (gena lux ce determină sinteza luciferazei care, în prezenţa substratului specific, luciferina, produce lumină; plantele transgenice ce conţin o asemenea genă au primit denumirea de plante "lampion"); gena pentru β-glucuronidaza bacteriană (gena gus); gena pentru proteina cu fluorescenţă verde (gena gfp = "green fluorescence protein")(Jefferson,


95

1988, Niedz şi colab., 1995), în timp ce drept markeri cuantificabili pot fi utilizaţi: activitatea NPT II, producerea de opine; activitaea β-glucuronidazică; activitatea cloramfenicol-acetil-transferazei; activitatea luciferazică; nivelul proteinei GFP (McClean, 1998).

Selecţia celulelor vegetale transformate se poate realiza, fie prin cultivarea acestora pe medii de cultură specifice ce conţin antibioticele corespunzătoare (kanamicină, cloramfenicol, higromicină), prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru evidenţierea, de exemplu, a produsului genei gus sau a genei lux) (Figura 8) sau prin teste fluorimetrice (pentru produsul genelor gus sau gfp). De remarcat că, vectorii de clonare cel mai recent construiţi conţin cel puţin două gene marker.

Figura 8. Lăstar de viţă de vie transformat cu un vector de clonare specific ce conţine gena pentru β-glucuronidază şi evidenţierea activităţii enzimatice cu ajutorul unui test histochimic (după Martinelli şi

Mandolino, 1994).

Vectorii de clonare în celulele vegetale sunt derivaţi de la plasmide naturale (plasmidele Ti sau Ri de la Agrobacterium tumefaciens, respectiv A.rhizogenes) sau de la virusuri specifice celulelor vegetale, ce asigură funcţionarea unor anumite secvenţe de ADN după integrarea lor în genomul celulelor vegetale. Ca şi în cazul vectorilor pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt, de obicei, vectori de tip navetă, ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona în două gazde diferite: E.coli şi Agrobacterium sp., iar anumite porţiuni ale lor se exprimă în celulele eucariote.

Un exemplu de asemenea vector, mult utilizat în experimentele de transfer de gene în celulele vegetale, este pBI121 (Figura 9).

Figura 9. Harta genetică a plasmidei pBI121.

C. P. Cornea

96

Plasmida pBI121 este un derivat al plasmidei pBin19 construită de Bevan în 1984. Ea are 13 kb şi conţine o serie de elemente genetice ce îi permit menţinerea în E.coli şi în diferite tulpini de Agrobacterium (ori, gena de rezistenţă la kanamicină). De asemenea, vectorul pBI121 conţine şi secvenţe ce sunt transferate în genomul celulelor vegetale. Acestea sunt: secvenţele marginale de 25pb (derivate de la ADN-T din plasmida Ti de la A.tumefaciens) esenţiale pentru transfer, între care au fost clonate două gene marker: gena de rezistenţă la kanamicină (nptII) şi gena ce codifică sinteza β-glucuronidazei (gus). Cele două gene marker au fost clonate sub controlul unor regiuni promotor sau terminator specifice: gena nptII este controlată de promotorul NOS (de la gena pentru nopalin-sintetază)(P1) şi de terminatorul NOS, iar gena gus se află sub controlul promotorului 35S de la virusul CaMV (virusul mozaicului conopidei)(P2) şi a secvenţei terminatoare NOS. Acest tip de vector permite sinteza de proteine de fuziune prin clonarea genei de interes la nivelul MCS localizat după promotorul 35S. Interesul deosebit al cercetătorilor pentru introducerea de gene heterologe în celulele vegetale şi pentru studiul funcţionării lor, a condus la construirea unor vectori din ce în ce mai perfecţionaţi. Unii dintre asemenea vectori permit exprimarea diferenţiată a unor gene clonate: la nivelul unor organe specifice ale plantei sau în diferite momente ale dezvoltării acesteia.

2. Aplicaţii ale transgenezei la plante

Speciile vegetale prezintă o mare diversitate genetică, iar cele sălbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obţine gene importante din punct de vedere practic. Cercetările de inginerie genetică la plante prezintă o semnificaţie teoretică deosebită, facilitând cunoaşterea modului de acţiune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltării plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Meyer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie moleculară se pot obţine informaţii utile asupra particularităţilor genomului plantelor folosite în ameliorare, a localizării unor gene de interes, a gradului de înrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff, 1994; Edwards şi Karp, 1997). În ceea ce priveşte aplicaţiile practice, până în prezent au fost obţinute o serie de rezultate semnificative, unele aplicate deja în practică aşa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze; plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători, plante transgenice rezistente la erbicide (figura 10); plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi, plante care produc fructe rezistente la înmuiere); plante transgenice capabile să sintetizeze metaboliţi secundari în cantităţi crescute; plante transgenice producătoare de anticorpi „comestibili” etc.

Figura 10. Comparaţie între aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la acţiunea erbicidelor şi cel al unor plante normale (după Tarano, 1993)


97

Pe lângă aceste reuşite, cercetările efectuate în prezent vizează, pe de o parte extinderea numărului de specii de plante la care transferul de gene utile să fie eficient şi, pe de altă parte, studii asupra controlului dezvoltării plantelor şi a exprimării genelor (activarea şi silenţierea genelor) (Chua şi Sundaresan, 2000). Aşa cum se poate vedea din cele spuse mai sus, aplicaţiile plantelor transgenice sunt extrem de diverse astfel că abordarea tuturor direcţiilor într-o singură lucrare nu este posibilă. Din acest motiv, în continuare vor fi prezentate doar câteva dintre aceste tipuri de aplicaţii, insistându-se pe cele care fie au potenţial aplicativ spectaculos, fie nu au fost pe deplin rezolvate, fie pot aduce noutăţi în plan fundamental şi practic. 2.1. Protecţia plantelor faţă de atacul insectelor Pierderile înregistrate anual de producţia agricolă globală datorită atacului insectelor dăunătoare sunt estimate la aproximativ 14%, în timp ce raportat la anumite specii vegetale în parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la grâu, 83% la orez, 59% la porumb, 74% la cartof, 58% la soia şi 84% la bumbac (Oerke şi colab., 1994). Insectele determină scăderea producţiei agricole atât prin acţiune directă cât şi prin acţiune indirectă, ca vectori ai unor fitopatogeni variaţi. Limitarea acţiunii acestora se realizează prin folosirea pesticidelor, estimate la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual. Tehnologia ADN recombinant oferă în prezent posibilitatea obţinerii de noi insecticide biologice care păstrează avantajele agenţilor biologici „clasici” de control având în plus unele caracteristici noi. Cu toate acestea, din considerente comerciale, tehnologiile respective nu sunt accesibile tuturor utilizatorilor posibili, mai ales dacă aceştia sunt săraci şi, în plus au generat o serie de dezbateri publice asupra utilităţii lor, a efectelor asupra altor organisme decât cele ţintă sau asupra mediului. Obţinerea de plante rezistente la dăunători reprezintă poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante, deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care conţin gene de origine bacteriană ce le asigura protecţie faţă de anumite insecte dăunătoare. Aceasta asigură, pe de o parte, obţinerea de recolte mai bogate şi, pe de altă parte, reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide.

In ultimii ani, au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistenţa la atacul insectelor, transferabile la plante. Dintre acestea sunt de amintit: genele ce codifică producerea δ-endotoxinei de la Bacillus thuringiensis; gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici; gene de la plante ce codifică sinteza unor lectine specifice; gene care determină inducerea sintezei unor compuşi vegetali de tipul fitoalexinelor etc.

2.1.1. Genele pentru δ-endotoxina de la Bacillus thuringiensis După descoperirea sa în 1901 de către Ishiwata, această bacterie a fost supusă unor

cercetări asupra producerii unor substanţe inhibitorii pentru insecte astfel că în 1951 a fost elaborat un biopesticid care a stat la baza obţinerii unor produse cunoscute sub numele de Thuricid şi Dipel. În elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observaţia că există un grup de bacterii Gram pozitive, aparţinând speciei Bacillus thuringiensis, care produc o toxină, numită delta-endotoxina sau proteina cristal, capabilă să omoare o gamă foarte largă de insecte (coleoptere, lepidoptere, diptere), în funcţie de tulpina bacteriană. De mare interes este tulpina B.thuringiensis var. tenebrionis care sintetizează o δ-endotoxină eficientă împotriva gândacului de Colorado. Genele implicate în sinteza acestei proteine sunt localizate, la majoritatea tulpinilor bacteriene, pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb), producerea toxinei făcându-se în cursul sporulării. De asemenea, s-a dovedit că proteina cristal (δ-endotoxina) este exprimată, în mod normal, ca o pro-toxină inactivă, de dimensiuni mari, care suferă o

C. P. Cornea

98

prelucrare proteolitică în intestinul insectei sensibile, devenind toxină activă. Aceasta recunoaşte receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale şi blochează funcţiile acestor celule, ceea ce conduce la moartea insectelor. Studiile asupra genelor ce codifică proteinele inhibitoare produse de B.thuringiensis au condus la gruparea acestora în patru tipuri pe baza specificităţii de acţiune (de tipul de insectă ţintă) şi a secvenţei de nucleotide:

- genele cry de tipul I codifică proteine de 130 kDa specifice pentru larvele de lepidoptere

- genele cry de tipul II codifică proteine de 70 kDa active asupra larvelor de diptere şi lepidoptere

- genele cry de tipul III codifică proteine de 70 kDa cu acţiune specifică asupra larvelor de coleoptere

- genele cry de tipul IV codifică proteine inhibitorii pentru larvele de diptere. Trebuie precizat însă faptul că numărul de gene identificate că sunt codificatoare

pentru proteine de tip δ- endotoxine este foarte mare: 140 de gene cu specificitate pentru lepidoptere, coleoptere şi diptere (Crickmore şi colb., 1998). S-a reuşit obţinerea genelor pentru proteina cristal de la mai multe tulpini de B.thuringiensis prin amplificare genetică (PCR). Deoarece s-a dovedit că gena întreagă pentru proteina cristal se exprimă foarte slab în celulele vegetale transformate, s-a realizat o genă modificată, ce conţine doar informaţia pentru porţiunea N-terminală a proteinei (aminoacizii 1-645) (Figura 11). Mai mult, pentru a mări exprimarea genei în plante, secvenţa naturală pentru aminoacizii 1-415 bogată în AT a fost înlocuită de o secvenţă sintetică, bogată în GC, ce conţine codonii preferaţi de celulele vegetale. Aceste gene recombinate au fost introduse în vectori derivaţi de la plasmida Ti (vectori binari ce conţin promotorul CaMV duplicat, fapt ce măreşte de 5 ori procesul de transcriere şi gene marker de selecţie – pentru rezistenţa la antibiotice sau la erbicidul fosfinotricin), transferate în celule de A.tumefaciens ce conţin plasmide Ti dezarmate.

Figura 11. Reprezentarea schematică a plasmidelor recombinate ce conţin gena cry A(b) de la Bacillus thuringiensis, folosite pentru obţinerea de plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători (după Carozzi şi

colab., 1992).


99

Mărimea plasmidelor recombinate obţinute variază între 5000 şi 10.000 pb, în funcţie de dimensiunea genei bacteriene şi a secvenţei promotor integrate în vector (Koziel şi colab., 1993).

Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test (cartof, tutun, bumbac). Selecţia s-a realizat mai întâi în funcţie de markerii de selecţie purtaţi de vectori (rezistenţa la antibiotice, testul GUS, rezistenţa la erbicid etc), iar în final, plantele regenerate au fost supuse atacului insectelor. Plantele transgenice regenerate au manifestat rezistenţă la atacul insectelor dăunătoare, caracterul menţinându-se şi exprimându-se şi în cazul experimentelor în câmp.

Prima plantă transgenică obţinută care manisfestă rezistenţă la atacul insectelor aparţine speciei Nicotiana tabacum (Vaeck şi colab., 1987), ea exprimând gena cry 1A, întreagă sau trunchiată, clonată sub controlul unui promotor constitutiv astfel încât proteina inhibitoare reprezintă 0,02% din totalul de proteine vegetale (din frunze).Câţiva ani mai târziu (1992) au fost obţinute plante de bumbac în care a fost introdusă gena cry 1A(c) modificată, clonată sub controlul promotorul CaMV 35S sau sub controlul unui promotor şi a unei secvenţe pentru o peptidă de tranzit prin cloroplaste izolate de la Arabidopsis, astfel că nivelul exprimării genei de interes a condus la obţinerea unui nivel ridicat al toxinei: 0,1% din proteina totală, respectiv 1%. O altă variantă de clonare a genei pentru toxina bacteriană a fost aceea a utilizării unor elemente genetice care asigură exprimarea genei de interes exclusiv în porţiunile verzi ale plantei (promotorul derivă de la gena pentru PEPC)(Hudspeth şi Grula, 1989) sau în polen (prin folosirea unui promotor derivat de la gena pentru o protein kinază dependentă de calciu = CDPK)(Estruch şi colab., 1994). Fujimoto şi colab. (1993) au utilizat o metodologie asemănătoare pentru a transforma plante de orez, iar Perlak şi colb.(1993), prin clonarea unei gene cry III sintetică au obţinut plante transgenice de tutun şi cartof rezistente la atacul gândacului de Colorado. Mai recent, Arencibia şi colab.(1997) au utilizat pentru clonare o genă modificată cry 1A(b) sub controlul promotorului CaMV şi au obţinut plante transgenice de trestie de zahăr cu rezistenţă la larvele de Diatraea saccharalis. Dată fiind semnificaţia practică a rezistenţei plantelor la insectele dăunătoare cercetările au fost extinse şi la alte specii de plante, obţinându-se plante de vinete rezistente la atacul unor coleoptere (Arpaia şi colab., 1997), brocoli cu rezistenţă la anumite specii de lepidoptere (Selvapandian şi colab., 1998), porumb cu rezistenţă la Busseola fusca (Rensburg şi colab., 1999) etc precum şi o serie de progrese la plante leguminoase (Ortiz şi colab., 2000).

Studiile de toxicitate efectuate asupra plantelor transgenice ce exprimă gena pentru δ endotoxină au dovedit că existenţa transgenei nu modifică particularităţile normale ale respectivelor plante, cu excepţia rezistenţei la atacul insectelor.

Pe lângă δ endotoxina produsă de tulpini de B.thuringiensis, au mai fost identificate şi alte specii de bacterii care produc proteine cu efect insecticid. Acesta este cazul unor tulpini de Bacillus cereus care produc două proteine, VIP 1 şi VIP2 cu efect asupra unor insecte, modul lor de acţiune fiind asemănător cu al δ endotoxinei (Estruch şi colb., 1997).

2.1.2. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect

insecticid Exprimarea de către plantele transgenice a unor enzime cum ar fi chitinaza, colesterol oxidaza, lipoxigenaza, fenol-oxidaza, peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea constitui o alternativă la utilizarea genei pentru δ endotoxină (Sharma şi colab., 2000). Dintre enzimele care pot asigura protecţie plantelor transgenice faţă de atacul insectelor, un loc aparte este ocupat de chitinaze, enzime care acţionează asupra chitinei, component de bază al învelişurilor insectelor. Astfel, plantele transgenice de tutun care

C. P. Cornea

100

exprimă gene pentru chitinază izolate de la insecte (Ding şi colab., 1998) sau de la fasole (Gatehouse şi colab., 1993) manifestă o rezistenţă crescută la lepidoptere. Mai mult, s-a observat faptul că prin clonarea genei pentru chitinază izolată de la bacteria Serratia marcescens s-a evidenţiat un efect sinergic al endochitinazei produse de plantele transgenice ce conţin suplimentar gena pentru δ-endotoxină faţă de larvele de Spodoptera litoralis (Rigev şi colab., 1996).

O altă enzimă de origine bacteriană care manifestă acţiune insecticidă este colesterol oxidaza. Spre exemplu, introducerea şi exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidază de la Streptomyces sp. în plante de tutun a condus la o rezistenţă crescută a plantelor transgenice obţinute faţă de larve de Anthonomus grandis (Cho şi colab.,1995).

Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacteriană (implicată în biosinteza citochinelor) prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul proteazic II (PI-IIK) a determinat obţinerea unor plante transgenice de Nicotiana plumbaginifolia rezistente la acţiunea larvelor unor lepidoptere specifice (Manduca sexta sau M.persicae)(Smigocki şi colab., 1993). O altă realizare importantă a fost aceea a introducerii în celulele vegetale a genei cpt2 ce codifică o proteină inhibitoare pentru tripsina, izolată de la Vicia faba. Această proteină are efect antimetabolic, protejând în felul acesta plantele transgenice de atacul unor dăunători. În mod similar au fost clonate în diferite gazde şi alte gene ce codifică inhibitori proteazici (Kunitz trypsin inhibitor, Bowman Birk proteinase inhibitor) sau lectine, proteinele codificate putând constitui adevărate "arme de apărare" pentru plantele transgenice ce le conţin (Foard şi colab., 1983). Astfel, este cunoscut faptul că numeroase insecte, cum ar fi lepidopterele, depind de serin-proteaze (tripsină, chemotripsină sau elastază), acestea fiind primele enzime ce realizează procesul de digestie.

O serie de gene ce codifică diferiţi inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate din diferite surse (plante, microorganisme) şi clonate în diferite specii vegetale, cum ar fi Medicago sativa, tutun, porumb etc; plantele transgenice obţinute au manifestat o rezistenţă crescută faţă de diferite insecte dăunătoare comparativ cu plantele normale, nemodificate genetic (Edmonds şi colab., 1996; Yeh şi colab., 1997). De asemenea, în anumite cazuri s-a remarcat faptul că introducerea în plante a unor gene suplimentare pentru inhibitori proteazici care să se alăture celor endogene determină un nivel crescut al rezistenţei la patogeni a plantelor transformate. Cu toate acestea, utilizarea inhibitorilor proteazici pentru controlul insectelor dăunătoare necesită studii amănunţite asupra interacţiunilor dintre plante şi insecte deoarece s-a observat că, în cazul anumitor inhibitori, cum sunt cei pentru serin-proteaze, efectul insecticid se manifestă şi asupra unor insecte utile (asupra albinelor, de exemplu)(Malone şi colab., 1995). Metabolismul glucidelor de la insecte reprezintă o altă ţintă pentru agenţii inhibitori testaţi în numeroase studii. Astfel, au fost izolate şi caracterizate genele pentru diferiţi inhibitori pentru α-amilază (de la grâu şi fasole); după clonarea în plante de tutun a genei izolate de la grâu în tutun s-a observat o creştere a mortalităţii larvelor de lepidoptere de până la 40%. In cazul clonării în plante de mazăre a genei pentru inhibitorul α-amilazei de la fasole sub controlul promotorului genei pha 1 s-a obţinut o exprimare crescută a genei străine la nivelul seminţelor, ceea ce a condus la o rezistenţă mai mare faţă de Collasobruchus sp. (Schroeder şi colab., 1995). Lectinele vegetale reprezintă un grup special de glicoproteine care au funcţii protectoare faţă de o serie de organisme dăunătoare. Studiile asupra acestor glicoproteine au dovedit că acestea produc efecte puternice asupra dezvoltării unor tipuri variate de insecte. Primul exemplu de plante transgenice ce conţin gene pentru lectine nespecifice şi care manifestă toxicitate pentru dăunători este reprezentat de plante tutun la nivelul cărora au fost clonate genele pentru lectina de la mazăre (Boulter şi colab., 1990). Cu toate acestea, multe


101

dintre lectinele vegetale au efect toxic şi asupra mamiferelor, ceea ce limitează utilizarea lor ca agenţi de mărire a rezistenţei plantelor la dăunători. O atenţie specială a fost acordată, de mulţi specialişti, lectinei cu specificitate pentru manoză de la ghiocel şi concanavalinei A: genele pentru aceste lectine au fost clonate în diferite specii de plante (tutun, tomate, cartof, trestie de zahăr, orez, grâu) iar proteinele heterologe sintetizate de acestea au determinat o sensibilitate redusă faţă de atacul unor insecte dăunătoare (larve de lepidoptere, afide, coleoptere)(Nutt şi colab., 1999; Stoger şi colab., 1999). Rezultatele obţinute sugerează că utilizarea plantelor transgenice ce conţin gene insecticide (cum ar fi cea pentru lectina din ghiocel) împreună cu un management integrat reprezintă posibilităţi promiţătoare pentru controlul dăunătorilor de la multe specii vegetale, inclusiv la grâu sau orez (Rao şi colab., 1998). Ca o concluzie se poate spune că, în ciuda rezultatelor remarcabile obţinute până acum, genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultură sunt fie prea specifice fie sunt doar parţial efective asupra ţintelor reprezentate de insectele dăunătoare. De aceea, pentru a folosi plantele transgenice ca adevărate „arme” pentru controlul dăunătorilor ar fi necesar ca la nivelul lor să existe transgene care să determine sinteza unor compuşi cu acţiuni diferite asupra aceleiaşi ţinte. Cercetările efectuate sunt de dată relativ recentă şi vizează, în principal combinarea în aceeaşi gazdă a genelor pentru o δ-endotoxină de la B.thuringiensis cu o altă genă cu efect inhibitor: de exemplu, gena pentru inhibitorul tripsinei de la Vicia faba (CpTI) sau pentru serin-proteaze (Cornu şi colab., 1996, Zhao şi colab., 1998); gena pentru proteina din învelişul virusului Y de la cartof (Li şi colab., 1999). O altă abordare interesantă este aceea prezentată de Herrera şi colab.(1997) care au introdus gena cry1A(c) într-o tulpină de Pseudomonas fluorescens capabilă să colonizeze trestia de zahăr prin intermediul a două plasmide, pDER405 şi pKT240 la nivelul cărora gena se găseşte în 13, respectiv 28 de copii. Testarea tulpinilor bacteriene recombinate asupra unor insecte dăunătoare specifice trestiei de zahăr a evidenţiat o rezistenţă mai mare a plantelor tratate cu bacteriile respective decât cele netratate.

De asemenea, deşi s-au obţinute plante transgenice cu rezistenţă la insecte dăunătoare în cazul mai multor specii de plante cultivate, mai puţine rezultate au fost raportate în cazul cerealelor, a legumelor şi a plantelor oleaginoase. Mai mult, în cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la siguranţa lor, la posibila toxicitate pentru om şi animale, a implicaţiilor ecologice ale utilizării lor şi, nu în ultimul rând la preţul de cost care trebuie să fie accesibil fermierilor şi ţărilor sărace(Riva şi colab., 2000). 2.2. Gene de rezistenţă la fitopatogeni microbieni, virali şi la nematode Rezistenţa plantelor la diferite boli a constituit un subiect pentru studii efectuate de multă vreme, reuşindu-se identificarea unui număr relativ mare de gene de rezistenţă. Deşi s-a crezut că genele endogene de rezistenţă ar asigura un efect durabil pentru plantele corespunzătoare, doar în foarte puţine cazuri acest lucru a fost adevărat. De exemplu, în cazul cartofului, programul de control al anumitor boli, cum este putregaiul provocat de Phytophtora infestans a trebuit abandonat deoarece rezistenţa la această boală a plantelor de cartof obţinute prin transferul celor 11 gene de rezistenţă pe baza încrucişărilor cu specia sălbatică Solanum demissum s-a dovedit a fi de scurtă durată (Landeo şi colab., 1995). De asemenea, identificarea eventualelor gene de rezistenţă în genomul diferitelor specii vegetale şi transferul lor la alte plante de cultură este extrem de dificilă şi consumatoare de timp dacă se utilizează metodele tradiţionale (hibridările intra- şi interspecifice). Procesul este considerabil accelerat prin utilizarea markerilor moleculari generaţi prin aplicarea tehnicilor RFLP („restriction fragment lenght polymorphism”), RAPD („random amplified polymorphic DNA”), SSR („single sequence repeat”) sau SNP („single nucleotide polymorphism”)

C. P. Cornea

102

(Schneider şi colab., 1997; Gold şi colab., 1999). Aplicarea markerilor moleculari a permis izolarea a aproape 20 de gene de rezistenţă (gene R) de la specii de plante bine caracterizate din punct de vedere genetic, dovedindu-se că multe dintre ele sunt grupate la nivelul unor regiuni cromosomale specifice (formează „clusteri”). Dintre aceste gene de rezistenţă, unele au fost transferate altor specii de plante decât cele de origine, prin tehnici de clonare moleculară, cu ajutorul unor vectori specifici care asigură transferul unor fragmente de dimensiuni mari (Hamilton, 1997), evidenţiindu-se faptul că în acest fel că genele R acţionează sinergic şi asigură o rezistenţă durabilă la unele boli. Aşa cum s-a menţionat deja, puţine gene R s-au dovedit a asigura un control durabil al bolilor la plante. Aşa este cazul genelor Bs2 de la ardei şi Xa21 de la orez care asigură rezistenţa la diferite tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris sau X.oryzae în cazul unor specii în care genele respective au fost clonate (de exemplu, la tomate)(Wang şi colab., 1996). Rezistenţa în cazul acestor gene se datorează faptului că ele asigură recunoaşterea unor proteine pe care le produc bacteriile sau fungii fitopatogeni, rezultatul fiind declanşarea unui fenomen de hipersensibilitate al plantei şi necroza ţesuturilor afectate (Lauge şi colab., 1998). Un alt exemplu de genă R cu acţiune durabilă este gena recesivă mlo de la orz care asigură rezistenţa plantelor ce o conţin la toate tulpinile de Erysiphe graminis, prin acumularea în celulele vegetale a unui compus antifungic de tip fenolic denumit p-cumaroil-hidroxiagmatina. Se preconizează ca această genă să fie utilizată pentru supresia prin tehnica antisens a genei dominante Mlo de la grâu sau de la alte specii de plante sensibile la Erysiphe sp.(Rommens şi Kishore, 2000). Prelucrarea „in vitro” a numitor gene R şi apoi introducerea lor în noi gazde conferă posibilităţi noi de rezistenţă. Acestea este cazul genei avrPto de la tomate care, după clonarea sa sub controlul unui promotor puternic cum este cel de 35S la CaMV determină rezistenţa plantelor de tomate transformate atât la tulpinile de Pseudomonas syringae pv.tomato cât şi la patogeni neînrudiţi, cum ar fi Xanthomonas campestris şi Cladosporium fulvum (Tang şi colab., 1999). Eforturile cercetătorilor de a obţine sisteme de rezistenţă aplicabile la un număr cât mai mare de specii vegetale nu se limitează doar la genele R ci includ şi mecanismele sistemice de apărare pe care le declanşează infecţia cu un anumit patogen („systemic acquired resistance” = SAR). Au fost izolate şi caracterizate mai multe gene implicate în SAR, dintre care, gena Npr1 care codifică un reglator transcripţional constituie o genă cheie în acest sistem. Supraexprimarea acestei gene măreşte rezistenţa plantelor de Arabidopsis thaliana sau de orez la o mare varietate de patogeni (Cao şi Dong, 1998). Un comportament interesant a fost observat în cazul genei Myb1 care este indusă prin infecţia cu VMT a plantelor de tutun rezistente şi care determină sinteza unui factor de transcriere care se leagă la nivelul promotorului unei gene implicate în patogeneză (gena PR1a). Modificarea nivelului de exprimare a genei Myb1 în plantele transgenice de tutun conduce la o rezistenţă crescută faţă de infecţia virală (cu VMT) ca şi faţă de fungul patogen Rhizoctonia solani(Klessig şi Yang, 1999). Alături de aceasta, o altă genă recent clonată, Pad4, izolată de la Arabidopsis thaliana, se dovedeşte extrem de interesantă pentru dezvoltarea rezistenţei cu spectru larg.: supraexprimarea genei respective în plante transgenice sporeşte şi rezistenţa faţă de fitopatogeni (Jirage şi colab., 1999). In ultimii ani, numeroase companii biotehnologice şi universităţi au început să evalueze performanţele plantelor transgenice ce exprimă proteine antifungice atât prin experimente „in vitro” cât şi în câmp. Au fost examinate atât plante ce conţin gene R sau gene implicate în SAR, cât şi gene de tipul celor ce codifică glucooxidaza (AGO) de la Aspergillus sp, a defensinelor, a enzimelor generatoare de H2O2, a β glucanazelor sau chitinazelor (Broekaert şi colab., 1999). Spre exemplu, deşi la nivel de laborator plantele transgenice de cartof ce conţineau gena fungică pentru glucozoxidază au manifestat o rezistenţă crescută faţă


103

de fitopatogeni, atunci când au fost trecute în câmp rezultatele au fost neconcludente. In cazul altor gene, cum ar fi cele pentru chitinază şi pentru β-1,3-glucanaza intracelulară, supraexprimarea acestora în plante transgenice de tomate a determinat o rezistenţă semnificativă faţă de Fusarium oxysporum (Cornelissen şi colab., 1997) 2.3. Plante transgenice producătoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi

Progresele înregistrate în ultimii 10 ani în biologia moleculară şi în domeniul imunologiei au permis o mai bună înţelegere a numeroase boli şi au condus la dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare. Una dintre direcţiile promiţătoare în acest sens este obţinerea de plante transgenice în care să se exprime gene pentru diferiţi antigeni. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimină sau previn unele boli la animale, iar în testele clinice în cazul oamenilor ele s-au dovedit a fi sigure şi funcţionale (Walmsley şi Arntzen, 2000). S-a dovedit că răspunsul imun al unui organism faţă de un anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura epitopilor agenţilor etiologici (Vior, 2000). In acest sens au fost elaborate tehnologii de obţinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul că elimină utilizarea de virusuri „vii” sau de microorganisme patogene active, dar dezavantajul că sunt termosensibile şi foarte scumpe. Producerea unor asemenea vaccinuri în plante elimină unele impedimente curente: preţul de cost ar fi mic, se elimină riscul contaminării de patogeni animali, se asigură o stabilitate pentru produsul obţinut, iar administrarea se poate face pe cale orală şi nu prin injectare. Primele testări clinice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate în 1998, prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de plante transgenice de cartof: administrarea „vaccinului” comestibil a condus la inducerea unui răspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket şi colab., 1998).

Metodologia de transfer a genelor de interes în plante se bazează atât pe sistemele ce utilizează vectorii de clonare derivaţi de la plasmidele Ti de la A.tumefaciens cât şi pe folosirea unor virusuri vegetale recombinate drept vectori ai genelor. Primele încercări de a obţine vaccinuri produse de plante datează din anul 1990 când Curtiss şi Cardineau au determinat exprimarea unei proteine antigenice de la Streptococcus mutans (proteina SpaA) după clonarea genei codificatoare în plante de tutun. După incorporarea de ţesut vegetal transformat în dieta şoarecilor, s-a obţinut un răspuns imun la nivelul mucoaselor faţă de proteina Spa A. Cercetări ulterioare au permis exprimarea antigenului de suprafaţă de la virusul hepatitei B în plante transgenice de tutun şi salată, a unei glicoproteine antigenice de la virusul turbării în plante transgenice de tomate, a subunităţilor toxinei holerice în plante transgenice de tutun sau cartof sau a glicoproteinei B de la citomegalovirusul uman în plante transgenice şi seminţe de tutun (Mason şi colab., 1992; McGravey şi colab., 1995; Arakawa şi colab., 1997; Tackberry şi colab., 1999). Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile „comestibile” produse de plante transgenice ţin de stabilirea metodelor optime de administrare şi dozare, a tipului de răspuns imun şi a duratei sale în cazul patogenilor de tipul Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, HIV sau virusul hepatitei murine. De asemenea, sunt examinate posibilităţile de a îmbunătăţi exprimarea unor antigeni prin realizarea unor gene sintetice, ca în cazul subunităţii B a enterotoxinei termolabile de la Escherichia coli: prin îndepărtarea din gena „naturală” a unei secvenţe de nucleotide care determină prelucrarea ineficientă sau degradarea prematură a proteinei heterologe în plantă, s-a reuşit o creştere de 3-14 ori a acumulării antigenului în frunzele sau tuberculii de cartof transgenic, iar efectul antigenic s-a dovedit prin hrănirea şoarecilor (Mason şi colab., 1998). Experimente recente efectuate de Brennan şi colab. (1999) au evidenţiat posibilitatea folosirii unor proteine antigenice derivate de la Staphylococcus sureus produse de plante

C. P. Cornea

104

transgenice ca vaccinuri orale sau nazale: prin administrarea la şoareci a probelor respective şi examinarea ulterioară a unor fluide recoltate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor sau a intestinului) au fost detectate imunogloguline de tipul IgA şi IgG specifice pentru antigenul folosit în toate fluidele testate. In paralel se realizează teste pe voluntari umani, pentru anumite tipuri de vaccinuri produse de plante: vaccin antidiareic ce conţine o proteină sintetică derivară de la subunitatea B a toxinei termolabile de E.coli, produs de plante de cartof transgenic; vaccin oral obţinut din cartof care conţine antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (HbsAg); vaccin antidiareic (pentru formele de boală de origine virală) ((Walmsey şi Arntzen, 2000).

O a doua strategie interesantă este clonarea în plante a genelor ce codifică sinteza unor anticorpi specifici, pentru obţinerea de „anticorpi monoclonali vegetali”. Producerea primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descrisă de Hiatt şi colab.(1989). Experimentele realizate la tutun au presupus două etape, urmărind clonarea separată, în plante diferite, a genelor ce codifică lanţul greu (catena H), respectiv uşor (catena L), ce alcătuiesc anticorpii (de exemplu, IgG1). Plantele transgenice au fost obţinute prin utilizarea sistemului de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens. Cele două tipuri de plante transgenice regenerate, una exprimând catena H iar cealaltă catenă L, au fost încrucişate între ele şi s-a examinat producerea de anticorpi funcţionali (asamblaţi) de către plantele apărute în descendenţă (Figura 12).

Figura12. Prezentarea schematică a procedeului de obţinere de anticorpi prin clonarea genelor codificatoare în

celulele vegetale (adaptare după Watson şi colab. 1992). Rezultatele obţinute au fost încurajatoare, în plantele transgenice descendente detectându-se prezenţa anticorpilor funcţionali, ei reprezentând aproximativ 1-1,5% din totalul proteinelor celulare extrase din frunze. Mai mult, s-a dovedit că anticorpii funcţionali au fost produşi doar atunci când moleculele de ADNc ce codifică cele două tipuri de catene


105

ale unui anticorp conţin o secvenţă semnal derivată de la genele pentru anticorpi de şoarece. Acest fapt sugerează că echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoaşte secvenţe leader heterologe, permiţând exprimarea genelor clonate sub controlul lor. Deşi promiţătoare, aceste experimente sunt abia la început, fiind necesare studii suplimentare în vederea optimizării producerii unor asemenea compuşi de către celulele vegetale, la nivel de bioreactor sau direct în câmp, la un preţ de cost convenabil (Whitelam şi colab., 1994). 2.4. Plante transgenice folosite pentru cercetări asupra unor procese fiziologice

fundamentale

Formarea ţesuturilor tumorale ca urmare a introducerii unor gene bacteriene în genomul vegetal prin transformarea realizată de bacteriile din genul Agrobacterium constituie un exemplu de modificare genetică naturală a procesului de biosinteză a fitohormonilor. Astfel, prin integrarea în genomul plantelor gazdă a genelor bacteriene care induc sinteza anormală a acidului indolilacetic (IAA) şi a citokininelor (CK) determină proliferarea necontrolată a celulelor vegetale. Pornind de la această observaţie, au fost examinate căile de biosinteză ale fitohormonilor vegetali precum şi posibilităţile de modificare controlată a lor în scopuri aplicative. Studiile efectuate asupra biosintezei de auxine au dovedit că aceasta este crescută în cazul plantelor transgenice ce conţin gene bacteriene cum ar fi: tms de la A.tumefaciens genele aux de la A.rhizogenes sau genele iaaM şi iaaH de la Pseudomonas syringae pv.savastanoi. Utilizarea drept plante test a speciilor Arabidopsis thaliana şi Nicotiana tabacum a evidenţiat faptul că există mai multe căi posibile de biosinteză ale IAA, unele implicând triptofanul ca intermediar iar altele presupunând implicarea indolului sau a unor alţi precursori timpurii. In cazul examinării biosintezei citokininelor au fost înregistrate niveluri crescute în cazul plantelor transgenice ce conţin gena ipt (pentru isopentenil transferaza) de la A.tumefaciens. Clonarea genei ipt sub controlul unor promotori variaţi (constitutivi, ţesut-specifici sau inductibili – cum sunt cei induşi prin şoc termic sau prin acţiunea cuprului) determină exprimarea variată a acesteia, consecinţa acumulării CK fiind formarea de muguri laterali, pierderea dominanţei apicale şi reducerea formării de rădăcini (Hedden şi Phillips, 2000). De asemenea, prin clonarea genei tzs de la A.tumefaciens (ce codifică un fitohormon cu acţiune similară produsului genei ipt) sub controlul unui promotor inductibil prin căldură, s-a obţinut o secvenţă notată hsp70-tzs care, introdusă în plante de rapiţă, a determinat o creştere a nivelului transzeatinei şi a condus la creşterea numărului de seminţe per silicvă (Roeckel şi colb., 1998). O atenţie specială a fost acordată giberelinelor (GA) al căror nivel în plante poate fi controlat cu ajutorul unor substanţe chimice: prin inhibarea biosintezei GA este stimulată creşterea unor plante, proces cu implicaţii practice deosebite. De aceea, modularea exprimării genelor ce codifică biosinteza GA prin utilizarea plantelor transgenice asigură aplicaţii importante în agricultură. Spre exemplu, supraexprimarea în plante transgenice de A.thaliana a uneia dintre genele pentru GA 20-oxidaza (enzimă cheie în procesul de biosinteză a GA) determină stimularea creşterii plantelor, alungirea tulpinii şi o înflorire precoce, fenomene asociate cu o acumulare de gibereline. De asemenea, s-a dovedit că sinteza enzimei GA 20-oxidaza este codificată de cel puţin trei gene diferite, care prezintă variaţii în ceea ce priveşte exprimarea. Astfel, plantele transgenice ce conţin o genă antisens pentru gena normală At20ox1 prezintă o reducere a alungirii tulpinii, fenotipul este de semi-piticism, iar nivelul GA este la o treime faţă de normal; în schimb, plantele transgenice ce conţin gena antisens pentru gena At20ox2 prezintă o creştere normală deşi internodiile sunt mai scurte iar plantele produc mai puţine silicule. In cazul utilizării genei antisens pentru At20ox3, are loc o reducere a lungimii hipocotilelor în cursul dezvoltării răsadului dar, ulterior, planta se dezvoltă normal.

C. P. Cornea

106

Concluzia acestor observaţii este aceea că produşii genelor menţionate prezintă ţinte tisulare diferite sau că influenţează etape diferite ale procesului de dezvoltare fără a necesita promotori specifici (Coles şi colab., 1999). Reducerea nivelului giberelinelor la diferite plante de interes se poate realiza şi pe alte căi, utilizându-se tot plante transgenice. Astfel, clonarea în planta test A.thaliana a genei pentru o GA 20-oxiadază de la fasole şi asigurarea condiţiilor de supraexprimare determină producerea de plante pitice. Fenomene similare au fost evidenţiate şi în cazul plantelor transgenice de Solamun dulcamara ce exprimă gena pentru aceeaşi enzimă izolată de la pepene (Hedden şi colab., 1999). O altă substanţă produsă de plante care, prin controlul biosintezei sale, determină aplicaţii practice deosebite este etilena. Astfel, plante transgenice de tomate, pepene, brocoli sau de Torenia fournieri (plantă ornamentală) în care a fost introdusă o genă antisens care blochează funcţionarea genei pentru ACCS (1-aminociclopropan-1-carboxilat sintetaza) sau ACCO (1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidaza) prezintă modificări legate de procesul de înflorire şi de coacere (Hedden şi Phillips, 2000). Studii genetice recente asupra unor plante transgenice au permis realizarea unor progrese semnificative legate de rolul brasinosteroizilor şi de identificarea genelor ce îi codifică (Chory, 1999). Astfel, clonarea genei BAS1 de la Arabidopsis şi asigurarea condiţiilor de supraexprimare a acesteia în plante de tutun determină reducerea nivelului de brasinosteroizi şi producerea de plante pitice (Nef şi colab, 1999). De asemenea. cercetările complexe efectuate asupra biosintezei diferiţilor hormoni produşi de plante şi a interacţiunilor dintre aceştia pentru controlul proceselor fiziologice normale au condus la o serie de observaţii interesante: modificarea nivelului de exprimare a unui hormon afectează şi nivelul altora, astfel că influenţele fiziologice sunt greu de estimat. De exemplu, IAA şi CK îşi inhibă reciproc sinteza, iar IAA stimulează sinteza de etilenă. La plantele transgenice de tutun s-a evidenţiat că auxina induce prelucrarea post-transcripţională a enzimei o-xilosiltransferaza care determină blocarea citokininelor. In concluzie, prelucrarea genelor ce codifică enzimele implicate în biosinteza fitohormonilor demonstrează posibilitatea obţinerii de plante transgenice care să prezinte niveluri mai ridicate sau mai scăzute ale acestor hormoni, în funcţie de scopul urmărit cu aceste plante. Plantele rezultate, ce prezintă modificări ale procesului de dezvoltare sau ale răspunsurilor faţă de condiţiile de mediu, pot avea aplicaţii comerciale astfel că pentru o reglare mai eficientă a proceselor respective genele de interes sunt clonate sub controlul unor promotori inductibili sau ţesut-specifici. Cu toate acestea, deoarece interacţiunile dintre fitohormoni determină efecte pleiotropice neaşteptate în plantele transgenice, sunt necesare studii suplimentare pentru înţelegerea şi controlul acestor procese.

De asemenea, reglarea exprimării transgenelor reprezintă un element de bază atât pentru cercetările fundamentale de biologie moleculară vegetală cât şi pentru aplicaţiile biotehnologice. Modalităţile de reglare sunt variate, un loc aparte fiind deţinut de sistemele inductoare reprezentate de diferite substanţe chimice care acţionează asupra genei de interes (ţintă), activând-o sau inactivând exprimarea sa. Utilitatea promotorilor inductibili a fost deja demonstrată prin elaborarea unui sistem de transformare genetică fără a folosi gene marker de selecţie şi prin utilizarea unui număr variat de transgene. In plus, aplicaţiile practice par a fi promiţătoare prin utilizarea ca inductori a unor compuşi agrochimici înregistraţi. Aceasta ar permite activarea în câmp a funcţionării anumitor gene de interes prin folosirea unei substanţe specifice ceea ce ar elimina pierderile firmelor producătoare de seminţe transgenice datorate fermierilor care păstrează o parte din recoltă pentru însămânţările din anul următor (Gatz, 1998).

Sistemele inductoare de acest tip pot acţiona în sensul activării unor recombinaze specifice care să determine anumite „remodelări” ale ADN nuclear al plantelor transgenice.:


107

în funcţie de conformaţia situsul de legare pentru recombinază, ADN ţintă (inclusiv transgena) poate fi activat sau inactivat. In mod similar, ele pot acţiona asupra unor organe specifice activând transgenele doar la nivelul ţesutului tratat (prin intermediul unor factori de transcriere particulari). In acest caz, exprimarea genelor este temporară (Zuo şi Chua, 2000).

3. Da sau nu plantelor transgenice?

In cadrul biotehnologiilor vegetale, obţinerea şi mai ales utilizarea practică a plantelor transgenice constituie subiectul unor controverse atât între diverşi membri ai comunităţii ştiinţifice cât şi între aceştia şi o serie de organizaţii neguvernamentale din diverse ţări. Adversarii plantelor transgenice s-au concentrat asupra a două direcţii principale: impactul asupra omului a consumului de produse alimentare rezultate din organisme modificate genetic (deci şi din plante transgenice) şi consecinţele eliberării organismelor vegetale modificate genetic asupra mediului. Testarea în câmp în 1986 a primelor plante transgenice şi apoi extinderea şi diversificarea experimentelor cu alte tipuri de asemenea plante modificate genetic, a fost considerată de unii specialişti şi de o parte a publicului larg (mai mult sau mai puţin instruit în ceea ce priveşte principiile tehnologiei ADN recombinant utilizată pentru obţinerea acestor organisme) drept o adevărată deschidere a unei noi cutii a Pandorei. Ceea ce se reproşează deseori cercetătorilor care lucrează în domeniul tehnologiei ADN recombinant aplicată plantelor este că modifică natura în mod artificial, încălcând astfel regulile naturale. Dovedirea, însă, a faptului că depăşirea barierelor interspecifice prin transferul de gene între organisme neînrudite (transfer pe orizontală) nu este invenţia omului ci este un fenomen care este întâlnit în natură (a se vedea transformarea celulelor vegetale de către bacteriile din speciile Agrobacterium tumefaciens şi A.rhizogenes) vine să contrazică acuzaţia menţionată. Ceea ce stă însă în picioare este faptul că, cel puţin teoretic există posibilitatea transferării transgenelor din plantele modificate genetic la plante înrudite din flora spontană. Se cunoaşte că multe plante de interes agronomic sunt, în plan reproductiv, izolate de restul plantelor din flora spontană deoarece ele provin din alte regiuni decât cele în care se cultivă (de exemplu, porumbul sau cartoful pentru Europa), astfel că „poluarea genetică” de care se face caz nu este posibilă (Tourte, 1998).

Un scenariu mai recent, elaborat de unii cercetători, care însă nu se bazează pe dovezi concrete ci doar pe supoziţii, consideră că folosirea vectorilor virali pentru transferul de gene ar face posibilă diseminarea transgenelor în natură nu numai la plante variate ci chiar şi la alte organisme (de exemplu, microorganisme patogene), acestea dobândind caractere noi (Ho, 2001). Cu toate acestea, până în prezent nu au fost obţinute date concludente asupra existenţei transferului pe orizontală a genelor exogene de la plantele cultivate la cele de tip sălbatic. Absenţa dovezilor din prezent nu înseamnă că fenomenul trebuie exclus; din contră, este necesară o permanentă monitorizare a posibilităţii diseminării pentru a se putea lua măsurile corespunzătoare dacă acest lucru s-ar produce.

O altă problemă care este pusă frecvent se referă la influenţa transgenelor asupra omului. Două întrebări apar mai frecvent în mass media: sunt plantele transgenice toxice pentru om şi animale? sau, există posibilitatea transferului transgenelor din ţesuturile vegetale transformate la om? Răspunsul la aceste întrebări nu este atât de simplu cât ar părea la prima vedere. Încă din Antichitate înţelepţii şi-au pus deseori problema de ce, de exemplu, iepurele care mănâncă în principal morcovi nu se transformă în morcov, sau omul care se hrăneşte cu o gamă variată de alimente nu împrumută din însuşirile acestora. In prezent, la această dilemă se adaugă şi genele de interes introduse în diferite plante de cultură care sunt utilizate în alimentaţie. Explicaţia absenţei dovezilor referitoare la acest transfer (genom vegetal – genom

C. P. Cornea

108

uman) se datorează proceselor de prelucrare la care sunt supuse alimentele în corpul uman, în urma cărora ADN este şi el degradat pierzându-şi însuşirile transformate.

In ceea ce priveşte posibilitatea toxicităţii unor produse alimentare obţinute din organisme modificate genetic, aici lucrurile nu sunt excluse, date fiind unele accidente apărute în urma consumului unor alimente provenite din materii prime insuficient controlate, fiind necesare studii extrem de laborioase asupra clarificării acestor aspecte. De altfel, atât pe plan internaţional cât şi naţional au fost elaborate o serie de documente legislative care reglementează utilizarea organismelor modificate genetic pentru obţinerea de alimente de uz uman, fiind unanim acceptată ideea etichetării obligatorii a produselor de acest tip. Se oferă consumatorului, în acest fel, posibilitatea de opţiune în vederea utilizării sau nu a produselor obţinute din materii prime de origine transgenică. Spre exemplu, recent s-a aprobat utilizarea plantelor de porumb transgenic ce conţin gena pentru proteina insecticidă Cry (derivată de la B.thuringiensis) dar numai pentru hrana animalelor şi pentru prelucrare industrială, nu şi pentru consumul uman deoarece există posibilitatea ca proteina respectivă să fie alergenă (Hileman, 2002). De asemenea, pentru a elimina posibilitatea ca anumite substanţe produse de organismele modificate genetic să producă alergii dar, în acelaşi timp să nu se excludă utilizarea acestora, multe instituţii naţionale sau internaţionale iau măsuri pentru elaborarea de teste rapide şi eficiente de identificare a posibililor compuşi alergeni sau dăunători.

Cu toate acestea, indiferent de curentele de opinie potrivnice obţinerii şi utilizării plantelor transgenice, avantajele oferite de această tehnologie modernă sunt certe. Aşa cum s-a prezentat pe parcursul acestui material, transgeneza la plante joacă un rol esenţial în cunoaşterea şi analiza genomului vegetal, în controlul procesului de dezvoltare, în înţelegerea metabolismului plantelor. De asemenea, aplicarea tehnologiei ADN recombinant plantelor de cultură în vederea obţinerii de noi soiuri cu caracteristici utile din punct de vedere economic constituie un demers economic cu implicaţii deosebite, benefice. De altfel, perfecţionarea permanentă a tehnicilor moleculare aplicate, a diversificării cunoştinţelor asupra structurii şi funcţionării materialului genetic constituie argumente convingătoare pentru continuarea şi aprofundarea experimentelor de inginerie genetică la plante, astfel că noile generaţii de plante transgenice obţinute vor fi sigure atât pentru mediul înconjurător cât şi pentru om.

Bibliografie selectivă 1. Altman, A., 1999, Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead, EJB, 2,

2. 2. Carozzi,N., WarrenW., Rice,D.A., Evola,S., Koziel,M.G., 1992, Expression of chimeric

CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco, Plant Molec.Biol., 20, p.539-548.

3. Cucu, N., Stefan, M., Mitru, M, Gavrilă, L., 1998, Modification of plant genome by genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome, în Implicaţii ştiinţifice şi bioetice în analiza şi manipularea genomului, Edit.Ars Docendi, p.161-169

4. Gatz,C., 1997, Chemical control of gene expression, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 48, p.89-108.

5. Gold, J., Harder, D., Smith, F., Aung, T, Procunier, J., 1999, Development of a molecular marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines, EJB., 2, nr.1.

6. Hedden, P., Phillips, A. L., 2000, Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.130-137.

7. Hileman, B., 2002, What’s hiding in transgenic foods? Chemical Eng. news, ian. 2002, p. 20-2.


109

8. Ho, M. W., 2001, Horizontal gene transfer – the hidden hazards of genetic engineering, Institute of Science in Society.

9. Martinelli, L., Mandolino, G., 1994, Genetic transformation and regeneration of transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris), Theor. Appl. Geneti., 88, p.621-628

10. Riva, G. A., Cabrera, J. G., Padron, C. A., 1998, Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation, EJB, 1, nr.2.

11. Robinson,J., 1999, Ethics and transgenic crops, Electronic Journal of Biotechnology, 2, nr.2.

12. Sharma, H. C., Sharma, K. K., Seetharama, N., Ortiz, R., 2000, Prospects for usig transgenic resistance to insects in crop improvement, EJB, 3, nr.2.

13. Tinland, B., 1996, The integration of T-DNA into plant genomes, Trends in Plant Science, 1., nr.6.p.178-183.

14. Tourte, Y., 1998, Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes, Edit.Dunod 15. Walmsley, A. M., Arntzen, C. J., 2000, Plants for delivery of edible vaccines, Current

Opinion in Biotechnology, 11, p.121-129. 16. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific

Academic Books. 17. Weising, K., Kahl., G., 1996, Natural genetic engineering of plant cells: the molecular

biology of crown gall and hairy root disease, World J. Microbiol.Biotechnol., 12, p.327-351.

18. Whitelam, G. C., Cockburn,W., Owen, M. R. L., 1994, Antibody production in transgenic plants, Biochem. Society Transact., 22., p.940-943.

19. Zuo, J., Chua, N. H., 2000, Chemical inducible systems for regulated expression of plant genes, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.146-151.

modificarea genetică a plantelor: principii generale de...

Documents