modifikasi struktur senyawa asam p-metoksi sinamat melalui

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat

Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti

Inflamasi

SKRIPSI

MUHAMAD SYAHID ALI

NIM: 1111102000115

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat

Melalui Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti

Inflamasi

SKRIPSI

Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Mendapat Gelar Sarjana Farmasi

MUHAMAD SYAHID ALI

NIM: 1111102000115

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Muhamad Syahid Ali

Nim : 1111102000115

Tanda Tangan :

Tanggal : 15 juni 2015

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK


Nim : 1111102000115

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Judul : Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-Metoksi Sinamat Melalui

Proses Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Anti Inflamasi.

Etil p-metoksisinamat merupakan senyawa utama yang terdapat dalam

rimpang kencur. Tujuan dari penelitian ini adalah memodifikasi struktur asam p-

metoksisinamat (APMS) yang dihidrolisis dari etil p-metoksinamat (EPMS) dan

menilai terhadap aktivitas antiinflamasi. Modifikasi senyawa Etil p-

metoksisinamat dilakukan melalui reaksi hidrolisis menggunakan NaOH sebagai

katalis, etanol sebagai pelarut yang selanjutnya menghasilkan senyawa asam p-

metoksisinamat. Senyawa asam p-metoksisinamat selanjutnya direaksikan melalui

reaksi nitrasi dengan menggunakan HNO3 sebagai reagen dan menggunakan

metode cold microwave menghasilkan senyawa asam p-metoksisinamat yang

mengandung gugus nitro. Hasil modifikasi diidentifikasi menggunakan GCMS,

IR, 1H-NMR,

13C-NMR dan HSQC. Uji aktivitas antiinflamasi dilakukan dengan

menggunakan metode antidenaturasi Bovine Serum Albumin (BSA). Senyawa

Asam p-metoksisinamat dapat menginhibisi denaturasi protein pada konsentrasi

10 ppm ( 0,115%) dan pada konsentrasi 100 ppm (0,325%) serta tidak mampu

menginhibisi pada konsentrasi 0,1 ppm ( -0, 54) dan 1 ppm (-0,34). Senyawa hasil

modifikasi Asam p-motoksisinamat menginhibisi denaturasi protein pada

konsentrasi 0,1 ppm (36,71%), 1 ppm (29,65%) dan 10 ppm ( 15,32 %), akan

tetapi pada konsentrasi 100 ppm (-7,93) tidak dapat menginhibisi denaturasi

protein. Hasil ini menunjukan bahwa terjadi peningkatan aktivitas antiinflamasi

pada senyawa nitrasi APMS dibandingkan pada senyawa APMS.

Kata kunci : Etil p-metoksisinamat, hidrolisis, Asam p-metoksisinamat, nitrasi,

antiinflamasi, Bovine Serum Albumin.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Muhamad Syahid Ali

Study Program : Bachelor of Pharmacy

Title : Structure Modification of p-Metoxycinnamate Acid

Through Nitration Process and Deternination of Anti-

inflammatory Activity

Kencur contains a large amount of ethyl p-methoxycinnamate compound.

The aims of this study were to modified the ethyl p-methoxycinnamate into p-

methoxycinnamate acid through hydrolysis reaction and determined the anti-

inflammatory activity. Ethyl p-methoxycinnamate was modified into p-

methoxycinnamate through hydrolysis reaction using NaOH as a catalyst,and

ethanol as a solvent. Then, p-methoxycinnamate was modified into p-

methoxycinnamate acid nitro derivative through nitration process using cold

microwave method and HNO3 as a reagent. The resuls were identified using

GCMS, IR, 1H-NMR.

13C-NMR, and HSQC. The determination of anti-

inflammatory activity was performed using Bovine Serum Albumin (BSA). p-

Methoxycinnamate acid 10 ppm (0.115%) and 100 ppm (0.325%) inhibits the

protein denaturation, while the 0.1 ppm (-0,54) and 1 ppm (-0,34) showed no

inhibition. And the p-methoxycinnamate nitro derivative 0.1 ppm (36.71%), 1

ppm (29.65%), and 10 ppm (15.32%) inhibits the protein denaturation, while the

100 ppm (-7,93) showed no inhibition. This results showed that anti-inflammatory

activity of p-methoxycinnamate acid nitro derivative was increased compared to

p-methoxycinnamate acid.

Keywords :Ethyl p-methoxycinnamate, hydrolysis, p-methoxycinnamate acid,

nitration, anti-inflammation, Bovine Serum Albumin

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah , puji dan syukur kehadirat allah SWT yang telah

melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah

kepada junjungan kita Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan

karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan

judul “Modifikasi Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat Melalui Proses

Nitrasi Serta Uji Aktivitas Sebagai Antiinflamasi”. Skripsi ini disusun untuk

memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana

Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Kesehatan Program Studi Farmasi UIN

Syarif Hidayatullah, Jakarta.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Kedua orang tua ayah Yayan Taryana dan ibu Lia Nurhaliah tercinta yang

telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril

maupun materi, tiada yang bisa aku balas atas semua pemberiannya, hanya

ucapan terimakasih ini yang bisa aku sampaikan. Kepada keduan kaka

tercinta A Edi & A Dede, kepada adik-adik tersayang Fanji, Piki, dan adik

kesayanganku Gangan & Gingin yang selalu menyemangatiku dalam

menuntun ilmu.

2. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing I dan bapak

Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan ilmu,

nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan penulisan

skripsi.

3. Bapak Dr.H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu

Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

5. Ibu Dr. Hj. Delina Hasan, M. Kes., Apt selaku pembimbing akademik

yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

6. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu

pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi

Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

7. Teman-teman seperjuangan “KENCUR” : Reza, Indri, Nova, Aziz, Sutar,

Indah, Mida, BTR, & Adyt yang telah saling membantu menyelesaikan

permasalah baik saat penelitian maupun saat penulisan skripsi dan tidak

lupa kepada ka Ipho dan Ka Fikri yang telah membimbing penelitian ini.

8. Nicky yang banyak membantu dalam penelitian dan belajar.

9. Teman-teman yang suka membantu dalam belajar : Fio (gembul), Rhesa

(Uni), Rianisa (achi), Reza (Abang), puspita dll yang selalu membantu

belajar dari awal kuliah sampai perkuliahan berakhir dan kepada ayu DG,

wina, henny, Icho yang telah membantu dalam berbagai hal sehingga saya

bisa menyelesaikan kuliah di farmasi UIN Jakarta.

10. Teman-teman satu kontrakan dan teman bermain : Wahidin mamet, Rijal,

Mozer, Andis, Akas, Haidar dll.

11. Teman-teman Farmasi 2011 dan spesial untuk kelas C yang telah

memberikan memori yang indah selama perkuliahan di pinggiran ibukota

Jakarta ini. Tanpa kalian perjalanan mencari ilmu ini tidak akan berwarna.

12. Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka

Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mb Rani, dan pak Rahmadi yang banyak

membantu selama penelitian berlangsung.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna.

Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis

harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini.

Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil

penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi

mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu

pengetahuan.

Ciputat, Juni 2015

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri ( UIN ) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertandatangan dibawah ini :


Nim : 1111102000115

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/ karya

ilmiah saya, dengan judul :

MODIFIKASI STRUKTUR SENYAWA ASAM P-METOKSISINAMAT MELALUI PROSES

NITRASI SERTA UJI AKTIVITAS SEBAGAI ANTIINFLAMASI

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri ( UIN ) Syarif Hidayatullah

Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak

Cipta.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : april 2015

Yang menyatakan

Muhamad Syahid Ali

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ........................................................................................... ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS .............................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................. v

ABSTRAK ........................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR .......................................................................................viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI........................ x

DAFTAR ISI ........................................................................................................ xi

DAFTAR GAMBAR .........................................................................................xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................................xiv

DAFTAR LAMPIRAN .....................................................................................xv

DAFTAR SINGKATAN ................................................................................... xvi

BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.............................................................................. 2

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................... 3

1.4 Hipotesa ............................................................................................. 3

1.5 Manfaat Penelitian ............................................................................. 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 4

2.1 Etil p-metoksisinamat ........................................................................ 4

2.2 Asam Nitrat........................................................................................ 5

2.3 Hidrolisis ........................................................................................... 5

2.4 Nitrasi ................................................................................................ 7

2.5 Kromatografi ..................................................................................... 9

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis ............................................... 10

2.5.2 Kromatografi Kolom ...................................................... 11

2.5.3 kromatografi gas............................................................. 12

2.6 Spektroskopi ..................................................................................... 13

2.6.1 Spektroskopi UV-Visible ................................................ 13

2.6.2 Spektroskopi Infra Merah .............................................. 13

2.6.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik ........................... 14

2.7 Uji inVitro Antiinflamasi dengan Bovine Serum Albumin ................ 15

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 16

3.1 Lokasi dan Waktu .............................................................................. 16

3.2 Alat dan Bahan .................................................................................. 16

Alat ..................................................................................................... 16

Bahan .................................................................................................. 16

3.3 Prosedur Penelitiaan ........................................................................... 16

3.3.1 Hidrolisis Etil p-metoksisinamat .......................................... 16

3.3.2 Nitrasi Asam p-metoksisinamat ........................................... 17

3.3.3 Identifikasi ........................................................................... 17

3.3.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi ........................ 18

3.3.5 Uji Invitro Antiinflamasi ...................................................... 19

(a) Pembuatan Larutan Uji ........................................................... 19

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

(b) Pembuatan Larutan Kontrol Positif ......................................... 19

(c) Pembuatan Larutan Kontrol Negatif ....................................... 19

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 20

4.1 Modifikasi Senyawa Etil p-metoksi Sinamat dengan reaksi

Hidrolisis ............................................................................................ 20

4.2 Modifikasi Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Dengan Reaksi

Nitrasi .................................................................................................. 21

4.3 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi .............................................. 23

4.3.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat.................24

4.3.2 Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat..................25

4.4 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur

Aktivitas Senyawa Hasil Modofikasi................................................32

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................... 36

5.1 Kesimpulan......................................................................................... 36

5.2 Saran .................................................................................................. 36

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 37

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

1. Gambar jalur sikimat dalam biosintesa fenilpropaoid

untuk menganalisa etil p-metoksisinamat .................................... 4

2. Gambar mekanisme reaksi hidrolisis pada ester .......................... 6

3. Gambar mekanisme reaksi hidrolisis ester dengan katalis basa 7

4. Gambar prinsip subtitusi elektrofilik pada aromatis .................. 8

5. Gambar Mekanisme nitrasi aromatik ........................................... 9

6. Gambar KLT senyawa hasil Hidrolisis ......................................... 20

7. Gambar Reaksi Hidrolisis............................................................... 21

8. Gambar KLT Optimasi Reaksi Nitrasi ......................................... 22

9. Gambar Reaksi Nitrasi Hasil Hidrolisis ........................................ 22

10. Gambar Hasil KLT senyawa dengan eluen heksan:etil (3:2) ..... 23

11. Gambar Serbuk APMS ................................................................... 24

12. Gambar Fragmentasi Senyawa Hasil Hidrolisis EPMS .............. 25

13. Gambar Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat .................. 25

14. Gambar Senyawa Hasil Nitrasi Nitrasi 4-Metoksi-2-Nitro-beta-

Nitrostirena ........................................................................................ 25

15. Gambar Spektrum IR ..................................................................... 26

16. Gambar Spektrum GCMS Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-

Nitrostirena ........................................................................................ 27

17. Gambar Fragmentasi Massa Senyawa Hasil Nitrasi APMS ....... 28

18. Gambar Asam p-metoksisinamat & senyawa hasil modifikasi

nitras ................................................................................................. 28

19. Gambar H-NMR Senyawa Hasil Nitras ........................................ 28

20. Gambar C-NMR Senyawa Hasil Nitrasi ....................................... 30

21. Gambar HSQC Senyawa Hasil Nitrasi .......................................... 31

22. Gambar Diagram Aktivitas Antiinflamasi .................................... 34

23. Gambar Senyawa Modifikasi ......................................................... 35

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

1. Tabel enafsiran IR ........................................................................... 26

2. Tabel Data Pergeseran Kimia (ὁ ) Spektrum 1H NMR Senyawa 4-

Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena ( CDCl3, 500 MHz) ............... 2

3. Tabel C-NMR senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena .... 32

4. Hasil Uji Antiinflamasi Senyawa Kontrol dan Senyawa Hasil

Modifikasi .................................................................................................. 33

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1: Kerangka Penelitian ..................................................................... 40

Lampiran 2: Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi .......................... 41

Lampiran 3: Identifikasi Senyawa Etil p-metoksisinamat .............................. 42

Lampiran 4: Spektrum IR Etil p-metoksisinamat ........................................... 43

Lampiran 5: Spektrum GC-MS Etil p-metoksisinamat .................................. 44

Lampiran 6: Spektrum 1H-NMR Etil p-metoksisinamat ............................... 46

Lampiran 7: Spektrum GC-MS Senyawa Asam p-metoksisinamat .............. 49

Lampiran 8: Spektrum IR Senyawa Reaksi Nitrasi ........................................ 50

Lampiran 9: Spektrum GC-MS senyawa Reaksi Nitrasi ................................ 51

Lampiran 10: Spektrum NMR Senyawa Hasil Reaksi Nitrasi ....................... 52

Lampiran 11: Perhitungan Reaksi .................................................................... 63

Lampiran 12: Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi ........................................ 65

Lampiran 13: Kurva Uji Antiiflamasi .............................................................. 66

Lampiran 14 : Gambar Senyawa ...................................................................... 67

Lampiran 15: Gambar Analisis Senyawa ......................................................... 68

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

AINS Anti Inflamasi Non Steroid

COX Siklooksigenase

g gram

IR Infra Red

KLT Kromatografi Lapis Tipis

NMR Nuclear Magnetic Resonance

UV Ultra Violet

EPMS Etil p-Metoksisinamat

APMS Asam p-Metoksisinamat

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia dikenal sebagai negara dengan sumber daya hayati kedua terbesar

didunia yang tersebar dari Sabang hingga Merauke. Di Indonesia terdapat lebih

kurang 30.000 jenis tumbuh-tumbuhan, lebih kurang 7.500 jenis diantaranya

termasuk tanaman berkhasiat obat lebih dari 1.800 jenis tanaman telah

diidentifikasi dari beberapa formasi hutan, namun hingga saat ini pemanfaatannya

belum optimal. Jumlah tanaman obat yang dimanfaatkan oleh masyarakat baru

sekitar 1.000 hingga 1.200 jenis, dan yang digunakan secara rutin dalam industri

obat tradisional baru sekitar 300 jenis (BPOM, 2014).

Salah satu tanaman tradisional yang dimanfaatkan untuk obat-obatan adalah

Kencur (Kaempferia galanga L.). Kencur diketahui mengandung minyak atsiri

dan merupakan salah satu tanaman Suku Zingiberaceae. Secara empirik rimpang

kencur sering digunakan sebagai obat tradisional, salah satunya sebagai anti

inflamasi (Hasanah et al, JMS 2011). Kandungan metabolit sekunder dalam

ekstrak kencur diantaranya ialah asam propionat (4,7%), pentadekan (2,08%),

asam tridekanoat (1,81%), 1,21-decosadiene (1,47%), beta sitosterol (9,88%), dan

komponen terbesarnya adalah etil p-metoksisinamat (80,05%) (Umar et al, 2012).

Dalam studi in vitro, etil p-metoksisinamat secara non-selektif menghambat

aktivitas COX-1 dan COX-2, dengan masing-masing nilai IC50 1,12 μM dan 0,83

μM. Hasil ini memvalidasi aktivitas antiinflamasi kencur yang dihasilkan oleh

penghambatan COX-1 dan COX-2 (Umar et al, 2012). Dari berbagai penelitian,

epidemiologi, dan studi klinis menunjukkan bahwa AINS mempunyai prospek

yang menjanjikan sebagai agen antikanker (Kashfi, 2002). Etil p-metoksisinamat

terdapat pada kencur (Kaempferia galangal Linn) dalam jumlah yang besar. Etil

p-metoksisinamat dapat diisolasi dan dimurnikan dengan mudah (Barus, 2009)

Modifikasi etil p-metoksisinamat yang telah dilakukan adalah amidasi

dengan dietanolamin (Bangun, 2011), amidasi dengan etanolamin (Barus, 2009),

adisi brom dengan pelarut karbontetraklorida dan reduksi dengan logam natrium

dan etanol kering (Surbakti, 2008), modifikasi dengan pereaksi pemecah eter

2


(Nurhayati, 2010) tanpa dilakukan uji aktivitas senyawa, modifikasi dengan

proses hidrolisis (Mufidah, 2014). Senyawa asam p-metoksisinamat (APMS)

merupakan senyawa turunan dari etil p-metoksisinamat yang direaksikan melalui

proses hidrolisis. Menurut hasil penelitian sebelumnya asam p-metoksisinamat

yang dihasilkan dari proses hidrolisis etil p-metoksisinamat tidak memiliki

aktivitas antiinflamasi (Mufidah, 2014).

Salah satu kelemahan dari senyawa antiinflamasi non steroid adalah kurang

selektif karena menghambat COX-1 dan COX-2 dengan efek samping yang sering

terjadi adalah induksi tukak peptik (Nazeruddin G. M. et al, 2010) yang sering

disertai dengan anemia sekunder akibat perdarahan saluran cerna (Farmakologi,

2007). Dalam rangka mengeksplorasi hubungan struktur aktivitas senyawa asam

p-metoksisinamat, maka akan dilakukan penelitian tentang pengaruh penambahan

atau pengurangan gugus tertentu pada struktur aromatis yakni dengan melakukan

substitusi gugus NO2, dengan adanya substitusi NO2 pada APMS diharapkan

dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi dan alasan di balik pengembangan

kelas obat ini adalah bahwa gugus NO2 dapat mempertahankan aliran darah

mukosa lambung dan mencegah leukosit pada endotel vaskular sirkulasi

splanknikus (salah satu peristiwa paling awal setelah pemberian AINS) sehingga

dapat melawan efek merugikan dari COX-1 dan cedera mukosa tidak terjadi

(Halen et al, 2009). Uji antiinflamasi dilakukan secara in vitro menggunakan

Bovine Serum Albumin (BSA) dengan melihat efek denaturasi pada BSA.

Pengujian ini dipilih karena mempunyai banyak keuntungan yaitu mudah dalam

pengerjaan, membutuhkan sampel yang sedikit, cepat, dan merupakan uji

pendahuluan dalam pengujian antiinflamasi

1.2 Rumusan Masalah

a. Apakah gugus fungsi pada senyawa asam p-metoksisinamat yang

dihidrolisis dari etil p-metoksisinamat dapat ditransformasi melalui reaksi

nitrasi?

b. Bagaimana hubungan struktur senyawa hasil nitrasi gugus fungsi asam p-

metoksisinamat terhadap aktivitas antiinflamasi?

3


1.3 Tujuan Penelitian

a. Melakukan modifikasi struktur senyawa asam p-metoksisinamat yang

dihidrolisis dari etil p-metoksisinamat

b. menilai analisa hubungan struktur aktivitas antiinflamasi senyawa yang

dihasilkan proses nitrasi asam p-metoksisinamat.

1.4 Hipotesa

a. Mendapatkan senyawa turunan asam p-metoksisinamat yang mengandung

gugus nitro yang diharapkan dapat memberikan informasi baru mengenai

hubungan struktur aktivitas senyawa etil p-metoksisinamat sebagai agen

antiinflamasi.

b. Memberikan informasi untuk proses modifikasi struktur dan uji aktivitas

dari senyawa asam p-metoksisinamat lebih lanjut, khususnya yang melalui

proses nitrasi.

1.5 Manfaat Penelitian

a. Proses nitrasi dapat menghasilkan senyawa turunan yang mengandung NO2.

b. Penambahan gugus NO2 pada senyawa asam p-metoksisinamat akan

mempengaruhi aktivitas antiinflamasi.

4


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Etil p-metoksisinamat

Etil p-metoksisinamat adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang

kencur yang merupakan bahan dasar tabir surya yaitu pelindung kulit dari

sengatan sinar matahari. EPMS merupakan senyawa aktif yang ditambahkan pada

lotion atau pun pada bedak setelah mengalami sedikit modifikasi yaitu

perpanjangan rantai dimana etil dari ester ini diganti oleh oktil, etil heksil ataupun

melalui heptil melalui transesterifikasi maupun esterifikasi bertahap (Barus,

2009).

Etil p-metoksisinamat termasuk kedalam senyawa ester yang mengandung

cincin benzene dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil

yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstrasinya dapat

menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil

asetat, methanol, air dan heksane (barus, 2009). Etil p-metoksisinamat merupakan

senyawa turunan asam sinamat sehingga biosintesinya termasuk pada jalur

sikhimat.

Gambar 2.1 Jalur asam sikhimat dalam biosintesa fenilpropanoid untuk

menghasilkan etil p-metoksisinamat (Bangun, 2011).

5


2.2 Asam Nitrat

Sifat Fisika

Rumus Kimia : HNO3

Berat molekul (g/mol) : 63,012

Bentuk (30ºC, 1 atm) : cair

Titik didih 1 atm, ºC : 83,4

Titik leleh, ºC : -41,59

Densitas (20ºC), g/ml : 1,502

Kelarutan (dalam 100 bagian)

- air dingin : ∞ (tak terhingga)

- air panas : ∞ (tak terhingga)

Meledak dalam pelarut etanol

Viskositas (25ºC), Cp : 0,761

Panas peleburan (Hfus),Kj/mol : 10,48

Panas pembentukan (Hf), (25ºC), Kj/mol: -174,10

Panas penguapan (25ºC), Kj/mol : 39,04

Energi bebas pembentukan (25ºC), Kj/mol: -80,71

Sifat Kimia

Asam nitrat merupakan suatu asam monobasa yang kuat, mudah bereaksi

dengan alkali, oksida dan senyawa basa dalam bentuk garam. Asam nitrat

merupakan senyawa yang berperan dalam proses nitrasi sebagai nitrating

agent. (Yulianto, 2010)

2.3 Hidrolisis

Hidrolisis adalah pemecahan ikatan kimia akibat reaksi air, hal ini

berlawanan dengan hidrasi yang merupakan penambahan elemen-elemen air pada

ikatan ganda, tetapi tidak terkait dengan fregmentasi molekul. Sejumlah besar

gugus fungsi yang ditemukan dalam obat-obatan mudah mengalami hidrolisis saat

penyimpanan, tetapi yang paling umum ditemukan yaitu pada ester dan amida.

(Donald, 2009)

6


Hidrolisis ester dan amida terjadi sebagai hasil serangan nukleofilik pada

karbon gugus karbonil dan pemecahan lebih lanjut ikatan tunggal karbon-oksigen

atau karbon-nitrogen. Karbon pada gugus karbonil lebih positif daripada yang

diperkirakan akibat tingginya elektronegativitas oksigen yang didekatnya.

Pembagian electron-elektron ikatan yang tidak seimbang menyebabkan terjadinya

polarisasi ikatan sehingga karbon bermuatan positif parsial, sedangkan oksigen

bermuatan negatif parsial (Donald , 2009).

Reaksi hidrolisis dapat terjadi dengan katalis basa atau asam. Mekanisme

reaksi hidrolisis sendiri dikelompokkan berdasarkan tipe reaksi dasar seperti

subtitusi nukleofilik, gugus fungsi yang ditransformasikan dengan reaksi

substitusi nukleofilik, substitusi asil nukelofilik, gugus fungsi yang

ditransformasikan dengan reaksi substitusi asil nukleofilik. Hidrolisis untuk

turunan asam karboksilat masuk ke dalam kategori terakhir yakni gugus fungsi

yang ditransformasikan dengan reaksi subtitusi asil nukleofilik. Mekanisme

hidrolisis pada gambar diinisiasi oleh protonasi pada karbonil oksigen. Protonasi

menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan elektron dari

karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan menerima penambahan

nukleofilik dari air (Larson and Weber, 1994).

Gambar 2.2 Mekanisme Reaksi Hidrolisis pada Ester (Larson and Weber, 1994).

7


Hidrolisis ester dengan katalis basa melalui mekanisme penambahan

nukleofilik OH (gambar 2.5) secara langsung kepada gugus karbonil. Hidrolisis

ester berkatalis basa terjadi karena ion OH merupakan nukleofil yang lebih kuat

dibandingkan air (Larson dan Weber, 1994).

Gambar 2.3 Mekanisme Reaksi Hidrolisis Ester dengan Katalis Basa

(Larson and Weber, 1994).

2.4 Nitrasi

Nitrasi adalah salah satu reaksi organik yang banyak dipelajari baik secara

aromatis maupun alifatik. Nitrasi dapat dilakukan dengan berbagai metode seperti

heterolitik (elektrofilik dan nukleofilik) dan nitrasi radikal. Nitrasi aromatik

biasanya merupakan elektrofilik dan untuk nitrasi alifatik adalah radikal bebas.

Senyawa nitroaromatik biasa digunakan sebagai senyawa intermediet dalam

sintesis plastik, insektisida, bahan peledak, dan juga farmasetik. Sedangkan untuk

nitroalifatik biasa digunakan sebagai pelarut dan hasil sintesis dalam sintesis

organik (Olah, 1982).

Nitrobenzen juga secara luas digunakan untuk pembuatan aniline dan

senyawa pyroxylin, pemurnian minyak pelumas, dan dalam produsi sabunserta

poles sepatu. Karena toksisitasnya, nitrobenzene telah terdaftar sebagai prioritas

polutan oleh EPA dan terdaftar dalam senyawa yang diatur dalam Resource

Conservation and Recovery Act. Hanya sedikit informasi terkait dengan nasib

8


nitrobenzene dilingkungan dan hamper tidak diketahui mekanisme

biodegradasinya (Billy et al, 1991).

Gambar 2.4 Prinsip Subtitusi Elektrofilik pada Aromatis

Reaksi nitrasi berlangsung dengan penggantian satu atau lebih gugus nitro (-

NO2) menjadi molekul yang reaktif. Gugus nitro akan menyerang karbon

membentuk nitro aromatik atau nitro parafin. Jika menyerang nitrogen

membentuk nitramin dan bila menyerang oksigen membentuk nitrat ester. Pada

proses nitrasi masuknya gugus (-NO2) ke dalam senyawa dapat terjadi dengan

menggantikan kedudukan beberapa atom atau gugus yang ada dalam senyawa.

Umumnya nitrasi yang banyak dijumpai adalah nitrasi –NO2 menggantikan atom

H (Yulianto, 2010).

Nitrating agent adalah reaktan elektrofilik, dimana reaksi akan terjadi pada

atom karbon dari cincin aromatik yang mempunyai kepadatan elektron terbesar.

Gugus NO2 yang masuk dapat membentuk posisi ortho, para, dan meta. Jumlah

isomer pada produk tergantung pada subtituen ini. Subtituen meta menyebabkan

kepadatan elektron menjadi lebih besar dibandingkan subtituen ortho dan para,

sehingga yield produk nitrasi akan didominasi isomer meta (Yulianto, 2010).

Mekanisme nitrasi aromatik yang mengikuti prinsip subtitusi elektrofilik

dengan berbagai step sehingga menghasilkan suatu senyawa nitro aromatik

dijelaskan dalam gambar.

9


Gambar 2.5 Mekanisme Nitrasi Aromatik

2.5 Kromatografi

Penjelasan tentang kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael

Tswett, yang mengumumkan pemberian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya

dalam suatu seri tanaman. Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang

berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fase.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur

yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini

membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan fasa lainnya

merupakan cairan yang merembes lewat. Fasa stasioner mungkin suatu zat padat

atau suatu cairan dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas

(Underwood, 1981).

Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan mempertimbangkan

beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah:

- Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)

- Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus

(adsorbs, penjerapan)

10


- Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap

(keatsirian)

Pada sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan

dalam keadaan demikian rupa sehingga komponen-komponennya harus

menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut. Hal ini melibatkan dua sifat berlainan,

misalnya penjerapan dan kelarutan, misalnya kelarutan di dalam dua cairan yang

tidak bercampur.

Walaupun kromatografi melibatkan proses saling mempengaruhi antara

beberapa sifat. Misalnya memasukkan senyawa ke dalam corong pisah yang berisi

dua pelarut yang masing-masing mempunyai kelarutan yang terbatas dalam

pelarut pasangannya (misalnya eter dan air), Senyawa itu cenderung terdistribusi

atau terpartisi di antara kedua cairan itu atau fase bergantung kepada sifat

kelarutannya. Partisi yang demikian merupakan persaingan antara kelarutan di

dalam cairan. Jikadimasukkan linarut ke dalam labu yang berisi cairan dan serbuk

bahan padat (misalnya arang), linarut akan terdistribusi di antara permukaan

bahan padat (dalam hal kedua ini, linarut menunjukkan sifat kejerapannya). Pada

akhirnya dimasukkan linarut ke dalam labu yang sedikit mengandung cairan yang

tidak atsiri, linarut akan menunjukkan sifat kelarutan dan keatsirian. Dalam sistem

kromatografi, mungkin saja dapat memperbesar perbedaan itu, walaupun

perbedaan itu sangat kecil, dan menjadikannya sebagai dasar pemisahan (Gritter,

1991).

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis menandai puncak perkembangan kromatografi

adsorpsi yang dicetuskan kali pertama oleh Izamailov dan Shraiber pada tahun

1938. Sebagai fase diam adalah bahan padat yang diletakkan pada plat gelas

secara seragam, dengan ketebalan lebih kurang 0,250 mm. Disamping plat gelas

juga sudah umum digunakan plat dari logam atau plastik.

Teknik kromatografi lapis tipis sangat penting artinya dalam bidang analisis

dan kedudukan kromatografi lapis tipis setelah menggeser kedudukan

kromatografi kertas. Hanya saja elusi pada KLT pada umumnya dilakukan dengan

cara menaik (ascending) satu atau dua dimensi. Sebagai fase diam dipakai cairan

11


atau campuran yang dikenal sebagai pelarut pengembang atau pelarut

pengembang campur. KLT merupakan metode pemisahan komponen-komponen

atas dasar perbedaan adsorpsi partisi oleh fase diam dibawah gerakan pelarut

pengembang atau pelarut pengembang campur. Pemilihan pelarut sangat

dipengaruhi oleh macam dan polaritas zat-zat kimia yang dipisahkan. (Mulja,

1995) KLT dapat dipakai dengan dua tujuan. Pertama, dipakai selayaknya sebagai

metode untuk mencapai hasil kualitatif, kuantitatif, atau preparatif. Kedua, dipakai

untuk menjajaki sistem pelarut dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam

kromatografi kolom atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritter, 1991). Nilai Rf

dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan sebagaimana dalam

persamaan :

Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solute mempunyai

perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yang berisi

solute bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum

Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik awal permukaan

fase diam.

2.5.2 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai

alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut

berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk

mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang

akan dipindahkan. Pemisahan tergantung kepada kesetimbangan yang terbentuk

pada bidang antar muka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta

kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya (Yazid, E., 2005).

Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode

kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 gram).

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita

pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam,

dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom

12


karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita

senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan

dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Gritter, 1991).

Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi flavonoida dapat ditingkatkan

hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran

flavonoida (berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti

selulosa, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap

komponen menggunakan pelarut yang cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca

yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung. Menempatkan larutan

cuplikan pada kolom sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap dielusi

lebih lanjut (Markham, 1988).

Pengisian kolom harus dikerjakan seragam, setelah adsorben dimasukkan

dapat diseragamkan kerapatannya dalam kolom dengan menggunakan vibrator.

Selain itu dapat juga dikerjakan dengan memasukkan adsorben dalam bentuk

larutan dan partikelnya dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak

seragam dapat menghasilkan rongga-rongga ditengah-tengah kolom. Pada bagian

bawah dan atas dari isian kolom diberi wool untuk menyangga isian. Bila kolom

telah diisi bahan isian permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah

permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya

gelembung-gelembung udara masuk kedalam kolom (Hosttetman, 1995).

2.5.3 kromatografi Gas

Kromatografi gas dan spektrometri massa dapat digunakan untuk

memisahkan komponen dengan memberikan waktu retensi dan puncak elusi yang

dapat dimasukkan ke dalam spektrofotometer massa untuk memperoleh berat

molekul, karakteristik dan informasi fragmentasi (Heinrich, 2004). Teknik ini juga

dapat digunakan untuk komponen yang polar (senyawa yang larut dalam air)

seperti calistegines dan polihidroksil alkaloid jika dibuat turunannya dengan

komponen yang sesuai (trimetilsilil klorida) untuk meningkatkan volatilitasnya

(Heinrich, 2004).

Kromatografi gas saat ini merupakan metode analisis yang penting dalam

kimia organik untuk menentukan senyawa tunggal dalam campuran. Spektrometer

13


massa sebagai metode deteksi yang memberikan data yang bermakna, yang

diperoleh dari penentuan langsung molekul zat atau fragmen (Heinrich, 2004).

2.6 Spektroskopi

2.6.1 Spektroskopi UV-Visible

Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur dalam larutan yang

sangat encer dengan pembanding blanko pelarut serta menggunakan

spektrofotometer yang merekam otomatis. Senyawa tanwarna diukur pada jangka

200-400 nm, senyawa berwarna pada jangka 200-700 nm. Prinsip kerja

spektrofotometer UV-Vis ialah interaksi sinar ultraviolet atau tampak dengan

molekul sampel. Energi cahaya akan mengeksitasi elektron terluar molekul ke

orbital lebih tinggi (Harborne, 1987).

Pada kondisi ini, elektron tidak stabil dan dapat melepas energi untuk

kembali ke tingkat dasar, dengan disertai emisi cahaya. Besarnya penyerapan

cahaya sebanding dengan molekul, sesuai dengan hukum lambert-Beer :

A= ɛ B C

Keterangan:

A= serapan

ɛ = absortivitas molar

B= tebal tempat komponen

C= konsentrasi konponen

Sumber radiasi pada spektrofotometer UV-Vis berdasarkan panjang

gelombang terbagi menjadi 2, yaitu lampu deuterium dan tungstent. Lampu

deuterium menghasilkan sinar 160-500 nm. Lampu tungstent digunakan di daerah

sinar tampak 350-3500 nm. Sumber radiasi dikatakan ideal jika memancarkan

sperktrum radiasi yang kontinyu, intensitasnya tinggi dan stabil pada semua

panjang gelombang (Day & Underwood, 1980).

2.6.2 Spektroskopi Infra Merah

Spektrofotometri inframerah merupakan suatu metode yang mengamati

interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah

panjang gelombang 0,75 –1.000 μm atau pada bilangan gelombang 13.000–10

14


cm-1

. Spektrofotometri inframerah merupakan alat untuk mendeteksi gugus

fungsional, mengidentifikasi senyawa dan menganalisis campuran. Banyak pita

absorpsi yang terdapat dalam daerah yang di sebut daerah “sidik jari” spektrum

(Harborne, 1987).

Spektrum inframerah suatu sampel dapat di ketahui letak pita serapan yang

dikaitkan dengan adanya suatu gugus fungsional tertentu (Underwood, 1999).

Spektroskopi inframerah digunakan sebagai analisis kualitatif untuk menentukan

gugus fungsi. Gugus fungsi dapat diintepretasi dengan memeriksa puncak

absorbsi dari spektrum inframerah.

Daerah pada spektrum inframerah diatas 1200 cm-1

menunjukkan pita

spektrum atau puncak yang disebabkan oleh getaran ikatan kimia atau gugus

fungsi dalam molekul yang telah ditelaah. Daerah dibawah 1200 cm-1

menunjukkan pita yang disebabkan oleh getaran seluruh molekul, dan karena

kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik jari. Intensitas berbagai pita direkam

secara subjektif pada skala sederhana: kuat, menengah atau lemah (Harborne,

1987).

2.6.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik

Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance) NMR

merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik

ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul.

Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen,

jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang

berdekatan dengan setiap atom hidrogen.(Cresswell and Campbell. 1982)

Pergeseran kimia adalah pengukuran medan dalam keadaan bebas. Semua

proton–proton dalam satu molekul yang ada dalam lingkungan kimia yang serupa

kadang–kadang menunjukkan pergeseran kimia yang sama. Setiap senyawa

memberikan penaikan menjadi puncak absorpsi tunggal dalam spektrum NMR.

(Silverstein. 1981).

Dalam spektroskopi NMR, suatu contoh senyawa ditaruh di antara kutub-

kutub sebuah magnet yang cukup kuat untuk mensearahkan sebagian dari inti-inti

yang mempunyai momen magnet. Contoh itu kemudian disinari dengan radiasi

15


elektromagnet, biasanya dalam jangkau frekuensi radio 107-108 Hz. Sebuah inti

yang berpusing yang disearahkan dengan medan magnet itu dapat dibalikkan

arahnya dengan cara menyerap sebuah proton yang energinya tepat sesuai. Inti

yang berlainan atau inti yang serupa tetapi terikat pada lingkungan yang berlainan,

menyerap foton pada panjang gelombang yang berlainan. Pola frekuensi radio

yang diserap merupakan spektrum NMR dari senyawa itu. (Cresswell and

Campbell.1982).

Di dalam medan magnet, perputaran elektron–elektron valensi dari proton

menghasilkan medan magnet yang melawan medan magnet yang digunakan.

Hingga setiap proton dalam molekul dilindungi dari medan magnet yang

digunakan mengenai dan bahwa besarnya perlindungan ini tergantung pada

kerapatan elektron yang mengelilinginya.Makin besar kerapatan elektron yang

mengelilingi inti, maka makin besar pula medan yang dihasilkan yang melawan

medan magnet yang digunakan. Akibat secara keseluruhan/ proton merasakan

adanya pengurangan medan yang mengenainya. Karena inti merasakan medan

magnet yang dirasakan lebih kecil, maka ia akan mengalami presesi pada

frekuensi yang lebih rendah. Setiap proton dalam molekul mempunyai lingkungan

kimia yang sedikit berbeda yang akan mengakibatkan dalam frekuensi yang

sedikit berbeda. ( Sastrohamidjojo. 1991 ).

2.7 Uji inVitro Antiinflamasi dengan Bovine Serum Albumin

Uji invitro antiinflamasi menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA).

Ketika BSA dipanaskan, akan mengalami denaturasi dan mengekspresikan

antigen yang berhubungan dengan tipe III reaksi hipersensitivitas dan yang

berhubungan dengan penyakit seperti penyakit serum, glomerulonefritis,

rheumatoid arthritis dan lupus eritematosus sistemik. Dengan demikian uji yang

diterapkan untuk penemuan obat yang dapat menstabilkan protein dari proses

denaturasi. Beberapa obat antiinflamasi nonsteroid seperti indometasin, ibufenak,

diklofenak natrium, asam salisilat, dan asam flufenamat mencegah denaturasi

protein BSA pada pH patologis (6,2-6,5) (Ramalingam, 2010).

16


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Lokasi dan Waktu

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia,

Laboratorium Penelitian I, Laboratorium Penelitian II, Laboratorium Kimia Obat

Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Penelitian

dimulai pada bulan Februari sampai April 2015.

3.2 Alat dan Bahan

Alat

Spektrofotometer H-NMR(500 MHz, JEOL), Spektrofotometer UV-vis

(HITACHI), GCMS (Agilent Technologies), Spektrofotometer Inframerah

Transformasi Fourier, seperangkat alat Kromatografi Lapis Tipis, Seperangkat

alat Kromatografi Kolom, timbangan analitik, microwave, Penangas air, rotary

evaporator (Eyela), gelas kimia, pipet tetes, pipet ukur, kertas saring, magnetic

stirrer (Wiggen Hauser).

Bahan

Senyawa etil p-metoksisinamat, HCl 15%, NaOH, HNO3 69%, metanol,

aseton, n-Heksan, etil asetat, akuades, es batu, Basa Tris, Bovine Serum Albumin.

3.3 Prosedur Penelitiaan

3.3.1 Hidrolisis Etil p-metoksisinamat

Sebanyak 1.500 mg NaOH dilarutkan dalam etanol pro analisia dalam gelas

kimia dan dengan kondisi pemanasan pada suhu 60º C dan pengadukan dengan

menggunakan magnetic stirer hingga NaOH larut. Kemudian setelah larut

tambahkan senyawa Etil p-metoksisinamat sebanyak 5.000 mg kedalamnya, suhu

dijaga tetap 60º C dan dibiarkan selama 3 jam. Hasil reaksi ditambahkan dengan

akuades ±1.000 ml dan akan didapatkan larutan dengan pH 13, tambahkan HCl

15% sehingga akan terbentuk endapan APMS, penambahan HCL 15% dilakukan

hingga pH larutan mencapai 4 yaitu ditandai dengan tidak terbentuk lagi endapan

apms. Endapan yang didapat disaring dengan menggunakkan kertas saring dan

17


keringkan dengan suhu ruang, setelah kering dihitung rendemen senyawa apms

yang didapat dengan menggunakan rumus berikut.

% rendemen

3.3.2 Nitrasi Asam p-metoksisinamat

Sebanyak 3 gram hasil hidrolisis Etil p-metoksisinamat yaitu apms

dimasukkan ke dalam erlemeyer dengan dikondisikan dingin pada suhu -15ºC.

Lalu dimasukkan 12 ml HNO3, aduk hingga asam p-metoksisinamat larut.

Dimasukkan dalam microwave dengan suhu 450ºC selama 2 menit. Hasil yang

didapat dicampur dengan akuades sebenyak 30 ml lalu saring dengan kertas

saring, setelah itu keringkan dengan suhu ruang (Ajay et al., 2006). Setelah kering

hitung rendemen hasil reaksi dengan menggunakan rumus berikut

% rendemen

3.3.3 Identifikasi

a. Identifikasi Organoleptis

Senyawa yang didapat baik senyawa murni etil p-metoksisinamat maupun

senyawa hasil modifikasi diidentifikasi warna, bentuk dan juga bau.

b. Identifikasi Senyawa Dengan KLT

Dilarutkan sedikit hasil reaksi nitrasi, APMS standar, EPMS standar dalam

vial terpisah kira-kira 2 mg dalam etil asetat 1 ml, eluen yang digunakan

adalah etil asetat:heksan dengan perbandingan 1:4, ditotolkan senyawa yang

akan diuji pada KLT lalu lihat hasilnya menggunakan UV dengan panjang

gelombang 254 nm.

c. Identifikasi Senyawa Menggunakan FTIR

Sedikit sampel padat (±1-2mg), kemudian ditambahkan bubuk KBr murni

(±200mg) dan diaduk hingga rata. Kemudian sampel (pellet KBr yang

terbentuk) diambil dan kemudian ditempatkan dalam tempat sampel pada

alat spektroskopi inframerah untuk dianalisis (Hidayati, 2012).

18


d. Identifikasi Senyawa Menggunakan GCMS

Kolom yang digunakan adalah HP-5MS (30 m × 0,25 mm ID × 0,25 µm);

suhu awal 70oC selama 2 menit, dinaikkan ke suhu 285

oC dengan

kecepatan 20oC/menit selama 20 menit. Suhu MSD 285

oC. Kecepatan

aliran 1,2 mL/menit dengan split 1:100. Parameter scanning dilakukan dari

massa paling rendah yakni 35 sampai paling tinggi 550 (Umar et al, 2012).

e. Identifikasi Senyawa Menggunakan 1H-NMR dan

13C-NMR

Sedikit sampel padat (±10mg), kemudian dilarutkan dalam pelarut

kloroform bebas proton (khusus NMR), setelah dilarutkan kemudian

dimasukkan ke dalam tabung khusus NMR untuk kemudian dianalisis.

3.3.4 Pembuatan Reagen untuk Uji Antiinflamasi

a. Larutan TBS (TrisBuffer Saline)pH 6.3

Sebanyak 1,21 g Trisbase dan 8,7 g NaCl dilarutkan dalam 1000 mL

aquades. Didapatkan larutan dengan pH 9,7. Kemudian adjust pH sampai

6,3 menggunakan asam asetat glasial (Mohan, 2003)

b. Penyiapan variat konsentrasi NaDiklofenak

Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm Na diklofenak dengan

pelarut metanol, yaitu 50 mg NaDiklofenak dilarutkan dalam 5mL

methanol. Kemudian dilakukan pengenceran menjadi 1000, 100, 10 dan 1

ppm.

c. Penyiapan variat konsentrasi APMS dan senyawa hasil modifikasi

(sampel).

Pembuatan larutan induk sebesar 10000 ppm baik senyawa hasil modifikasi

maupun APMS dengan pelarut metanol.yaitu 50 mg sampel APMS dan

senyawa hasil modifikasi nitrasi dilarutkan dalam 5 mL methanol.

Kemudian dilakukan pengenceran menjadi 1000, 100, 10 dan 1 ppm.

19


d. Pembuatan Larutan BSA 0,2 %(w/v)

Sebanyak 0.2g BSA dilarutkan dalam TBS 100mL (William set al., 2008).

3.3.5 Uji Invitro Antiinflamasi

Pengujian Aktivitas Senyawa Hasil Modifikasi Terhadap Denaturasi BSA :

a. Pembuatan Larutan Uji

Larutan Uji (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan sampel yang kemudian

ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL sehingga didapatkan

variat konsentrasi menjadi larutan 100, 10, 1, dan 0,1ppm

b. Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Larutan kontrol positif (5 mL) terdiri dari 50 µL larutan natrium diklofenak

yang kemudian ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL

sehingga didapatkan variat konsentrasi menjadi 100, 10, 1, dan 0,1 ppm

c. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif

Larutan kontrol negatif (5 mL) terdiri dari 50 µL metanol yang kemudian

ditambah dengan larutan BSA hingga volume 5 mL. Kemudian diinkubasi

pada suhu ruang 27ºC s/d 28

ºC selama 30 menit. Lalu setiap larutan diatas

dipanaskan selama 5 menit pada suhu 73ºC. Lalu dibiarkan dingin selama

25 menit dan diukur turbiditasnya dengan spektrofotometer diukur pada

gelombang 660 nm.

Persentase inhibisi dari denaturasi atau presipitasi BSA dikalkulasikan

dengan rumus berikut:

20


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pada penelitian ini dilakukan modifikasi asam p-metoksisinamat hasil

hidrolisis dari etil p-metoksisinamat melalui reaksi nitrasi.

4.1 Modifikasi Senyawa Etil p-metoksi Sinamat dengan Reaksi Hidrolisis

Reaksi hidrolisis dilakukan dengan mereaksikan EPMS sebanyak 5 gram

(0,024 Mol) dalam etanol dan direaksikan dengan bantuan katalis basa NaOH 1.5

gram (0.0375 mol) dan dipanaskan pada suhu 60oC selama tiga jam sampai

terbentuknya serbuk berwarna putih. Setelah reaksi berlangsung, hasil reaksi

berupa filtrat lalu ditambahkan akuades yang berguna untuk pencucian filtrat.

Kemudian ditambahkan HCl 15% tetes demi tetes sehingga akan terbentuk

endapan putih berupa hasil hidrolisis yaitu Asam p-metoksisinamat (APMS) hal

ini terjadi karena filtrat sebelum ditambahkan HCl 15% memiliki pH 13 kemudian

ditambahkan HCl 15% sampai dengan pH 4, ini bertujuan untuk mengikat ion Na+

sehingga terbentuklah endapan putih berupa hasil hidrolisis ( Mufidah, 2014).

Gambar 4.1 KLT senyawa hasil Hidrolisis

Residu yang didapat dicuci lagi dengan akuades untuk menghilangkan

garam yang terbentuk kemudian residu dikeringkan. Residu yang didapat

berwarna putih.

Rendeman hasil reaksi hidrolisis yang didapatkan sebanyak 4.115 mg %,

berikut hasil perhitungan rendemen senyawa apms.

21


% rendemen hidrolisis

= 82,304%

Mekanisme reaksi hidrolisis diinisiasi oleh protonasi pada karbonil oksigen.

Protonasi menyebabkan keadaan terpolarisasi pada gugus karbonil melepaskan

electron dari karbon sehingga bersifat lebih elektrofilik dan akan menerima

penambahan nukleofilik OH (Larson dan Waber, 1994).

Mekanisme reaksi hidrolisis sebagai berikut:

Gambar 4.2 Reaksi Hidrolisis

4.2 Modifikasi Senyawa Asam p-metoksi Sinamat Dengan Reaksi Nitrasi

Reaksi nitrasi dilakukan dengan mereaksikan APMS dengan HNO3 dengan

menggunakan metode cold microwave. Keuntungan dari metode cold microwave

adalah waktu reaksinya yang cepat dan tidak diperlukannya H2SO4 sebagai katalis.

Suhu pada saat pencampuran sampel dengan reagen yang harus dijaga pada suhu -

15ºC (bose, et al. 2006). Pada nitrasi ini terjadi reaksi substitusi atom H pada

benzen oleh gugus nitro dari reagent HNO3 sebagai nitrating agent. Benzen akan

22


menyerang muatan positif atom nitrogen dari elektrofil, yang mana ikatan N=O

lepas pada waktu yang sama. Hal ini diikuti dengan lepasnya proton untuk

menstabilkan gugus aromatik (Zulfa, 2012).

Tujuan reaksi nitrasi adalah menambahkan gugus NO2 pada senyawa asam

p-metoksisinamat, sehingga dengan bertambahnya gugus NO2 akan diuji aktivitas

antiinflamasinya. Optimasi dilakukan dengan menggunakan 3 keadaan yaitu 300

watt, 450 watt dan 600 watt. Hasil KLT senyawa optimasi terlihat pada gambar

4.3.

Gambar 4.3 KLT Optimasi Reaksi Nitrasi

A. 300 Watt, B. 450 Watt, C. APMS

Dari hasil tersebut menunjukan bahwa untuk reaksi dengan menggunakan

450 watt karena spot yang terbentuk lebih tebal sehingga bisa diasumsikan bahwa

reaksi dengan 450 watt menghasilkan lebih banyak senyawa hasil reaksi nitro.

Untuk 600 watt hasil reaksi tidak didapatkan, hal ini karena untuk reaksi dengan

600 watt didapatkan hasil reaksi yang hangus, sehingga tidak bisa digunakan. Hal

ini bisa disebabkan karena reaksi berjalan terlalu panas, sehingga mendapatkan

hasil yang hangus.

Gambar 4.4 Reaksi Nitrasi Hasil Hidrolisis

23


Karena senyawa masih terdapat beberapa spot maka dilakukan pemisahan

dengan menggunakan kolom kromatografi, dimana setelah di lakukan kolom

kromatografi didapatkan senyawa murni dengan spot tunggal sebagai berikut

Gambar 4.5. Hasil KLT senyawa dengan eluen heksan:etil (3:2)

Hasil rendemen senyawa nitrasi dari 3000 mg campuran hasil reaksi didapat

senyawa murni sebanyak 412 mg dan rendemen dapat dihitung dengan persamaan

berikut

%rendemen

= 13,73%

4.3 Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi

Identifikasi senyawa hasil modifikasi dimulai dengan melihat perbandingan

nilai Rf seluruh senyawa yang di KLT menggunakan eluen heksan:etil asetat

dengan perbandingan 3:2 (lihat gambar 4.5)

Etil p-metoksisinamat : 0,875

Asam p-metoksisinamat : 0.35

Hasil Nitrasi : 0.6

Berdasarkan nilai Rf tersebut dapat diketahui tingkat kepolaran senyawa

hasil modifikasi. Etil p-metoksisinamat memiliki polaritas paling rendah dimana

nilai Rf etil p-metoksisinamat mencapai 0.875, sedangkan Asam p-

metoksisinamat memiliki polaritas yang paling tinggi terlihat dari nilai Rf yang

paling rendah yaitu 0,35. Senyawa hasil modifikasi memiliki nilai Rf diatas

24


senyawa Asam p-metoksisinamat yang artinya terjadi penurunan polaritas, hal ini

terjadi karena adanya pemasukan gugus NO2 pada cincin benzen senyawa Asam

p-metoksisinamat.

4.3.1 Senyawa Hasil Hidrolisis Etil p-metoksisinamat

Senyawa hasil hidrolisis etil p-metoksisinamat memiliki karakteristik

sebagai berikut:

1. Warna : Putih

2. Bau :Tidak berbau

3. Bentuk : Serbuk

Gambar 4.6. Serbuk APMS

Analisa senyawa hasil hidrolisis ini dilakukan dengan menggunakan GCMS

dan membandingkan nilai Rf dan dibandingkan dengan hasil GCMS dan nilai Rf

dari Mufidah (2014). Dari interpretasi GCMS pada senyawa hasil hidrolisis

menunjukan bahwa senyawa hasil hidrolisis muncul pada waktu retensi 9,649

yang memiliki berat molekul (BM) 178,0 serta fragmentasi massa pada 161; 133;

117; 89; dan 63 (lampiran 7 ). Berikut fragmentasi senyawa hasil hidrolisis etil p-

metoksisinamat:

25


Gambar 4.7. Fragmentasi Senyawa Hasil Hidrolisis EPMS

Dari data GCMS dan nilai Rf ternyata hasil yang diperoleh sama seperti

yang dilakukan Mufidah (2014), sehingga senyawa hasil hidrolisis Etil p-

metoksisinamat adalah Asam p-metoksisinamat.

Gambar 4.8. Struktur Senyawa Asam p-metoksisinamat

4.3.2 Senyawa Hasil Nitrasi Asam p-metoksisinamat

Senyawa hasil nitrasi asam p-metoksi sinamat memiliki karakteritik sebagai

berikut:

1. Warna : kuning

2. Bau : bau khas

3. Bentuk : serbuk

Gambar 4.9. Senyawa Hasil Nitrasi 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

26


Elusidasi struktur senyawa hasil modifikasi dilakukan dengan menggunakan

IR, GCMS, dan NMR

Tabel 4.1. Penafsiran IR

Gambar 4.10. Spektrum IR

Penafsiran spektrum IR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

ditunjukan pada table 4.1 yaitu ditemukan pita serapan pada bilangan gelombang

v3098,78 cm-1

adalah serapan spesifik vibrasi ulur ikatan antar atom C-H pada

500750100012501500175020002500300035004000

1/cm

60

67.5

75

82.5

90

97.5

105

%T

30

98

.78

29

23

.25

16

14

.49

15

26

.72

13

49

.26

12

10

.38

10

86

.93

10

10

.74

90

3.6

9

nitrasi apms

Ikatan Daerah Absorbansi (V,cm-1

)

Aromatik posisi para 903,69

NO 1526,72

C-O 1334,80-1316,47

C-Haril 3098, 78

C=C 1614

C-H alifatik 2974,36-2882,74

C-O Aril 1210, 38

27


gugus aromatik. Keberadaan aromatik juga ditunjukan dengan adanya C=C pada

bilangan gelombang v 1619, 49 cm-1

. Aromatik disubsitusi para juga ditunjukan

dengan munculnya serapan pada bilangan gelombang v903,69 cm-1.

C-H Alifatik

ditemukan pada bilangan gelombang 2974,36-2882,74 cm-. dan pada bilangan

gelombang 1210, 38 cm-1

terdapat C-O yang berikatan pada aromatik. Serapan

vibrasi C-O ditemukan pada pita v1349,26 cm-1

. Lalu terdapatnya gugus nitro

pada posisi aromatik dapat ditunjukan dengan adanya pita serapan pada bilangan

gelombang v 1526,72 cm-1

.

Elusidasi senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena selanjutnya yaitu

menggunakan analisa GCMS. Dari data kromatogram GCMS dari trasi 4-Metoksi-

2-Nitro-beta-Nitrostirena, muncul kromatogram pada waktu retensi 11,9 dengan

berat molekul (BM) 224 dengan fragmentasi massa pada 224; 177; 147; 102; dan

77. Berikut hasil fragmentasi pada senyawa ini.

Gambar 4.11. Spektrum GC-MS senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

28


Gambar 4.12. Fragmentasi Massa Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

Berdasarkan interpretasi GCMS yang dengan BM 224 menunjukan telah

masuknya gugus NO2 pada gugus benzene dan karboksilat, sehingga gugus

karboksilat hilang dan diganti dengan gugus NO2. Hal ini sesuai dengan aturan

nitrogen yang menyatakan bahwa jika jumlah atom nitrogen didalam suatu

senyawa ada 1 maka berat molekul senyawa adalah ganjil, sedangkan jika atom

nitrogen dalam suatu senyawa adalah dua maka berat molekul adalah genap (pavia

et al. 2001)

Gambar 4.13. 1. APMS, 2. 2 nitro-4-metoksi-beta-nitrostirena

Gambar 4.14. H-NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

29


Tabel 4.2. Data Pergeseran Kimia Spektrum 1H NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-

Nitrostirena ( CDCl3, 500 MHz)

Posisi

Asam 5nitro p-

metoksisinamat

1H NMR

APMS

1H NMR

2 7,95 (d, 1H,

J=13,65)

7,63 (d, 1H,

J=16,2)

3 7,55 (d, 1H,

J=13,65)

6,34 (d, 1H,

J=16,2)

5 6,95 (d, 1H,

J=9,1)

6

8,05 ( d, 1H, J=

1,95 )

7, 54 (d, 1H,

J=9,1)

8 7,74 (d, 1H,

J=2,6)

7,72 ( d, 1H,

J=9,1)

7, 54 (d, 1H,

J=9,1)

9 7,18 (d, 1H,

J=9,1)

7,47 (d, 1H,

J=9,1)

11 4,04 3,82 (s, 3H)

Interpretasi NMR pada penelitian ini dibandingkan dengan hasil interpretasi

NMR pada senyawa Asam p-metoksisinamat pada penelitian Mufidah (2014).

Spektrum H1NMR memberikan sinyal pergeseran kimia 4,04 ( 3H ) dan muncul

dengan bentuk singlet. Sinyal ini lebih kearah downfield karena berikatan dengan

oksigen (-OCH3, metoksi), sedangkan pada H-NMR senyawa APMS pergeseran

kimia terjadi pada 3, 82 (3H) dan memiliki bentuk dan sinyal yang sama seperti

senyawa Asam 5nitro p-metoksisinamat . Pergeseran kimia 7,95 (1H) berbentuk

doublet memiliki hubungan dengan pergeseran kimia 7,55 (1H) berbentuk doublet

dengan konstanta kopling 13,65 Hz. Pergeseran kimia tersebut sama dengan H-

NMR APMS pada pergeseran kimia 6,34 dan 7,63 berbentuk doublet dan dengan

konstanta kopling 16,2 Hz. Bentuk tersebut adalah olefin dengan proton

30


berkonfigurasi trans. Kemudian pada pergeseran kimia 8,05 ppm (1H), 7,72 (1H),

dan 7,18 (1H) adalah proton-proton yang tersubsitusi. Sinyal pada pergeseran

kimia 7,72 ppm menunjukan bahwa satu proton terkopling secara metha dengan

satu proton pada sinyal 8,05 ppm dengan nilai konstanta kopling 1,95 Hz Hz.

Selanjutnya terkopling secara ortho dengan proton pada sinyal 7,18 ppm dan nilai

konstanta kopling 9,1 Hz. Hal ini dibandingkan dengan H-NMR APMS pada

pergeseran kimia 6,95 ppm dan 7,54 ppm (4H) yang merupakan proton-proton

dari benzen dengan dua substitusi yaitu menunjukan bahwa dua proton yang

ekivalen terkopling secara ortho dengan dua proton yang ekivalen lainnya

(Mufidah, 2014). Perbedaan APMS dengan Asam 5nitro p-metoksisinamat yaitu

terletak pada H di posisi 5 yang mana Asam 5nitro p-metoksisinamat tidak

terdapat H pada posisi 5 karena sudah disubstitusi oleh NO2 pada posisi 1. .

Gambar 4.15 C-NMR Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

31


C

Gambar 4.16 HSQC senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

interpretasi NMR selanjutnya yaitu 13

C-NMR dan HSQC. Spektrum 13

C-NMR

memberikan pergeseran kimia pada 57,13 ppm yaitu C pada posisi 11, hal ini bisa

dilihat dari HSQC yang didapat, yaitu didapat korelasi antara H-NMR pada

pergeseran kimia 4,04 ppm yakni H pada posisi 11 dengan 13

C-NMR pergeseran

kimia 57,13 ppm , artinya C dengan pergeseran kimia 57,13 ppm berikatan

dengan H pada pergeseran kimia 4,04 ppm. Berikutnya 13

C-NMR memberikan

pergeseran kimia pada 114,57 ppm dan pada HSQC didapat korelasi dengan H-

NMR pada pergeseran kimia 7,18 ppm yakni H pada posisi 9, artinya C dengan

spektrum 114,57 ppm berikatan dengan H pada posisi 9. 13

C-NMR selanjutnya

memberikan pergeseran kimia pada 134,71 ppm dan didapat korelasi dengan H-

NMR pada pergeseran kimia 7,72 ppm yaitu pada H posisi 8, sehingga dapat

diartikan bahwa terjadinya ikatan antara C dengan H pada posisi 8. Lalu 13

C-

NMR memberikan pergeseran kimia pada 136,48 ppm dan membentuk korelasi

dengan H-NMR pada pergeseran kimia 7,95 yaitu H pada posisi 2, artinya terjadi

ikatan C & H pada posisi 2. Berikutnya 13

C-NMR memberikan sinyal pergeseran

kimia pada 126,36 ppm dan membentuk korelasi dengan H pada posisi 6 yakni

32


pada pergeseran kimia 8,05 ppm. Sinyal karbon 13

C-NMR memberikan

pergeseran kimia pada 137,45 ppm dan membentuk korelasi dengan H-NMR pada

pergeseran kimia 7,55 ppm, yaitu H pada posisi 3, sehingga dapat diartikan bahwa

terjadi ikatan antara C & H diposisi 3. Sinyal karbon lainnya yaitu pada

pergeseran kimia 155,53 ppm merupakan karbon tersier (C3) yang dapat berikatan

dengan atom oksigen dari metoksi. Sinyal karbon terakhir yaitu pada pergeseran

kimia 122,68 yaitu karbon kuartener (4C).

Tabel 4.3 C-NMR senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

13C-NMR senyawa hasil nitrasi

Posisi Pergeseran kimia

11 57,13 ppm

9 114,57 ppm

6 126,68 ppm

8 134,71 ppm

2 136,48 ppm

3 137,45 ppm

7 155,53 ppm

4 122,68 ppm

4.4 Pengujian Aktivitas Antiinflamasi dan Hubungan Struktur Aktivitas

Senyawa Hasil Modofikasi

Pada penelitian ini, uji aktivitas antiinflamasi invitro dengan prinsip

penghambatan denaturasi protein dimana denaturasi terjadi karena adanya

perlakuan pemberian panas (William et al, 2008), pengujian ini dipilih sebagai

skrining awal uji antiinflamasi pada senyawa hasil modifikasi, metode ini juga

dipilih karena adanya masalah yang terjadi berkaitan tentang penggunaan hewan

pada penelitian farmakologi seperti kode etik. Selain itu obat-obat anti inflamasi

konvensional NSAID seperti fenil butazon dan indometasin tidak bertindak hanya

dengan menghambat produksi prostaglandin dengan menghalangi enzim COX,

tetapi juga dengan pencegahan denaturasi protein, dengan demikian uji

antidenaturasi protein adalah metode yang mudah untuk memeriksi aktivitas

antiinflamasi (Ullah et al, 2014)

33


Uji aktivitas antiinflamasi dilakukan pada dua senyawa yang didapatkan

yaitu Asam p-metoksisinamat dan senyawa hasil reaksi nitrasi dan Na Diklofenak

sebagai kontrol positif. Pada uji inhibisi denaturasi BSA dengan rentang

konsentrasi uji 50-0,035 ppm dapat memberikan % inhibisi >20% maka dianggap

memiliki aktivitasi sebagai antiinflamasi (William et al,.2008).

Tabel 4.4. Hasil Uji Antiinflamasi Senyawa Kontrol dan Senyawa Hasil Modifikasi

Sampel Konsentrasi % Inhibisi

Na

diklofenak

0.1 ppm 1,59

1 1 ppm 4,56

10 ppm 26,75

100 ppm 98,85

EPMS

0.1 ppm 30,9

1 ppm 36,46

2 10 ppm 46,76

100 ppm 54,93

APMS

0.1 ppm -0.54

3 1 ppm -0.34

10 ppm 0.11

100 ppm 0.32

4-metoksi-

2-nitro-

beta-

nitrostirena

0.1 ppm 36.71

4 1 ppm 29.65

10 ppm 15.32

100 ppm -7.93

34


Gambar 4.17. diagram aktivitas antiinflamasi

Natrium diklofenak aktif dalam memberikan aktivitas antiinflamasi

dimulai dari konsentrasi 10 ppm dengan persen inhibisi 26,75 %dan pada

konsentrasi 100 ppm dapat menghambat denaturasi protein sebesar 98,85%.

Senyawa EPMS aktif sebagai antiinflamasi dimulai dari konsentrasi 0,1 ppm

sampai dengan konsentrasi 100 ppm, terlihat dari hasil yang didapat yaitu pada

konsentrasi 0,1 ppm memberikan persen inhibisi sebesar 30,9 %, 1 ppm 36,46%,

10 ppm 46,76 % dan 100 ppm sebesar 54,93. Artinya semakin tinggi konsentrasi,

maka semakin tinggi aktvitas sebagai antiinflamasi. Senyawa Asam p-

metoksisinamat yang merupakan hasil dari hidrolisis sebelumnya telah diteliti

efek aktivitas antiinflamasi oleh mufidah (2014), bahwa senyawa Asam p-

metoksisinamat tidak mempunyai aktivitas sebagai antiinflamasi. Pada pengujian

kali ini juga mendapatkan hasil yang sama dimana senyawa Asam p-

metoksisinamat sama sekali tidak memiliki aktivitas sebagai antiinflamasi, terlihat

dari persen inhibisi yang dihasilkan baik pada konsentrasi terendah sampai

konsentrasi tertinggi menghasilkan persen inhibisi negative dan <20%.

Senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena dengan konsentrasi 0,1

ppm, 1 ppm, dan 10 ppm mengalami peningkatan aktivitas antiinflamasi

dibandingkan dengan senyawa APMS pada konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm dan 10

ppm, sedangkan pada konsentrasi 100 ppm tidak menghasilkan peningkatan

aktivitas sebagai antiinflamasi, hal ini terlihat dari persen inhibisi yang dihasilkan

-20

0

20

40

60

80

100

120

0.1 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm

Na diklofenak

EPMS

APMS

4-metoksi-2-nitro-beta-nitrostirena

35


dimana persen inihibisi senyawa ini yaitu pada konsentrasi 0.1 ppm sebesar

36.71%, 1 ppm sebesar 29,65%, 10 ppm sebesar 15,32% dan pada konsentrasi

100 ppm -7,93%. Artinya penambahan gugus NO2 pada senyawa Asam p-

metoksisinamat memberikan efek peningkatan efek antiinflamasi. Dari data

tersebut terlihat semakin kecil konsentrasi maka semakin besar aktivitas

antiinflamasi, hal yang sama juga terjadi pada penelitian uji antiinflamasi senyawa

hasil isolasi Butea monosperma (Ningappa et al, 2012) dan ektrak Annona

cherimola mempunyai aktivitas antiinflamasi pada konsentrasi yang rendah,

sedangkan semakin tinggi konsentrasi, semakin rendah aktivitas antiinflamasi

(Verma et al, 2011).

1 2

Gambar 4.18. 1. Asam p-metoksisinamat, 2. 4-Metoksi-2-Nitro-beta-

Nitrostirena

Untuk senyawa hasil modifikasi melalui reaksi nitrasi, dapat dianalisa

bahwa penambahan gugus NO2 pada gugus aromatik senyawa Asam p-

metoksisinamat dapat meningkatkan aktivitas antiinflamasi, hal ini disebabkan

karena terjadinya penurunan polaritas senyawa asam p-metoksisinamat oleh

gugus NO2.

36


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Transformasi gugus fungsi pada etil p-metoksisinamat berhasil dilakukan

melalui proses hidrolisis menjadi asam p-metoksisinamat, lalu dinitrasi

menghasilkan senyawa 4-Metoksi-2-Nitro-beta-Nitrostirena

2. Hubungan struktur aktivitas hasil modifikasi asam p-metoksisinamat

terhadap antiinflamasi menunjukan bahwa penambahan gugus NO2 dapat

meningkatkan aktivitas antiinflamasi pada konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm, 10

ppm.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut tentang reaksi dan pereaksi, kondisi

reaksi dan waktu reaksi sehingga dapat diperoleh rendemen senyawa yang

lebih baik.

2. Perlu dilakukan uji invivo pada senyawa hasil modifikasi untuk penelitian

lebih lanjut.

3. Perlu dilakukan pengujian uji antiinflamasi pada konsentrasi yang lebih

kecil.

37


DAFTAR PUSTAKA

Aliya nur hasanah.et al. 2011. Analisis Kandungan Minyak Atsiri dan Uji

Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Rimpang Kencur (Kaempferia galanga

L.). Jurnal matematika & sains, Vol.16 Nomor 3, Hal 147-152.

Bangun, Robijanto. 2011. Semi Sintesis N,N-Bis(2-Hidroksietil)-3-(4-

Metoksifenil) Akrilamida Dari Etil P-Metoksisinamat Hasil Isolasi

Rimpang Kencur (Kaempferia Galanga, L) Melalui Amidasi Dengan

Dietanolamin. Medan: Universitas Sumetra Utara.

Barus, Rosbina. 2009. Amidasi Etil p-Metoksisinamat yang Diisolasi dari Kencur

(Kaempferia Galanga, Linn). Medan: Sekolah Pasca Sarjana Universitas

Sumatera Utara.

Billy E. Haigler and Jim C Spain. 1991. Biotransformation of Nitrobenzene by

Bacterial Containing toluene Degradative Pathways.

Bose, K ajay et al. 2006. Cold Microwave Chemistry: Synthesis Using Pre-Cooled

Rearents.

BPOM RI. 2014. Kebun Tanaman Obat Badan POM RI.

Chandra et all india, 2012. Evaluation of in vitro anti-inflammatory activity of

coffee against the denaturation of protein

Cairns, Donald. Intisari Kimia Farmasi. 2004. EGC. jakarta

Cresswell ,C. J.,Runquist dan Campbell. 1982. Analisis Spektrum Senyawa

Organik. . Edisi kedua. Bandung: Penerbit ITB.

Day,R. A., dan Underwood, A. L., 1999, Analisis Kimia Kuantitatif (Penerjemah

Aloysius Hadyana Pudjaatmaka,), Penerbit Erlangga, Jakarta, hal: 491.

Ernawati Teni et al. 2012. Synthesis of a Cnadidate Anti-Cancer Inhibitor

Compound:N,N-Diethylcinnamide. Intrnational Confrence and

Alternative Medicine In Health Care: Surakarta

Farmakologi dan Terapi UI. 2007. Departemen Farmakologi dan Terapeutik

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta

Halen, Parmeshwari K et al. 2009. Prodrug Designing of NSAIDs. Mini-Reviews

in Medicinal Chemistry, 9, 124-139.

38


Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia: penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerjemah: Kosasih P., Soediro Iwang. Bandung: Penerbit

ITB.

Heinrich, M. Barnes, J. Gibbons, S. Williansom, M, E. Fundamental Of

Pharmacognosy and Phytotherapy. Philadelpia: Penerbit Elsevier.

Hidayati, Nur et al. 2012. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Antifungal Akar

Acacia Mangium Dan Aktivitasnya Terhadap Ganoderma Lucidum.

Sekolah Pasca Sarjana : Universitas Gadjah Mada.

Hostettman, K. 1995. Cara Kromatografi Preparatif “Penggunaan pada Isolasi

Senyawa Alam”.. Penerbit ITB. Bandung

Schiefer Isaac T et al. 2012. Inhibition of amyloidogonesis by non-steroidal anti –

inflamatmatory drugs and their hybrid nitrates.

Griter,. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung

Khoirunni’mah, zulfa. 2012. Modifikasi Senyawa Metil Sinamat melalui Proses

Nitrasi Serta Uji Toksisitas BSLT (Brine Shrimp lethality Test) Terhadap

HasilSenyawa Modifikasi

Khosrow kashfi et al. 2002. Nitric Oxide-Donating Nonsteroidal Anti-

Inflammatory Drugs Inhibit the Growth of Various Cultured Human

Cancer Cells: Evidence of a Tissue Type-Independent Effect

Larson, Richard A.; Eric J. Weber. 1994. Reaction Mechanisms In Environmental

Organic Chemistry. Lewis Publisher : United States of America.

Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi.

Padmawinata.: ITB Press. Bandung

Mohan, Chandra. 2003. Calbiochem; Buffer. CALBIOCHEM® and Oncegene

Research Products.

Mufidah, syarfatul. 2014. Modifikasi struktur senyawa etil P-metoksisinamat

Yang Diisolasi dari Kencur (Kaemferia galangal Linn) melalui

transformasi gugus fungsi serta Uji Aktivitsa Sebagai Antiinflamasi

Mulja, M,. 1995. Analisis Instrumental. ITB. Bandung.

Nazeruddin, G. M. dan S. B. Suryawanshi. 2010. Sythesis of Novel Mutual Pro-

drugs by Coupling of Ibuprofen (NSAID) with Sulfa Drugs. J. Chem.

Pharm. Res., 2010, 2(4):508-512.

Ningappa Praveen Tatti et al. 2012. Evaluation of in-vitro anti-denaturation

activity of isolated compound of butea monosperma bark.

39


Olah, George A et al. 1982. Recent aspects of nitration : New Preparative

Methods and Mechanism studies (A Review). Proc. Natl. Acad. Sci. USA

Vol. 79 4487-4494.

Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Cetakan Pertama. Yongyakarta :

Penerbit Liberty

Silverstein, R. M. 1984. Penyidikan Spektometrik senyawa Organik. Jakarta :

Penerbit Erlangga.

Taufikurohmah, T.; Rusmini; Nurhayati. 2008. Pemilihan Pelarut Optimasi Suhu

Pada Isolasi Senyawa Etil P-metoksisinamat (EPMS) Dari Rimpang

Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri Kosmetik.

Ullah et al. 2014. Evaluation of antinociceptive, in-vivo & in-vitro anti-

inflammatory activity of ethanolic extract of Curcuma zedoaria rhizome

(Research Article). BMC Complementary and Alternative Medicine.

Bangladesh

Umar, Muhammad I et al. 2012. Bioactivity-Guided Isolation of Ethyl-p-

methoxycinnamate, an Anti-inflammatory Constituent, from Kaempferia

galanga L. Extracts. Molecules, 17, 8720-8734.

Verma, adarsh. M, Ajay kumar, Kavitha and Anurag. Kb3. 2011. Activities of

annona cherimola in-vitro anti denaturation and antioxidant.

Williams, LAD et al. 2008. The In Vitro Anti-denaturation Effects Induced by

Natural Product and Non-steroidal Compounds in Heat Treated

(Immunogenic) Bovine Serum Albumin is Proposed as a Screening Assay

for the Detection of Anti-inflammatory compounds, without the Use of

Animals, in the Early Stages of The Drug Discovery Process. West Indian

Medical Journal 57 (4):327.

Yazid, E. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Penerbit Andi. Yogyakarta.

Yulianto, Yogo Tri. 2010. Prarancangan Pabrik Nitrobenzen dari Benzen dan

Asam Campuran dengan Proses Kontinyu Kapasitas 120.000 Ton/Tahun.

Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Muhammadiyah Surakarta.

40


Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Reaksi hidrolisis

Reaksi

Nitrasi

Dengan

menggun

akan

HNO3

Senyawa Etil p-

metoksisinamat

Asam p-metoksisinamat

Senyawa Hasil Reaksi Nitrasi

Identifikasi menggunakan

kromatografi (KLT dan kolom),

GCMS dan spektrofotometri (IR

dan NMR).

Identifikasi

Uji Invitro Antiinflamasi

Uji Invitro Antiinflamasi menggunakan

metode denaturasi protein pada Bovine

Serum Albumin (BSA).

41


Lampiran 2: Skema Identifikasi Senyawa Hasil Modifikasi

Senyawa Hasil Modifikasi

Pemisahan Senyawa Hasil

Modifikasi

Kromatografi

Kromatografi Lapis Tipis Kromatografi Kolom

Fraksi-Fraksi Senyawa Hasil Modifikasi

GCMS Spektrofotometer IR H-NMR

Analisa Data

Identifikasi Menggunakan Instrumentasi

42


Lampiran 3. Identifikasi Etil p-metoksisinamat (Mufidah, 2014)

Organoleptis Etil p-metoksisinamat

Senyawa Etil p-metoksisinamat diisolasi dari rimpang kencur (Kaempferia

galanga Linn.) yang diperoleh dari kebun balittro (Balai Penelitian Tanaman

Rempah dan Obat) di wilayah Sukabumi, Jawa Barat. Etil p-metoksisinamat

berwujud kristal putih kekuningan, memiliki aroma yang khas, mempunyai titik

leleh 47-52oC.

43


Lampiran 4: Spektrum IR Etil p-metoksisinamat

Hasil analisis Spektrofotometri IR menunjukkan penafsiran spektrum IR senyawa

isolat kencur (Etil p-metoksisinamat ) dari berbagai bilangan gelombang

absorbansi gugus fungsi yang spesifik seperti yang tertera pada gambar dan tabel

berikut:

Ikatan Daerah Absorbansi

(𝒗,𝒄𝒎−𝟏)

C=O 1704,18

C-O 1367,59-1321,3

C-H Aril 3007,15-3045,73

C=C Aril 1629,92-1573,02

C-H Alifatik 2979,18-2842,23

C-O Aril 1252,82-1210,38; 1029,07

Aromatik posisi para 829,43

44


Lampiran 5: Spektrum GC-MS Etil p-metoksisinamat

Hasil interpretasi Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS)

menunjukkan bahwa senyawa isolat kencur (Etil p-metoksisinamat) muncul pada

waktu retensi 9,932 dan memiliki berat molekul 206,0 g/mol dengan fragmentasi

massa pada 161; 134; 118; 103; 89; 77; 63; dan 51. Adapun spektrum GC-MS dan

fragmentasi yang terjadi pada senyawa isolat kencur (Etil p-metoksisinamat)

adalah sebagai berikut

45


46


Lampiran 6: Spektrum 1H-NMR Etil p-metoksisinamat

47


Hasil analisis 1H-NMR menggunakan pelarut CDCl3 menunjukkan nilai

pergeseran kimia (δ) sebagai berikut:

Posisi Pergeseran Kimia

(δ, ppm) (CDCl3)

12 1,33 (t, 3H, Ј=7,15)

11 4,25 (q, 2H, Ј=7,15)

8 6,31 (d, 1H, Ј=15,6)

7 7,65 (d, 1H, Ј=16,25)

5 6,90 (d, 1H, Ј=9,05)

4 7,47 (d, 1H, Ј=8,45)

2 7,47 (d, 1H, Ј=8,45)

1 6,90 (d, 1H, Ј=9,05)

15 3,82 (s, 3H)

Struktur Etil p-metoksisinamat

Spektrum 1H-NMR memberikan sinyal pada pergeseran kimia 1,33 ppm (3H)

berbentuk triplet dan juga pada 4,25 ppm (2H) berbentuk quartet. Sinyal ini lebih

downfield karena berikatan dengan oksigen. Spektrum 1H-NMR juga memberikan

sinyal pada pergeseran kimia 3,82 ppm (3H) berbentuk singlet. Sinyal ini lebih

downfield karena berikatan dengan Oksigen (-OCH3, metoksi). Pergeseran kimia

6,31 ppm (1H) berbentuk doublet memiliki hubungan dengan puncak pada

pergeseran kimia 7,65 ppm (1H) berbentuk doublet, dengan rentang nilai

konstanta kopling yang dekat yaitu 15,6 dan 16,26 Hz. Bentuk tersebut adalah

olefin dengan proton berkonfigurasi trans. Kemudian pada pergeseran kimia 6,9

ppm-7,4 ppm (4H) merupakan proton-proton dari benzen dengan dua subtitusi.

48


Pola sinyal ini menunjukkan bahwa 2 proton yang ekivalen terkopling secara

ortho dengan 2 proton yang ekivalen lainnya, yang kemudian menunjukkan

bahwa sinyal ini adalah sinhyal H 7/11 dan H 8/10.

Dari data-data yang diperoleh tersebut, senyawa hasil isolasi dari kencur

(Kaempferia galanga L.) adalah etil p-metoksisinamat.

49


Lampiran 7: Spektrum GC-MS Senyawa Asam p-metoksisinamat

50


Lampiran 8: Spektrum IR senyawa nitrasi

500750

10001250

15001750

20002500

30003500

4000

1/cm

60

67.5 75

82.5 90

97.5

105

%T

3098.78

2923.25

1614.49

1526.72

1349.26

1210.38

1086.93

1010.74

903.69

nitrasi apms

51


Lampiran 9: Spektrum GC-MS Senyawa nitrasi APMS

52

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Lampiran 10: H-NMR, C-NMR, HSQC senyawa hasil nitrasi

53


54


55


1H-NMR

56


57


58


59


60


HSQC

61


62


63


Lampiran 11: Perhitungan Reaksi

a. Perhitungan Bahan untuk Reaksi Hidrolisis

1. Etil p-metoksisinamat

- Terpakai = 5 gram, BM=206,24 gr/mol

- Mol

-

=0,024 mol

2. NaOH

- BM = 40 gr/mol

- Mol

= 1,5 X 0,024

= 0.036 mol

- Massa (g)

=mol X BM

= 0,0479 X 40

= 1,44 gram1,5 gram

b. Perhitungan Bahan Reaksi Nitrasi

1. Asam p-metoksisinamat

- Terpakai = 3 gram, BM= 178

- Mol

-

=0,0169 mol

2. Asam Nitrat

- BM = 63,01 g/mol

- Ƿ =1,4 g/mL

- Mol

= 16 X 0,0169

= 0,2704 mol

- Massa (g)

=mol X BM

64


= 0,2704 X 63,01

= 17,5612

- Volume (mL)

-

= mol

= 12,112 mL

65


Lampiran 12: Hasil Perhitungan Uji Antiinflamasi

Senyawa hasil nitrasi

Kon

s

KN = 1.247 % INHIBISI MEA

N

SD MEAN±S

D I II III

0.1 0.78

6

0.79

5

0.78

3

36.8 36.17

6

37.16

5

36.71 0.49

5

36.71±0.49

5

1 0.87

6

0.89

4

0.86 29.7 28.28

8

30.98

9

29.65 1.35 29.65±1.35

10 1.01

6

1.08

3

1.06 18.4

4

13.1 14.43 15.32 2.77 15.32±2.77

100 1.34

1

1.34

7

1.34

9

-7.56 -8.04 -8.2 -7.93 0.32

9

-

7.93±0.329

Senyawa 4-metoksi-2-nitro-beta-nitrostirena

Kon

s

KN = 2.593 % INHIBISI MEA

N

SD MEAN±

SD I II III

0.1 2.622

3

2.59

3

2.60

6

-

1.129

0 -0.501 -0.543 0.567 -0.543 ±

0.567

1 2.616 2.58

7

2.60

3

-

0.887

0.231 -0.385 -0.347 0,559 -0.347 ±

0,559

10 2.605 2.58

3

2.58

2

-

0.462

0.385 0.424 0.115 0,5 0.115 ±

0,5

100 2.587 2.58

2

2.57

3

-

0.231

0.424 0.784 0.325 0,514 0.325 ±

0,514

Senyawa Na-Diklofenak

Konsentrasi % inhibisi SD

0.1 1.59 0.36

1 4.56 2.98

10 26.75 4.43

100 98.85 0.8

Senyawa EPMS

Kon

s

KN = 1,002 KN=

0,20

5

% INHIBISI MEA

N

SD MEAN±

SD

I II III

0.1 0,675 0,67

3

0,14

9

32,6 32,8 27,3 30,9 3,119 30,9±3,1

19

1 0,602 0,59

6

0,14

6

39,9 40,5 29 36,46

7

6,473 36,467±

5,473

10 0,557 0,59

3

0,11

4

44,4 40,8 44,3 46,76

7

4,852 46,767±

4,852

100 0,449 0,44

7

0,08

8

55,2 52,4 57,2 54,93

3

2,411 54,933±

2,411

66


Lampiran 13: Kurva Uji Antiiflamasi

-20

0

20

40

60

80

100

120

0.1 ppm 1 ppm 10 ppm 100 ppm

Na diklofenak

EPMS

APMS

4-metoksi-2-nitro-beta-nitrostirena

67


Lampiran 14 : Gambar Senyawa

Etil p-metoksisinamat Asam p-metoksisinamat Senyawa hasil nitrasi

68


Lampiran 15: Gambar Analisis Senyawa

Gambar 1: Analisa dengan IR

Gambar 2: Analisa dengan GCMS

Gambar 3: Analisa Dengan HNMR

modifikasi struktur senyawa asam p-metoksi sinamat melalui

Documents