monographie parabens
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LES PARABENS
UTILISATION ET TOXICITÉ
PHOTO : XEOPHIN
ELIE Nicolas
RIPOLL Lionel
Master 1 Chimie Fine
Le Havre, 2007
Table des matièresIntroduction :............................................................................................................... 1
1. Que sont les parabens :............................................................................................. 2
1.1. Propriétés et structures chimiques :...................................................................... 2
1.2. Emploi :............................................................................................................ 2
1.3. Mode d'action :.................................................................................................. 3
1.4. Législation :....................................................................................................... 3
2. Moyens d'obtention possibles :.................................................................................... 4
2.1. Synthèse industrielle :........................................................................................ 4
2.2. Biosynthèse :..................................................................................................... 5
3. Méthodes officielles de dosage et d'analyse :................................................................ 6
3.1. Identification :................................................................................................... 6
3.1.1. Solution de référence :................................................................................. 6
3.1.2. Échantillon :................................................................................................ 6
3.1.3. Exploitation des résultats :............................................................................ 7
3.2. Dosage :........................................................................................................... 7
3.2.1. Gamme étalon :.......................................................................................... 8
3.2.2. Échantillon :................................................................................................ 8
3.2.3. Exploitation des résultats :............................................................................ 8
4. Toxicité :................................................................................................................. 9
4.1. DJA, DL50 et doses absorbées :........................................................................... 9
4.2. L'hydrolyse des parabens................................................................................... 10
4.3. Toxicité de l'acide p-hydroxybenzoique :.............................................................. 11
4.4. Bioaccumulation :............................................................................................. 11
4.5. L'effet oestrogénisant :...................................................................................... 12
4.6. Parabens et cancer du sein :.............................................................................. 13
4.7. L'effet allergisant.............................................................................................. 13
5. Produits de substitution :.......................................................................................... 14
6. Conclusion :........................................................................................................... 15
Bibliographie
INTRODUCTION :
La famille des parabens regroupe les esters de l'acide p-hydroxybenzoïque. Le nom de
parabens est d'ailleurs une compression du nom de PARAhydroxyBENzoates [1].
On peut les retrouver commercialement sous différentes appellations. Par exemple, le
méthylparaben se retrouve sous les noms de 4-(méthoxycarbonyl)phénol, nipagin®,
méthyl-p-hydroxybenzoate, méthyl-4-hydroxybenzoate, p-hydroxybenzoate de méthyle, ...
Cependant, dans les produits alimentaires et cosmétiques, la législation prévoit une
appellation commune sous les noms de méthyl, éthyl, propyl et butylparabens [2].
Leur première utilisation en tant que conservateur remonte à 1920. Selon la définition de
la Communauté Européenne [3], on entend par conservateur toute substance “ qui prolonge
la durée de conservation des denrées alimentaires en les protégeant des altérations dues
aux micro-organismes ”.
L'absence de problèmes liés à leur utilisation depuis cette date en font des substances
considérées comme sûres.
Ce n'est que dernièrement que des études ont remis en cause leur utilisation et lancé la
polémique actuelle, suite à la découverte de leur effet oestrogénisant et de leur présence
dans des cellules cancéreuses.
Notre travail consistera en la synthèse de divers travaux sur le sujet afin de faire le point
sur l'état des connaissances actuelles.
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Structure générale
R Methyl Ethyl Propyl Butyl
N° CAS 99-76-3 120-47-8 94-13-3 94-26-8
N° EINECS 202-785-7 204-399-4 202-307-7 202-318-7
N° INS/E(ester / sel)
E218 / E219 E214 / E215 E216 / E217 -
Masse Molaire
(g.mol-1)152,05 166,06 180,08 194,09
Pf (°C) 131 116-118 96-98 68-69
Peb (°C) 270-280 297-298 - -
Solubilité dans l'eau à
25°C0,25 % 0,17 % 0,05 % 0,02 %
pKa 8,17 8,22 8,35 8,37
Apparence(à 25°C)
Cristaux incolores sans odeur et sans goût
Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des principaux parabens
OR
HO
O
1. Que sont les parabens :
1.1. Propriétés et structures chimiques :
Comme nous l'avons déjà vu, les parabens constituent la famille des esters de l'acide
p-hydroxybenzoïque.
Les différentes propriétés physico-chimiques des parabens les plus couramment utilisés
sont regroupées dans le tableau 1. Cependant, on trouve aussi l'isopropyl, l'isobutyl et le
benzylparaben qui ne sont pas détaillés dans le tableau du fait de leur faible emploi.
Les produits cosmétiques et alimentaires sont généralement sous forme liquide ou gel et
ont un pH compris entre 5 et 7 (pour les produits H/E). Avec un pKa moyen de 8,2, les
parabens sont des acides faibles. Ils se trouvent donc sous leur forme acide dans ce
domaine de pH. À température ambiante, ils se présentent sous la forme de cristaux, il
faudra donc les solubiliser dans un solvant adéquat pour les incorporer dans la matrice
souhaitée. Leur solubilité dans l'eau étant assez faible, on emploie souvent des solubilisants
et on les substitue, notamment en alimentaire, par leurs sels.
Compte tenu de leurs hauts points d'ébullition, supérieurs à 270°C, les parabens sont
stables à la température, ils peuvent donc être employés dans des produits destinés à la
cuisson [4].
1.2. Emploi :
Les parabens sont employés dans un grand nombre de produits alimentaires et
cosmétiques pour leurs propriétés antifongiques et antimicrobiennes [5][6].
De plus, leur faible toxicité, leur large spectre d'activité (sur les bactéries, levures,
moisissures et champignons), leur bonne stabilité chimique (vis-à-vis du pH et de la
température), leur biodégradabilité et leur faible coût en font des conservateurs très
employés [4].
Ils peuvent être utilisés dans des produits en contact avec la peau, les muqueuses, les
cheveux, les ongles, les aisselles. Ils sont actuellement utilisés dans 80 % des formulations
cosmétiques [2].
En alimentaire, on les trouve dans les pâtisseries, les glaces, les boissons non
alcoolisées, les crèmes, les confitures et gelées, les conserves, les sirops, ... Les parabens
méthyliques et propyliques sont les plus utilisés dans ce domaine [4].
Ils sont très efficaces contre les champignons et les bactéries. Cependant, ils sont plus
actifs contre les bactéries Gram-positives que contre les Gram-négatives. Ils sont souvent
employés en combinaison avec d'autres conservateurs comme des précurseurs du
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formaldéhyde, des isothiazolinones ou du phénoxyéthanol afin de compléter leur spectre
d'action [7].
Leur solubilité dans l'eau décroît et leur pouvoir antibactérien augmente avec la longueur
de leur chaîne alkyle. Ainsi, les méthyl et éthylparabens, bien que présentant les plus faibles
actions antimicrobiennes, sont les plus utilisés du fait de leur grande solubilité en phase
aqueuse. En effet, les attaques microbiennes sont majoritaires dans cette phase [6][8].
C'est pourquoi, en formulation, on préfère souvent utiliser une combinaison des
différents parabens, à chaînes alkyles courtes et moyennes, plutôt qu'un seul. La protection
de toutes les phases (aqueuse et huileuse) est ainsi assurée [9].
1.3. Mode d'action :
Le mécanisme d'action des parabens sur les bactéries est à l'heure actuelle encore mal
connu. Toutefois, certaines études proposent un modèle expliquant la lyse cellulaire.
Les études actuelles permettent de postuler un mécanisme d'activation moléculaire du
canal MscL [10]. Pour rappel, les organismes procaryotes possèdent une membrane
plasmique constituée, entre autre, de trois familles de canaux mécanosensibles (MscM,
MscS et MscL). Ceux-ci sont impliqués dans la régulation de la pression osmotique de la
bactérie.
Une étude menée par Nguyen et al. [6] explique que les parabens activeraient les
canaux MscL et MscS en diminuant leur seuil d'activation. Les canaux s'ouvrent alors
anormalement pour tenter de réguler la pression osmotique et une partie du contenu
cytoplasmique, indispensable à la survie de la bactérie, est expulsée. Ceci conduit à la lyse
de la cellule.
Cependant, ce mode d'action n'est pas complètement admis et d'autres études proposent
des mécanismes différents de lyse cellulaire.
1.4. Législation :
Leur emploi en tant qu'additifs alimentaires est régi par la directive Européenne 95/2/CE
du 20 Février 1995 [3]. Ainsi, l'isopropyl, le butyl, l'isobutyl et le benzylparaben ne sont pas
autorisés pour cet usage et ne portent, par conséquent, pas de numéros d'additifs
alimentaires.
La directive 76/768/CEE du 27 Septembre 1976 [11] régit, quant à elle, l'utilisation des
esters de l'acide para-hydroxybenzoïque et de ses sels dans les produits cosmétiques et fixe
leur emploi à 0,4 % (en acide) pour un ester et 0,8 % (en acide) pour les mélanges
d'esters.
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Température(°C)
Pourcentage
Acide SalicyliqueAcide
p-hydroxybenzoïqueAcide
4-hydroxyisophtalique
Na1 K Na K Na K
100 942 46 4 54 2 0
150 97 54 2 44 1 2
200 96 79 2 16 2 5
250 95 67 1 1 4 32
1 : Les symboles Na et K se référent respectivement à la carboxylation du phénolate de sodium et de potassium.
2 : Ces valeurs rapportent les pourcentages d'acides isolés dans le mélange.
Tableau 2: Carboxylation du phénol (D'après Lindsey et Jeskey, 1957)
Figure 2: Mécanisme (a) et diagramme d'énergie (b) de la réaction de Kolbe-Schmitt. A et E représentent respectivement les réactifs et les produits ; B, C et D représentent les intermédiaires, alors que o-TS1, TS2 et TS3 sont les états de transition (D'après Marković et al., 2002)
2. Moyens d'obtention possibles :
2.1. Synthèse industrielle :
Les parabens, en tant qu'esters, sont préparés à partir de l'acide p-hydroxybenzoïque et
l'alcool correspondant à la chaîne alkyle souhaitée. Le procédé industriel utilise le phénol
comme précurseur de l'acide, selon la réaction de Kolbe-Schmitt.
Cette réaction consiste en la carboxylation à chaud et sous pression du phénol en
présence d'un sel métallique et de dioxyde de carbone (figure 1).
Figure 1: Réaction de Kolbe-Schmitt [12]
Un mécanisme probable de réaction a été mis en évidence par les travaux de Z. Marković
et al. [13]. Celui passe par la formation d'un complexe entre le phénol, le sel et le dioxyde
de carbone (figure 2a).
Cette publication comprend également une étude thermodynamique de la réaction de
Kolbe-Schmitt. Celle-ci suppose que la formation du para passe par un intermédiaire
réactionnel moins stable, nécessitant une énergie d'activation plus élevée que dans le cas
de la formation de l'ortho (figure 2b). On assisterait alors à une déformation du cycle
permettant la formation d'un chélate, orientant la réaction en para. Cette déformation
pourrait être à l'origine de la formation préférentielle du composé ortho.
Malgré tout, il reste possible d'orienter l'addition en ortho ou en para en fonction du sel
utilisé. Lindsey et Jeskey, dans une de leurs études [14], ont ainsi comparé l'influence du
sel métallique utilisé dans la régiosélectivité de la réaction. Leurs résultats montrent que
l'addition se fait préférentiellement en para avec le sel de potassium. Dans le tableau 2, on
remarque que, pour des températures comprises en 100 et 150°C, les proportions de l'acide
p-hydroxybenzoïque sont au moins 13 fois supérieures lors de l'emploi de sel de potassium
à la place du sel de sodium, d'où l'emploi de KOH comme base dans la synthèse industrielle.
Dans cette même étude, les auteurs ont aussi étudié l'influence de la pression et de la
température sur les proportions finales d'acide p-hydroxybenzoïque. On détermine ainsi les
conditions idéales de synthèse aux alentours de 140°C sous une pression de 5 atm
(tableau 3).
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Température(°C)
Pression(atm)
Pourcentage
Acide Salicylique Acide p-hydroxybenzoïque
140 5 60 40
210 5 76 24
240 5 93 5
180 40 97 3Le mélange réactionnel a été chauffé pendant 4h à la température indiquée, la période de préchauffage étant d'environ 15 heures.
Tableau 3: Carboxylation du phénolate de potassium (D'après Lindsey et Jeskey, 1957)
Figure 3: Concentrations en harmine, harmaline et méthylparaben contenus dans différentes parties de la plante et de ses exsudats. Les traitements ont été les suivants : 1, plante entière; 2, contenu intracellulaire des racines non-transformées; 3, contenu intracellulaire des feuilles non-transformées; 4, contenu intracellulaire des pousses non-transformées; 5, contenu intracellulaire des tubercules non-transformés; 6, exsudats des racines modifiées; 7, contenu intracellulaire des racines modifiées; 8, exsudats dans la terre de plants d'Oca élevés en serre. (D'après H. P. Bais et al., 2003)
L'acide p-hydroxybenzoïque est ensuite engagé dans une réaction d'estérification. L'acide
sulfurique y est employé industriellement en tant que catalyseur [15]. En variant l'alcool
utilisé, on peut ainsi obtenir toute la famille des parabens.
La réaction s'effectue à chaud, non pas pour améliorer le rendement car l'estérification
est une réaction pratiquement athermique mais afin d'atteindre plus rapidement l'état
d'équilibre [16].
2.2. Biosynthèse :
Les parabens se trouvent à l'état naturel dans les plantes et certaines bactéries.
L'étude de Ali et al. montre la présence de méthylparaben et de propylparaben chez
Stocksia Brahuica (famille des Sapindaceae, qui compte également les litchis) [17]. On
retrouve également la présence du méthylparaben dans les graines de pamplemousse [18],
le mûrier, le passiflore, le myrtillier, la vanille [4] et dans les plants d'Oca (Oxalis
Tuberosa).
L'étude de Bais et al. [19] menée sur des plants d'Oca, non-modifiés et modifiés à l'aide
de Agrobacterium rhizogenes, met en évidence la présence de méthylparaben, ainsi que
d'harmine et d'harmaline. Ces trois molécules sont reconnues pour leur activité
antibactérienne et antifongique.
La figure 3 montre que celles-ci sont trouvées principalement dans leurs racines, et plus
particulièrement dans leurs exsudats. Les auteurs notent la présence d'une concentration
élevée de ces molécules dans la terre de culture. Ils ne montrent pas d'activité
antimicrobienne pour le méthylparaben, mais seulement une activité antifongique à partir
d'une concentration de 40 µg.mL-1. La figure 4 montre que la modification apportée par A.
rhizogenes permet à la plante de produire le méthylparaben en plus grande quantité. Après
28 jours de culture, la concentration en méthylparaben est environ 10 fois plus importante
pour un plant modifié.
Peng et al. [15] montrent que les parabens peuvent aussi être synthétisés par un certain
nombre de bactéries marines (figure 5), notamment la souche A4B-17 pour laquelle la
production est la plus importante.
La biosynthèse de l'acide p-hydroxybenzoïque, en tant que métabolite secondaire, peut
passer par deux voies distinctes. La première passe par la transformation du chorismate par
l'intermédiaire de la chorismate lyase. La seconde transforme les cinnamates en benzoates
grâce à la coenzyme-A, puis A. niger fournit l'acide p-hydroxybenzoïque. La spécificité de
A4B-17 résiderait dans l'utilisation d'une enzyme de type estérase pour la production de
parabens.
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Figure 4: Une courbe typique de croissance et de production dans les racines de culture d'Oca en fonction du temps : Harmine, harmaline et methylparaben contenus dans les exsudats des racines modifiées comparés à celles non-modifiées. (D'après H. P. Bais et al., 2003)
Figure 5: Cinétique de la synthèse de 4HBA et de ses esters par la souche A4B-17. (D'après Peng et al., 2006)
Figure 6: Zone d'inhibition de la souche A4B-17 contre Bacillus subtilis subsp. subtilis IFO1379 (D'après Peng et al., 2006)
La figure 6 montre que ces bactéries utilisent les parabens comme moyen de défense
vis-à-vis des autres micro-organismes. En effet, il n'y a pas de développement de B. subtilis
dans un rayon de 0,4 cm autour de A4B-17.
3. Méthodes officielles de dosage et d'analyse :
Les méthodes de dosage et d'identification des parabens sont réglementées par la
directive Européenne 96/45/CE du 2 juillet 1996 [20], basée sur les travaux de De Kruijf et
al. [21][22]. Celle-ci, en tant que directive, laisse toutefois le soin aux états membres de
mettre en place les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires,
notamment la vérification, par des contrôles officiels, de la bonne application des méthodes
qu'elle décrit.
3.1. Identification :
L'identification des parabens se fait par Chromatographie sur Couche Mince (CCM).
3.1.1. Solution de référence :
Sept solutions différentes à 0,1% m/v contenant respectivement les méthyl, éthyl,
propyl, butyl et benzylparaben, le phénoxy-2-éthanol et le phénoxy-1-propanediol sont
préparées afin de servir de point de comparaison pour le calcul des rapports frontaux.
3.1.2. Échantillon :
L'échantillon est dans un premier temps acidifié pour éliminer les sels puis mis en
solution dans de l'acétone afin de solubiliser le plus grand nombre de composés.
L'échantillon est ensuite filtré.
Le filtrat est ensuite mélangé à de l'eau et le pH est ensuite amené à 10 afin de faire
passer les conservateurs dans la phase aqueuse (formation de phénolates). Les parabens ne
sont pas hydrolysés lors de cette opération car celle-ci se déroule à froid.
Les acides gras sont ensuite précipités en milieu alcalin sous forme de sels de calcium. La
solution est de nouveau filtrée puis le filtrat est une première fois extrait à l'éther
diéthylique afin d'éliminer tous les produits organiques.
On récupère la phase aqueuse, contenant les conservateurs, que l'on tamponne à pH 2
avec de l'acide chlorhydrique. Les parabens repassent dans la phase organique et celle-ci
est une dernière fois extraite à l'éther diéthylique. L'échantillon est ainsi prêt pour être
analysé.
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Composé Rf x100 Couleur
Acide p-hydroxybenzoïque 11 Rouge
méthylparaben 12 Rouge
benzylparaben 16 Rouge
éthylparaben 17 Rouge
propylparaben 21 Rouge
butylparaben 26 Rouge
phénoxy-2-ethanol 29 Jaune
phénoxy-1-propanediol 50 Jaune
Tableau 4: Exemple de Rf pouvant être obtenus (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)
L'analyse se fait par CCM avec un éluant apolaire afin d'améliorer la migration des
composés : la Commission Européenne préconise l'utilisation d'un mélange n-pentane/acide
acétique 88:12. La plaque est révélée chimiquement en utilisant une solution commerciale
de réactif de Millon (nitrate mercurique).
3.1.3. Exploitation des résultats :
Lorsque la plaque est correctement révélée, on peut calculer les rapports frontaux des
différentes taches obtenues et les comparer à ceux des solutions de référence. Les
parabens ainsi que l'acide p-hydroxybenzoïque apparaissent sous forme de taches rouges. Il
est possible qu'une coélution existe entre l'acide et le méthylparaben ou bien entre le benzyl
et l'éthylparaben. Le tableau 4 présente à titre indicatif des valeurs de Rf pouvant être
obtenues.
3.2. Dosage :
Le dosage des parabens et d'autres conservateurs (phénoxy-2-éthanol et
phénoxy-1-propanediol) s'effectue par HPLC en phase inverse. Il s'agit d'un dosage par
étalonnage externe utilisant un étalon interne : l'hydroxy-4-benzoate d'isopropyle.
Dimensions de la colonne L = 12,5 cm ; Ø = 4,6 mm
Phase stationnaire Nucléosil 5C18 ou équivalent
Phase mobile THF/MeOH/MeCN/H2O (5/10/25/60 v/v)
Débit PM 1,5 mL.min-1
Détecteur UV à 280 nm
Tableau 5: Caractéristiques de l'appareillage HPLC utilisé.
Les parabens sont des composés apolaires comportant un chromophore, l'utilisation
d'une colonne apolaire et d'un détecteur UV sont donc particulièrement adaptés.
Le tetrahydrofuranne (THF) est utilisé comme co-solvant, permettant alors de
s'affranchir des différences de polarité entre les conservateurs. La séparation repose
maintenant uniquement sur l'hydrophilie des composés analysés. Le méthanol et
l'acétonitrile permettent de moduler la polarité de l'eau et, ainsi, d'optimiser les conditions
de séparation. Ils sont utilisés également dans le but d'augmenter la viscosité de la phase
mobile de façon à augmenter la résolution en diminuant l'agitation moléculaire (première
Loi de Fick).
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Figure 8: Séparation des pics (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)
Figure 9: Facteur d'asymétrie des pics (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)
Figure 7: Chromatogramme d'un shampooing. Présence de PhEt (Rt=4,0 min), MePa (Rt=4,6 min), EtPa (Rt=7,4 min), PrPa (Rt=13,4 min), BuPa (Rt=25,9 min). (D'après Borremans et al., 2004)
3.2.1. Gamme étalon :
On prépare 5 solutions étalons diluées dans un mélange éthanol/eau (9/1 v/v) contenant
l'étalon interne et les conservateurs suivants : méthyl, éthyl, propyl, butyl, benzylparabens,
phénoxy-2-éthanol et phénoxy-1-propanediol. Puis on effectue l'analyse HPLC de ces
solutions, ce qui permet d'obtenir les différentes courbes d'étalonnage.
3.2.2. Échantillon :
La préparation de l'échantillon pour le dosage HPLC est plus simple que celle nécessaire
pour l'identification. En effet, cette technique permet l'analyse d'un plus grand nombre de
composés. Ceci permet de s'affranchir des étapes de purification longues entraînant la perte
possible d'une partie des produits à doser.
L'échantillon est acidifié, notamment afin d'éliminer les sels de parabens. Il est ensuite
mis en solution dans un mélange éthanol/eau. On effectue un chauffage suivi d'un
refroidissement rapide sous un flux d'air froid puis il est stocké pendant une heure au
réfrigérateur. On augmente ainsi la solubilité des conservateurs dans l'éthanol. L'échantillon
est ensuite filtré afin d'éliminer toute particule solide restante. Il est enfin injecté après
avoir pris soin d'y ajouter l'étalon interne.
3.2.3. Exploitation des résultats :
La figure 7 est un exemple de chromatogramme pouvant être obtenu grâce à cette
méthode. On remarque que la préparation de l'échantillon est efficace car il y a peu de pics
parasites.
La méthode est générale et s'applique donc à tous les produits. Ceci implique que la
résolution des pics ne soit pas toujours optimale. Un facteur de séparation des pics et un
facteur d'asymétrie sont donc introduits par cette directive.
Le facteur de séparation, défini par la figure 8, doit être d'au moins 0,90 pour que
l'analyse soit acceptée, alors que le facteur d'asymétrie (As), défini par la figure 9, doit lui
aller, pour tous les pics, de 0,9 à 1,5. Le texte précise que la composition de la phase
mobile peut être optimisée dans le but d'obtenir la séparation souhaitée.
Compte tenu de la qualité du chromatogramme obtenu et en se basant sur la théorie de
la répartition gaussienne, le calcul des concentrations ne s'effectuera pas en tenant compte
des aires des pics mais en reportant les hauteurs des pics sur les courbes étalons. Le
résultat obtenu, exprimé en pourcentage par rapport à la masse, est, en toute rigueur,
minoré mais les travaux de Borremans et al. [23] montrent que l'on peut considérer cette
minoration comme non significative.
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Figure 10: Chromatogramme illustrant l'interférence de l'acide sorbique dans un échantillon cosmétique ; MePa (Rt=4,7 min), acide sorbique (Rt=4,8 min) (D'après Borremans et al., 2004)
Espèces Voie Méthyl paraben
Éthyl paraben
Propyl paraben
Butyl paraben
Souris Oral >8000 -6 322 à >8000
13 200
SourisOral (sel de sodium)
2000 1500 3700 950
Souris Sous-cutanée 125–1200 - 1650 -
Souris Sous-cutanée (sel de sodium)
1200 1650 1650 2500
Souris Intra-péritonéal 760–960 - 640 -
Rat Oral 2100–8000 4300 >8000 -
Lapin Oral 3000a 4000a 6000a -
Chien Oral 3000a 5000a 4000a -a : DL100 ou dose léthale
Tableau 6: DL50 (mg/kg) des parabens sur différentes espèces animales par différentes voies d'admission. (D'après Soni et al., 2005)
Cette même étude éprouve la reproductibilité et la répétabilité de cette méthode qui
semblent significativement améliorées en comparaison des résultats originaux. Les auteurs
expliquent ces différences par les performances accrues des dernières colonnes
chromatographiques, les travaux de De Kruijf et al. datant de 1989.
Elle met aussi en avant qu'il peut exister une coélution entre le méthylparaben et l'acide
ascorbique ou le sorbate de potassium, qui sont eux-aussi des conservateurs utilisés dans
les formulations cosmétiques (figure 10). Ce phénomène est résolu en utilisant un gradient
de phase mobile : MeOH/MeCN/H2O (10/15/75, v/v/v) pendant 10 min, puis gradient
linéaire d'une minute jusqu'à MeOH/MeCN/H2O (15/30/55, v/v/v) puis isocratique jusqu'à la
fin de l'analyse. L'augmentation de la séparation s'explique par l'augmentation du caractère
hydrophile de la phase mobile : les conservateurs étudiés étant hydrophobes, leur
interaction avec la phase stationnaire sera plus importante.
4. Toxicité :
4.1. DJA, DL 50 et doses absorbées :
Soni et al., dans leur rapport sur la sécurité des parabens [4], regroupent les résultats
de différentes études portants sur la détermination des DL50. Ces résultats sont présentés
dans le tableau 6. En raison de problèmes de solubilité des parabens, les études ont
principalement portées sur leurs sels sodés. Pour cette raison, les valeurs concernant les
sels sont plus précises que celles de leurs homologues non-sodés, dont les valeurs sont
absentes, approximées ou contenues dans un intervalle relativement large. On remarque
que, dans le cas d'une administration orale, la DL50 diminue avec l'augmentation de la
chaîne alkyle alors que la tendance est inversée pour une administration sous-cutanée.
Au vu de ces résultats, les autorités européennes de sécurité des aliments (EFSA) fixent
une DJA groupée de 10 mg/kg pour les esters méthylique et éthylique de l'acide
p-hydroxybenzoïque et de leurs sels de sodium, n'étant pas en mesure de fixer une DJA
pour le paraben propylique étant donné les études récentes supposant sa toxicité. Elles
conviennent, ainsi que l'AFSSAPS, qu’il est peu probable que le propylparaben présente un
risque pour la santé, compte tenu de son utilisation limitée [2][24].
La commission de cosmétologie du 29 Septembre 2005 autorise, quant à elle, la
poursuite de l'utilisation des parabens aux conditions prévues par la réglementation
actuelle, en excluant le benzylparaben compte tenu du manque de données le concernant et
de son manque d'intérêt. Elle propose également, à cette époque, une inscription
nominative des esters évalués favorablement à la place de l'appellation générique “ ester de
l'acide p-hydroxybenzoïque ”.
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Ces valeurs sont à comparer avec les valeurs trouvées par les différentes études qui se
sont penchées sur les doses totales d'exposition quotidienne. À l'heure actuelle, ces études
estiment cette exposition à 76 mg/j (soit 1,26 mg/kg/j pour un individu de 60 kg). La
participation des produits alimentaires est estimée à 1 mg/j (soit 0,017 mg/kg/j), celle des
cosmétiques à 50 mg/j (soit 0,833 mg/kg/j) et celle des médicaments à 25 mg/j (soit
0,417 mg/kg/j) [4].
4.2. L'hydrolyse des parabens
Les travaux de Ye [25] montrent que les parabens subissent une hydrolyse dans notre
organisme, dont le sous-produit majoritaire est l'acide p-hydroxybenzoïque qui peut être
ensuite excrété dans les urines sous sa forme propre ou sous forme de glycine, glucuronide
et de sulfates conjugués de l'acide p-hydroxybenzoïque. Lors d'une étude sur le lapin [26],
l'administration par gavage d'une dose unique de méthylparaben (0,4 ou 0,8 g/kg) conduit
après 24h à 39% d'acide p-hydroxybenzoïque libre, 15% d'acide p-hydroxyhippurique, 22%
de p-hydroxybenzoyle glucuronide, 10% de sulfate de p-carboxyphényle. Ils constatent
également que lors de l'augmentation de la longueur de la chaîne alkyle, le taux d'excrétion
urinaire de l'acide p-hydroxybenzoïque diminue.
Différentes études, portant sur la cinétique de l'hydrolyse des parabens montrent que la
détoxification s'effectue en deux étapes. La première consiste en l'hydrolyse proprement
dite des parabens pour les éliminer rapidement dans les urines sous forme d'acide
p-hydroxybenzoïque. La seconde passe par une excrétion métabolique conduisant aux
autres produits précédemment cités.
Les parabens peuvent également subir une hydrolyse lors de leur administration par voie
cutanée. Ainsi, Wooi et al. [27] et Seko et al. [28] rapportent que 70% du propylparaben
appliqué sur la peau de rats est métabolisé. En employant du diisopropyl fluorophosphate
(inhibiteur d'estérase), ils constatent l'absence de métabolites et montrent ainsi que les
carboxyl estérases, présentes dans la peau et la graisse sous-cutanée [1], sont
responsables de cette métabolisation.
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Figure 11: Les différentes formes de l'acide p-hydroxybenzoïque après hydrolyse des parabens.
HN
O
O
OH
HO
acide p-hydroxyhippurique
S
O
O
O
OHO
OH
sulfate de p-carboxyphényle
O
OH
OH
HO
O
O
HO
O
OH
p-hydroxybenzoyle glucuronide
Figure 12: Réponse oestrogénique d'une cellule soumise à l'action de différents parabens. Les réponses maximales (A540 ~ 2,7) à la concentration maximale ne sont pas montrées. (A) Le graphe décrit l'absorbance en fonction de la concentration logarithmique du 17β-estradiol dilué en série de 10 nM à 5 pM, et des methyl, ethyl, propyl, butyl et 4-n-dodecylparabens dilués de 500 µM à 250 nM, mesurée après 3 jours d'incubation. (B) Comparaison de l'effet oestrogénique du butylparaben avec ceux de l'acide p-hydroxybenzoïque (dilué de 500 µM à 250 nM) et du 4-nonylphénol (dilué de 2 mM à 1 µM). Le blanc montre la réponse de base dans l'essai. (D'après Routledge et al., 1998)
On sait également que la capacité des parabens à passer à travers le stratum corneum
(barrière la plus externe de la peau) augmente avec la longueur de la chaîne
ester [8][29][30]. Même si cette pénétration reste faible, la surface d'application étant
importante, la dose administrée ne peut être négligée [9].
Cependant, il est fréquent de leur associer des tensioactifs afin de mieux les solubiliser
dans les produits cosmétiques, ce qui a pour effet de diminuer leur pénétration à travers la
peau. En effet, une étude sur la peau du cochon de Guinée [31] a montré que la présence
de solubilisants tels que le polysorbate 80, le polyethylène glycol ou le PEG 400 diminue
l'absorption des parabens, notamment le butylparaben, alors que leur activité
antimicrobienne augmente.
4.3. Toxicité de l'acide p -hydroxybenzoique :
Compte tenu de la quantité de métabolites produits lors de l'hydrolyse des parabens, il
est intéressant de se pencher en priorité sur la toxicité de l'acide p-hydroxybenzoïque étant
donné qu'il représente à lui seul la majeure partie des métabolites.
D'après un rapport de l'Organisation de Co-opération et de Développement Economique
[32], rassemblant les données actuelles sur l'acide p-hydroxybenzoïque, sa DL50 est de
6000 mg/kg et sa NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) est de 1000 mg/kg/jour.
Ce même rapport indique qu'il est peu irritant pour la peau et moyennement pour les
yeux. C'est aussi un sensibilisant modéré. Les études montrent qu'il est 100% biodégradé
après 28 jours. Son log(P) de 1,37 à 25°C montre qu'il a une bioaccumulation assez faible.
Il présente également peu d'effets oestrogénisant comme le suggèrent les travaux
(figure 12B) de Routledge et al. [8], de Byford et al. [33] et de Darbre et al. [34]. Celui-ci
ne présente donc pas d'effet sur la fertilité, le ratio des sexes ou la morphologie des
enfants.
L'acide p-hydroxybenzoïque n'est pas tératogène, ni génotoxique et est donc classé dans
les substances à priorité faible pour les travaux à venir [32].
4.4. Bioaccumulation :
On a vu cependant que la totalité des parabens n'était pas hydrolysée. Il faut donc
maintenant se pencher sur le devenir de ces parabens. D'après l'Agence Française de
Sécurité SAnitaire et des Produits de Santé (AFFSAPS) : “ en raison de leur hydrolyse dans
l'organisme, ils ne sont pas susceptibles de s'accumuler dans les tissus ”.
Dans une étude, portant sur des chiens, des doses de 100 mg/kg/j de méthyl, éthyl,
propyl et butylparaben ont été administrées par intraveineuse. Les auteurs constatent la
présence des esters dans le cerveau, la rate et le pancréas et de métabolites dans le foie et
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Tableau 7: Limites de confiance des concentrations moyennes (ng.g-1) de parabens dans 20 tumeurs mammaires.(D'après Darbre et al., 2004)
les reins. Par contre lors de l'administration par voie orale de doses pouvant aller jusqu'à
1 g/kg, les auteurs ne constatent aucune accumulation. D'autres études sur la toxicité
chronique et aiguë portant sur le rat, la souris, le lapin et le chat ont montré qu'il n'y avait
aucune accumulation des parabens ou de leurs métabolites dans l'organisme [35].
Ainsi, à ce jour, aucune étude n'a prouvé l'accumulation de parabens dans les tissus
sains. Cependant, il n'en est pas de même pour des tissus cancéreux. En effet, Darbre et al.
[34] publient en 2004 une étude qui sera à l'origine de la polémique actuelle visant à
interdire leur emploi. Celle-ci met en évidence la présence de parabens dans des tissus
cancéreux du sein. Ils trouvent ainsi des concentrations de parabens pouvant aller de 0 à
12,8 ng/g (tableau 7), ainsi qu'une concentration de PCBs (pesticide PolyChloroBiphényls)
de 267 ng/g et de OCPs (Pesticides OrganoChlorés) de 707,5 ng/g. Les auteurs ne
fournissent pas d'explications quant à l'origine systémique ou non des parabens et ne
peuvent conclure à une éventuelle corrélation entre la présence de parabens et la formation
de la tumeur. C'est pourquoi, ils préconisent de refaire une étude avec un groupe plus large
que les 20 utilisés et avec la présence d'un groupe témoin. Par ailleurs, le méthylparaben
est celui qui est retrouvé en plus forte quantité. Ceci s'explique soit par le fait qu'il fait
partie des deux parabens les plus employés (avec le propylparaben) [34][25], soit par le
fait qu'il s'absorbe mieux dans les graisses [34].
Selon le dernier rapport de sécurité sur les parabens [4], les études de toxicologie aiguë,
subaiguë ou chronique actuelles ont montré que, leur pouvoir oestrogénisant mis à part, les
parabens ne montraient pas d'effets toxiques par les différentes voies d'administration.
4.5. L'effet oestrogénisant :
Même si les parabens sont reconnus comme des substances relativement sûres
[4][8][36], leur effet oestrogénisant est très controversé à l'heure actuelle. Celui-ci est
néanmoins considéré comme faible par les études toxicologiques sur le sujet
[4][8][36][34]. Cet effet a été étudié du fait de leur structure similaire à d'autres produits
connus pour être “ oestrogène-like ” : les alkylphénols. En effet, la présence d'un
groupement alcool en para sur le cycle aromatique est considéré comme une condition
importante pour observer un effet oestrogénique [36].
Leur effet oestrogénisant augmente avec la longueur de la chaîne alkyle [33]. Routledge
et al. [8] ont comparé l'effet oestrogénique des quatre parabens les plus utilisés avec celui
du 17β-estradiol, principal oestrogène naturel (figure 12A). Leurs résultats indiquent que les
méthyl, éthyl, propyl et butylparabens sont respectivement 2 500 000, 150 000, 30 000 et
10 000 fois moins oestrogénique que le 17β-estradiol. Ils remarquent sans pouvoir
l'expliquer que le 4-n-dodécylparaben se montre inactif dans la gamme de concentration
testée, ce qui est en contradiction avec l'effet observé précédemment.
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Figure 13: Effets des administrations sous-cutanée de methyl et butylparaben sur le poids des utérus secs de rats immatures. Estradiol (E2) (0,04 mg/kg, sc) a été utilisé pour un contrôle positif. Le groupe de contrôle (C) a reçu exclusivement de l'huile d'arachide. (D'après Routledge et al., 1998)
Une autre étude menée par Byford et al. [33] sur des cellules du sein montre que la
concentration en paraben doit être de 100 000 (butyl, propyl) à 500 000 (éthyl, méthyl) fois
supérieure à celle du 17β-estradiol pour que ceux-ci exercent leur effet.
Comme vu précédemment, le butylparaben est celui qui présente la plus forte toxicité.
Pour observer cet effet, Routledge et al. administrent à des rats immatures des doses
variables de parabens et en mesure les effets sur l'utérus des animaux.
Pour une dose orale de 800 mg/kg/j, aucun effet n'est observé pour le méthyl alors que
le butyl provoque une faible augmentation du poids de l'utérus.
Pour des doses sous-cutanée de butylparaben comprises entre 400 et 1200 mg/kg/j, on
on observe une augmentation pouvant atteindre 170%. La plus faible dose induisant une
réponse est de 200 mg/kg/j, alors qu'une dose de 800 mg/kg/j de méthylparaben n'induit
toujours aucun effet (figure 13).
L'exposition aux oestrogènes naturels ou synthétiques peut affecter défavorablement la
santé de l'homme, et particulièrement les fonctions de reproduction. Oishi [36][37] montre
ainsi que les butyl et propylparabens ont un effet sur le système de reproduction des souris
mâles et qu'ils endommagent les dernières étapes de la spermatogènese dans les testicules.
Pour des doses de 1504, 146 et 14,4 mg/kg/j, tous les groupes présentent une
détérioration de leurs spermatozoïdes. À la plus forte dose, une augmentation du poids de
l'épididyme est observé alors qu'il n'y a aucun effet sur le foie, la prostate et les vésicules
séminales. Dans sa dernière étude [29], pour des doses de 1000 mg/kg/j, il n'observe pas
d'effet avec les méthyl et éthylparabens.
4.6. Parabens et cancer du sein :
Darbre, dans un de ses articles étudiant l'effet des différents oestrogènes
environnementaux sur l'apparition du cancer du sein [38], émet l'hypothèse d'une relation
entre la présence de parabens dans des cellules cancéreuses [34] et l'apparition de tumeurs
mammaires. Elle suppose que l'origine des parabens serait liée à l'application de produits
cosmétiques sous les aisselles, tels que les antitranspirants.
Cependant, elle conclue, qu'à l'heure actuelle, aucune étude n'a pu prouver une relation
entre la présence de substances chimiques et le développement du cancer du sein. Le CTFA
(Cosmetic, Toiletries and Fragrance Administration), la FDA (Food And Drug Administration)
et l'ACS (American Cancer Society) valident cette conclusion [39][40].
4.7. L'effet allergisant
De nombreux cas individuels d'allergies cutanées de type IV (retardées) ont pu être
rapportés. Les individus sensibles aux parabens sont souvent capables de les tolérer lors de
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leur emploi dans les produits cosmétiques s'ils sont appliqués sur une peau saine.
Cependant, les personnes présentant déjà un problème de peau à l'endroit de l'application
peuvent subir une réaction allergique. Ce paradoxe a été mis en évidence par Fischer qui le
nomme “ paraben paradox ”. Dans le cas d'ingestion d'aliments ou de médicaments
contenant des parabens, seuls quelques rares cas d'allergies ont pu être rapportés. Le plus
souvent, cela provoque un eczéma localisé et sans gravité [1].
On observe également des allergies de type I (immédiates) lors de l'application cutanée
de solutions de parabens. Ces réactions allergiques provoquent des urticaires localisés pour
la plupart. Toutefois, dans certaines de ces études, les parabens sont mis en cause sans
preuve véritable de leur effet. En 1979, Henry et al. décrivent un cas d'allergie immédiate à
des solutions de parabens. Celles-ci comportent cependant des doses élevées de méthyl et
éthylparaben (5%) [41]. Les doses employées commercialement sont jugées trop faible
pour induire une réaction allergique sur une peau saine. Il existe également des cas isolés
d'allergie de type I lors d'administration parentérale (voie autre que l'ingestion). Là encore,
les réactions sont localisées et bénignes [1].
5. Produits de substitution :
Nous avons vu les différents problèmes liés à l'utilisation des parabens, il semble
maintenant important de regarder les différents produits dont nous disposons aujourd'hui
pour les substituer. A l'heure actuelle, la famille de l'alcool benzylique est une autre grande
famille de conservateur que l'on trouve dans les produits cosmétiques. On trouve aussi au
sein de cette famille l'acide benzoïque et son sel, le benzoate de sodium. Ces produits ont
une DJA de 5mg/kg/j [42], plus faible que celle fixée pour les parabens. Nair [42] rapporte
que les conservateurs de cette famille ont des propriétés cancérigènes et tératogènes
avérées, et qu'ils sont également allergènes à des doses cutanées de 5%. L'auteur note
l'absence d'étude de toxicité chronique ainsi que le manque de données sur l'ingestion de
ces produits et encourage les recherches, compte-tenu des effets connus à cours terme.
On emploie aussi souvent le phénoxy-2-éthanol pour protéger les produits formulés.
Celui-ci présente une DL50 de 1,26 g/kg et est aussi considéré comme tératogène, allergène
et irritant notamment pour les yeux. On lui connaît aussi des effets sur le sperme des
poissons à des doses de 0,05%. Toutefois, la pénétration à travers la peau reste assez
faible [43].
On peut également utiliser des conservateurs naturels comme le linalol. Celui-ci a été
classé comme substance allergène [44] par la Commission Européenne dans la directive
2003/15/CE [45], qui oblige ainsi les industriels à signaler la présence de ce produit dans
les formulations. De plus, son spectre d'action peu large en fait un conservateur peu
efficace et ses propriétés organoleptiques peuvent parfois être indésirables.
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6. Conclusion :
Les parabens sont donc largement utilisés dans les domaines alimentaires,
pharmaceutiques et cosmétiques pour leurs propriétés antifongiques et antibactériennes.
Leur emploi est strictement réglementé au niveau Européen et les doses d'emploi sont
fixées à 0,4% individuellement et à 0,8% en mélange. Pour vérifier cela, une méthode de
dosage obligatoire a été éditée. Celle-ci repose sur une méthode HPLC en phase inverse et
doit être précédée d'une identification par CCM.
Les parabens sont obtenus industriellement à partir du phénol, selon la réaction de
Kolbe-Schmitt, puis par estérification avec l'alcool portant la chaîne alkyle voulue. Certaines
études montrent qu'ils sont également trouvés à l'état naturel dans différents aliments et
plantes ainsi que dans certaines espèces de bactéries, ce qui pourrait éventuellement, selon
les auteurs, conduire à une voie d'obtention biosynthétique.
L'emploi des parabens depuis plus de 80 ans en tant que conservateur, leur toxicité
relativement faible et leur hydrolyse rapide dans l'organisme en ont fait des substances
reconnues comme sûres. Même si leur effet oestrogénisant est démontré, celui-ci reste
considéré comme faible, aux doses d'emploi, comparé aux oestrogènes naturels tel que le
17-β-estradiol.
La bioaccumulation des parabens dans les tissus sains n'a pu être démontrée. Darbre et
al. ont, par contre, démontré leur présence dans les tissus cancéreux. Aucune étude n'a, à
ce jour, pu démontrer une relation de cause à effet entre la présence de parabens et
l'apparition d'une tumeur cancéreuse.
Comme pour toute substance, il existe des cas d'allergies aux parabens mais celles-ci
sont bénignes et localisées. Depuis 1920 et malgré leur emploi massif dans les différents
produits, seuls quelques cas spécifiques ont pu être rapportés à l'heure actuelle.
Les DJA, DL50 et toutes les doses utilisées pour les études de toxicité sont largement
supérieures aux doses d'exposition quotidiennes estimées. C'est pourquoi, au vu de leur
rapport bénéfice/risque, aucune autorité n'a interdit leur utilisation, d'autant plus qu'aucun
substitut présentant un spectre d'action aussi large, une aussi bonne stabilité et un risque
moindre n'a été trouvé. La substitution des parabens n'est donc pas si simple.
Toutefois, le manque d'études récentes et la découverte, il y a peu, d'une possible
bioaccumulation requière de nouvelles études plus larges et menées sur un plus long
terme ...
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[45] Directive 2003/15/CE du parlement Européen et du conseil du 27 février 2003 modifiant la directive 76/768/CEE du Conseil concernant le rapprochement des législations des états membres relatives aux produits cosmétiques ; JO n° L66/26 du 11 Mars 2003; 1-10
RÉSUMÉ :
Les parabens sont les esters de l'acide p-hydroxybenzoïque. Ce sont des substances chimiques stables, aussi bien au pH qu'à la température, largement employés pour leurs propriétés antibactériennes et antifongiques. Leur mode d'action est encore mal connu, toutefois une hypothèse sur leur action sur la membrane plasmique des cellules a été formulée. Le parlement Européen a mis en place un cadre législatif décrivant leur emploi en alimentaire et en cosmétique.
Ils sont obtenus industriellement par estérification de l'acide p-hydroxybenzoïque, lui-même produit selon la réaction de Kolbe-Schmitt à partir du phénol. On les retrouve naturellement dans différentes plantes et bactéries, ce qui a permis de mettre en évidence leur biosynthèse.
Suite à leur emploi massif dans les différentes industries, le parlement Européen a publié une méthode d'identification et de dosage, reposant respectivement sur deux techniques d'analyse chimique que sont la CCM et l'HPLC en phase inverse.
Leur effet toxique est faible. Ainsi, la DJA groupée est fixée à 10 mg/kg, alors que la dose d'exposition est estimée à 1,26 mg/kg/jour. Ils sont, par ailleurs, principalement hydrolysés dans le corps en acide p-hydroxybenzoïque et celui-ci ne présente pas d'effet toxique important. On les considère actuellement comme faiblement allergisants et on ne prouve pas la présence d'effets tératogènes et cancérigènes. Toutefois, récemment la découverte d'un effet oestrogénique a remis en cause leur utilisation. Cet effet est 100 000 à 500 000 fois plus faible que le 17-β-estradiol. Il est à l'origine de l'hypothèse d'un possible lien entre l'exposition aux parabens et l'apparition de cancer du sein, lien qui n'a pu être démontré à l'heure actuelle.
Au vu des connaissances actuelles, il semble que le rapport bénéfice/risque favorise la poursuite de l'emploi des parabens, car leur substitution n'est pas si simple, compte tenu des effets des autres produits. Ce résultat réclame des études toxicologiques plus larges et la découverte de nouveaux conservateurs pourrait permettre de limiter leur utilisation.