NOMBRE: Pérez Hernández José de Jesús MATRÍCULA: 99334642 TELÉFONO: 015959281079 LICENCIATURA: Biología Experimental DIVISIÓN: Ciencias Biológicas y de la Salud UNIDAD UNIVERSITARIA: Iztapalapa TRIMESTRE LECTIVO: 05-P TÍTULO DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DEL QUE DEPENDE EL PDI: Compartamentalización de la respuesta inmunológica en el SNC TITULO DEL PDI: Modularización de la función inmunológica en la corteza somatosensorial primaria del ratón adulto NOMBRES DE LOS ASESORES EXTERNOS: Dra. Anhaí Chavarria Krauser NOMBRES DE LOS ASESORES INTERNOS: Dra. Elisa Vega Avila

MODULARIZACIÓN DE LA FUNCIÓN INMUNOLÓGICA EN LA CORTEZA

SOMATOSENSORIAL PRIMARIA DEL RATÓN ADULTO

Antecedentes y Marco Teórico

El sistema nervioso central (SNC) está constituido por unidades modulares

denominadas columnas que agrupan células nerviosas y conexiones que procesan un tipo de

información semejante (Mountcastle, 1979; Leise, 1990). Por ejemplo, en la corteza visual

de los primates y felinos, existen columnas de células que procesan preferencialmente

información proveniente del ojo izquierdo o del ojo derecho (columnas de dominancia

ocular; Leise, 1990). La evidencia anatómica hasta ahora acumulada, junto con diversos

estudios neurofisiológicos, sugiere que las columnas corticales participan en el

procesamiento de información de tipo neural (Mountcastle; 1979, Livingstone et al; 1984,

Leise, 1990). Por otro lado, observaciones previas realizadas en el laboratorio sugieren que

la organización de la respuesta inmunológica difiere entre las distintas regiones del sistema

nervioso. Por ejemplo, cisticercos ubicados en el parénquima cerebral o en los surcos, se

asocian con niveles bajos de citocinas y anticuerpos específicos en el líquido

cefaloraquídeo. En contraste, los parásitos localizados en el espacio subaracnoideo de la

base o intraventriculares, inducen una respuesta más pronunciada con altos niveles de

citocinas y de anticuerpos específicos (Chavarria et al., 2005). Así mismo, los niveles de

expresión de citocinas en diversas regiones parenquimatosas del cerebro de mono difieren

entre sí en respuesta a la infección por Plasmodium coatneyi (Tongren et al., 2000). Esta

heterogeneidad no solamente se observa consecutiva a la infección directa del SNC, sino

también en las respuestas inmunológicas del mismo a infecciones periféricas. Para ilustrar

este punto cabe mencionar que la infección experimental con tripanosomas en la rata

conduce a una producción más elevada de citocinas en los plexos coroideos con relación al

parénquima cerebral (Sharafeldin et al, 1999). De esta forma, estas observaciones apoyan

la existencia de compartimentos inmunológicos en el SNC, cuya identidad estructural aún

desconocemos.

¿Cuales son las bases estructurales y fisiológicas de la compartamentalización de la

respuestas inmunológica en el SNC? Hasta donde sabemos aún no existe una respuesta a

esta pregunta. Es posible, sin embargo, que existan módulos definidos por el tipo, la

distribución y la densidad de células presentadoras de antígeno (Matyszak et al; 1996,

McMenamin et al; 2003, Guillemin et al; 2004, Galea et al; 2005). En apoyo a esta

posibilidad, se ha observado que los plexos coroideos y las meninges muestran

principalmente macrófagos y células dendríticas, mientras que en el parénquima cerebral la

microglia y los macrófagos perivasculares son los tipos celulares predominantes (Matyszak

et al; 1996, McMenamin et al; 2003, Guillemin et al; 2004, Galea et al; 2005). También se

ha observado que la expresión del MHCII, una molécula necesaria para la presentación de

antígenos, varía en diferentes regiones del SNC, siendo muy baja en la corteza cerebral y

alta en la médula espinal (Vass et al; 1990).

Para evaluar la hipótesis referida utilizamos el modelo de la corteza somatosensorial

primaria del ratón adulto. Esta corteza contiene un mapa corporal constituido por módulos

columnares denominados barriles (White et al; 1993). Cada uno de los barriles representa

grupos de mecanoreceptores localizados en las vibrisas faciales del ratón. Debido a su

definición anatómica, podemos identificarlos con mucha precisión (Woolsey et al; 1970;

Killackey et al; 1979). Esto facilitó la evaluación de la relación entre la modularidad neural

con la inmunológica.

Hipótesis

Existe una relación estructural y funcional entre los módulos neurales y los módulos

inmunológicos.

Objetivo General

Evaluar la relación anatomo-funcional entre los módulos neurales y los módulos

inmunológicos.

Objetivos Específicos

1. Evaluar la distribución y densidad de células microgliales, macrófagos

perivasculares y astrocitos en el interior de los barriles (modular) y en el tejido

circundante (no modular) en ratones adultos, utilizando técnicas de

inmunohistoquímica y análisis digital de imágenes.

2. Evaluar la distribución y densidad de células microgliales, macrófagos

perivasculares y astrocitos en el interior de los barriles (modular) y en el tejido

circundante (no modular) en ratones adultos, después de realizada una lesión

circunscrita, utilizando técnicas de inmunohistoquímica y análisis digital de

imágenes.

3. Evaluar la presencia de citocinas en el interior de los barriles (modular) y en el

tejido circundante (no modular) en ratones adultos, utilizando técnicas de

inmunohistoquímica y análisis digital de imágenes.

4. Evaluar la presencia de citocinas en el interior de los barriles (modular) y en el

tejido circundante (no modular) en ratones adultos, después de realizada una lesión

circunscrita, utilizando técnicas de inmunohistoquímica y análisis digital de

imágenes.

Metodología

Animales de experimentación

Se usaron ratones machos adultos de la cepa CD1 de 60 a 80 días de edad

(n=4/grupo experimental), los cuales fueron mantenidos en un ciclo luz:obscuridad 14:10,

con agua y comida ad libitum. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados

por los comités de ética locales.

Lesiones circunscritas de la zona modular (zona de los barriles) y la zona no modular

de la corteza somatosensorial

Para realización de las lesiones, los ratones adultos fueron anestesiados con

ketamina y xilacina (90µg/10µg/g de peso). Los animales se colocaron en un aparato

estereotáxico, después se expuso el cráneo y se les realizó un pequeño agujero de 0.5mm

con un dremmel. Posteriormente se realizó una lesión circunscrita en la zona modular (zona

de los barriles) de la corteza somatosensorial (coordenadas: anteroposterior: 1.5mm;

profundidad: 0.5mm; lateral: 2.3mm relativo a bregma) o en la zona no modular

(coordenadas: anteroposterior: 1.8mm; profundidad: 0.5mm; lateral: 2.3mm relativo a

bregma) utilizando una aguja estéril de 30 G 1/2. Transcurridos dos minutos, se retiró la

aguja, y los animales fueron suturados y colocados en cajas aisladas hasta su recuperación.

Los animales se sacrificaron (ver abajo) a los dos días de realizada la lesión. Se eligió este

periodo debido a que la respuesta inflamatoria en el SNC es de inicio rápido y a las 24-48

horas hay reactividad de la glia. Antes de su sacrificio, los animales fueron anestesiados

con pentobarbital (20 mg/kg de peso corporal), perfundidos con solución salina y

posteriormente con paraformaldehído al 4%. Los animales fueron decapitados, se

obtuvieron los cerebros, se disectó la corteza cerebral lesionada y la contralateral para ser

postfijadas entre dos laminillas y procesadas por métodos de inmunohistoquímica para

determinar la respuesta inmunológica circundante a la lesión. Se realizaron las tinciones de

inmunohistoquímica para determinar la respuesta de astrocitos (antígeno GFAP), de

macrófagos y microglia (antígenos MHCII y F4/80) y la expresión de citocinas

inflamatorias (IFNγ, TNFα) y anti-inflamatorias (IL4, IL10) en el tejido lesionado y

circundante.

Inmunohistoquímica

Ratones normales, lesionados en la zona modular y en la zona no modular se

sacrificaron a los 2 días posteriores a la lesión. Cumplido este periodo, los animales fueron

anestesiados con pentobarbital sódico (20 mg/kg de peso corporal), prefundidos,

decapitados y sus cerebros cuidadosamente removidos para evitar dañar la corteza cerebral.

Se separaron las cortezas de cada cerebro y se colocaron sobre portaobjetos recubiertos con

cinta de teflón para extender las cortezas y facilitar la visualización del mapa de los

barriles. Las muestras se congelaron por inmersión en 2-metilbutano pre-enfriado con hielo

seco. Después de ser congeladas, las muestras se almacenaron a -74° C hasta efectuar los

experimentos morfológicos. Para ello, se realizaron cortes tangenciales seriados (35µm de

espesor) de las cortezas cerebrales a una temperatura de -20° C utilizando un criostato. Los

cortes fueron recuperados y colocados en pozos con amortiguador de fosfatos (PB; 0.1M,

pH 7.4). En seguida se inactivó la actividad de peroxidasa endógena en el tejido con 3%

H202 en PB durante 15 minutos y se lavaron 3 veces por 5 minutos con PB. Los cortes

fueron incubados con una solución de bloqueo que contiene albúmina sérica bovina (ABS;

3%) y tritón X-100 (0.3%) disueltos en PB, en agitación y a temperatura ambiente por 90

minutos. Se agregó el anticuerpo primario rata anti-TNFα de ratón, rata anti-F4/80 de

ratón, rata anti-IL4 de ratón, rata anti-IL10 de ratón (todos de Serotec; a una dilución 1:50),

o rata anti-MHCII de ratón, rata anti-IFNγ de ratón y conejo anti-GFAP (todos de

Chemicon; a una dilución 1:500 excepto anti-GFAP 1:300), diluidos en la solución de

bloqueo. El anticuerpo primario se incubó toda la noche a 4° C en agitación. Como control

de los experimentos se omitió el anticuerpo primario y se incubó sólo con suero de bloqueo.

Al día siguiente los cortes fueron lavados 3 veces por 15 minutos en agitación con una

solución de lavado que contenía Tritón X-100 (0.3%) en PBS. Posteriormente, los cortes se

incubaron por 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente en agitación con los anticuerpos

secundarios biotinilados dirigidos contra IgGs de rata (Chemicon, a una dilución 1:500) o

contra IgGs de conejo, todos de Vector, a una dilución 1:500) en correspondencia con los

anticuerpos primarios utilizados. Pasado ese tiempo, se retiró el exceso de anticuerpos y los

cortes se lavaron tres veces con la solución de lavado. Los cortes se incubaron con el

complejo avidina-peroxidasa (Elite AB Kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)

por 1 hora 30 minutos a temperatura ambiente en agitación, se lavaron tres veces con PB, y

la actividad de peroxidasa se reveló con un kit de 3,3- diaminobencidina y peróxido de

hidrógeno de acuerdo al protocolo recomendado por el proveedor (Vector Laboratories).

Los cortes se tiñeron para visualizar los barriles de la corteza somatosensorial con violeta

de cresilo por 25 minutos, se lavó, con agua destilada para posteriormente ser deshidratados

en soluciones crecientes de etanol. Al final del procedimiento, los cortes se montaron sobre

laminillas cubiertas de gelatina y se dejaron secar hasta el día siguiente en ambiente libre de

polvo, se montaron en Cytoseal y se observaron en un microscopio de campo claro o

epifluorescencia (Optiphot-2, Nikon, Tokio, Japan o Axioscop 40, Carl Zeiss, Gottingen,

Germany). Las fotografías fueron tomadas con una cámara digital (Coolpix4300, Nikon o

AxioCam MRc, Carl Zeiss) y convertidas a escala de grises con el programa Adobe

Photoshop®. Estas fotografías fueron utilizadas para mapear la distribución de astrocitos y

células presentadoras de antígenos dentro y fuera de los barriles. Para ello, se estimó su

densidad. Los datos obtenidos fueron contrastados estadísticamente utilizando un t de

Student fijando la significancia estadística a una p<0.05.

Resultados

Distribución y densidad de células microgliales, macrófagos perivasculares y astrocitos

en la corteza somatosensorial primaria de ratones adultos normales

El análisis inmunohistoquímico efectuado en la corteza somatosensorial primaria de

ratones machos CD1 en condiciones fisiológicas, reveló la ausencia de astrocitos (Fig. 1

A), así como del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II (MHCII de sus siglas en

inglés), una molécula necesaria para la presentación antigénica (Fig. 1 B). Por otra parte,

encontramos una menor densidad de células microgliales y macrófagos perivasculares con

respecto al resto de la corteza cerebral (Fig. 1 C). En la Fig. 1 D se observan algunos

macrófagos perivasculares (ver la cabeza de flecha) y un mayor número de células

microgliales en el septo o borde (ver flechas) con respecto al interior de los barriles.

Presencia de citocinas en la corteza somatosensorial primaria de ratones adultos

normales

En cuanto a la respuesta inmunológica, nosotros estudiamos dos citocinas pro-

inflamatorias (INFγ y TNFα) y dos anti-inflamatorias (IL4 e IL10). Las citocinas pro-

inflamatorias y la IL4 no fueron detectadas en la zona modular de los barriles (Fig. 2 A, B y

C). Sin embargo, llama la atención la presencia de IL10 en el interior de los barriles y no

así en el borde o septo de los mismos (Fig. 2 D). La imagen muestra que esta citocina se

encuentra principalmente en las terminaciones nerviosas de las neuronas (Fig. 2 D, ver

flechas).

Distribución y densidad de células microgliales, macrófagos perivasculares y astrocitos

en la corteza somatosensorial de ratones adultos después de realizada una lesión

circunscrita

Después de realizar una lesión circunscrita de tipo penetrante observamos una

respuesta glial pronunciada tanto en las lesiones realizadas en la zona modular como en

aquellas fuera de la zona modular (Fig. 3 A-F). Es notable la activación de la microglia y

de los macrófagos perivasculares ya que expresan MHCII (Fig. 3 C y D), la cual en

condiciones fisiológicas no está presente (ver Fig. 1 B). Los astrocitos muestran poca

reactividad como se puede observar en la Fig. 3 E y F. Llama la atención que en las

lesiones realizadas dentro de la zona modular o en los barriles, la respuesta glial difiere en

su distribución con respecto a las lesiones realizadas fuera de los barriles. Podemos

observar que solamente los barriles cercanos a la lesión muestran reactividad celular (Fig. 3

A y C). Por otro lado, la respuesta de macrófagos y células microgliales es más intensa en

el septo que en el interior de los barriles (Fig. 3 A y C).

Presencia de citocinas en la corteza somatosensorial de ratones adultos después de

realizada una lesión circunscrita

Con respecto a la expresión de las citocinas anti-inflamatorias, observamos un

aumento en la expresión de IL 4 después de realizada la lesión tanto en la zona modular

como no modular (Fig. 4 A y B). Sin embargo, se puede ver que la distribución de IL4 en la

zona modular es más pronunciada en el septo de los barriles con respecto al interior de los

mismos (Fig. 4 A). Por otro lado se observa que la expresión de IL10 es únicamente

detectable en el borde de la lesión fuera de la zona modular (Fig. 4 D) mientras que en los

barriles está ausente (Fig. 4 C).

En contraste con la baja expresión de IL 4 e IL 10, INFγ se encuentra expresado en

gran cantidad tanto en las lesiones dentro de la zona modular como fuera (Fig. 5 A y B).

TNFα muestra un perfil similar aunque menos pronunciado (Fig. 5 C y D). Nuevamente se

puede observar que en las lesiones realizadas dentro de la zona modular la expresión de

ambas citocinas pro-inflamatorias es mayor en el septo de los barriles con respecto al

interior de los mismos (Fig. 5 A y C).

Discusión

Los datos obtenidos en este trabajo apoyan la existencia de módulos inmunológicos

y que éstos están relacionados estructural y funcionalmente con los módulos neurales. En

este proyecto nos enfocamos a estudiar la respuesta inmunológica en una zona modular de

la corteza somatosensorial correspondiente al mapa corporal de las vibrisas faciales,

denominada barriles.

Nuestras observaciones muestran que la corteza somatosensorial tiene una

organización inmunológica particular en condiciones fisiológicas. En primera instancia

notamos que la distribución de células gliales es diferente en el área de los barriles con

respecto a otras zonas de la corteza cerebral, mostrando una menor densidad de microglia y

macrófagos perivasculares en los barriles, y que su distribución es preferentemente en los

septos y escasa en el interior de los mismos. Estos tipos celulares participan tanto en

fenómenos de protección contra patógenos, de inmuno-regulación y de reparación de

tejidos fagocitando restos celulares, como en procesos regenerativos (Chen L et. al. 2002).

Sin embargo, la microglia y los macrófagos son los principales participantes en eventos

inflamatorios que pueden llevar a daño tisular (Chavarria et al., 2004), por lo que su menor

densidad en el área de los barriles pudiera conferir cierta “protección” ante un estímulo

inflamatorio. Por otro lado, la ausencia de la expresión del MHCII en la corteza cerebral

también pudiera ser relevante al contribuir al ambiente inmuno-privilegiado del SNC.

Otro hallazgo relevante es la presencia de IL10 en condiciones fisiológicas

únicamente en el interior de los barriles en las terminaciones nerviosas. La IL10 es una

citocina con propiedades anti-inflamatorias o inmuno-reguladoras. Adicionalmente se le ha

atribuido el papel de neuroprotectora, ya que previene la muerte celular al bloquear la

caspasa 3 (Beachis et al., 2001). La presencia de la IL10 en el interior de los barriles

pudiera conferirle características inmunológicas diferentes que al septo de los mismos.

Las diferencias que hallamos en la corteza somatosensorial con respecto al resto de

la corteza cerebral apoyan la existencia de módulos inmunológicos, estas observaciones se

ven reforzadas por los datos obtenidos al lesionar fuera y dentro de la zona modular.

Observamos que la respuesta de las células gliales difiere, cuando la lesión es realizada

fuera del área modular la distribución glial es alrededor del borde de la lesión y muestra una

respuesta intensa que disminuye en zonas alejadas de la lesión. Esta distribución contrasta

con la que hallamos al lesionar en la zona modular, ya que la respuesta glial es únicamente

en los barriles pegados a la lesión y es más intensa en los septos con respecto al interior de

los barriles. Se sabe que los astrocitos tienen un papel importante en la modulación de la

respuesta inmunológica en el SNC (Aschner, 1998), sin embargo, no observamos una

respuesta de astrocitos en las lesiones tanto en la zona modular como en la zona no

modular; esto pudiera deberse a que los astrocitos requieren más tiempo para su activación

que las células microgliales (Cornet. et.al, 2000 ) y que los animales de experimentación

fueron sacrificados a los dos días después de realizada la lesión. La respuesta celular más

marcada que encontramos es principalmente de la microglia y los macrófagos. La microglia

muestra un perfil de activación no sólo por morfología sino también al encontrar la

expresión de MHCII tanto en el borde de la lesión como en zonas alejadas. En el caso de

las lesiones de la zona modular encontramos la expresión del MHCII en concordancia con

la distribución de las células microgliales y macrófagos ya mencionada. Estas

características descritas pudieran conferirle a la zona modular una respuesta más delimitada

y controlada con respecto al resto de la corteza cerebral.

La presencia de citocinas anti-inflamatorias fue muy limitada tanto en lesiones en el

área modular como fuera. Cabe destacar que la presencia de IL10 en el interior de los

barriles, que se observó en condiciones fisiológicas, desaparece totalmente después de la

lesión, es probable que esta citocina haya sido utilizada para regular el proceso

inflamatorio, y de esta manera delimitar el daño así como prevenir la muerte neuronal

(Beachis et al., 2001). Mientras que en las lesiones realizadas fuera de los barriles

observamos la presencia de IL10 e IL4 en células con morfología de macrófagos.

Previamente se ha reportado que los macrófagos al fagocitar mielina producen moléculas

anti-inflamatorias (Bavone et al., 2006). Dado que en el borde de la lesión hay muerte

celular incluso de oligodendrocitos, es posible que los macrófagos activados puedan

fagocitar restos de mielina, dando como resultado la producción de IL10 e IL4. Este

fenómeno no ocurre con la misma intensidad en el área de los barriles, lo que siguiere que

el mecanismo de inmuno-regulación pudiera ser diferente.

En contraste con la respuesta anti-inflamatoria, la respuesta de citocinas pro-

inflamatorias es considerablemente más intensa, especialmente la de INFγ. La presencia de

esta citocina es muy marcada en el borde de las lesiones y su periferia de las zonas no

modulares y contrasta con la intensidad y distribución de IFNγ en los barriles, donde se

expresa nuevamente más en los septos con respecto al interior de los barriles.

Adicionalmente se observa que el área de expresión de INFγ es menor en los cerebros

lesionados que en el área modular. INFγ puede ser neurotóxico (Lambertsen et al., 2004),

pudiera ser que la baja expresión de INFγ en la zona modular limite la extensión del daño.

Dado que observamos que la expresión de IFNγ es menor en el interior de los barriles con

respecto a los septos, es posible que la IL10 haya regulado o incluso suprimido en esta área

la respuesta inflamatoria de IFNγ. Así mismo, llama la atención la expresión de IFNγ en la

microglia activada y en macrófagos de las zonas no modulares. Por otro lado, la expresión

de TNFα en las lesiones tanto en la zona modular como no modular es menor con respecto

a INFγ. Llama la atención que muestra una distribución similar a la respuesta de IFNγ, es

decir, en la zona modular es más pronunciada en los septos que en el interior de los barriles.

TNFα es una molécula pleiotrópica que tiene efectos tanto pro-inflamatorios como efecto

neuroprotector al inducir neuroplasticidad cuando está presente en cantidades pequeñas

(William C et al., 2000). Es posible que la baja expresión de esta citocina en el área

modular pudiera estar relacionada más con el efecto neuroprotector que inflamatorio.

Conclusión

Los datos obtenidos en este proyecto apoyan la existencia de módulos

inmunológicos en el SNC y que estos compartimentos están relacionados estructural y

funcionalmente con los módulos neurales. Los módulos inmunológicos pueden conferirle a

los módulos neurales características inmunológicas diferentes que pudieran estar

relacionados con eventos de mayor o menor inflamación y por lo tanto con mayor o menor

daño tisular y la pérdida o conservación de la función. Nuestras observaciones abren nuevas

perspectivas en el estudio y la comprensión de la fisiología y patología del SNC.

A B

C D

Fig. 1 Distribución de las células gliales en la zona modular de los barriles en ratones

normales. Expresión de GFAP para ver astrocitos (A), del MHCII (B) y de F4/80 (C, D)

para ver macrófagos (ver la cabeza de flecha) y microglia (ver las flechas). A, B y D fueron

tomadas a 20X, C a 4X.

B

A

C D

Fig. 2 Presencia de IL 10 en el interior de barriles. Expresión de INFγ (A), TNFα (B),

IL4 (C) e IL10 (D). Las flechas muestran terminaciones nerviosas dentro de los barriles. A,

B y C fueron tomadas a 20X, D a 40X.

A B

C D

E F

Figura 3. Distribución de células gliales después de una lesión circunscrita en la

corteza somatosensorial. Expresión del marcador F4/80 de microglia y macrófagos (A y

B), del MHCII (C y D) y de GFAP en astrocitos (E y F). Lesión realizada en los barriles

(A, C y E), lesión realizada fuera de los barriles (B, D y F). Las fotos fueron tomadas a

10X( A, B, C, D y F) y 4X( E )

A B

C D

Figura 4. Expresión de IL 4 e IL10 después de una lesión circunscrita en la corteza

somatosensorial. Expresión de IL4 (A y B) e IL10 (C y D). Lesión realizada en los barriles

(A y C), lesión realizada fuera de los barriles (B y D). A y B fueron tomadas a 10X, C y D

a 20X.

A B

C D

Figura 5. Expresión de INFγ y TNFα después de una lesión circunscrita en la corteza

somatosensorial. Expresión de INFγ (A y B) y TNFα (C y D). Lesión realizada en los

barriles (A y C), lesión realizada fuera de los barriles (B y D). Las fotos fueron tomadas a

4X.

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