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Molekularbiologie

Methoden

Dr. Thomas Seehaus

Molekularbiologische Methoden Seite 2

Aufgabe

Isolation des hypothetischen Gens KRYP1 aus Zucchini


DNA-Extraktion aus Geweben

Jede Zelle enthält im Zellkern DNA (Desoxyribonukleinsäure). Dazu kommen Proteine, Fette, Kohlenhydrate, Ionen.

Um die DNA freisetzen zu können, müssen zunächst die Zellwand, Zellmembran und die Kernmembran zerstört werden.

Zellwände werden mechanisch und/oder enzymatisch geöffnet. - Glasbeads, Mörsern, kalt, flüssiger Stickstoff oder Trockeneis- Enzyme

Da die Membranen aus amphiphilen Molekülen aufgebaut sind, können sie mit Detergentien (in herkömmlichen Spülmitteln) aufgelöst werden. Fette werden ebenfalls im Detergenz gelöst.

Die in den Spülmitteln enthaltenen Enzyme (Proteasen) zerstören außerdem begleitende Eiweiße (Proteine, u. a. DNasen!).

Aufreinigung der DNA durch Ethanol-Fällung (Dehydratation der DNA => fällt aus, Kohlenhydrate und Ionen bleiben gelöst)

Vorüberlegungen für einen Versuch mit Haushaltsmitteln


Besonderheiten bei RNA-Extraktion

RNA ist sehr viel schwieriger zu isolieren als DNA

- Cytoplasma enthält sehr viele RNasen (RNA abbauende Enzyme, u. a. zur Regulation der Proteinsynthese!)

- RNasen müssen inhibiert oder deaktiviert werden (Proteasen, RNase-Inhibitoren, Phenol)

- auf der Haut sind viele RNasen vorhanden!

- Handschuhe tragen, Gerätschaften und Lösungen sterilisieren!

RNA-Moleküle sind kleiner als DNA-Moleküle

- Ethanol-Fällung ist daher weniger effizient

- Ethanol muss sehr kalt sein (-20°C)

- zur Unterstützung höherer Salzgehalt


DNA-Isolierung aus Zucchini

Material/Geräte:

- Zucchini, (Kartoffel)reibe, Teesieb, Thermometer, 100 ml Messzylinder, zwei 100 ml Bechergläser, ein 250 ml Becherglas (niedrige Form), 60°C warmes Wasser, Spülmittel (das Proteasen enthält!), Kochsalz, Brennspiritus, Eiswürfel, evtl. kleine Styroporbox

Vorbereitungen:

- 20 ml Brennspiritus (oder 96 % Ethanol) eine Stunde vor dem Versuch ins Kühlfach (ca. -20°C) legen. Zum Transport auf Eis (in einer kleinen Styroporbox) legen.

- Wasser (60°C) bereitstellen (z. B. in einem Babyflaschenwärmer)

- Spülmittel-/Salz-Lösung zur Extraktion: 50 ml Wasser mit 5 ml Spülmittel (mit Proteasen) und 1 g Kochsalz gut mischen.


DNA-Isolierung aus Zucchini - Durchführung

Man reibt ein Zucchini-Stück und füllt einen Esslöffel in ein 100 ml Becherglas

- Durch das Reiben wird das Pflanzengewebe zerkleinert und die Zellwände teilweise aufgebrochen

und gibt 25 ml der Spülmittel-/Salz-Lösung hinzu

- Das Spülmittel enthält Detergentien, die aufgrund ihrer chemischen Struktur Lipide in Lösung bringen. Salze verstärken den Effekt



Das Becherglas für 15 Minuten in ein 60°C warmes Wasserbad stellen. Sehr gut geeignet sind dafür (gebrauchte) Babyflaschenwärmer. (Kann man bei ebay ersteigern!)

- Die höhere Temperatur beschleunigt die Freisetzung der DNA und zerstört DNAsen (Enzyme, die DNA zersetzen.)

In Eiswasser abkühlen.

- Abkühlen verhindert DNA-Zerfall

Den Zucchini-Brei durch ein Teesieb passieren. Dazu das Teesieb auf ein 250 ml Becherglas (niedrige Form) legen und mit einem Teelöffel durch das Netz streichen.



Einen Teil (ca. 1 Teelöffel) des Breis in ein kleines Becherglas o. ä. füllen und ganz vorsichtig mit tiefgekühlten (möglichst aus der Kühltruhe) Alkohol überschichten. Dazu den Alkohol langsam seitlich hinein fließen lassen. Besser geht es mit einer Pipette.

- DNA (und RNA) sind in Ethanol bei niedriger Temperatur unlöslich und fallen daher leicht aus.

Die DNA wird oberhalb des Breis als weißgelbe Flocken/Klümpchen sichtbar.

Durch Abgießen oder Herausfischen kann man die DNA in ein Röhrchen mit Alkohol überführen.


DNA-Isolierung: Quellen

Trolldenier, G.: Isolierung der Erbsubstanz aus Zucchini - die DNA-Küche (Industrieverband Agrar)

www.chempage.de/versuche/vdna.htm

www.chemicon.com/techsupp/genomic.asp

www.dialog-gentechnik.at/binaries/108927.pdf

Empfohlen wird auch die DNA-Extraktion aus anderen pflanzlichen Geweben, z. B. Tomaten, Kiwi, Zwiebeln usw.

Interessant bleibt auch die früher häufig vorgeschlagene Extraktion aus tierischem Material z. B. Kalbsbries.


Pufferlösung zur Aufbewahrung von DNA

Tris-Puffer (EDTA-Tris-Acetat, pH 7.75)

10 mM (12,12 g) Tris-(hydroxy-methyl)-aminomethan

1 mM (0,74 g) Na2-EDTA (Dinatrium-Ethylendiamin-tetraacetat)

mit destilliertem Wasser auf 900 ml aufgefüllt

pH-Wert mit 2 M Essigsäure auf 7,75 einstellen

mit destilliertem Wasser auf 1000 ml Endvolumen auffüllen

Aufbewahrung von DNA-Proben

- in TE-Puffer bei -20°C

- alternativ gefällt unter Ethanol

- lyophilisiert

EDTA: KomplexbildnerTRIS: pH-Puffer


Nachweis von DNA

Feulgen Nuklealreaktion (Robert J. W. F., 1884-1955, physiol. Chemiker, Gießen)

mittels Photometrie quantitativ faßbare Färbung der DNA, der Zellkerne, Chromosomen, Plastiden, Bakterien u. Viren

nach (mild-)saurer hydrolytischer Abspaltung der Purinbasen erfolgt die Umsetzung der zurückbleibenden Desoxyribose (mit freier Aldehydgruppe an C1) mit Schiff-Reagens (fuchsinschweflige Säure; 1 Std.) zu rotviolettem Farbstoff


Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen

UV-Spektrophotometrie

Nukleinsäuren besitzen ein Absorptionsmaximum bei 260 nm

optische Dichte (OD260) von 1 entspricht einer Konzentration von 50 μg dsDNA/ml, 35 μg RNA/ml oder 33 μg ssDNA/ml.

Es wird in der Regel eine 200 fache Verdünnung der Lösung in einem Endvolumen von 200 μl hergestellt und photometrisch in einer Quarzküvette gegen Wasser vermessen.

Die Reinheit der DNA-Lösung kann durch das Erstellen eines Absorptionsspektrums beurteilt werden, das bei 260 nm ein Absorptionsmaximum aufweisen sollte. Verunreinigung mit Protein lassen sich durch hohe Absorption bei 280 nm identifizieren.

Charakteristisch für eine saubere DNA-Lösung ist ein Wert des Quotienten 260nm/280nm nahe 2.


Übersicht Enzyme für die Molekularbiologie

Nukleasen

- Unspezifische Nukleasen (Endo- und Exonukleasen, Dnase, RNase)

- Spezifische Endonukleasen (Restriktions-Endonukleasen)

Ligasen

Polymerasen

- DNA-abhängige DNA-Polymerasen (Replikation)

- RNA-abhängige DNA-Polymerasen (Reverse Transkription)

- DNA-abhängige RNA-Polymerasen (Transkription)

Kinasen

Phosphatasen


Isolierte DNA „handlich“ machen

Unsere isolierte DNA besteht idealerweise aus Zucchini-Chromatiden (Länge mehrere cm/dm pro Molekül!)

- DNA-Moleküle können brechen/zerreißen

- gesuchtes Gen irgendwo auf den Chromatiden versteckt

- übliche Trennmethoden mit so langen DNA-Molekülen überfordert

Aufgabe:

- reproduzierbare Zerlegung der DNA in handliche Fragmente

Welche Methoden stehen zur Verfügung?


Unspezifische Nukleasen

Exonuclease III

- 3’-5’ Exonuklease

- dsDNA mit einem Einzelstrangbruch

- mit blunt ends

- 3’ recessed ends

Nuklease Bal 31 (Alteromonas expejiana)

- dsDNA => 3‘- und 5‘-Exonuklease

- ssDNA => Endonuklease

- Ca-abhängige Reaktionen, Stop durch EDTA

- Gezielte Verkürzung von DNA

Nuklease S1 (Aspergillus oryzae)

- ssDNA => Endonuclease (pH<4,5 / T<20°C !)

- Abbau ungepaarter Bereiche in DNA-RNAHybriden (cDNA-Synthese)


Unspezifische Nukleasen

DNase I (Rinder-Pankreas)

- dsDNA und ssDNA, zufälliges Schneiden beider Stränge

- Entfernen von DNA, Einführen statistischer Schnittstellen in einzelne Stränge

- Enzym besitzt 3 verschiedene Aktivitäten, die in gentechnischen Experimenten unterschiedlich genutzt werden können

- 5‘-3‘ Polymerase-Aktivität : freie 3‘ OH-Enden, freie Nukleotide, Mg2+ als Kofaktor, Einzelstrangmatritze

- 5‘-3‘ Exonuklease-Aktivität: Abbau von DNA im Doppelstrang (Reparatur)

- 3‘-5‘Exonuklease-Aktivität: Korrekturlesen (in Gegenwart von dNTP‘s gehemmt)

- Polymerase-und Exonuklease-Aktivitäten liegen im intakten Enzym im Gleichgewicht vor

- Polymerasefunktion kann durch Salzkonzentration und die Konzentration freier Nukleotide erhöht werden


λ-Phagen infizieren E. coli unterschiedlich effizient!

Paar von Enzymen schützt Bakterien

Methylase markiert eigene DNA an spezifischen Stellen

Endonuklease schneidet DNA an den spezifischen Stellen, wenn diese nicht methyliert sind

=> fremde DNA wird abgebaut!


Spezifische Nukleasen (Restriktionsenzyme)

Quelle: Bakterien

- Restriktion: Immunität gegen Phagen, Schutz vor fremder DNA

- Schutz der eigenen DNA durch spezifische Methylierungsmuster

Als Werkzeuge interessant:

- Typ II Endonukleasen (sequenzspezifische Bindung und Hydrolyse)

Erkennungssequenzen:

- Palindrome / Nicht-Palindrome

- 4-8 Basenpaare (4-, 5-, 6-, 8- cutter)

Isochizomere: Gleiche ES, gleiche Schnittstelle

Neochizomere: Gleiche ES, andere Schnittstelle

Schnitt-Frequenzen (statistisch!):

- 4-cutter = 1/256 bp, 6-cutter = 1/4096 bp, 8-cutter = 1/65536 bp

Entstehende Fragmente: 5‘-Phosphat, 3‘-OH


Restriktions-Enzyme

Typ I: Schneidet die DNA an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.

Typ II: Schneidet die DNA innerhalb der Erkennungssequenz. Benötigt kein ATP und hat keine Methyltransferase-Aktivität.

Typ III: Schneidet die DNA etwa 20 bis 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Benötigt ATP und transferiert eine Methylgruppe von S-Adenosyl-Methionin.

Beispiele für Typ II:


Restriktion genomischer DNA

vollständige Restriktion mit einer Restriktionsendonuklease

vollständige Restriktion mit zwei ver-schiedenen Restriktionsendonukleasen

partielle Restriktion mit einer Restriktionsendonuklease


Auftrennen von DNA-Fragmenten

Agarose-Gel zur Trennung verschieden langer DNA-Fragmente

Trennende Kraft: elektrische Spannung

negativ geladene DNA wandert von der Anode zur Kathode

poröse Gelstruktur setzt der Wanderung der Fragmente Widerstand entgegen

je kleiner die Fragmente sind, desto schneller wandern sie


Wiedergewinnung von DNA aus Agarose-Gel

Ethidium Bromid

interkaliert in dsDNA

Nachweis der DNA durch Fluororeszenz

Gelstückchen können ausgeschnitten und die DNA eluiert werden

Wiedergewinnung der DNA durch Ethanolfällung

Achtung: UV-Licht schädigt die Augen!


Verbinden von DNA-Fragmenten

kompatible Enden von Restriktions-Fragmente hybridisieren miteinander

dsDNA wird gebildet

DNA-Ligase schließt Lücken im Zucker-Phosphat-Rückgrad der DNA

Doppelhelix aus zwei verschiedenen DNAs hergestellt


DNA-Ligasen

Verknüpfung des 3‘-OH eines DNA-Fragments mit dem 5‘-Phosphat eines anderen

benötigt ATP

Häufigste: T4-Ligase

Komplementäre „sticky ends“

- Raumtemperatur

- Reaktionszeit einige Stunden

Blunt ends

- 10°C oder Kühlschrank

- Reaktionszeit über Nacht

- Effizienz gering, da keine stabilisierenden Wasserstoffbrücken zwischen den zu verbindenden DNA-Fragmenten


Ligation verschiedener Restriktionsfragmente


Ligationsstrategien


Plasmide

ringförmige, extrachromosomal lokalisierte DNA-Moleküle, die in den meisten gram-positiven und gram-negativen Bakterien, in einigen Hefen, aber nicht in höheren Eukaryoten vorkommen

wurden Anfang der 50-er Jahre durch das Auftreten und die schnelle Ausbreitung von Antibiotika-Resistenzen entdeckt

verschaffen den Wirtszellen in entsprechender Umgebung (Anwesenheit des Antibiotikums) einen Wachstumsvorteil

Unterscheidung von konjugativen (F-Plasmid) und nicht-konjugativen Plasmiden

konjugative Plasmide können durch Transfer von einer Donorzelle in eine Rezipientenzelle übertragen werden (Konjugation)

Verwendung von nicht-konjugativen Plasmiden in der Gentechnik (biologische Sicherheit)


Eigenschaften von Vektoren

Replikationsursprung

- Voraussetzung für die Replikation

selektierbare „Marker“

- Nachweis der Anwesenheit des Plasmids in Bakterienzellen

- Antibiotikaresistenz

- auxotrophe Marker

Restriktionsschnittstellen

- nur je eine für verschiedene Restriktions-Endonukleasen, jedoch innerhalb der Marker, zur Linearisierung

geringe Größe

idealerweise bekannte DNA-Sequenz


Verknüpfung von DNA-Fragmenten

T4 Ligase als meist genutztes Enzym für die Verknüpfungsreaktion

Abhängigkeit der Verknüpfungsreaktion von der Konzentration der DNA-Fragmente

Bevorzugung von inter- oder intramolekularer Reaktion ist von der DNA-Konzentration und der Fragmentgröße abhängig

konstante DNA-Konzentration

Größe des DNA-Fragmentes Neigung zur intramolekularen Reaktion

konstante DNA-Fragmentlänge

DNA-Konzentration Neigung zur intramolekularen Reaktion

hohe DNA-Konzentrationen – Bevorzugung intermolekularer Reaktion

bei Klonierungsexperimenten ist bevorzugt eine bimolekulare Reaktion erwünscht


optimale Konzentrationen für bimolekulare Reaktion


Prinzip der DNA-Klonierung

Linearisierung des Vektors und der Fremd-DNA mit gleicher oder kompatibler Restriktions-endonuklease

Mischen der beiden DNAs in optimaler Konzentration

Ligierung mit T4-DNA-Ligase

Transformation in kompatible Wirtszellen (meist E.coli)


Transformation

einige Bakterien besitzen die Eigenschaft DNA aus der Umgebung aufnehmen zu können

Labormethoden zur Erhöhung der Aufnahmeeffizenz:

Hitzeschock

- Bakterienzellen werden mit Calciumchlorid oder effektiver mit Rubidiumchlorid behandelt, so dass zwischen der negativ geladenen DNA und der negativ geladenen Zellmembran weniger abstoßende Kräfte bestehen. Bei einem kurzen Hitzeschock (41–43 °C für 45–90 Sekunden) entstehen Poren in der Membranen, so dass die DNA in die Zellen gelangen kann.

Elektroporation

- Hierbei werden die Bakterien mit einem elektrischen Schock behandelt (2000-2500 V für einige Millisekunden), um die Membran zu öffnen. Diese Methode ist effektiver als die chemische Methode

Anschließend Kultur unter Selektionsbedingungen


Selektion der gesuchten Plasmide

Mögliche Ligationsergebnisse:

1.Vektor religiert

2.Fremd-DNA religiert

3.Vektor + Fremd-DNA ligiert

Gesucht: 3.

2. keine Replikation in Bakterien (ORI fehlt)

Bei Klonierung in BamH1-Stelle:

- 1. Klone Ampicillin- und Tetrazyklin resistent

- 3. Klone nur Ampicillin resistent

Identifikation der Klone durch Stempeln auf Ampicillin- und Tetrazyklin-Platten


Replikaplattierung


Selektionsbeispiel


Kinasen / Phosphatasen

Kinasen

- Anhängen eines Phosphats an 5‘-OH einer Nukleinsäure

- unter Verbrauch von ATP

- Häufigste: T4-Polynucleotidkinase

- Anwendung:

- Markierung mit radioaktivem 32P

- Auffüllen dephosphorylierter 5'-Enden

Phosphatasen

- Abspalten eines Phosphats vom 5‘-Ende einer Nukleinsäure

- BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase)

- CIP (Calf Intestine Phosphatase)

- Anwendung: Verhinderung unerwünschter Ligation


Verhinderung der Vektor-Religierung

Alkalische Phosphatase entfernt 5'-Phosphat

linearisierter Vektor kann nicht mehr rezyklisiert werden

Bei Hybriden mit Fremd-DNA kann zumindest je Strang eine Lücke geschlossen werden


Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen

Nach der Klonierung unseres Gemisches von DNA-Fragmenten aus Zucchini erhalten wir eine Fülle von Klonen, von denen einige wenige das oder die gesuchten Fragmente enthalten sollten

Wie können wir diese identifizieren?

einige Möglichkeiten:

- Komplementation auxotropher Mutanten (Mangelmutanten)

- Fragment muss intaktes Gen enthalten, das auxotrophe Mutation komplementieren kann

- Zielorganismus (E.coli) muss Gen des Spenders (Zucchini) „verstehen“

- Vektor muss zur Genexpression (Transkriptions-Signale) fähig sein

- Direkte Identifikation durch DNA-DNA-Hybridisierung mit „Sonden-DNA“

- Sequenz muss zumindest teilweise bekannt sein, z. B. Ableitung aus Proteinsequenz, bekannte Sequenz eines nahe verwandten Organismus

- Sonde muss markiert sein


DNA-Polymerasen

DNA-Polymerase I aus E. coli (Kornberg-Polymerase)

- DNA-Synthese 5‘=>3‘ an DNA-Matrize und Primer

- 5‘-3‘-Exonuklease

- 3‘-5‘-Exonuklease

- Nick-Translation

Klenow-Polymerase

- Proteolyse der DNA-Polymerase I

- Klenow-Fragment => stark verminderte Exonuklease

- Auffüllen von Einzelsträngen, benötigt Primer

Thermostabile DNA-Polymerasen

- PCR-Enzyme !


nick translation

A) DNase I erzeugt Einzelstrang-Brüche (nicks) indem sie die Phosphodiester-Bindungen (p) spaltet. Dabei entsteht eine 5'-Phosphat-Gruppe und ein 3'-Hydroxyl-Ende. Zugabe von E. coli DNA Polymerase I liefert zwei Enzymaktivitäten: i. 5'3' Exonuclease entfernt vom freien 5'-Ende

sequentiell Nukleotide in 5'3' Richtung

ii. DNA Polymerase baut von der freien 3'-Hydroxyl Gruppe in 5'3' Richtung neue Nukleotide ein und füllt die, durch Exonuklease erzeugte, Lücke wieder auf (translation)

B) Random primed labeling. Klenow-Polymerase synthetisiert radioaktiv markierte DNA-Stränge anhand hitze-denaturierter Einzelstrang-Matritzen mit Hexanukleotid Primern mit zufälligen Sequenzen


End-Markierung von DNA

A) Markierung von Oligonukleotiden durch Kinase.

• Das 5'-terminale Phosphat wird in einer Austauschreaktion durch 32P-markiertes -Phosphate aus [-32P]-ATP ersetzt. Auf gleiche Weise können beide 5'-Enden doppel-strängiger DNA markiert werden.

B) Auffüllen überhängender Enden mit Klenow-Polymerase.

• DNA wird mit einer passenden Restriktions Endonuclease gepalten um 5'-Überhänge zu erzeugen. Diese dienen als Primer für Klenow_Polymerase um markierte Nukleotide ein zu bauen. Fragmente, die nur an einem Ende markiert sind, können durch internes Schneiden in einer passenden Restriktionsstelle erzeugt werden, um zwei unterschiedlich große Fragments zu erhalten, die leicht nach der Größe fraktioniert werden können.


radioaktiv:

- 32P ([-32P]ATP)

- 35S (ersetzt O- in [-P]ATP)

- Nachweis durch Autoradiographie (Schwärzung eine Films durch radioaktive Substanzen)

nicht radioaktiv

- Fluoreszierende Gruppe

- anitgene Gruppe (Digoxigenin, Nachweis mit anti-Digoxigenin-Antikörper, der an Reportermolekül gekoppelt ist, das wiederum Farbreaktion auslöst)

- ...

Markierungsmöglichkeiten für DNA


Hybridisierung


Hybridisierung und Renaturierung


Southern Transfer


Hybridiserung und Autoradiografie


Southern - Ergebnisse


RFLPs: Restriction Fragments Length Polymorphisms

verschiedene Allele eines Gens können verschiedene Restriktionsmuster produzieren

diese Muster sind vererbbar

Verwendung:

- Genomkartierung- Analyse von Varianten- Verwandschaftsanalyse- DNA-Fingerprinting


DNA - fingerprinting

D2: Tochter aus erster Ehe der Mutter

S2: Adoptivsohn

DNA des Verdächtigen 1 stimmt mit Sperma-DNA vom Tatort überein

„boyfriend“ war nicht beteiligt


Übersicht Blotting - Methoden

Prinzip

- Trennung von Makromolekülen durch Elektrophorese

- Transfer der Moleküle aus dem Gel auf Nitrozellulosemembran

- Nachweis spezifischer Moleküle

Southern

- Makromoleküle: DNA

- Nachweis: Hyridisierung mit markierten Sonden (DNA, Oligonukleotide)

Northern

- Makromoleküle: RNA

- Nachweis: Hyridisierung mit markierten Sonden (DNA, Oligonukleotide)

Western

- Makromoleküle: Proteine

- Nachweise: Antikörper


Verschiedene Vektortypen

Expressionsvektoren

- klonierte DNA soll in Wirtszellen exprimiert werden- Probleme:

- Wirtszelle muss DNA-Regulation des Ausgangsorganismus „verstehen“- gesamte Regulationseinheit muss kloniert sein

- Lösung: Klonierung des prozessierten Gens: mRNA

Vektor Einbaugröße (kb) Plasmid <10 kb

Bacteriophage 9-20 kb Cosmids 33-47 kb

BACs (künstlicheBakterienchromosomen) 75-125 kb

YACS (künstliche Hefechromosomen) 100-1000 kb

Cosmide sind Plasmid-Vektoren, die cos-Sequenzen (Phage λ)enthalten. Diese sind für die Integration in Phagen notwendig


Klonierung von prozessierten Genen: cDNA

Isolation von mRNA

- Regulation hat stattgefunden

- Splicing hat stattgefunden

- endgültige kodierende Sequenz

- Polyadenylierung durchgeführt

DNA-Synthese

- poly-dT als Primer!

- Reverse Transkriptase als DNA-Polymerase

zweite Syntheserunde zur Produktion von dsDNA

Klonierung der „fertigen Gene“ in Expressionsvektoren


RNA-abhängige DNA-Polymerasen

Reverse Transkriptasen

- Umschreibung retrovorale RNA in DNA

- Laboranwendung: cDNA-Synthese aus RNA

Enzme:

AMV-RT (Avian Myeloblastosis Virus)

- RNase H, (DNA-abh. DNA-Pol.)

- T = 42°C, niedrigere Prozessivität (1-2 kb)

MMLV-RT (Moloney Mouse Leukemia Virus)

- geringere RNase H

- T = 37°C, höhere Prozessivität (> 2 kb)

Modifizierte MMLV-RT (SuperScript etc.)

- keine RNase H !

- Produktlängen bis 20 kb !


Primer

Oligo-dT-Primer

- 15-20 dT

- Hybridisierung mit 3‘-PolyA-Schwanz der mRNA

- Möglichkeit der Full-length-cDNA

Random-Primer

- Statistische Hexamere

- Alle Bereiche von mRNA und Nicht-mRNA vertreten

Spezifische Primer

- Bei bekannter Sequenz

- Niedrige Ausbeuten

Anwendungen:

- cDNA-Banken

- RT-PCR


DNA-abhängige RNA-Polymerasen

Enzyme der regulären Transkription

Verwendung als Werkzeuge:

Polymerasen aus Phagen

- SP6-Polymerase

- T3-Polymerase

- T7-Polymerase

Erkennung spezifischer Promotor-Sequenzen

RNA-Synthese 3‘ von diesen Sequenzen


„DNA-Bibliotheken“

Quelle:- genomische DNA- cDNA

Ziel:- möglichst jede DNA-Sequenz eines Organismus in Plasmid kloniert (Genomsequenzierung)- möglichst jede mRNA eines Organismus als Klon (Physiologie, Zellzyklus, etc)


Expression humaner Antikörper in Bakterien

Klonierung des Vektors pSEX in E.coli führt zu Produktion veränderter M13-Phagen

Ein Teil der Bindeprotein pIII trägt eine humane erste Antikörperdomäne mit Antigenbindestelle


DNA-Bibiliothek in YACs

Mit Hilfe dieser Methode können extrem lange DNA-Fragmente bis zu 1 MBb (z. B. zur Erzeugung von Genombibliotheken) kloniert werden

Erzeugung langer Fragmente durch partiellen Restriktionsverdau

Es können Regulationsmechanismen größerer Geneinheiten untersucht werden


Expression in Pflanzen

● Agrobacterium tumefaciens (erzeugt Tumore in den Wirtspflanzen)

● Bei der Infektion einer Pflanze durch das Bakterium verlässt ein Stück DNA (= T-DNA) mit 30,000 Basenpaaren das Plasmid und integriert sich in die DNA der pflanzlichen Wirtszelle.

● Die Tumorgene der T- DNA müssen inaktiviert werden

● Fremdgene müssen an dieselbe Stelle des Ti-Plasmids integriert werden. Das rekombinante Plasmid mit dem integrierten Gen muß dann wieder in die A. tumefaciens Zelle transferiert werden. Die Bakterienzelle muß nun in das Protoplasma der Pflanzenzelle gebracht werden.

● Die Wirtspflanzen exprimieren die eingebarchten Gene


Transgene Pflanzen: einige Beispiele

Anti-Matsch-TomatePolygalacturonase (PG)

Bt-Mais („Genmais“)

Transgene SojapflanzenResistenz gegen Roundup,Liberty


Polymerase Kettenreaktion

PCR

Molekularbiologie

Methoden

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Dr. Thomas Seehaus


Geschichte

1970 Kjell Kleppe: Vermehrung von DNA durch zwei flankierende Primer, wegen fehlender technischer Möglichkeiten geriet die Methode wieder in Vergessenheit

1983 Kary Banks Mullis: erneute Erfindung der Polymerase-Kettenreaktion, Idee: künstliche Vervielfältigung von DNA durch wiederholte Verdopplung in mehreren Zyklen mit Hilfe von DNA-Polymerase

Verbesserung: Verwendung von thermostabilen DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien

Taq-Polymerase aus Thermus aquaticus, fehleranfällig -> Mutationen!

Pwu-Polymerase aus Pyrococcus woesei, Korrekturmechanismus!

Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, ebenfalls Korrekturmechanismus


PCR in der Praxis

Vervielfältigung von kurzen (bis 3000 bp), genau definierten Teilen eines DNA-Stranges

Benötigte Komponenten:

- Original-DNA

- zwei Primer, die den zu vermehrenden Bereich berenzen

- thermostabile Polymerase

- Nukleotide

- Mg2+-Ionen (Kofaktor der Polymerasen)

- Pufferlösungen (geeignete chemische Umgebung für Polymerasen)

- Thermocycler


PCR - Beispiel

1,0 µl DNA-Vorlage (100 ng/µl)

2,0 µl pro Primer (10 µM)

1,0 µl Pfu-, Taq- oder andere thermostabile Polymerase (1-5 U/µl)

1,0 µl 10 mM Desoxy-Nukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), „dNTP“

5,0 µl 10fach konzentrierte Polymerase-Pufferlösung

38,0 µl H2O

ad 50,0 µl Gesamtvolumen

Ein 200 µl-Reaktionsgefäß mit den 50 µl Gemisch wird in den Thermocycler gestellt.


Ablaufschema der PCR

(1) Schmelzen (Denaturierung) bei ca. 96 °C.

(2) Anlagerung (Primerhybridisierung) bei ca. 68 °C.

(3) Verlängerung (Elongation) bei ca. 72 °C (P=Polymerase).

(4) Der erste Zyklus ist beendet.


Schritte des PCR-Prozesses

Die folgenden Angaben sind als Richtwerte gedacht. Meist muss eine PCR auf die spezifische Reaktion hin optimiert werden. Für eine normale Präparation eines Amplifikats reicht folgendes Programm aber aus:

Initialisierung. Das Gemisch wird ca. 2 Minuten lang auf 96 °C erhitzt, um sicherzustellen, dass sich die DNA-Doppelstränge getrennt haben. Manche (sogenannte hot start-) Polymerasen müssen auch durch eine noch längere anfängliche Erhitzungs-Phase (bis zu 15 Minuten) erst aktiviert werden.

Denaturierung. Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf 96 °C halten. Das genügt gewöhnlich, um die DNA während der Zyklen zu zerlegen.

Anlagerung (annealing). Die Temperatur ca. 30 Sekunden lang auf einer Temperatur halten, die eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. Die genaue Temperatur wird hierbei durch die Länge und die Sequenz der Primer bestimmt (bzw. der passenden Nukleotide im Primer, wenn durch diesen Mutationen eingeführt werden sollen = site-directed Mutagenesis). Wird die Temperatur zu niedrig gewählt, können sich die Primer u. U. auch an nicht 100%-komplementären Sequenzen anlagern und so zu unspezifischen Produkten („Geisterbanden“) führen. Wird die Temperatur zu hoch gewählt, ist die thermische Bewegung der Primer u. U. so gross, dass sie sich nicht richtig anheften können, so dass es zu gar keiner oder nur ineffizienter Produktbildung kommt. Meist liegt die Temperatur bei 55°C bis 65°C.


Schritte des PCR-Prozesses

Verlängerung (elongation). Die Temperatur für ca. 30 Sekunden je 500 Basenpaare auf 68-72 °C (je nach Polymerase) halten.

Die Schritte 2-4 werden 25-40 mal wiederholt.

Das Gemisch wird bei 4-8 °C aufbewahrt. Man kann die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einleiten, so dass sie über Nacht läuft. Die DNA wird bei 4-8 °C nach nur einer Nacht nicht beschädigt.

Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist ein Verfahren, bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschließend eine Spannung angelegt wird. Dann bewegen sich die kürzeren DNA-Stränge schneller als die längeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit einer DNA-Leiter, die DNA-Fragmente bekannter Größe enthält und parallel zur Probe im Gel mitläuft, bestimmt werden.

Das PCR-Produkt in niedriger (Bande 2) und hoher (Bande 3)Konzentration im Vergleich mit der DNA-Leiter (Bande 1) in Agarose-Gel.

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