möglichkeiten und grenzen von nachweismethoden · methode aussagekraft grenzen schadstoff- muster...
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Bundesweite Fortbildung für Bodenschutzbehörden sowie für interessierte Sachverständige und Pflichtige
LABO Förderprojekt B 4.13 des Länderfinanzierungsprogramms „Wasser, Boden und Abfall“ www.laenderfinanzierungsprogramm.de
MNA-Konzepte - Grundlagen & Vorgehensweise -
Möglichkeiten und Grenzen von Nachweismethoden
Dr. Kathrin R. Schmidt, TZW-DVGW
Untersuchung und Charakterisierung von Schadstofffahnen
NATURAL ATTENUATION (NA)
„Natürliche Schadstoffminderungsprozesse sind biologische, chemische
und physikalische Prozesse, die ohne menschliches Eingreifen zu einer
Verringerung (…) eines Stoffes im Boden oder Grundwasser führen“
Industrie- standort
ungesättigte Bodenzone
Wasserwerk Rezeptor
Aquifer gesättigte
Bodenzone
Grundwasser- Fließrichtung
Schadensherde Ablagerung
DNAPL (LCKW)
Aquitard
Schadstofffahne
LNAPL
Der biologische Abbau ist bei vielen Grundwasser-
schäden der maßgebende frachtreduzierende Prozess.
MIKROBIELLER ABBAU VON CHLORETHENEN
Aerob-oxidativer Abbau je weniger Chloratome desto leichter abbaubar
CO2
Cl-
H2O H H
C = C H Cl
Cl H
C = C Cl Cl
Cl Cl
C = C Cl Cl
Anaerob-reduktiver Abbau je mehr Chloratome desto leichter abbaubar
Auxiliar-
substrate
PCE
TCE
cDCE
VC
Ethen
H H
C = C Cl Cl
H H
C = C H H
H2
Chlorethene Sauerstoff
(Elektronen-Donoren) (Elektronen-Akzeptor)
werden oxidiert wird reduziert
Auxiliarsubstrate Chlorethene
(Elektronen-Donoren) (Elektronen-Akzeptoren)
werden oxidiert werden reduziert
O2
CH3 CH
3
CH3
S
O
MIKROBIELLER ABBAU VON AROMATEN (AKW)
Aromaten
(Elektronen-Donoren)
werden oxidiert
O2
CO2
H2O
Sauerstoff
(Elektronen-Akzeptor)
wird reduziert
Alternative Elektronen-Akzeptoren:
-25,4
Energiegewinn
am Beispiel
Naphtalin
(kcal/eeq)
NO3 N2 -23,9
Fe(III) Fe(II) -5,7
SO4 S2- -1,7
CO2 CH4 -1,0
OFFENE FRAGEN VOR ANWENDUNG VON MNA
welche Schadstoffe werden abgebaut?
welche Milieubedingungen sind erforderlich?
wie effizient ist der Abbau?
ist MNA ausreichend? (Zeitskala, Einhalten von Grenzwerten, Toxizitätsreduktion etc.)
Industrie- standort
ungesättigte Bodenzone
Wasserwerk Rezeptor
Aquifer gesättigte
Bodenzone
Grundwasser- Fließrichtung
Schadensherde Ablagerung
DNAPL (LCKW)
Aquitard
Schadstofffahne
LNAPL Welche Abbauprozesse sind
? ? ? ? im Untergrund wirksam?
NACHWEISMETHODEN
Schadstoffmuster
Redoxmilieu
Molekularbiologischer Nachweis (PCR)
Keimzahl-Bestimmung (MPN)
Mikrobiologische Abbauversuche
Isotopenuntersuchung
PCE EthenVCcDCETCEPCE EthenVCcDCETCE
Aerob/ anaerob
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C
E F G H
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C
E F G H
D
12C Abbau schneller 13C Abbau langsamer
STANDORT 1: FRANKENTHAL, RHEINLAND-PFALZ
Schadstoffe: Chlorethene
Verursacher: Metallverarbeitender Betrieb
und chemische Reinigung
Flächige Schadstofffahne in der Innenstadt
Bislang P&T am Herd und MNA in der Fahne
SCHADSTOFFMUSTER
Schadstoffmuster am Standort
gibt Hinweise auf Abbauvorgänge
Abbau wird u.a. deutlich durch:
die Detektion spezifischer
Metabolite im Abstrom
sowie kürzere Fahnenlängen
für gut abbaubare und
hydrophile (weniger Retardation)
als für schlecht abbaubare und
hydrophobe Substanzen
PCE EthenVCcDCETCEPCE EthenVCcDCETCE
Acenapthen
3,6 mg/L
Naphthalin
31 mg/L
Wasserlöslichkeit
Metabolite der
anaerob-reduktiven
Dechlorierung:
cDCE ist Haupt-
kontaminant
wenig VC
relativ kurze Fahne
SCHADSTOFFMUSTER: CKW-STANDORT
PCE > 100 µg/L
TCE > 100 µg/L
cDCE > 100 µg/L
VC > 100 µg/L
0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m
REDOXMILIEU
Hydrochemische Standort-Bedingungen
grenzen mögliche Abbauprozesse ein
Redoxmilieu: Bewertung von
Elektronen-Akzeptoren (Sauerstoff, Nitrat, Eisen(III), Mangan(IV), Sulfat)
und/ oder Respirationsprodukten (Nitrit, Eisen(II), Mangan(II), Sulfid, Methan)
Informationen über die Verfügbarkeit
von Auxiliarsubstraten, Nährstoffen
O2 H2O
NO3 N2
Fe(III) Fe(II)
Mn(IV) Mn(II)
SO4 S2-
CO2 CH4
PCE > 100 µg/L
TCE > 100 µg/L
cDCE > 100 µg/L
VC > 100 µg/L
0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m
REDOXMILIEU: CKW-STANDORT
In verschiedenen
Fahnenbereichen
(lateral und vertikal)
liegen für
unterschiedliche
Abbauprozesse
geeignete
Bedingungen vor
MIKROBIOLOGISCHE BESTANDSAUFNAHME (PCR)
Nachweis von bestimmten Mikroorganismen
in Feldproben (Grundwasser, Boden)
PCR (Polymerase Chain Reaction):
Molekularbiologischer Nachweis der
DNA (= Erbgutinformation)
Schadstoff-abbauende Bakterien/
Enzyme liefern Informationen zum
Abbaupotential
Redox-aktive Bakterien/ Enzyme und
hydrochemische Daten ermöglichen
Beurteilung des Redoxmilieus Abbild
ung v
on h
ttp://b
bru
ner.
org
/bitn/b
r_c1.h
tm
PCE > 100 µg/L
TCE > 100 µg/L
cDCE > 100 µg/L
VC > 100 µg/L
0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m
PCE
TCE
cDCE
VC
Ethen
Desulfomonile sp.
Desulfuromonas sp.
Dehalobacter sp.
Dehalococcoides sp.
Korrelation von
PCR-Nachweis,
Schadstoffmuster
und Redoxmilieu
PCR-METHODE: CKW-STANDORT
MIKROBIOLOGISCHE BESTANDSAUFNAHME (MPN)
Nachweis von Mikroorganismen-Gruppen
mit bestimmten Leistungen in Feldproben
(Grundwasser, Boden)
MPN (Most Probable Number):
Wachstum und Keimzahl-Bestimmung
im Labor (Kulturverfahren)
Schadstoff-abbauende Bakteriengruppen liefern
Informationen zum Abbaupotential
Redox-aktive Gruppen und hydrochemische Daten
ermöglichen Beurteilung des Redoxmilieus
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A
B
C
E
F
G
H
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A
B
C
E
F
G
H
D
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
51 F 44 F 45 F 46 F Messstellen
Keim
e / g
Tro
cken
su
bsta
nz
Nitrat-Reduzierer
Sulfat-Reduzierer
Eisen-Reduzierer
aerobe VC-Verwerter
Aerobe VC-Verwerter sind weit verbreitet
Sulfat-Reduktion von untergeordneter Bedeutung gegenüber Nitrat- und Eisen-Reduktion
MPN-METHODE: CKW-STANDORT
< 6
,7
< 6
,7
< 6
,7
MIKROBIOLOGISCHE ABBAUVERSUCHE
Nachweis am Standort auftretender
mikrobiologischer Abbauprozesse
Standortmaterial (Grundwasser, Sediment)
Labor-Mikrokosmen oder in-situ (Bactraps)
Standort-nahe oder gezielt veränderte
Bedingungen
Untersuchung von Schadstoffabbau und
Redoxprozessen
Ch
lore
then
e,
Ch
lori
d [
µM
]
0
5
10
15
20
25
30
35
0 7 17 26 31 35 38 45 59 61 63 66
Zeit [Tage]
Metabolitenbildung unter
anaeroben Bedingungen:
Stoffmengenerhaltung: aus
ca. 27 µmol PCE (4,3 mg) werden
ca. 27 µmol cDCE (2,6 mg)
Mineralisierung unter
aeroben Bedingungen
0
20
40
60
80
100
0 5 7 10 11 12 14 17 19
Zeit [Tage]
aerob-oxidativ anaerob-reduktiv
ABBAUVERSUCHE: CKW-STANDORT
sequentiell anaerob-aerobe
Schadstoff-Elimination
TCE Cl H
C = C Cl Cl
cDCE H H
C = C Cl Cl
PCE Cl Cl
C = C Cl Cl
cDCE H H
C = C Cl Cl
2 CO2 + 2 Cl- + H2O
Chlorid
cDCE
TCE
PCE
Nachweis mikrobiologischer NA-Prozesse
am Standort mittels chemischer Analytik
Quellen- und
Verursacherzuordnung
Quantifizierung des
biologischen Abbaus
Isotope = Atome desselben Elements mit unterschiedlicher
Anzahl an Neutronen, z.B. 12C (leicht) und 13C (schwer),
beide stabil, d.h. nicht radioaktiv
ISOTOPENUNTERSUCHUNG
Abbild
ung v
on h
ttp://w
ww
.agro
isola
b.d
e/im
ages/s
tabile
isoto
pe.g
if
Cl Cl
12C = 12C
Cl Cl
Cl Cl
12C = 12C
Cl Cl
Cl H
12C = 12C
Cl Cl
Cl H
12C = 12C
Cl Cl
Cl Cl
12C = 13C
Cl Cl
Cl Cl
12C = 13C
Cl Cl
Cl H
12C = 13C
Cl Cl
Cl H
12C = 13C
Cl Cl
leichtes Kohlenstoff-
isotop 12C
schnellere Umsetzung
schweres Kohlenstoff-
isotop 13C
langsamere Umsetzung
PCE TCE
ISOTOPEN: MIKROBIOLOGISCHE FRAKTIONIERUNG
Bakterien verwerten bevorzugt die leichten Isotope
Anreicherung der schweren Isotope in verbleibenden Schadstoff
Veränderung der Isotopenverhältnisse = Isotopenfraktionierung
Bakterien
setzen 12C schneller
um als 13C
13C
13C
13C 13C
12C 12C
12C 12C
12C 12C
12C
12C 12C 12C
12C
12C 12C
12C 12C
12C 12C 12C
12C
13C 13C
Ausgangsschadstoff
mit spezifischem
Isotopenverhältnis
gebildete
Verbindung
abgereichert
an 13C
„leichter“
13C
12C 12C
12C 12C 12C 12C
12C 12C 12C
12C
12C 12C
12C 12C
13C
verbleibende
Substanz
angereichert
an 13C
„schwerer“
13C 13C
12C
12C
12C
12C 12C
12C
13C
13C und
ISOTOPEN: MIKROBIOLOGISCHE FRAKTIONIERUNG
Isotopensignatur = Verhältnis von schweren zu leichten Isotopen in
Bezug zu einem Standard (δ-Notation)
13C/12C natürliches Verhältnis ca. 1 : 100
2H/1H natürliches Verhältnis ca. 1 : 10.000
-20
0
20
40
60
80
100
0% des Ausgangsschadstoff 25% 50% 75% 100%
Iso
top
en
-Sig
natu
r
ε = - 5 schwache
Fraktionierung
ε = - 30 starke
Fraktionierung
ε = - 15 mittlere
Fraktionierung
je höher die Anreicherungsfaktoren desto besser für Nachweis und Quantifizierung geeignet
korrekte Quantifizierung nur mit richtigem Anreicherungsfaktor möglich
ISOTOPEN: ANREICHERUNGSFAKTOREN
Isotopisch
schwerer
Isotopisch
leichter
PCE > 100 µg/L
TCE > 100 µg/L
cDCE > 100 µg/L
VC > 100 µg/L
0 m 200 m 1200 m 400 m 600 m 1000 m 800 m 1400 m
13C-Isotopen-
anreicherung (Summen-
signaturen) im Feld
Bestimmung von
Anreicherungsfaktoren
in Mikrokosmen
Quantifizierung des
Abbaus im Feld
ISOTOPEN: CKW-STANDORT
0
2
4
6
8
10
0 10 20 30 40 50 60
Zeit [Tage]
Ko
nzen
trati
on
- 50
- 30
- 10
10
30
50
VC mg/L VC δ13C
Iso
top
en
-Sig
natu
r
- 23,5 ‰
- 17,3 ‰
- 15,8 ‰
- 23,9 ‰
METHODE AUSSAGEKRAFT GRENZEN
Schadstoff-
muster
anaerob-reduktive
Dechlorierung nachweisbar
keine Information über aerob-
oxidativen Abbau
Redox-
milieu
Information über die
Randbedingungen des Abbaus
durch Verwendung von integrierenden
Mischproben Bewertung oft ungenau
PCR
Leitorganismen der anaerob-
reduktiven Dechlorierung
nachweisbar
kein Aktivitätsnachweis
Nachweis für aerob-oxidativen Abbau
in der Entwicklung
MPN aerobe VC-Verwerter
nachweisbar
kein Nachweis für anaerob-reduktive
Dechlorierung
teilweise relativ lange Inkubationszeit
Abbau-
versuche
detaillierte Charakterisierung
des Schadstoff-Abbaus
(Abbaureihenfolge,
erforderliche Bedingungen etc.)
relativ lange Zeitdauer, insbesondere
anaerob
keine ins Feld übertragbaren
Abbauraten
C-Isotopen
ermöglicht chemischen
Nachweis des Abbaus und
Quantifizierung
Interpretation der Ergebnisse teilweise
anspruchsvoll
BEWERTUNG DER METHODEN FÜR CHLORETHENE
STANDORT 2: RÜSGES, NORDRHEIN-WESTFALEN
Schadstoffe: PAK, BTEX, NSO-HET
Verursacher: Chemische Fabrik
Schadstofffahne ausgehend von
Werksgelände
MNA-Konzept wird umgesetzt
SCHADSTOFFMUSTER: AKW-STANDORT (PAK)
gut abbaubares, hydrophiles Naphthalin nur am
Fahnenbeginn nachweisbar
schlecht abbaubares, hydrophobes Acenapthen
reichert sich im Fahnenverlauf an
REDOXMILIEU: AKW-STANDORT
aerob
Fe(III)-reduzierend
Sulfat- reduzierend/ methanogen
In verschiedenen Fahnenbereichen liegen
für unterschiedliche Abbauprozesse
geeignete Bedingungen vor
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
Herd Abstrom Abstrom
60 m 130 m Ae
rob
e K
eim
e /
mL
Gru
nd
wa
ss
er Gesamtkeimzahl (flacher Horizont)
Gesamtkeimzahl (tiefer Horizont)
AKW-Verwerter (flacher Horizont)
AKW-Verwerter (tiefer Horizont)
MPN-METHODE: AKW-STANDORT
Höhere Keim-
zahlen im Herd
als im Abstrom
zeigen mikrobielle
Aktivität bei
Grundwasser-
Belastung
< 6
,7
< 6
,7
ABBAUVERSUCHE: AKW-STANDORT
+++ = Abbau innerhalb 50 Tage ++ = Abbau innerhalb 280 Tage, 12°C + = Abbau innerhalb 280 Tage, 20° C - = kein eindeutiger Abbau
Abbauaktivität hängt von
Redoxbedingung ab
RedoxzoneSulfat-
reduzierend
Fe(III)-/Sulfat-
reduzierendaerob
Ethylbenzol + + +++
Benzol + + +++
Naphthalin + ++ +++
Acenaphthen - - +++
Phenanthren - + +++
Fluoren - - +++
Dibenzofuran + + +++
Benzothiophen - + +++
2-Methylbenzofuran - - +++
Dibenzothiophen - - +++
Carbazol - - +++
2-Methyldibenzofuran - - +++
BT
EX
NS
O-H
ET
PA
K
13C-Isotopen-Anreicherung im Feld
qualitativer Nachweis des biologischen
Abbaus
ISOTOPEN: AKW-STANDORT
KE B7 [μg/L] δ13
C [‰]
isoPropylbenzol 14,4 -20,9±0,9
Indan 190 -21,8±0,6
GW 22 [μg/L] δ13
C [‰]
isoPropylbenzol 14,6 -17,9±0,5
Indan 91 -21,3±0,5
KE B8 [μg/L] δ13
C [‰]
isoPropylbenzol 3,2 -19,5±0,7
Indan 15 -18,5±0,5
METHODE AUSSAGEKRAFT GRENZEN
Schadstoff-
muster
Abreicherung leichter
abbaubarer Substanzen
erkennbar
reiner Konzentrations-Rückgang gibt
keinen Aufschluss über fracht-
reduzierende Prozesse
Redox-
milieu
Information über die
Randbedingungen des
Abbaus
durch Verwendung von integrierenden
Mischproben Bewertung oft ungenau
PCR/ MPN
gibt Informationen zu
Abbaupotential und
Redoxmilieu
PCR: kein Aktivitätsnachweis
MPN: teilweise relativ lange
Inkubationszeit
Abbau-
versuche
detaillierte Charakteri-
sierung des Schadstoff-
Abbaus
relativ lange Zeitdauer, insbesondere
anaerob
keine ins Feld übertragbaren Abbauraten
C-Isotopen
ermöglicht chemischen
Nachweis des Abbaus und
ggf. Quantifizierung
Interpretation der Ergebnisse teilweise
anspruchsvoll
PAK: aufgrund der Molekülgröße schwer
anwendbar
BTEX: aufgrund niedriger Anreicherungs-
faktoren schwer anwendbar
BEWERTUNG DER METHODEN FÜR AROMATEN
METHODE CHLORETHENE
27 ausgewertete Praxisfälle
AROMATEN
21 ausgewertete Praxisfälle
Schadstoff-
muster
bei allen Praxisfällen und
Forschungsvorhaben
bei allen Praxisfällen und
Forschungsvorhaben
Redox-
milieu
bei allen Praxisfällen und
Forschungsvorhaben
bei allen Praxisfällen und
Forschungsvorhaben
PCR bei 65% der Praxisfälle bei Forschungsvorhaben
bereits angewandt
MPN bei 45% der Praxisfälle bei 85% der Praxisfälle
Abbau-
versuche bei 80% der Praxisfälle bei 75% der Praxisfälle
C-Isotopen Daten-Basis am TZW nicht ausreichend
Die Auswertung stellt eine Auswahl dar, da weitere Substanzklassen
nicht berücksichtigt wurden.
Stand: September 2013
HÄUFIGKEIT DER ANWENDUNG AM TZW
PCE
Ethen
VC
cDCE
TCE
PCE
Ethen
VC
cDCE
TCE
Aerob/ anaerob
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C
E F G H
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C
E F G H
D
12C schnell 13C langsam
BEWERTUNG DER VERSCHIEDENEN ISOTOPE
Isotopenmethoden ermöglichen
die Unterscheidung frachtreduzierender
von anderen NA-Prozessen
sowie die Quantifizierung im Feld
Isotope Chlorethene PAK/ NSO-HET BTEX
13C/12C +++ +/- ++ Die gleichzeitige
Betrachtung von
zwei Isotopen
(dual, 2D) liefert
weitergehende Informationen.
2H/1H +
Entwicklungs-
bedarf
Entwicklungs-
bedarf ++
37Cl/35Cl +
Entwicklungs- bedarf
nicht anwendbar
Schadstoffmuster wichtige erste Hinweise,
Daten liegen meistens vor
Redoxmilieu wichtige Randbedingung, Daten liegen oft vor
Mikrobiologische Bestandsaufnahme PCR: schneller Nachweis mikrobieller Potentiale
MPN: relativ schneller Nachweis mikrobieller Aktivitäten
Abbauversuche (Mikrokosmen) liefern umfassende Kenntnisse des Abbauverhaltens
Isotopenfraktionierung ermöglicht Unterscheidung zwischen Frachtreduktion durch
biologischen Abbau und anderen NA-Prozessen sowie Quantifizierung
ZUSAMMENFASSUNG Einzelfallbetrachtung: Je nach Komplexität eines
Standortes werden Methoden
für einen multiple-lines-of-
evidence-approach ausgewählt.
ANWENDUNGSBEISPIELE AUS KORA
Frankenthal Killisfeld
Schadstoff-
verteilung
Primärkontaminanten: PCE und TCE Primärkontaminanten: PCE und TCE
Abbauprodukte: cDCE ist Hauptkontaminant,
VC Abbauprodukte: cDCE, VC, Ethen
Redox
Redoxpotential (mV): 140 – 560 Redoxpotential (mV): 47 – 470
Sauerstoff (mg/L): < 0,1 – 5,5 Sauerstoff (mg/L): < 0,1 – 2,6
Nitrat (mg/L): < 0,5 – 100 Nitrat (mg/L): < 0,5 – 46
Eisen (mg/L): < 0,01 – 5,9 Eisen (mg/L): < 0,01 – 8,5
Methan (µg/L): < 10 – 530 Methan (µg/L): < 10 – 2000
MPN aerobe VC-Verwerter in 11 von 12 Proben
detektiert
verschiedene anaerobe und aerobe Verwerter-
Gruppen nachgewiesen
PCR
PCE à cDCE halorespiratorische Organismen
an mehreren Messstellen nachweisbar Dehalococcoides sp. (PCE à VC/Ethen) an
mehreren Messstellen nachweisbar Dehalococcoides sp. (PCE à VC/Ethen) nur
an BP46 nachweisbar
Abbau-
versuche
Anaerob-reduktiv: PCE/TCE à cDCE (VC) Anaerob-reduktiv: PCE/TCE à Ethen
Aerob-oxidativ: VC produktiv, cDCE
cometabolisch mit VC, cDCE produktiv
Aerob-oxidativ: VC produktiv, cDCE
cometabolisch mit VC
Isotopen
Anreicherungsfaktoren in Abbauversuchen
bestimmt
Abbau am Standort quantifiziert
Anreicherungsfaktoren in Abbauversuchen
bestimmt
Abbau-
schema
sequentiell anaerob-aerob: sequentiell anaerob-aerob:
PCE/TCE anaerob-reduktiv zu cDCE (VC) PCE/TCE anaerob-reduktiv zu VC/Ethen/Ethan
cDCE (VC) aerob-oxidativ zu CO2, H2O, Cl VC (cDCE) aerob-oxidativ zu CO2, H2O, Cl
PCR: ZUR VERFÜGUNG STEHENDE METHODEN
Parameter Qualitative PCR (ja/nein Ergebnis)
Quantitative PCR (Genkopien/mL)
Anaerob reduktiv dechlorierende
Organismen PCE Ethen: Dehalococcoides sp.
PCE cDCE: Desulfomonile, Desulfuromonas, Dehalobacter, Desulfitobacterium sp.
Anaerob reduktiv dechlorierende
Enzyme von Dehalococcoides PCE TCE (pceA), TCE Ethen (tceA), cDCE Ethen (vcrA), VC Ethen (bvcA)
Redoxprozesse Nitrat-, Eisen-, Sulfat-Reduzierer,
Methanogene, Acetogene, Anammox ()
Aromaten abbauende Enzyme Naphthalin-Dioxygenase,
Toluol-4-Monooxygenase () ()
Zell-Lyse
Membranfiltration
DNA-Extraktion und Reinigung
PCR = Polymerase Chain Reaction
Wasserprobe
Bakterien
DNA, Proteine,
Zelltrümmer
DNA
Amplifizierte DNA
PCR – DURCHFÜHRUNG
DNA = Erbgutinformation aller Zellen
Organismen-Nachweis anhand der
DNA für Ribosomen (= Proteinbaustelle,
in jeder Zelle enthalten)
enthält hoch konservierte Regionen
selbst nicht verwandte Arten haben
die gleiche Sequenz
und hoch variable Regionen jede Art
hat eine einzigartige Sequenz
Enzym-Nachweis anhand der DNA für Enzyme
Information über genetisches Potential,
aber nicht über aktuelle Aktivität
pic
ture
taken fro
m
http://b
bru
ner.
org
/bitn/b
r_c1.h
tm
DNA = DESOXYRIBONUCLEINSÄURE
entstandene DNA-Stränge bilden die
Vorlage für den nächsten Durchgang
bei jedem Durchgang wird die DNA-
Menge verdoppelt
exponentielle Vervielfältigung
Polymerase Primer
1
3
2
Auftrennung der doppel-
strängigen DNA
Anlagerung der Primer
Vervollständigung der Einzel-
stränge zum Doppelstrang
PCR = POLYMERASE CHAIN REACTION
bp= Basenpaare +
- Start
2176 bp 1766 bp
1230 bp 1030 bp
653 bp 517 bp 453 bp 394 bp 298 bp 220 bp
154 bp
Gel-elektrophoretische Trennung des
PCR-Produkts in einem Agarose-Gel
DNA ist negativ geladen
wandert im elektrischen Feld zur
Anode (Plus-Pol)
das Agarose-Gel bildet ein Molekülsieb
kleinere Fragmente wandern
schneller
Auftrennung der DNA-Fragmente
nach ihrer Größe
AUSWERTUNG EINER PCR-REAKTION
REAKTIONSSCHEMA QUANTITATIVE PCR
l
l l
l
l
l
l l
+ Farbstoff
Zugabe von Fluoreszenz-
farbstoffen zur PCR-Reaktion
ungebunden
wenig Fluoreszenz
Bindung an doppelsträngige
DNA Fluoreszenz
Exponentielle Zunahme der
Fluoreszenz mit exponentieller
Vervielfältigung der DNA
Messung der zunehmenden
Fluoreszenz als Maß für die
DNA-Menge einer Probe
MPN: ZUR VERFÜGUNG STEHENDE METHODEN
Parameter Quantitativ
(Keime/mL)
aerobe Schadstoffabbauer
VC-Verwerter
PAK-Verwerter
NSO-Heterozyklen-Verwerter
BTEX-Verwerter
aerobe Gesamtkeimzahl (GKZ) Redoxprozesse
Nitrat-Reduzierer (anaerob: NO3 N2)
Eisen-Reduzierer (anaerob: Fe(III) Fe(II))
Sulfat-Reduzierer (anaerob: SO4 S2-)
Methanogene (anaerob: CO2 CH4)
Nitrifikanten (aerob: NH4 NO2 NO3)
Nitrat-Ammonifizierer (anaerob: NO3 NO2 NH4)
Wasserprobe
dekadische
Verdünnungsreihe
Inkubation in selektiven
Nährmedien unter
verschiedenen Bedingungen
Auszählung der
bewachsenen Röhrchen
Berechnung der Keimzahlen
MPN – DURCHFÜHRUNG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A
B
C
E
F
G
H
D
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C
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C
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10
10
10
10
10
10
10
10
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Sterilkontrollen
PCR MPN
anwendbar
auf
Grundwasser- und
Bodenproben
Grundwasser- und
Bodenproben
Nachweis
von spezifischen
Bakterienarten mit
bestimmter Abbauleistung
von Bakterien mit
bestimmter Abbauleistung
Arten müssen bekannt und
molekularbiologisch
charakterisiert sein
Arten müssen nicht
bekannt sein
alle Abbauprozesse nur produktive
Abbauprozesse
quantitativ quantitativ
Präsenz, keine Aktivität Aktivität unter
Laborbedingungen
Zeitbedarf 2 – 3 Tage 1 bis 6 Wochen
VERGLEICH DER METHODEN PCR UND MPN
Wasserproben Befüllung der Gefäße direkt im Feld
ggf. Zugabe von Sediment, Schadstoffen, Auxiliarsubstraten, Nährstoffen
Inkubation unter relevanten Bedingungen
Proben-Entnahme und Analytik auf Schadstoffabbau und Redoxchemie
Bewertung des Standort-spezifischen Abbaupotentials
ABBAUVERSUCHE – DURCHFÜHRUNG
Bestimmung von Standort-spezifischen Faktoren in Abbauversuchen empfehlenswert
-35-30-25-20-15-10-50
anaerob PCE zu TCE
anaerob TCE zu cDCE
anaerob cDCE zu VC
anaerob VC zu Ethen
aerob TCE zu CO2
aerob cDCE zu CO2
aerob VC zu CO2
anaerob Benzol
anaerob Toluol
anaerob Xylole
aerob Benzol
aerob Toluol
aerob XyloleAnreicherungsfaktor ε [‰]
unterschiedliche Faktoren für
cDCE und VC anaerob bzw. aerob
Daten aus
Aelion, 2010:
ISOTOPEN: ANREICHERUNGSFAKTOREN