modulo 5: diagnosi microbiologica delle … di... · immunitarie sono in grado di eliminare...

C.I. MEDICINA DI LABORATORIOMICROBIOLOGIA CLINICACL MEDICINA E CHIRURGIA – AA 2014-2015

Modulo 5: DIAGNOSI MICROBIOLOGICA DELLE INFEZIONI DEL CIRCOLO EMATICO E DEL CUORE

Giovanni Di Bonaventura, PhD

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-PescaraNuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel 0871 3554812)Centro Scienze dell’Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel 0871 541519)E-mail: [email protected]

Il sistema cardiovascolare è un distretto anatomico fisiologicamente STERILE

È tuttavia possibile che i microrganismi (batteri, virus, miceti o protozoi) riescano, con varie modalità, a raggiungere l’apparato circolatorio:

Eventi fisiologici: masticazione, evacuazione con sforzo Estrazioni dentali Endoscopia Ferite cutanee: accidentali, chirurgiche Lesioni mucose: accidentali, chirurgiche, per pratiche di igiene orale Morsicature di animali Iniezioni: farmaci, droghe, tatuaggi Trasfusioni Cateterismo intravascolare Propagazione da processi infettivi

La presenza dei microrganismi in circolo può essere eradicata dai meccanismi di difesa (flogosi, fagociti circolanti e SRE, risposta immune) dell’ospite, oppure può causare una infezione.

Nel determinismo di una infezione giocano un ruolo importante: microrganismo: potenziale patogenetico; patogenicità specifica nei confronti di questo

distretto; carica microbica; ospite: efficacia della risposta immune.

Infezioni intravascolari: batteriemia, sepsi shock settico.

Infezioni del cuore: pericarditi, miocarditi, endocarditi.

Batteriemia: definizioni

In generale, una batteriemia può essere classificata come: (169, 181).

transiente, la cui durata varia da pochi minuti a poche ore, è associata a procedure

invasive che interessano siti anatomici colonizzati da una fisiologica flora microbica

cutanea (colonscopia, cateterizzazione percutanea, estrazioni dentarie) o con la

manipolazione di siti infetti localizzati (foruncoli). In un normoreattivo, le difese

immunitarie sono in grado di eliminare l’agente microbico dal circolo.

Intermittente, tipicamente associata ad infezioni circoscritte (closed-space), come ascessi

od infezioni focali (polmonite, osteomielite), od alla presenza di ostruzioni ricorrenti biliari

o urinarie, cateteri impiantati e colonizzati. E’ definita come episodi ricorrenti batteriemici

causati dallo stesso microrganismo rilevato in maniera intermittente nel circolo ematico a

causa di clearance cicliche e ricorrenza del patogeno al sito primario di infezione.

Persistente, comunemente associata a foci infettivi in sede intravascolare quali

endocardite infettiva o infezioni vascular-graft.

In ogni caso, la carica microbica è generalmente modesta potendo arrivare anche a 1

CFU/ml, rendendo così difficoltosa la diagnosi microbiologica (107, 169, 175, 215).

Sepsi: definizione

Se la batteriemia (o fungemia) non viene adeguatamente controllata, ciascun tipo di batteriemia potrebbe portare allo sviluppo di sepsi (gr. σήψις , "sēpsis", putrefazione), una sindrome clinica scatenata da un processo infettivo con importanti alterazioni nella risposta infiammatoria e metabolica, nella respirazione e nella coagulazione.

La sindrome settica è un continuum che va dalla sindrome da risposta infiammatoria sistemica (Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS) alla sindrome da insufficienza multiorgano (Multiple-Organ-Dysfunction Syndrome, MODS). Le fasi intermedie sono rappresentate dalla sepsi, la sepsi severa e lo shock settico.

* ipotensione (pressione sistolica sanguigna [SBP]: 90 mm Hg oppure 2 deviazioni standard al di sotto del valore fisiologico per l’età, pressione arteriosa media di 70 mm.

BSI: Epidemiologia

Le infezioni del circolo sanguigno (BloodStream Infections, BSI) sono associate ad un elevato tasso di morbidità e mortalità (20-70%).

Negli USA, circa 750.000 pazienti sviluppano BSI batterica o fungina ogni anno, risultando in 215.000 decessi (3, 120).

Recentemente è stato stimato che le manifestazioni cliniche più severe associate a BSI, sepsi e shock settico, rappresentano la 10a causa di morte negli USA, essendo responsabile del 6% della mortalità totale (50.4 morti per 100.000 individui della popolazione) (96).

In Europa, si stimano circa 135.000 decessi per anno a causa di complicanze sepsi-correlate, con una incidenza complessiva di sepsi pari a 3 casi per 1.000 individui (103).

Il costo economico delle complicanze sepsi-correlate è molto alto. Negli USA, è stato stimato in circa 17 bilioni di dollari/anno (3).

Relazione tra Infezione, SIRS, MODS, MOFS e shock settico

SEPSI SEVERA: sepsi con una o più disfunzioni di organo/sistema

• cardiovascolare (ipotensione e shock)

• respiratoria (ipossiemia)

• renale (anuria o oliguria)

SHOCK SETTICO: sepsi grave con ipotensione resistente alla “fluid resuscitation”* e

che richiede intervento farmacologico (agenti vasopressori o inotropici)

*(tentativo di ripristino della perfusione dei tessuti vitali mediante somministrazione di

fluidi per via intravenosa)

SEPSI: infezione + 2 criteri della SIRS

MODS (Multiple Organ Dysfunction Syndrome): ipotensione e ipoperfusione risultano

in disfunzione a livello di diversi organi o sistemi

MOFS: Multiple Organ Failure Syndrome

CID (Coagulazione Intravascolare Disseminata): grave stato patologico caratterizzato da abnormale coagulazione del sangue, con presenza disseminata di trombi/ emorragie

SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome): stato infiammatorio

che interessa l’intero sistema (ospite)

http://www.unipg.it/

http://www.unipg.it/

LO SHOCK SETTICO È LA PIÙ COMUNE CAUSA DI MORTE NELLE

UNITÀ DI TERAPIA INTENSIVA (ICU, Intensive Care Units)

Se la diagnosi è rapida, la prognosi è favorevole nell’80% dei casi,

altrimenti si ha una mortalità di circa il 70%.

Soggetti a rischio maggiore:

immunodepressi, ustionati, traumatizzati, anziani, diabetici, portatori di

catetere.

L’eziologia delle sepsi è cambiata negli ultimi decenni a causa di un aumentato numero di:

tecniche cardiochirurgiche

manovre invasive

tossicodipendenze iv

trapianti d’organo

gravi immunocompromissioni

uso/abuso antibiotici

prima erano spesso secondarie a ferite infette

(cocchi GRAM+: S. aureus, S. pyogenes)

ora sono spesso secondarie a pratiche iatrogene

(GRAM- intestinali o urinari: P. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae)

od installazione di cateteri

contaminazione con microrganismi della cute quali S. aureus o stafilococchi

coagulasi-negativi (CoNS: S. epidermidis, etc.), streptococchi orali (S. mutans, S.

salivarius), enterococchi (E. faecalis)

Le sepsi possono avere anche eziologia polimicrobica.

Batterica

• Cocchi Gram+, compresi stafilococchi coagulase-negativi (CoNS), S. aureus ed Enterococcus spp.

• altri microrganismi di origine ambientale o commensali da cute, orofaringe, gastro-intestinali(Enterobacteriaceae: E. coli, Klebsiella spp, P. aeruginosa).

ORIGINE (focolaio sepsigeno)

L’infezione può avere origine (focolaio sepsigeno) da:

cavo orale (stafilococchi, streptococchi)

apparato digerente (enterobatteri, batteri anaerobi)

vie urinarie (enterobatteri, E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp.);

apparato genitale femminile (enterobatteri, batteri anaerobi)

alte vie respiratorie, attraverso l’impiego di ventilazione assistita (Pseudomonas spp, Legionella spp)

Fungina

• Fungemia generalmente si osserva in pazienti immunosoppressi e quelli con patologie gravi o terminali.

• Vie di accesso al sistema circolatorio:

• cute danneggiata

• da siti primari di infezione o tramite cateteri intra-vascolari

• perdita di integrità della mucosa (es. gastrointestinale)

• Candida albicans isolata con alta frequenza; Malassezia furfur in neonati con nutrizione lipidica parenterale.

• I funghi non invadono le cellule ematiche, fatta eccezione per Histoplasma che si moltiplica all’interno dei leucociti.

Eziologia

Protozoaria

• Presenti in maniera transiente nel circolo, in quanto migrano verso altri tessuti od organi:

• Toxoplasma gondii

• Microfilariae

• Mansonella, Loaloa, Wuchereria, Brugia

• Plasmodium: invade gli eritrociti umani.

• Generalmente rivelati mediante visualizzazione diretta.

Virale

• Sebbene numerosi virus circolino nel sangue periferico, la patologia primaria è da riferire alla infezione dell’organo o del tipo cellulare “target”.

• Virus che invadono il circolo comprendono EBV, CMV, HIV.

• La cellula può essere distrutta o danneggiata dalla replicazione virale e la risposta immune dell’ospite contribuisce alla patogenesi.

Eziologia

Patogenesi della sepsi

Il riconoscimento delle componenti batteriche da parte del sistema immune,

determina risposte flogistiche (umorali e cellulo-mediate) localizzate e sistemiche.

La cascata infiammatoria viene innescata dal rilascio di prodotti batterici:

GRAM - : endotossina LPS, formyl-peptidi, esotossine, proteasi.

GRAM + : acidi teicoici, esotossine, superantigeni (toxic shock

syndrome toxin - TSST), esotossina A pirogenica streptococcica (SpeA),

emolisine, peptidoglicano, componenti parietali dei funghi.

Batteri Gram - Batteri Gram +

azione del LPS azione del peptidoglicano e acidi teicoici

Induzione di infiammazione e shock settico nelle infezioni sistemiche

Le citochine indotte possono agire direttamente, oppure indirettamente tramite mediatori secondari come: ossido nitrico, trombossani, leucotrieni, platelet-activating factor (PAF), prostaglandine, sistema del Complemento.

Le diverse attività biologiche del lipopolisaccaride

http://www.med.unipg.it/

http://www.med.unipg.it/

DIAGNOSI di laboratorio

Significato clinico dell’indagine emocolturale

• L’indagine emocolturale (emocoltura) rappresenta il “gold standard” per la diagnosi di

BSI. Si basa sulla ricerca di microrganismi vitali presenti nel sangue.

• Una accurata identificazione microbica e la definizione della via di ingresso sono “centrali”

per una gestione ottimale delle BSI.

• L’esame emocolturale rende possibile la valutazione della antibiotico-sensibilità del

microrganismo isolato; questa caratteristica non è, ad oggi, soddisfatta da nessuna altra

tecnica diagnostica.

• Questo aspetto è importante dal momento che numerosi studi hanno dimostrato come

una inadeguata terapia antibiotica rappresenti un fattore di rischio indipendente per la

mortalità o a causa dell’insuccesso dell’indagine microbiologica in pazienti con infezioni

gravi (81, 100, 102, 105, 206, 217).

82%77%

70%

61%57%

50%

43%

32%26%

19%

9%5%

Time to Appropriate Antimicrobial Rx following Onset of Hypotension (hrs)

Survival – Patients with Septic Shock

Kumar et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit Care Med. 2006 Jun;34(6):1589-96.

Un recente studio condotto su una coorte di pazienti con shock settico ha dimostrato che a

seguito di comparsa di ipotensione, ogni ora di ritardo nella somministrazione di una efficace

terapia antibiotica è associata ad un aumento della mortalità di circa 8% (95).

Una innappropriata terapia antibiotica iniziale in pazienti con infezioni gravi è associata ad una maggiore mortalità

Rello et al. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:196–200; Kollef et al. Chest 1998;113:412–420

Ibrahim et al. Chest 2000;118:146–155; Luna et al. Chest 1997;111:676–685

Luna et alCrude mortality

0 20 40 60 80 100

Ibrahim et alInfection-related mortality

Kollef et alCrude mortality

Raello et alInfection-related mortality

Mortality (%)

Initial appropriate therapy

Initial inappropriate therapy

Efficacia e significato clinico della emocoltura

L’efficacia ed il significato clinico dell'emocoltura dipendono da diversi fattori, sia metodologici che interpretativi, dipendenti soprattutto dalla fase pre-analitica:

il momento (timing) del prelievo

il volume del campione

il numero e la frequenza dei prelievi

l'accuratezza del prelievo

il tempo che intercorre tra il prelievo e l’incubazione dei flaconi

Quando effettuare il prelievo

Effettuare il prelievo il prima possibile e, comunque, prima dell’inizio di una eventuale terapia antibiotica.

Quando il paziente è in terapia, eseguire il prelievo prima della somministrazione dell’antibiotico, quando la sua concentrazione ematica è presumibilmente più bassa.

Il momento del prelievo può non essere critico nelle batteriemie di tipo continuo (es. endocardite, brucellosi, febbre tifoide) perchè sono caratterizzate da crescita e moltiplicazione dei microrganismi direttamente nel torrente circolatorio, sebbene vi si ritrovino a concentrazioni modeste.

Il timing di prelievo risulta invece essere fondamentale nei casi di batteriemia intermittente (situazione più frequente), in quanto i batteri vengono rilasciati ad intervalli in circolo dal sito di infezione (polmoni, vie genito-urinarie, tratto gastro-intestinale, ascessi). Occorre effettuare il prelievo prima del rialzo febbrile in quanto la batteriemia (maggiore concentrazione di batteri nel sangue) può precedere di oltre 1 h il rialzo termico.

E’ dunque importante studiare la curva termica; se questo non è prevedibile allora bisogna prelevare all'inizio del picco.

Se il rialzo febbrile è preceduto da brividi, bisognerebbe eseguire il prelievo al momento del brivido.

Bisogna tuttavia ricordare che molti pazienti possono essere ipotermici anche nella fase batteriemica o potrebbero essere non in grado di attivare una risposta di tipo febbrile all’infezione.

Numero di prelievi

Non esistono protocolli univoci per quanto attiene il numero di prelievi e la loro frequenza, al fine di una corretta diagnosi di BSI [Weinstein et al, JCM 2011].

Un solo prelievo può non evidenziare una batteriemia intermittente e rende difficile interpretare il significato clinico dell’isolamento di certi microrganismi.

E’ consigliabile eseguire 3 prelievi, in rapida successione, preferibilmente al rialzo febbrile. Un secondo ed un terzo set di emocolture*, infatti:

aumentano la sensibilità analitica

facilitano il rilievo di contaminazioni

Raramente è giustificato il prelievo di più di 3 sets, in quanto la sensibilità del metodo non aumenta significativamente; aumentano, invece, i costi ed i rischi di anemizzazione iatrogena del malato.

La frequenza di prelievo (timing) dipende dalla gravità del quadro clinico: a distanza di 10-15 min nei casi più urgenti; distanziati da più ore nei casi meni gravi [Baron et al, CID 2013]

Nel caso di sospetta sepsi e di febbre di origine sconosciuta, i prelievi vanno eseguiti da siti separati. * 1 set emocolturale è formato da: 1 flacone per aerobi + 1 flacone per anaerobi

Wei

nst

ein

et a

l, JC

M 2

01

1

Ripetizione del prelievo

Non ci sono indicazioni per il prelievo nei giorni successivi per il follow-up, perché quest’ultimo si basa sui dati clinici.

Esistono, tuttavia, due eccezioni:

l’endocardite (la persistenza dell’infezione può richiedere una modifica della terapia);

le sepsi da S. aureus, in cui il prelievo dopo 2 e 4 giorni può fornire utili indicazioni di complicanze infettive insorte per via ematogena (es. endocardite od osteomielite) o per estensione dell’infezione in altre sedi (metastatizzazione: tromboflebite settica, ascessi).

Volume di campione

Il volume di sangue utilizzato per la coltura è l’elemento più critico nella diagnosi di BSI.

Numerosi studi condotti sia sulla popolazione adulta che pediatrica hanno infatti dimostrato che la frequenza di isolamento emocolturale aumenta all’aumentare del volume di sangue utilizzato:

correlazione diretta fra volume di sangue e positività, con un aumento della sensibilità diagnostica pari al 3% per ml di sangue inoculato.

importante per i pazienti pediatrici, nei quali non è sempre possibile prelevare quantità sufficienti;

In corso di batteriemia nell’adulto si riscontrano circa 103 CFU/litro. Si raccomanda pertanto il prelievo di 20-30 ml di sangue per la semina di un set di flaconi (10-15 ml per ciascuno dei 2 flaconi seminati: aerobi + anaerobi).

Nei neonati e nei bambini, la carica microbica è di solito maggiore rispetto agli adulti. Pertanto, si raccomandano volumi % minori:

3-5 ml (2-12 anni)

2-3 ml (1 mese-2 anni)

1-2 ml (neonati)

E’ necessario mantenere un adeguato fattore di diluizione sangue/brodo per proteggere i microrganismi dal potere battericida del siero (Complemento, lisozima, fagociti):

1/10 (vol/vol)

1/5, soddisfacente in pazienti non sottoposti ad antibiotico-terapia.

E' necessario il rigoroso rispetto delle norme di asepsi durante il prelievo: emocolture falsamente positive comportano interpretazioni diagnostiche erronee, con conseguenti terapie inutili.Prima di procedere con manovre per l’esecuzione del prelievo è opportuno predisporre il materiale occorrente verificando l’integrità delle confezioni e le relative date di scadenza.

1. lavare le mani (lavaggio sociale) prima e dopo il prelievo2. indossare guanti e mascherina3. ricercare il sito di prelievo mediante palpazione4. applicare il laccio lontano dal punto di inserzione dell’ago cannula5. indossare i guanti sterili 6. disinfettare la cute con soluzione alcolica di clorexidina gluconata

0,5%, quindi con iodoforo (Iodiopovidone 10%), applicando con movimento circolare verso l’esterno

7. l'azione del disinfettante è tempo-dipendente: MAI PUNGERE PRIMA DI 1 MINUTO (ossia a cute asciutta, a seguito di evaporazione del disinfettante)

8. dopo la disinfezione, evitare di ripalpare il sito di prelievo.

Come effettuare il prelievo

9. eseguire la venipuntura (l’accesso alla vena deve essere distale rispetto al punto definitivo)

10. fermare l’ago cannulla o il butterfly con cerotto, raccordarlo in asespi con un raccordo a due vie con camicia per prelievo vacutainer, rimuovere il tappo metallico dal flacone anaerobio dell’emocoltura e inserirlo all’interno della camicia.

11. verificare l’aspirazione del sangue all’interno del flacone per emocoltura e prelevare 10 ml

12. rimuovere prontamente il flacone dall’apposito contenitore di plastica

13. collegare al set di prelievo il flacone aerobio14. prelevare 10 ml di sangue15. rimuovere il secondo flacone dal connettore di prelievo16. estrarre l’ago dalla vena

Come effettuare il prelievo

Inoculare il campione di sangue nei flaconi per l’indagine emocolturaledirettamente al letto del paziente.

1. Togliere il tappo dal flacone e assicurarsi che il flacone non sia incrinato, contaminato o torbido. Controllare anche che i tappi non siano rigonfi o incavati. NON USARE il flacone se viene notato qualsiasi difetto.

2. Prima di inoculare la vial, disinfettare il diaframma con alcol (NON si raccomanda lo iodio).

3. Iniettare in modo sterile, o prelevare direttamente 8 – 10 ml per flacone

4. Eliminare il set di prelievo negli adeguati contenitori per rifiuti sanitari a rischio infettivo (es. aghi in contenitori rigidi).

5. Non cambiare tappo ago e ago stesso prima di inoculare le bottiglie.

Applicare su ogni flacone il barcode del nosologico del paziente verticalmente e senza coprire il codice a barre del flacone.

Indicare su ogni flacone la tipologia di prelievo (sangue da vena periferica o sangue da catetere) e l’ora del prelievo.

Non scrivere assolutamente e non attaccare cerotti, etichette o altri adesivi nella zona del flacone occupata dal codice a barre.

Prelievo “in sicurezza” del campione: ilsistema VACUTAINER

BACTEC 9000/F

Soluzione chiave per la sicurezza dell’operatore:

Compatibilità con sistema VACUTAINER

BACTEC è l’UNICO

compatibile con il

VACUTAINER

Safety-Lok Blood

Collection Set

Le provette BD Vacutainer® - pre-etichettate, dotate di vuoto precalibrato e sterili internamente - sono compatibili con la linea di prodotti per l’Accesso Venoso (aghi e set da prelievo, adattatori luer, ecc.).

La chiusura di sicurezza BD Hemogard™ riduce drasticamente l’esposizione al rischio biologico sia nel momento del prelievo, sia durante il trattamento dei campioni ematici, consentendo agli Operatori Sanitari di operare nella massima sicurezza.

Numerosi studi hanno dimostrato la criticità del tempo che intercorre tra il prelievo del campione e l’incubazione dei flaconi.

Idealmente, i flaconi inoculati devono essere inviati immediatamente al laboratorio – e comunque entro le 2 h dal prelievo - al fine di minimizzare il rischio di falsi negativi dovuti alla diminuzione della carica microbica.

Si registra una significativa riduzione nella sensibilità diagnostica dell’emocoltura quando i flaconi: vengono lasciati a RT per più di 12 h

vengono pre-incubati a 37°C prima dell’arrivo in laboratorio (Sautter et al, JCM 2006).

Il campione deve essere trasportato a temperatura ambiente. Non refrigerare il campione (incompatibile con la tipologia del campione, presenza di microrganismi termosensibili).

Il trasporto deve avvenire «in sicurezza» per l’operatore, utilizzando un contenitore rigido per evitare rotture, perdite accidentali o stillicidio.

Trasporto del campione

Criteri di «non conformità» del campione

Flacone senza adeguata etichettatura

Flacone rotto, non a tenuta o con contaminazione manifesta

Flacone ricevuto a distanza (oltre le 24 h) dal prelievo

Campioni in contenitori non adeguati alla raccolta e/o trasporto

Fase analitica

L’indagine emocolturale viene attualmente effettuata mediante sistemi automatizzati dotati di un sistema integrato di moduli che consentono l’incubazione, il monitoraggio continuo del campione e la rilevazione di crescita microbica.

La crescita microbica viene rivelata mediante l’analisi del rilascio di CO2, prodotta da metabolismo microbico, attraverso varie tecniche:

sensori fluorescenti (Bactec 9240; Becton Dickinson)

sensori colorimetrici (BacT/Alert; bioMerieux, France)

misurando le variazioni di pressione nel flacone a seguito di consumo e/o produzionedi gas (VersaTREK; TREK Diagnostic Systems).

Tra i sistemi automatizzati, Bactec e BacT/Alert sonosicuramente quelli più comunemente utilizzati.

Sistema BD BACTEC: funzionamento

I flaconi, precedentemente inoculati con il campione, vengono inseriti nello strumento per l’incubazione e la periodica lettura.

I campioni sono mantenuti in agitazione da un sistema meccanico di inclinazione (da orizzontale a 20°). Ogni rack effettua 30 movimenti completi al minuto.

La lettura in continuo, per la quale ogni flacone risulta letto ogni 10 minuti, è legata ad un sofisticato meccanismo su base ottica che sfrutta la produzione di CO2 del metabolismo batterico.

Ogni flacone contiene infatti un sensore chimico, posto sul fondo del flacone all’interno di una matrice protettiva, contenente composti fluorescenti che reagiscono in presenza di CO2 prodotta dal microrganismo.

L’aumento della fluorescenza del sensore sarà direttamente proporzionale all’aumento di CO2 presente.

Con un diodo ad emissione luminosa, un rivelatore di fotodiodi e filtri adeguati, il sistema misura la fluorescenza proveniente dal sensore fluorimetrico.

Contenuto. Ciascun flacone contiene i seguenti reagenti: acqua purificata terreno di coltura liquido arricchito (brodo di estratto di caseina di soia; oppure: estratto lievito,

estratto di tessuto animale, Brucella broth) fattori di crescita (carboidrati, emina, menadione, vitamina B6) anticoagulante (SPS, Sodio polianetol sulfonato 0.035%) composto che lisa leucociti (rilascio intracellulari; limita potere battericida sierico) resina (Antibiotic Removal Device, ARD): cationiche e non, assorbono e neutralizzano gli antibiotici

eventualmente presenti se il paziente è in antibiotico-terapia).

Tutti i flaconi sono addizionati di CO2, per favorire la crescita microbica.I flaconi per anaerobi sono pre-ridotti ed addizionati con CO2 e N2.

Sistema BD BACTEC: i flaconi

Tipologie: Aerobi (esigenti e non) Anaerobi (esigenti e non) Miceti Micobatteri

Ciascun flacone di ogni set (flacone aerobi + flacone anaerobi) deve essere seminato con circa: 10 ml di sangue, per i flaconi non pediatrici 0.1-3 ml di sangue, per i flaconi pediatrici

Nel caso di volume prelevato insufficiente per entrambe le vials, viene seminata la vial per aerobi, poichè questi microrganismi sonomaggiormente prevalenti nella eziologia delle BSI.

Tempi di positivizzazione del campione

I campioni vengono incubati, nei sistemi automatizzati, per un periodo di 5 giorni, sebbeneil tempo medio di positivizzazione di un campione contenente microrganismi a crescita rapida è di circa 20 h.

In casi particolari ed in base alle informazioni fornite con il modulo di richiesta, il tempo d’osservazione può essere protratto (fino a 10-14 giorni) qualora si sospetti la presenza di microrganismi «esigenti» e/o a lenta crescita:

bacilli Gram- (Bartonella spp., Brucella spp., Borrelia spp., Legionella spp., Francisella spp., Bordetella holmesii, Campylobacter spp.)

cocchi Gram+ (Abiotrophia spp., Granulicatella spp.)

bacilli Gram+ (Bacillus hackensackii)

Altri (Mycoplasma spp., Mycobacterium spp., diversi llieviti, Nocardia spp.)

Gruppo «HACEK», frequente causa di endocardite. Crescono generalmente entro cinque 5 gg di incubazione; tuttavia, in presenza di un forte sospetto di endocardite, è necessario prolungare l’incubazione (10-12 gg):

H Haemophilus spp

A Actinobacillus actinomycetemcomitans

C Cardiobacterium hominis

E Eikenella corrodens

K Kingella kingaeil sospetto per microrganismi a lenta crescita deve essere obbligatoriamente segnalato sul modulo di richiesta

Fase analitica: gestione dei campioni positivi

Se il campione è positivo:

si prelevano 10 ml del terreno, si centrifugano e sul sedimento si effettua:

1. esame microscopico: valutazione morfologia (cocchi, bacilli) e caratteristiche tintoriali (Gram,

arancio di acridina, blu di metilene)

2. Antibiogramma «diretto»*: Kirby-Bauer effettuato «direttamente» dal flacone (valutazione

preliminare)

3. identificazione preliminare*: mediante tests fenotipici rapidi

4. subcoltura in terreni selettivi e differenziali: agar cioccolato (anaerobiosi), Agar cioccolato (CO2),

MacConkey, Agar sangue, MSA, Agar Sabouraud

5. identificazione definitiva

6. antibiogramma definitivo

* Le valutazioni preliminari (ID e antibiogramma) vengono tempestivamente comunicate al Clinico,

secondo modalità che consentano la tracciabilità degli eventi ed in conformità alla norma UNI EN

ISO 9001, al fine di avviare una terapia antibiotica in tempi rapidi.

Refertazione - TAT

Day 0: prelievo campione

Day 1: positivizzazione del campione

semina flaconi positivi e preparazione antibiogramma diretto

comunicazione esito osservazione microscopica

Day 2:

comunicazione antibiogramma diretto

allestimento ID e antibiogramma definitivi

Day 3:

• refertazione finale (ID + antibiogramma): deve indicare chiaramente eventuali dati discordanti con i risultati preliminari, specificando che i dati finali rappresentano il dato corretto.

Tempi più lunghi saranno necessari in presenza di microrganismi a lenta crescita

Interpretazione dell’indagine emocolturale

• Una emocoltura positiva ha valore prognostico: indica una diagnosi eziologica definitiva,

consentendo l’inizio di una terapia antibiotica mirata verso il microrganismo isolato.

• Tuttavia, risultati falsi-positivi possono limitare l’utilità diagnostica dell’indagine.

• In presenza di una emocoltura positiva, è necessario stabilire se l’isolato sia suggestivo per

una infezione clinicamente significativa, quindi associata ad un elevato rischio di mortalità e

morbidità, oppure si tratti di un contaminante senza alcuna rilevanza eziologica.

probabile PATOGENO (VERO positivo)

probabile CONTAMINANTE (FALSO positivo)

Interpretazione dell’indagine emocolturaleContaminazione

Prevalenza

Prevalenza media pari al 2-3%, (range: 0.6% - 6%).

Prevalenza recentemente aumentata a causa di:

progresso tecnologico: la maggiore sensibilità analitica consente di rilevare anche concentrazioni esigue del microrganismo;

aumentato utilizzo di dispositivi per accesso vascolare (CVC, catetere venoso centrale)

cambiamento delle modalità di venipuntura, al fine di minimizzare il rischio biologicoassociato a puntura da ago.

Impatto finanziario

Risultati falsi-positivi (vs veri-negativi) sono associati ad un maggiore costo laboratoristico

(+20%) e terapeutico (+39%). [Bates et al., JAMA 1991]

Falsi-positivi da CoNS: 50% dei casi trattati con antibiotici, causando un costo aggiuntivo

pari a circa 1.000 $/paziente. [Souvenir et al., J Clin Microbiol 1998]

Cause:

La contaminazione può avvenire al momento:

del prelievo, per batteri presenti sulla cute del paziente o di chi esegue il prelievo;

del prelievo, per batteri transitoriamente in circolo ma non responsabili della sepsi.

dell’inoculo del campione, a causa di batteri che si trovano sulla membrana di protezione del flacone.

Conseguenze:

difficoltà interpretative del risultato

terapia antibiotica inutile

impossibilità di continuare l’iter diagnostico emocolturale

Tuttavia, microrganismi classicamente considerati «contaminanti» (Bacillus spp, Corynebacterium spp, Propionibacterium spp, CoNS, Aerococcus spp, Micrococcus spp) possono, in particolari situazioni, avere un ruolo eziologico.

Interpretazione dell’indagine emocolturaleContaminazione

Come poter limitare il problema delle contaminazioninell’indagine emocolturale ?

(Hall et al, Clin Microbiol Rev 2003)

Individuazione dei contaminantiIdentità del microrganismo

L’indicatore più importante di una avvenuta contaminazione è la identità del microrganismo

Evidenze analitiche suggestive per una contaminazione:

crescita di Bacillus spp, Corynebacterium spp, Propionibacterium acnes, CoNS in solo 1 dei set emocolturali*.

crescita di più microrganismi in solo 1 dei set emocolturali*.

Differente eziologia tra isolamento al sito primario e quello da emocoltura.

* Ad ogni prelievo si semina un set emocolturale

Schifman et al, Arch Pathol Lab Med 1998; b Weinstein et al, J Clin Microbiol 2003

Individuazione dei contaminantiIdentità del microrganismo: CoNS e polimicrobismo

Tuttavia, è importante ricordare che ciascuno di questi microrganismi potrebbe, in particolaricondizioni, causare una vera batteriemia. Il mancato riconoscimento del loro ruolo eziologicoporterebbe ad una mancata terapia e, quindi, a conseguenze devastanti.

Gli stafilococchi coagulasi-negativi (CoNS) rappresentano i contaminanti più prevalenti nell’indagine emocolturale (70-80%).

Tuttavia, recentemente è stato scoperto un loro ruolo nelle batteriemie in pazienti con dispositivi protesici e CVC:

sebbene soltanto il 12.4% dei CoNS sia clinicamente rilevante, essi rappresentano la terzacausa di batteriemia a causa della loro alta prevalenza. [Weinstein et al., Clin Infect Dis 1997]

Generalmente, le BSI sono causate da un unico microrganismo, portando al convincimento chel’evidenza di una crescita polimicrobica sia sempre suggestive per una contaminazione.

Tuttavia, diversi studi hanno evidenziato che dal 6 al 21% delle batteriemie vere sono ad eziologia polimicrobica, generalmente in pazienti ad alto rischio.

La proporzione delle colture positive in una serie di prelievi è importante per unacorretta interpretazione di una indagine emocolturale:

soltanto la positività di tutti i sets analizzati per uno stesso microrganismo è suggestiva di una batteriemia reale.

la presenza di una positività parziale potrebbe, tuttavia, indicare una batteriemia transitoria.

Per differenziare una batteriemia transitoria da una contaminazione è necessarioanalizzare almeno 2 sets di emocolture allo stesso tempo.

Ottenere 2 sets per l’indagine emocolturalerisulta difficoltoso nei pazienti pediatrici. [Shifman et al, Arch Pathol Lab Med, 1996]

Individuazione dei contaminantiNumero di set emocolturali positivi

Individuazione dei contaminantiTime to Growth (Time to Positivity, TTP)

Un altro parametro importante da considerare nel rilevare una contaminazione è il tempo necessario affinchè la crescita del microrganismo possa essere rilevata in coltura.

Principio:

nella batteriemia, la carica batterica sarà maggiore rispetto a quella associata ad una contaminazione;

la detettabilità di un microrganismo sarà funzione diretta della sua concentrazione: tanto maggiore sarà la carica del microrganismo, tanto minore sarà il tempo necessario a rilevarne la crescita.

Diversi studi hanno indicato che la positivizzazione di una emocoltura a distanza di 3-5 giorni dall’inizio della incubazione è fortemente suggestiva per una contaminazione.

un valore di TTP ≤ 15 h è associato ad un VPP = 84% per infezioni vere nei pazienti in giovane età [Haimi-Cohen et al, Paediatr Infect Dis 2003].

Tuttavia, esistono in lettaratura dati contrastanti al riguardo della sensibilità di questo parametro nel differenziare una infezione vera da una contaminazione [Weinstein, J Clin Microbiol 2003;

Weinstein, J Clin Microbiol 2011].

Refertazione di probabile contaminazione

Weinstein et al, JCM 2011

Interpretazione dell’indagine emocolturaleProbabile patogeno

Evidenze analitiche suggestive per una reale BSI:

Crescita di uno stesso microrganismo in colture ripetute ottenute a tempi e/o siti

differenti.

Rilevanza eziologica dell’isolato: Enterococchi (sospetta endocardite), bacilli Gram-

(sepsi clinica da Gram-).

Crescita di microrganismi di origine intestinale od urinaria: Enterobacteriaceae, SPN,

anaerobi Gram-, S. pyogenes.

Isolamento di flora microbica commensale da pazienti con sospetta batteriemia

(immunosoppressi).

probabile PATOGENO (VERO positivo)

probabile CONTAMINANTE (FALSO positivo)

Interpretazione dell’indagine emocolturaleRisultati falsi-negativi

I principali fattori responsabili per risultati falsi negativi all’indagine emocolturalesono:

errato timing del prelievo (rispetto al rialzo termico)

insufficiente volume di sangue esaminato

errato numero di prelievi

tempo tra prelievo del campione e sua incubazione

prelievo eseguito in corso di terapia antibiotica

microrganismi esigenti, a lenta crescita o non coltivabili*

* Microrganismi non coltivabili sono Rickettsia spp., Coxiella burnetii, Chlamydophila pneumoniae e Tropherymawhipplei la cui diagnosi si basa su tecniche molecolari o immunologiche. Questo aspetto rende conto delle negatività emocolturali in presenza di endocardite infettiva (2.5 – 31%), spessocausata da questa tipologia di microrganismi.

Ruolo del Laboratorio di Microbiologia Clinica nel management della sepsi

Le principali raccomandazioni per la corretta gestione della sepsi severa e dello shock

settico prevedono (36):

rapida somministrazione di una terapia empirica ad ampio spettro entro 1 h dalla

diagnosi;

prelievo di sangue per emocoltura e, se possibile, indagine colturale dei siti corporei

“microbiologicamente rilevanti” prima dell’inizio della terapia antibiotica;

tempestiva rianimazione del paziente entro le prime 6 h;

valutazione clinica e radiologica del paziente per definire la potenziale fonte di infezione

primaria.

E’ necessario ridurre il TAT, attraverso una diagnosi RAPIDA

Diagnosi rapida di sepsi

Diagnosi rapida di sepsiRuolo del Laboratorio di Microbiologia

Nella fase acuta, il ruolo del Laboratorio di Microbiologia Clinica è generalmente marginale, dal momento che il Clinico è consapevole che saranno necessarie almeno 24 - 72 h per la conferma di una eziologia infettiva, identificazione del patogeno e valutazione della antibiotico-sensibilità.

Tempo medio di ricezione dell’antibiogramma da parte del Clinico = 40 h [Kerremans et al., JAC 2008].

Il ruolo dell’indagine emocolturale è cruciale per la definizione di una adeguata terapia antibiotica. Tuttavia, differenti fattori (terapia antibiotica in atto, microrganismi esigenti, campione non conforme) potrebbero avere un impatto negativo sulla performance diagnostica, anche in presenza di un forte sospetto per BSI.

Pertanto, ad integrazione dell’indagine emocolturale, per la ricerca rapida di batteri e funghi si può ricorrere ad approcci “rapidi” che non richiedano l’esame colturale:

nucleic acid-based techniques

nucleic acid –not based techniques Con queste metodiche è possibile ottenere ID + AST nell’arco della giornata lavorativa,

consentendo eventualmente di modificare, in tempi clinicalmente utili, lo schema della antibiotico-terapia empirica.

La appropriatezza della terapia antibiotica iniziale riducesignificativamente il tasso di mortalità

Rello et al. Am J Respir Crit Care Med 1997;156:196–200;

Kollef et al. Chest 1998;113:412–420

Ibrahim et al. Chest 2000;118:146–155; Luna et al. Chest 1997;111:676–685

Dr. Graeme Forrest. Infectious Diseases.

University of Maryland Medical Center

ICAAC 2006, San Francisco, CA

“If you were septic, would you wait 48-72 hours to know if you are receiving appropriate or unnecessary antibiotic therapy?”

Rapid diagnosis

Rapid diagnosis

Nucleic acid-based diagnostic technologies (NATs)

I saggi NAT-based applicati alla sepsi possono essere divisi in due gruppi principali:

NATs per la ricerca e la identificazione di patogeni nei flaconi emocolturali; riducono il TAT di 1 gg.

NATs per la ricerca ed identificazione di patogeni direttamente nel campione(sangue, siero, plasma). Riducono il TAT di 2-4 gg.

Questi saggi sono utili qualora si sospetti la presenza di microrganismi a lentacrescita, come nel caso di endocardite infettiva con emocoltura negativa(rickettsiosi, febbre Q, bartonellosi, brucellosi, Whipple’s disease).

In riferimento alla metodica impiegata, i NATs si dividono in:

amplified (PCR-based): SeptiFast

not amplified (hybridization-based): PNA-FISH

Mancini et al., The Era of Molecular and Other Non-Culture-Based Methods in Diagnosis of Sepsis. CMR; 23(1), 2010.

NATs: principali sistemi in commercio

Amplified NATs

Sono state descritte 3 tipologie di strategie:

Pathogen-specific assays per ricerca di geni specie- o genere-specifici. La principalelimitazione risiede nella elevata variabilità della eziologia delle BSI. Utile nel caso in cui siapossible stabilire determinanti genici di antibiotico-resistenza (es. mecA neglistafilococchi; geni van negli enterococchi) con riduzione del TAT di 12-16 h vs saggifenotipici. Da definire il rapporto costo/efficacia e l’impatto clinico di questa riduzione del TAT.

Broad-range assays per ricerca di sequenze conservate nel genoma batterico (16S, 5S, 23S rRNA) o fungino (18S, 5.8S, 28S rDNA). Il principale limite consiste nella necessità di dover “leggere” il prodotto amplificato (sequencing, analisi polimorfismi, RT-PCR). Utile in caso di emocolture persistentemente negative in presenza di forte sospetto clinico di BSI o endocardite infettiva. Rischio di falsi-positivi per DNA batterico/fungino ambientalecontaminante il kit estrazione acidi nucleici od i flaconi emocolturali.

Multiplex assays in grado di ricercare simultaneamente targets specie- o genere-specifici di diversi patogeni coinvolti in un determinato tipo di infezione. Differentisoluzioni tecniche: multiplex PCR + analisi pattern elettroforetico, ibridazione su ELISA assay, multiplex real-time PCR.

Amplified NATs: LightCycler SeptiFast® (Roche)

Rappresenta l’unico sistema in grado di rivelare la presenza di batteri e funghi in un campione di sangue intero mediante strategia «multiplex RT-PCR».

E’ in grado di evidenziare la maggior parte (>90%) dei microrganismicausa di sepsi.

Gram (-) Escherichia coli Klebsiella (pneumoniae/oxytoca) Serratia marcescens Enterobacter (cloacae/aerogenes) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Stenotrophomonas maltophilia

Gram (+) Staphylococcus aureus CoNS (Coagulase negative Staphylococci) Streptococcus pneumoniae Streptococcus spp. Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

Funghi Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida krusei Candida glabrata Aspergillus fumigatus

LightCycler SeptiFast® (Roche): caratteristiche

Campione richiesto: 1.5 mL di sangue K-EDTA

Amplificazione del DNA di batteri e funghi mediante PCR Real-time multiplex: Impiego di sonde marcate con 4 diversi fluorofori Identificazione di specie tramite Melting amplified-DNA Analysis (% Dna ds vs temperatura) Prevista eliminazione di amplificati contaminanti

Software dedicato SIS (SeptiFast Identification Software) per interpretazione dei risultati di amplificazione e di analisi dei profili di melting.

Rapidità: risultati disponibili in < 5 h

Il risultato è indipendente dalla capacità di crescita del microrganismo e dalla presenza di antibiotici nel campione di sangue (rileva la presenza di DNA).Alta sensibilità (3-30 CFU/ml), anche in presenza di funghi e di infezioni “miste” (batteri+fungi).

Ridotto TAT: 6 h, circa.

Costi elevati: €150 - €200 per saggio.

Non sostituisce l’esame emocolturale !Non consente l’esecuzione dell’antibiogramma……. tuttavia, per i campioni positivi per S. aureus è possibile determinare la presenza del gene mecA responsabile della resistenza alla meticillina (Methicillin-Resistant S. aureus, MRSA).

Not-amplified NATs

Altre metodiche molecolari possono essere utilizzate per la ricerca del target molecolare nei flaconi che si sono positivizzati all’esame colturale.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) con sonde oligonucleotidiche per la ricerca di geni(tipicamente geni rRNA) batterici o fungini.

Una evoluzione dei classici oligo-probes sono le sonde “peptide nucleic acid” (PNA), costituite da oligomeri sintetici che mimano la struttura del DNA o RNA.

PNA (Peptide Nucleic Acid)

PNA probes: oligos che mimano il DNA in cui lo scheletro

carboidrato-fosfato carico negativamente viene sostituito

da uno scheletro N-(2-aminoethyl)-glycine, di natura

«peptidica» e non carico.

A differenza dei probes a DNA, il PNA non incontrerà la

repulsione elettrostatica, in tal modo ibridizzando più

rapidamente e stabilmente con il target.

PNA probes ibridizzano con RNA ribosomale (rRNA).

PNA può essere marcato con un fluorocromo (PNA-FISH).

PNA-FISH probes sono meno sensibili all’inibizione da

impurità presenti nei differenti campioni clinici, rispetto

alle metodiche amplified NAT-based.

Analogamente alle convenzionali FISH probes, le PNA

probes sono generalmente disegnati per la ricerca di geni

rRNA naturalmente ridondanti, consentendo la ricerca di

microrganismi senza la necessità della fase di

amplificazione.

Not-amplified NATsPNA-FISH AdvanDx® (AdvanDx)

Impiega sonde PNA marcate con fluorocromi per la ricerca di geni rRNA di un limitato numero di batteri (S. aureus o CoNS, Enterococcus faecalis o altri enterococchi selezionati, E. coli, P. aeruginosa) e geni rDNA of Candida spp (Candida albicans/C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata/C. krusei).

La sensibilità e la specificità è molto alta, con valori medi vicini al 99% e 100%, rispettivamente.

PNA-FISH AdvanDx® (AdvanDx): metodica

1) Fix 2) Hybridize 3) Wash & Mount 4) Examine

1 drop Fixation Solution1 drop + Blood Culture

Fix cells by heat, flame OR methanol fixation

1 drop of PNA Probe* and a coverslip

Immerse in Ethanol for 5 min. Hybridize at 55 OC for 90 min.

Prepare and pre-heat Wash Solution to 55 OC

Immerse in Wash Solution and remove coverslip

Wash at 55 OC for 30 min.

1 drop of Mounting Medium and a coverslip

Examine using Fluorescence Microscope with 60x or 100x oil objective

Turn Around Time = 3 h

Hands-On Time = 10 min

PNA-FISH AdvanDx® (AdvanDx)

PNA-FISH AdvanDx® (AdvanDx)

A seguito di positività, il campione viene sottoposto a colorazione Gram per valutare quale PNA FISH test utilizzare.

TAT: Diagnosi «classica» vs PNA-FISH

Day 0 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4

Phlebotomy

Phlebotomy

Positive Blood Culture

Gram Stain

Traditional Species ID

Antibiotic Susceptibility

Positive Blood Culture

RapidSpecies ID

Empiric Rx Broad-spectrum Rx Targeted Rx

Empiric Rx Targeted Rx

Traditional Dx

PNA FISH

Traditional Species ID

Antibiotic Susceptibility

Call to physician

Call to physician

Non NAT-based assays

Le metodiche non-NAT-based utilizzate per la identificazione diretta dei microrganismi nel sistema emocolturale comprendono:

saggi convenzionali immunologici e biochimici. La variabilità antigenica e biochimica, cosìcome la presenza di più di una specie microbica (infezioni polimicrobiche), potrebberendere difficile l’interpretazione del risultato, richiedendo l’isolamento del(i) microrganismo(i) dal flacone emocolturale.

saggi fenotipici e saggi più recenti basati sull’utilizzo di batteriofagi al fine di migliorare la performance diagnostica del classico saggio di placca. In fase di validazione il MicroPhageMRSA/MSSA blood culture test (Longmont), per la identificazione di S. aureus e la ricerca di meticillino-resistenza (TAT: 5 h).

tecniche di analisi proteomica, come il Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS). Questa tecnica è in grado di identificarebatteri e funghi determinandone il profilo proteomico. E’ stata inoltre utilizzata per identificare fattori di virulenza batterici o markers di antibiotico-resistenza. Il principalevantaggio consiste nell’ottenimento dei risultati in tempi brevissimi, nell’ordine di pochiminuti.

Non NAT-based assaysMALDI-TOF

La spettrometria di massa (MS) è una tecnica analitica per la determinazione della composizione elementare di un campione. Il principio della MS consiste nello ionizzare composti chimici per generare molecole cariche e misurare il loro rapporto massa-carica. Tali "carte di identità" molecolari possono essere utilizzate per una rapida identificazione batterica (ID) da colonie isolate.

La tecnologia MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight) esamina gruppi di proteine rilevate direttamente in batteri intatti. Il campione da analizzare viene miscelato con un altro composto, chiamato matrice.

La miscela viene applicata sulla piastrina e ionizzata in seguito ad irradiazione con un laser. La matrice assorbe la luce laser e vaporizza insieme al campione acquisendo una carica elettrica (ionizzazione). Uno o più campi elettrici proiettano gli ioni nel tubo di volo dello spettrometro di massa, gli ioni vengono separati in base al loro rapporto massa-carica (m/z), ed infine viene misurata la quantità di ogni ione. Il rilevamento viene effettuato alla fine del tubo di volo.

Non NAT-based assaysMALDI-TOF

Non NAT-based assaysMALDI-TOF- applicazioni in microbiologia

IDENTIFICAZIONE MICROBICA

Il materiale necessario alla indagine in MALDI-TOF può essere: i) crescita su agar sangue a seguitodi 2-3 h di incubazione del campione di sangue da vial positiva; ii) campione di sangue positivo in vial, previa purificazione da proteine umane, terreno e sangue (1 h, circa).

Identificazione ottenuta in 4-5 min, causando una riduzione del TAT di almeno 1 giorno.

Accurato nella ID di Enterobacteriaceae, gran parte dei non-fermentanti, stafilococchi, enterococchi, streptococchi beta-emolitici, anaerobi (soprattutto Actinomyces spp.).

Difficile ID di alcuni batteri e gran parte dei lieviti, causa scarsa qualità dello spettro ottenuto e dei databases disponibili.

ANTIBIOTICO-RESISTENZA

Ricerca di determinanti genici responsabili di antibiotico-resistenza: mecA, meticilllino-resistenza;

vanA e vanB, vancomicina-resistenza;

blaKPC, resistsenza vs carbapenemi

TIPIZZAZIONE MICROBICA

Tipizzazione per il controllo delle infezioni (outbreaks epidemici)

Ricerca di fattori di virulenza

Non NAT-based assaysMALDI-TOF: performance

Alatoom AA, et al: Comparison of direct colony method versus

extraction method for identification of gram-positive cocci by use of

Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of

flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2011 Aug;49(8):2868-2873

Non NAT-based assaysMALDI-TOF: pros & cons

VANTAGGI

Costi contenuti

Ridotto TAT (identificazione in alcuni min vs h per tecniche classiche)

Automatizzata, ripoducibilità inter-laboratorio

Elevata sensibilità: necessaria 1 CFU

Ridotto rischio biologico (inattivazione del campione)

Versatile (batteri, inclusi anaerobi; funghi)

Flessibile: sistema aperto, personalizzabile

LIMITAZIONI

Non fornisce AST

Non adatto per esame diretto da campione (tranne urine): richiesto isolamento

Ripetibilità (estrazione)

Cut-off variabile

Sporulazione, «esigenti», terreni, timing

Perdita finanziaria relativa alla strumentazione esistente

Database: tassonomia, sicurezza, flessibilità

Biomarkers non molecolari di sepsi

Le limitazioni dell’indagine emocolturale hanno stimolatol’interesse verso lo sviluppo di tests rapidi e sensibili per la ricerca di biomarkers, seppur non specifici, di sepsi.

Galattomannano (GM)

1-3-beta-D-Glucano (BG)

Citochine, Interleuchine

Proteina C-reattiva (PCR)

Procalcitonina (PCT)

TREM-1

Biomarkers non molecolari di sepsi: Antigeni fungini

Galattomannano (GM): componente parietale di Aspergillus spp.

ELISA assay per diagnosi di aspergillosi invasiva. Un test positivo in 2 campioni sequenzialiè considerato essere un valido indice per diagnosi di aspergillosi invasiva.

Di semplice esecuzione, la ricerca di GM nel siero può dare risultati falsi-positivi(assunzione di particolari cibi, soprattutto se la barriera intestinale è alterata; graft-versus-host disease gastrointestinale; lipoglicani associati a Bifidobacterium spp.; soluzionicontenenti gluconato sodico; terapia con beta-lattamici semi-sintetici, soprattuttopiperacillina-tazobactam).

Sebbene considerato specifico per Aspergillus spp., è stata osservata cross-reattività con altre specie fungine (Blastomyces dermatitidis, Penicillium spp., Fusarium spp.).

L’impatto clinico, in continuo aumento, delle infezioni invasive non causate da Aspergillusrichiede cautela nell’interpretazione di un risultato positivo, soprattutto quando non possa essere esclusa la presenza di una infezione sostenuta da specie crossreattive.

Sensibilità (70%, o minore nel caso di pz trapiantati) e specificità non sempre ottimali.

Biomarkers non molecolari di sepsi: Antigeni fungini

1-3-beta-D-Glucano (BG): componente di parete cellulare presente in numerose specie fungine, compresa Candida spp.

Analogamente a GM, diversi studi riferiscono di sensibilità variabile (70% circa).

In gran parte dei pazienti con infezione invasiva fungina confermata, i livelli di BG rimangono elevati per diversi giorni prima della diagnosi clinica. Possibile impiego per rapido orientamento della terapia empirica nel paziente neutropenico.

L’utilizzo combinato di GM e BG potrebbe aumentare la specificità ed il valore positivopredittivo di ciascun test (identificazione di falsi-positivi).

BG e GM non sono in grado di rilevare la presenza di Zigomiceti (Mucorales spp, Entomophtorales spp), causa infrequente seppur emergente di micosi fungine invasive.

Biomarkers non molecolari di sepsi: Citochine

I monociti/macrofagi ed i neutrofili intervengono nella risposta immune innata diretta nei confronti delle infezioni batteriche stimolando la sintesi di citochine pro-infiammatorie che, se prodotte in eccesso, contribuiscono alla disfunzione d’organo ed alla comparsa di sepsi.

Il rilascio di citochine infiammatorie in risposta a patogeni e danno dell’ospite potrebbe causare una sepsi e, quindi, SIRS. Numerose citochine risultano essere aumentate nel siero di pazienti con sepsi: quelle appartenenti alla TNF-family, interleuchine, chemochine, recettori (proteine/antagonisti) citochinici.

Gentile et al., Methods, 2014

Biomarkers non molecolari di sepsi: Citochine

IL-6

Viene indotta da TNF-α e può essere misurata accuratamente nel sangue, avendo una lungaemivita.

IL-6, importante mediatore dello shock settico, ha un elevato valore predittivo per gravitàed outcome clinico del paziente settico.

Possibile “early marker”: misurazione rapida al letto del paziente; Cmax entro 2h.

Inoltre, IL-6 è un marker aspecifico di infezione. Alti livelli si rinvengono anche durante: faseacuta di risposta al danno, pancreatite acuta, trapianto renale in pazienti ad alto rischio per rigetto o graft failure (trapianto tessuto/organo).

Attualmente “research tool”, da un punto di vista clinico IL-6 potrebbe essere considerataquale precoce predittore di effetti a cascata, come disfunzione d’organo, a causa del suoruolo iniziale nella risposta citochinica.

L’interpretazione dei risultati risulta difficile, anche rispetto ai markers attualmenteutilizzati in clinica; inoltre, i Clinici non sentono il bisogno di un marker aggiuntivo.

Biomarkers non molecolari di sepsi: Proteina C reattiva (PCR)

Proteina della fase acuta sintetizzata prevalentemente negli epatociti e nei macrofagialveolari in risposta a varie citochine, IL-6 compresa.

PCR svolge inoltre un ruolo immunomodulante, regolando la cascata del Complemento e la opsonizzazione e fagocitosi batterica.

La cinetica della PCR sierica è caratterizzata da una rapida risposta all’infiammazione e da una breve emivita (19 h, circa).

Aspecifico. Aumentati livelli sono stati osservati nel paziente settico ma anche in numerosicondizioni non infettive: infarto post-miocardico, malattie reumatiche. La aspecificità di CRP non ci consente di considerarla quale principale marker di sepsi.

Biomarkers non molecolari di sepsi: Procalcitonina (PCT)

SINTESI E REGOLAZIONE CELLULARE

Pro-peptide della calcitonina, un ormone classicamente prodotto nelle paratiroidi e coinvolto nell’omeostasi del calcio.

La concentrazione sierica di PCT (< 0.05 ng/ml nei soggetti sani) aumenta nel corso di infezione per la sintesi in sedi extra-tiroidee (fegato), indotta da citochine indotte durante una infezione batterica.

Di contro, la sintesi di PCT viene ridotta dalle citochine prodotte in risposta ad una infezione virale (IFN-γ).

PCT è maggiormente specifica per le infezioni batteriche rispetto ad altri markers infiammatori (CRP). Consente, infatti, di differenziare una infezione batterica da una virale.


VALORE DIAGNOSTICO

Elevati livelli di PCT sono predittivi per un alto rischio di sepsibatterica e per la gravità dell’infezione.

PCT può differenziare i pazienti con sepsi da quelli con SIRS. Particolarmente utile nel risk assessment (FDA-approved), soprattutto nei pazienti pediatrici. Elevati e persistenti livelli di PCT sono stati associati ad un outcome sfavorevole in pz ICU.

PCT predice il rischio per infezione batteriemica (confermatada positività al colturale),1 sebbene non differenzi tra Gram+ e Gram-.2

1. Muller F, et al. Procalcitonin levels predict bacteremia in patients with community-acquired pneumonia: a prospective cohort trial. Chest 2010, 138(1):121-129.2. Kruger S, et al. Inflammatory parameters predict etiologic patterns but do not allow for individual prediction of etiology in patients with CAP: results from the German competence network CAPNETZ. Respir Res 2009, 10:65.


LIMITI CLINICI

Pur essendo considerata uno dei principali marker di sepsi, la utilità clinica della PCT rimanedibattuta. Numerosi studi evidenziano la incapacità di PCT nel differenziare la sepsi da SIRS non infettiva in pazienti adulti critici.

Specificità non ottimale. Elevati livelli di PCT anchein altri stati infiammatori non infettivi: shock cardiogeno, pancreatite necrotizzante, trauma, ustioni, post-operative, pancreatiti.


MONITORAGGIO LIVELLI

E’ importante monitorare la variazione nel tempo dei livelli di PCT.

Infatti, la riduzione nel tempo del livello iniziale di PCT è un indicatore predittivo di outcome assai più sensibile rispetto al solo valore iniziale.3,4

La mancata riduzione dei livelli durante il follow-up identifica pazienti refrattari alla terapia.

3. Charles PE, et al. Procalcitonin kinetics within the first days of sepsis: relationship with the appropriateness of antibiotic therapy and the outcome. Critical Care (London, England) 2009, 13(2):R38.4. Schuetz P, Maurer P, Punjabi V, et al. Procalcitonin decrease over 72 hours in US critical care units predicts fatal outcome in sepsis patients. Critical Care 2013;17:R115.


PCT & TERAPIA ANTIBIOTICA

Il profilo cinetico della PCT la rende un valido biomarker per la gestione della terapia antibiotica nel paziente settico:

aumento dopo 3 h dalla somministrazione di endotossina e picco intorno alle 14 h. Emivita: 24 h.

Bassi livelli di PCT possono guidare il Clinico nella interruzionedella terapia empirica nei pazienti inizialmente consideratisettici, ma che successivamente non mostravano segni di infezione. Di contro, la mancata riduzione dei livelli di PCT monitorati ogni 1-2 gg è fortemente suggestiva per la refrattarietà alla terapia.

In diversi studi clinici è stato osservato che nei pazienti con sepsi severa o shock settico l’applicazione di un algoritmodecisionale basato sulla diminuzione relativa di PCT plasmaticoconsente una significativa riduzione della durata della terapiaantibiotica e della degenza in ICU.

Tuttavia, i saggi per PCT non hanno raggiunto ancora unasufficiente sensibilità/specificità per orientare adeguatamentela terapia antibiotica.


La riduzione a valori <0.5 ng/mL o di almeno 80-90% rispetto al picco è indicativa della necessità di interromperela terapia antibiotica, se associata ancheal miglioramento del quadro clinico.5

La mancata riduzione dei livelli di PCT monitorati ogni 1-2 gg è fortementesuggestiva per la refrattarietà allaterapia.

5. Schuetz P, et al. Procalcitonin algorithms for antibiotic therapy decisions: a systematic review of randomized controlled trials and recommendations for clinical algorithms. Archives of Internal Medicine 2011, 171(15):1322-1331.


RAPPORTO COSTO/BENEFICIO

L’utilizzo di PCT nel management del paziente settico consente una significativa riduzione di:7,8

utilizzo di terapia antibiotica

durata della terapia antibiotica

ospedalizzazione (riduzione di 1,5 giorni di degenza)7

effetti collaterali

emergenza di batteri multi-resistenti

costi (terapia, degenza)

7. Nobre V, et al. Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatment duration in septic patients: a randomized trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2008,

177(5):498-505.

8. Heyland DK, et al. Procalcitonin for reduced antibiotic exposure in the critical care setting: a systematic review and an economic evaluation. Critical Care Medicine 2011, 39(7):1792-

1799.

Biomarkers non molecolari di sepsi: Markers aspecifici, non microbiologici

Biomarkers non molecolari di sepsi: Markers aspecifici, non microbiologici

TREM-1 (triggering receptor expressed on myeloid cells 1). I monociti/macrofagi ed ineutrofili intervengono nella risposta immune innata diretta verso le infezioni batterichestimolando la sintesi di citochine pro-infiammatorie (TNF-a, IL-1b) che, se prodotte in eccesso, contribuiscono alla disfunzione d’organo ed alla comparsa di sepsi.

TREM-1 appartiene alla superfamiglia di Ig e viene iperespressa in risposta alle infezionicausate da batteri o funghi. Quando si lega al ligando, TREM-1 stimola il rilascio di citochine.

Di contro, TREM-1 non viene iperespressa in malattie infiammatorie, quali quelle intestinali(morbo di Chron) e SIRS.

Una forma solubile di TREM-1 (sTREM-1) viene liberata dalle membrane dei fagociti attivatie può essere misurata nei liquidi biologici.

Diversi studi hanno dimostrato la maggiore sensibilità e specificità di TREM-1 rispetto a CRP e PCT. Tuttavia, poichè non è ancora stato definito il suo ruolo nella valutazione del risk assessment e nel definire la prognosi del paziente settico, esso rappresenta, ad oggi, un “research tool”.

Biomarkers non molecolari di sepsiInterpretazione “integrata”: bioscore

Considerata la rilevante complessità e variabilità della malattia, nessun biomarker può essere utilizzato singolarmente come marker per predire accuratamente (sensibilità, specificità) la prognosi nel paziente settico.

L’impiego combinato di più markers (“bioscore”) potrebbe rivelarsi maggiormente utile per una precoce diagnosi di sepsi, rispetto all’utilizzo dei singoli biomarkers.

Multiplex Analysis of Inflammatory Markers Using

Bio-Plex Pro™ Human Cytokine Assays

BATTERIEMIE CATETERE-RELATE (CVC-BSI)

Le batteriemie e le sepsi sono spesso associate alla presenza di catetere venoso

centrale (CVC).

In generale, l’infezione è inizialmente (I settimana) circoscritta alla superficie esterna

del catetere.

Successivamente, i microrganismi raggiungono il lume del catetere.

L’infezione CVC-relata, sia endoluminale che superficiale, si associa alla formazione

di biofilms microbici, intrinsecamente resistenti all’azione degli antibiotici ed alla

risposta immune.

CVC-BSIPatogenesi

CVC-BSIEpidemiologia

Patogeno (%)

CoNS 37

Gram-negativi 14

Enterobacter spp 5

Pseudomonas aeruginosa 4

Klebsiella pneumoniae 3

Escherichia coli 2

Staphylococcus aureus 13

Enterococcus 13

Candida spp 8

CVC-BSIDiagnosi

Il 15-25% dei CVC è colonizzato da CoNS, seppur in pazienti asintomatici.

Pertanto, soltanto in presenza di un quadro clinico suggestivo per batteriemia e di

infiammazione al sito di inserzione del catetere, si possono seguire due approcci

diagnostici per stabilire se l’infezione possa essere correlata alla presenza del catetere:

non conservativo (in situ): richiede la rimozione, mediante tecnica asettica, del

catetere; punta e segmento sottocutaneo vengono sottoposti a coltura. Indicato nel caso

di sospetta infezione da:

S. aureus: possibile metastatizzazione

bacilli Gram-: rimozione CVC associata a maggiore sopravvivenza;

trombosi settica

Candida spp: outcome sfavorevole nel caso di mancata rimozione

conservativo: non richiede la rimozione del catetere; è indicata nel caso di cateteri a

lunga permanenza.

Possono essere utilizzate tecniche semi-quantitative o quantitative.

CVC-BSIDiagnosi non conservativa

1. Metodo semiquantitativo di Maki [N Engl J Med, 1977] o del “roll-plate”: far rotolare gli

ultimi 4-5 cm della punta catetere su agar sangue per 4 volte; conta numero CFU

sviluppatesi a seguito di incubazione.

Cut-off per positività: ≥ 15 CFU.

Sensibilità: 85%; specificità: 82% [Ann Int Med 2005]

2. Metodo quantitativo di Cleri o del “broth washing”: un segmento di CVC viene

vortexato (max vel; 1 min) in un volume noto di brodo sterile, quindi diluzioni seriali 10-fold

della sospensione vengono seminate su agar sangue; conta CFU.

Cut-off per positività: ≥ 1.000 CFU/ml, sebbene alcuni microrganismi (S. aureus, Candida

spp, bacilli Gram-) potrebbero avere un cut-off più basso.

Sensibilità: 83%; specificità: 87% [Ann Int Med 2005].

3. Metodo quantitativo mediante «flushing»: si instillano 2 ml di brodo sterile (BHI broth)

nel lume del catetere, semina diluizioni 10-fold su agar sangue; conta CFU.

Cut-off per positività: ≥ 1.000 CFU/ml [Linares et al, JCM 1985]

CVC-BSIDiagnosi conservativa (in situ)

Principio: in presenza di CVC-BSI, la carica microbica è maggiore al sito di infezione (catetere)

vs circolo periferico.

Si eseguono 2 sets per emocoltura: 1 da campione periferico, 1 da catetere. Quindi si valuta:

Monitoraggio continuo del tempo differenziale di positivizzazione (Differential Time to

Positivity, DTP). La batteriemia sarà CVC-relata se:

il tempo di positivizzazione della emocoltura da CVC è minore (differenza ≥ 2 h) di quello

osservato nel campione prelevato da vena periferica [Blot et al., Lancet 1999]. Esiste infatti

una relazione inversa fra tempo di positivizzazione e la carica microbica; inoltre:

entrambe le emocolture debbono confermare la stessa eziologia microbica.

Specificità: 91%; sensibilità: 94%

Esame emocolturale quantitativo. La batteriemia sarà CVC-relata se:

la carica microbica del campione da catetere è almeno 3 volte maggiore rispetto a quella

osservata nel campione periferico; inoltre:

entrambe le emocolture confermano la stessa eziologia microbica.

Specificità: 100%; sensibilità: 77.8%

Oppure, in mancanza di prelievo periferico o nel caso di catetere con più lumi, se:

emocoltura positiva (> 100 CFU/ml) da campione catetere [Mermel et al, CID 2009]. Nel

caso di catetere multi-luminale, effettuare un prelievo da ciascun lume per maggiore

sensibilità diagnostica [Robinson et al, J Ped Hematol Oncol 2002; Guembe et al, CID 2010].

ENDOCARDITE - INFIAMMAZIONE DELL’ENDOCARDIO

PERICARDITE - INFIAMMAZIONE DEL PERICARDIO

MIOCARDITE - INFIAMMAZIONE DEL MUSCOLO CARDIACO

INFEZIONI CARDIACHE

ENDOCARDITE INFETTIVA (EI)

spesso si presenta come FOS (in più di una occasione, temperatura > 38.3°C che si

protrae per > 3 settimane)

l’infezione deriva da microrganismi portati dal circolo ematico

adesione microbica alle strutture endocardiche:

- valvolari (endotelio che riveste le valvole)

- murali (endotelio che riveste le pareti delle cavità cardiaca)

L’endocardite infettiva si manifesta con lesioni dette vegetazioni, in cui i

microrganismi si organizzano come biofilms.

La sede più frequente è rappresentata dai lembi delle valvole e si

possono avere:

infezioni dell’endotelio valvolare nativo; alterazioni già presenti

possono favorire la formazione di vegetazioni con aggregati di fibrina

e piastrine, siti recettoriali per adesione dei microrganismi (S. aureus

aderisce con coagulasi e proteine che legano il collagene).

infezioni delle valvole prostetiche; si forma uno strato superficiale di

fibrinogeno, sul quale i batteri aderiscono e formano un biofilm (S.

epidermidis).

ENDOCARDITE INFETTIVA

Patogenesi endocardite da S. aureus

PRINCIPALI AGENTI EZIOLOGICI DI ENDOCARDITE INFETTIVA

VALVOLE NATURALI: streptococchi viridanti orali ed enterococchi stafilococchi (S. aureus, CoNS) enterobatteri Candida

VALVOLE PROTESICHE (infezioni precoci, <2 mesi dall’intervento): stafilococchi (S. aureus, CoNS) funghi enterobatteri

VALVOLE PROTESICHE (infezioni tardive): streptococchi viridanti orali ed enterococchi stafilococchi (S. aureus, CoNS) enterobatteri

Le infezioni possono essere causate anche da batteri Gram– appartenenti al gruppo HACEK.

INFEZIONI RICORRENTI VIE URINARIE E. coli

MANOVRE CAVO ORALE Streptococchi viridanti

NEOPLASIE/DIVERTICOLITI DEL COLON S. bovis

ANZIANO MANOVRE VIE URINARIE Enterococchi

DIABETE MELLITO Streptococchi ß-emol. A e B

TOSSICODIPENDENTI Stafilococchi + HACEK

ENDOCARDITE INFETTIVA fattori di rischio eziologia

Spesso vi è una patologia cardiaca preesistente

(es. esito di febbre reumatica)

Rash da febbre reumatica

Endocardite da MRSA. Microascesso a livello del

tessuto miocardico. Evidenti, neutrofili che

circondano cocchi Gram+.

Endocardite “verrucosa” valvolare aortica

Endocardite infettivaDiagnosi microbiologica

L’indagine emocolturale è il gold standard per la diagnosi di laboratorio della EI.

Prelievo di 3 sets per emocoltura nell’arco delle 24h.

Non è necessario prelevare al rialzo febbrile in quanto nella EI la batteriemia ècontinua.

Tuttavia: la carica microbica è frequentemente molto bassa (<100 CFU/ml)

presenza di microrganismi di difficile isolamento (es. streptococchi tiolo-dipendenti)

paziente in terapia antibiotica

Pertanto, la frequenza di «falsi negativi» è piuttosto elevata: 2-30% (eziologia batterica)

50% (eziologia micotica)

Endocardite infettivaDiagnosi microbiologica: emocoltura

Endocardite infettivaDiagnosi microbiologica: altre tecniche

Esame patologico su tessuto valvolare o frammenti embolici (gold standard diagnostico). Utilizzo di colorazioni, immunoistochimica.

Microscopia elettronica: sensibile ma costosa.

ELISA: Coxiella burnetii, Bartonella spp, stafilococchi.

Immunoassay (ELISA): ricerca in urine (Legionella).

PCR su tessuto valvolare, non adatto su sangue. PCR positiva (per mesi) a seguito di eradicazione

PERICARDITE

Gli agenti più frequentemente causa di pericardite sono:

virus: enterovirus (Coxsackie A e B,), adenovirus, HIV;

batteri: stafilococchi, streptococchi, Haemophilus spp, M. tuberculosis

funghi

La pericardite è la infiammazione del sacco fibro-sieroso che racchiude il cuore

(pericardio).

Tra i sintomi, sono presenti dolore improvviso al precordio, al collo, alla spalla sinistra,

dispnea, rumori di sfregamento pericardico.

Può manifestarsi in tre forme, a seconda dell’eziologia:

acuta siero-fibrinosa, se l’infezione è di natura virale;

acuta purulenta, se l’infezione è batterica (tranne Mycobacterium tuberculosis);

cronica, causata da M. tuberculosis o funghi.

Nella infezione virale il danno ai tessuti è causato da:

1. danno diretto causato dalla replicazione virale;

2. distruzione delle cellule infettate dal virus mediata dai linfociti T;

3. citotossicità cellulare mediata da anticorpi.

L’infezione è autolimitante e raramente fatale.

Nella pericardite virale la sede di replicazione primaria è extra-cardiaca,

seguita da viremia.

Nella infezione batterica il danno ai tessuti è causato da:

1. produzione di tossine ed enzimi da parte del batterio;

2. danno miocardico per aumentata pressione a seguito di infiammazione.

La risoluzione della infezione è associata a fibrosi e, a volte, a pericardite

cronica con mortalità >50%.

I microrganismi giungono al pericardio:

da altro focolaio infettivo (pneumococchi di solito infettano il pericardio

secondariamente ad una polmonite);

dal circolo ematico (stafilococchi, meningococchi e H. influenzae,

agenti responsabili di batteriemie).

PERICARDITE - patogenesi

MIOCARDITE

Fa parte di un gruppo più ampio di patologie infiammatorie che comprende anche

forme tossiche o autoimmuni.

Tra i sintomi sono presenti: astenia, cardiopalmo, dispnea.

In molti casi l’infezione è subclinica, ma a volte può causare morti improvvise nei

giovani.

In teoria qualsiasi microrganismo può essere causa di Miocardite; in pratica,

l’eziologia è prevalentemente virale: enterovirus (Coxsackie B, ECHO), influenza

virus, HIV, virus esantematici infantili.

La replicazione primaria del virus avviene a livello faringeo o intestinale cui segue

la fase viremica

Miocardite virale. Infiltrato linfocitico interstiziale caratteristico delle

miocarditi virali. I più comuni agenti etiologici virali sono i Coxsackie B.

Miocardite e pericarditediagnosi di laboratorio

Sia nella pericardite che nella miocardite, il Laboratorio di Microbiologia ha una limitata rilevanza diagnostica.

Generalmente diagnosi non eziologica ma si basa sui dati semeiologici ed anamnestici, ECG, etc.

Esiste inoltre un considerevole overlaptra pericardite e miocardite al riguardo della eziologia e della clinica.

Campioni clinici:

Liquido pericardico, biopsia pericardica/miocardica

Siero: acuto vs convalescente

Tecniche diagnostiche:

Osservazione microscopica, coltura (batteri, micobatteri, funghi)

solo in presenza di un versamento pericardico purulento si cerca di isolare l’agente eziologico.

se il liquido non è purulento si può ricercare M. tuberculosis, ma non è possibile isolare virus.

Sierologia, istopatologico, coltura (virus)

modulo 5: diagnosi microbiologica delle … di... · immunitarie sono in grado di eliminare...

Documents