„molekulare biophysik“ nmr-spektroskopie (teil...
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„Molekulare Biophysik“
NMR-Spektroskopie
(Teil 3)
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DasNMR-Spektrometer
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Peter SchmiederFMP
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
Hardware-SchrankProbenkopf
Probenwechsler
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
B0 [Tesla] 0 [MHz]
1.4 60
5.9 250
9.4 400
14.1 600
21.2 900
Das Erdmagnetfeld hat eine Stärke
von 30-60 T (0.3 –0.6 Gauss)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magnet
flüssiger Stickstoff
Supraleitende Spule
Bohrung des Magneten:54 mm „narrow bore“89 mm „wide bore“
flüssiges Helium
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Magneten sind faszinierend aber auch gefährlich
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
RT-Probenkopf
Cryo-Probenkopf
ATM-Probenkopf
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Der Probenkopf
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Die Probe im Probenkopf
Helmholtz-Spule
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Der Shim, das Problem der Homogenität
abcd
a,b,c,d
a,b,c,da,b,c,d
a,b,c,d
a
b
c
d
d
c
b
a
t
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Die Hardware, d.h. die Elektronik
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Hardware
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Hardware
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
;zgdc;avance-version (03/04/17);1D sequence with decoupling
#include <Avance.incl>
"d11=30m"
1 zed11 pl12:f2
2 30m do:f2d11 cpd2:f2d1p1 ph1go=2 ph3130m do:f2 mc #0 to 2 F0(zd)
exit
ph1=0 2 2 0 1 3 3 1ph31=0 2 2 0 1 3 3 1
Software
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Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Ein Problem der eindimensionalen NMR-Spektroskopie ist, dass selbst recht einfach
Moleküle oft nicht oder nur mit hohem Aufwand eindeutig zugeordnet werden können
Zimtsäureethylester
Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)
O
O
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Ein Zuordnung mit Datenbanken ist oft nicht sicher genug
O
OH
H
7.21
7.14
7.21
7.30
7.30 4.19
1.30
7.64
6.39
01234567PPM
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm
3.0
2
2.0
7
1.0
0
2.9
9
3.1
2
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit 13C oft noch besser als mit 1H
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
020406080100120140160180PPM
160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Der entscheidende Vorteil dermehrdimensionalen NMR-Spektroskopie ist:
MagnetisierungstransferEs entstehen Signale, die auf eine Wechselwirkung zwischen den Kernen hinweisen. Das können WW
durch die Bindung (via J-Kopplung) oder durch den Raum (via NOE) sein.
Diese Signale werden auf einer Fläche oder in einem mehrdimensionalen Raum verteilt, was eine gute
Auflösung ermöglicht.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-NMR2 Achsen:
Intensität vs. Frequenz
2D-NMR3 Achsen:
Intensität vs. Frequenz (1)vs. Frequenz (2)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-NMR schematisch
Preparation Detektion
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
1D-1H-Spektrum
C11H13N2O3Br
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
2D-NMR Sequenzen enthaltenzwei neue Elemente:
Evolutionszeit und Mischzeit
Preparation Evolution Mischung Detektion
Evolution:Erzeugen einer weiterenFrequenzachse durch indirekte Detektion
Mischung:Transfer von Magnetisierung von
Spin zu Spin über Wechsel-Wirkungen zwischen Spins
(t1) (t2)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit der Evolutionszeit wird
eine indirekte Dimension
erzeugt, man bewerkstelligt
das durch die systematische
Veränderung einer
Zeitspanne in einer Sequenz
von Pulsen, man braucht also
mindestens zwei Pulse.
Die Evolutionszeit
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Die Aufzeichnung des FIDs
haben wir uns schon im Detail
angeschaut, sie wird jetzt für
jeden neuen Zeitwert
wiederholt. Auch in der
indirekten Dimension müssen die
Zeiten ganzzahlige Vielfache
eines Intervalls t sein
Die Evolutionszeit
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Das schauen wir uns wieder näher an und nutzen die gleichen
drei Linien wie beim 1D
z
x
y 90°-x
z
x
y 2000 Hz-500 Hz
-1500 Hz
90Y90-x
kt1kt2
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Man erkennt dass die Anfangsintensität in t2
von der Frequenz abhängt
(kt1 = t1)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000
10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0
[Hz]
[ppm]
x
y
t1 = 166 sec
x
y
x
y
t1 = 0 sec
x
y
t1 = 332 sec t1 = 498 sec
t1 = 0 sec
t1 = 166 sec
t1 = 332 sec
t1 = 498 sec
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3000 2000 1000 0 -1000 -2000 -3000
10 8.33 6.66 5 3.33 1.66 0
[Hz]
[ppm]
t1 = 0 sec
t1 = 166 sec
t1 = 332 sec
t1 = 498 sec
t [msec]
0.1
0.2 0.3
0.4
0.5Iy0
1
-1
Entlang der indirekten Zeitachse entsteht das gleiche Bild wie entlang der direkten
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Insgesamt also ein zweidimensionaler FID
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Eine erste FT ergibt ein „Interferogram“.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Eine zweite FT ergibt ein zweidimensionales Spektrum.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Zur Auswertung
betrachtet man
Contour-Plots, die
Peakintensität als
Höhenlinien
darstellen.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
In mehrdimensionalen Experimenten wird gute Auflösung
durch mehr Werte für kt1 erreicht.
Daher ist in mehrdimensionalen Experimenten die
Auflösung in den indirekten Dimensionen immer begrenzt.
Die Zeit für die Messung ist
aber der Anzahl der
aufgezeichneten FIDs direkt
proportional, gute Auflösung
bedeutet also lange Messzeit.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Gäbe es nur Evolution und Detektion dann würde in
beiden Zeitdimensionen immer die gleichen Frequenzen
detektiert, ganz entscheidend ist also die Mischzeit, in
der es zur Übertragung von Magnetisierung von einem
Kern zum nächsten kommt.
Preparation Evolution Mischung Detektion
(t1) (t2)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Diese Übertragung von Magnetisierung während der Mischzeit kann durch verschiedene Mechanismen
geschehen. Der am meisten verwendete Mechanismus ist die J-Kopplung, von großer Bedeutung ist aber auch
der NOE-Effekt, die Übertragung durch den Raum.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Wichtig ist auch ob die Übertragung zwischen gleichen Spins der gleichen Kernsorte oder
andersartigen Spins erfolgt.Man unterscheidet daher homonukleare und
heteronukleare Experimente.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
homonukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen gleichartigen Kernen statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen des gleichen Kerns. Findet Transfer statt, ergibt sich in beiden Dimensionen eine unterschiedliche Verschiebung: KreuzsignalFindet kein Transfer statt, dann ergibt sich in beiden Dimensionen die gleiche Verschiebung:Diagonalsignal
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
heteronukleare Experimente Transfer von Magnetisierung findet zwischen unterschiedlichen Kernsorten statt. Beide Frequenzachsen zeigen die chemischen Verschiebungen unterschiedlicher Kerne. Findet Transfer statt, ergibt sich ein Signal am Schnittpunkt der chemischen Verschiebungen der involvierten Kerne. Findet kein Transfer statt, dann ergibt sich kein Signal.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
3D-NMR
Preparation
Preparation
Evolution
Evolution
Mischung
Mischung
Detektion
Detektion
Preparation Evolution (1) Mischung (1) Evolution (2) Mischung (2) Detektion
Ein dreidimensionales Experiment entsteht formal durch
Kombination von zwei zweidimensionalen Experimenten,
solche Experimente sind vor allem bei Proteinen wichtig.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Das Spektrum ist dann keine Fläche mit
Signalen mehr sondern ein Würfel, mit drei
Achsen mit chemischer Verschiebung.
Intensität zeigt sich als „vierte Dimension“
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Mit einem Satz homo- und heteronuklearer 2D-Experimente sollte eine Zuordnung aller Resonanzen von kleinen Molekülen möglich sein, oft braucht man
nur ein COSY, ein HMQC und ein HMBC
Zimtsäureethylester
Ethyl-3-phenylprop-2-enoat (IUPAC)
O
O
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Das COSY-Experiment
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Die einfachste denkbare zweidimensionale
Sequenz besteht aus zwei Pulsen, das ist das
homonukleare COSY:
90Y90x
t1
Preparation Evolution Mischung Detektion
t2
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Wir haben mit derEvolutionszeit eine zweiteDimension erzeugt aber
das 2D Spektrumhat nur eine Diagonale.
Wenn wir nur die Evolution betrachten haben wir aber auf beiden Achsen die gleiche Information.
1 2
1
2
H1 H2H (ppm)
H (ppm)
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Wenn wir in der Mischzeit aber Transfer haben dann
ist etwas neues entstanden:
Es gibt Signale, die in den
beiden Dimensionen mit
unterschiedlichen
chemischen Verschiebungen
„markiert“ worden sind:
die Kreuzsignale. 1 2
1
2
H1 H2H (ppm)
H (ppm)
Transfer
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
Ein Anwendungsbeispiel:
H H H H
?J12 J34
J12 ~ J34
Eine Zuordnung ist im 1Dnicht möglich...
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
COSY
....aber im 2D ganz leicht.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Mehrdimensionale NMR-Spektroskopie
Im COSY ist die Ethylgruppe leicht, Aromat und Olefin nicht komplett zuzuordnen
O
O
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
8
7
6
5
4
3
2
1
ppm
7.07.5 ppm
7.0
7.5
H
HH
H
H
H
H
O
OH
H
7.21
7.14
7.21
7.30
7.30 4.19
1.30
7.64
6.39
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Das HMQC/HMBC-Experiment
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Bislang haben wir ein homonukleares Experiment betrachtet, man kann aber auch in natürlicher
Häufigkeit heteronuklearen Experimente machen, entweder basierend auf der direkten 1H-X-
Kopplung (HMQC) oder der Weitbereichskopplungen (HMBC).
X nX
1H
nX X X
1H HMQCHMBC
X
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Ob ein Transfer stattfindet hängt von der Größe
der Kopplungskonstanten ab und kann auch durch die
Pulssequenz beeinflusst werden.
Mit Kopplungen < 1 Hz ist kein Transfer möglich.
Kopplungen über eine Bindung sind größer als über
mehrere Bindungen.
1JHH = 276 Hz
2JHH = 0 .. 30 Hz3JHH = 0 .. 20 Hz4JHH = 0 .. 3 Hz
1JHC = 125 .. 200 Hz
2JHC = 0 .. 20 Hz3JHC = 0 .. 15 Hz4JHC = 0 .. 2 Hz
1JHN = 60 .. 100 Hz
2JHN = 0 .. 15 Hz3JHN = 0 .. 8 Hz4JHN = 0 .. 1 Hz
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Man kann sich zwei Varianten von heteronuklearen
zweidimensionalen Experimenten überlegen, je
nachdem welchen Kern man detektiert und welchen
man in der indirekten Dimension hält.
Das hat Einfluss auf die Auflösung, die erreichbar
ist, und auf die Empfindlichkeit der Messung.
In der indirekten Dimension erfordert doppelte
Auflösung doppelte Zeit, in der direkten Dimension
ist das kein Problem.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Die Empfindlichkeit der Messung hängt von mehreren Faktoren ab:
MagneticMoment
Spin AngularMomentum
Bd 0S/N ~ (pB0) (d)( )
H ~ 4 C, die Detektion auf Protonen bringtalso einen Faktor 8 !!
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56/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
X
H
HMQC = Heteronuclear MultipleQuantum Correlation
Ein Signal zeigt die direkte Bindung
zwischen H und X an.
Die Kopplung zwischen H und X ist nicht zu sehen, während der Evolution
und der Acquisition wird „entkoppelt“.
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57/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
O
O
Im HMQC unseres kleinen Moleküls bekommen wir 5 Korrelationen von Wasserstoffen zu Kohlenstoff im Aromaten / Olefin-Bereich
ppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
140
120
100
80
60
40
20
ppm
7.07.58.0 ppm
130
140
H
HH
H
H
H
H
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
100% Zuordnung haben wir aber noch nicht
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58/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
Um die Spektren ganz zweifelsfrei zuzuordnen brauchen wir dann das HMBC in dem Signale durch die
kleinen, über mehrere Bindungen reichenden Kopplungen erzeugt werden.
Im allgemeinen sind 2J und 3J Kopplungen groß genug um eine Korrelation zu ergeben, in bestimmten Situationen können aber auch Kopplungen über mehrere Bindungen
Signal ergeben.Signale durch direkte Kopplung versucht man zu unterdrücken um das Spektrum zu vereinfachen.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
HMQC/HMBC
= via 1JHX
Transfer via 1JHX Transfer via nJHXX
H H
HMBC = Heteronuclear MultipleBond Correlation
HMQC HMBC
Es bleiben nicht unterdrückte Signale von den 1JHC übrig als kleine Doubletts, andere Signale zeigen
Weitbereichskopplung an.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
Im HMBC sind die Signale der Ethylgruppe wieder eindeutig und man findet auch leicht das CO der Säuregruppe
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
O
OH
HH
H
H
H
H
CH3
H Hppm
8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
40
60
80
100
120
140
160
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Das NMR-Spektrometer
O
O
Um mit Aromaten und Olefinen klar zu kommen muss man sehr genau hinschauen
O
O
128.7
128.0
128.7
126.4
135.2
126.4 145.2
116.3
166.561.4
14.2
H
HH
H
H
H
H
CH3
H H
grün = HMQC, rot = nicht unterdrückte Signale
ppm
6.66.87.07.27.47.67.88.0 ppm
120
125
130
135
140
145
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Ein Beispiel
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br Desoxythymidin
Das Molekül: Brivudin
Brivudin wird bei Herpes zoster angewendet
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
N
NHCH3
O
O
O
OH
OH
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
Die Experimente
1D-1H 1 min
1D-13C 1 h
DEPT 10 min
COSY 10 min
13C-HMQC 10 min
13C-HMBC 50 min
15N-HMQC 3 h
15N-HMBC 35 h
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
1D-1H-Spektrum
C11H13N2O3Br
DMSO
H/D
H/D
H2O
1 1 11 1 1 1 1 1 2 2
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br
1D-13C-Spektrum
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
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67/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
C11H13N2O3Br
DEPT-Spektrum
1D-13C-Spektrum
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
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68/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
Zuckerbereich
Korrelation von Frequenzen via 1H-1H-Kopplung, i.a. nur zwei oder drei Bindungen.
COSY
6
3
7 oder 8,nicht unterscheidbar
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
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69/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
DMSO
H2O
H/D
COSY
3‘OH
5‘OH
1‘
2‘
4‘5‘
3‘
1'
2'3'
4'
5' O
OH
OH
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70/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMQCZuckerbereich
Basenbereich
1‘
2‘
4‘
5‘3‘
6Korrelation von Frequenzen
via 1H-13C-Kopplung, man korreliert nur direkt
aneinander gebundene Kerne.
7/8
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
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71/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
2‘
1‘4‘ 5‘3‘6 7/8 7/8
1D-13C-Spektrum
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72/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC
1‘
Zuckerbereich
Basenbereich
Korrelation von Frequenzen via 1H-13C-Kopplung, man korreliert über bis zu 4
Bindungen (2JHC bis 4JHC), 1JHC gibt ein Dublett.
N
NHBr
O
O
O
OH
OH
1
1'
2'3'
4'
5'
2
34 5
6
7
8
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73/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
1‘
6
4‘
2
5
Korrelation ausgehend von H1‘ Korrelation zu 5 ist
schwach und 5 ist von 7/8 aus zu sehen.
= via 1JHC
6
7/8
7/8 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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74/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
3
1‘
2
5
Korrelation ausgehend von H3
C2 fehlt !!
7
4
Hier muss 7 sein N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
6 1‘
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75/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
7
5
Korrelation ausgehend von H7, das via H3 zugeordnet ist.
4
8
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
8
5
Korrelation ausgehend von H8, das via H3/H7 zugeordnet ist.
7 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
13C-HMBC(Basenbereich)
6
61‘
2
5
Korrelation ausgehend von H6, alles ist zu sehen, das hilft nicht beim Zuordnen,
es passt aber alles.
7
4
8
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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78/90
Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
ppm
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
142
144
146
148
150
152
154
156
158
160
162
164
166
168
170
15N-HMQC
3 N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
ppm
13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
142
144
146
148
150
152
154
156
158
160
162
164
166
168
170
15N-HMBC
3
1
3 6 1‘ 2‘
N
NHBr
O
O
H
HH
H
1
1'
2
34 5
6
7
8
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
Ein Beispiel: Brivudin
Zuordnung1H [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]
1' 6,16 84,5 -
2' 2,17 39,8 -
3' 4,27 69,9 -
4' 3,79 87,5 -
5' 3,62 61 -
1 - - 149,7
2 - 149,2 -
3 11,92 - 157,7
4 - 161,6 -
5 - 109,7 -
6 8,09 139,4 -
7 6,87 129,9 -
8 7,25 106,5 -
13C [ppm] 13C [ppm] 15N [ppm]
predicted dT dT
1' 77,8 ± 8,2 85,1 -
2' 39,9 ± 5,1 40,4 -
3' 68,7 ± 1,6 71,7 -
4' 74,8 ± 9,2 88,4 -
5' 63,8 ± 0,3 62,4 -
1 - - 142,7
2 156,8 ± 10,6 151,6 -
3 - - 153,5
4 135,7 ± 6,9 137,3 -
5 117,5 ± 3,1 110,5 -
6 135,7 ± 11,4 164,9 -
7 132,6 ± 6,9 - -
8 89,4 ± 15,8 - -
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DOSY
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Das DOSY (Diffusion Ordered SpectrocopY) ist eine besondere Art von Spektroskopie, da es zweidimensionale
Spektren erzeugt, die auf einer Achse die Diffusionrate des Moleküls anzeigen.
Die Diffusionsrate kann für unterschiedliche Untersuchungen von Bedeutung sein, z.B. für eine Bestimmung von Größe oder
Aggregation. Sie kann aber auch zur Untersuchung von Stoffgemischen eingesetzt werden, wobei die Spektren der im Gemisch enthaltenen Stoff nach deren Größe getrennt
aufgetragen werden.Das Experiment nutzt die Tatsache dass die Diffusion die
Moleküle durch das Probenvolumen bewegt, dessen Magnetfeld durch Gradienten beeinflusst werden kann.
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Ohne Diffusion können zwei Gradienten durch einen 180°-Puls aufgehoben werden. Den 180°-Puls kann man auch in zwei Hälften teilen und dazwischen einfach warten das Diffusion passiert, z-
Magnetisierung ist langlebiger als x,y-Magnetisierung
180 18090 90 90
G z
H1
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSYDas Experiment wird nun mehrfach durchgeführt und dabei die Gradientenstärke zwischen 0 und maximal variiert. Man erzeugt also eine indirekte Dimension mit Gradientenstärke statt Zeit.
Die Zeit für die Diffusion bleibt dabei konstant.
180 18090 90 90
G z
H1
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
I
g [T/m]
Die zu erwartenden Intensitäten ergeben sich aus den
Diffusionsgleichungen: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]
Das ist eine Gauss-Kurve: I = Io exp – x g2
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Die kann linearisiert werden: I = Io exp [- D 2 g2 2 ( - /3 - /2)]
T = 2 ( - /3 - /2) - ln (I/Io) = D 2 T * g2
g2 [T2/m2]
- ln (I/Io)
y = -0,0051203 + 14,129x R= 0,99998
Damit kann die
Diffusionskonstante
aus der Steigung
ermittelt werden
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
% Gradient
0
100
80
60
40
20
Ein praktisches Beispiel ist die Untersuchung zweier
Komplexbildner in D2O, es sollte festgestellt werden ob die beiden
eine Komplex miteinander bilden
1H-1D-Spektrum
pseudo-2D-Spektrum
Gauss-Kurve
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Zur Auswertung wurde neben der linearisierten Gausskurve….
auch eine andere Art der Darstellung gewählt
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Vorlesung "Molekulare Biophysik": NMR-Spektroskopie
DOSY
Man kann die Gausskurven durch eine inverse Laplace-
Transformation in ein Spektrum mit Diffusionskonstante auf der
indirekten Achse verwandeln.
HDO
CB6CS
log(m2/s)
log(m2/s)
Diffusionskonstante
Diffusionskonstante