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LES PARABENS UTILISATION ET TOXICITÉ PHOTO : XEOPHIN ELIE Nicolas RIPOLL Lionel Master 1 Chimie Fine Le Havre, 2007

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Page 1: Monographie Parabens

LES PARABENS

UTILISATION ET TOXICITÉ

PHOTO : XEOPHIN

ELIE Nicolas

RIPOLL Lionel

Master 1 Chimie Fine

Le Havre, 2007

Page 2: Monographie Parabens

Table des matièresIntroduction :............................................................................................................... 1

1. Que sont les parabens :............................................................................................. 2

1.1. Propriétés et structures chimiques :...................................................................... 2

1.2. Emploi :............................................................................................................ 2

1.3. Mode d'action :.................................................................................................. 3

1.4. Législation :....................................................................................................... 3

2. Moyens d'obtention possibles :.................................................................................... 4

2.1. Synthèse industrielle :........................................................................................ 4

2.2. Biosynthèse :..................................................................................................... 5

3. Méthodes officielles de dosage et d'analyse :................................................................ 6

3.1. Identification :................................................................................................... 6

3.1.1. Solution de référence :................................................................................. 6

3.1.2. Échantillon :................................................................................................ 6

3.1.3. Exploitation des résultats :............................................................................ 7

3.2. Dosage :........................................................................................................... 7

3.2.1. Gamme étalon :.......................................................................................... 8

3.2.2. Échantillon :................................................................................................ 8

3.2.3. Exploitation des résultats :............................................................................ 8

4. Toxicité :................................................................................................................. 9

4.1. DJA, DL50 et doses absorbées :........................................................................... 9

4.2. L'hydrolyse des parabens................................................................................... 10

4.3. Toxicité de l'acide p-hydroxybenzoique :.............................................................. 11

4.4. Bioaccumulation :............................................................................................. 11

4.5. L'effet oestrogénisant :...................................................................................... 12

4.6. Parabens et cancer du sein :.............................................................................. 13

4.7. L'effet allergisant.............................................................................................. 13

5. Produits de substitution :.......................................................................................... 14

6. Conclusion :........................................................................................................... 15

Bibliographie

Page 3: Monographie Parabens

INTRODUCTION :

La famille des parabens regroupe les esters de l'acide p-hydroxybenzoïque. Le nom de

parabens est d'ailleurs une compression du nom de PARAhydroxyBENzoates [1].

On peut les retrouver commercialement sous différentes appellations. Par exemple, le

méthylparaben se retrouve sous les noms de 4-(méthoxycarbonyl)phénol, nipagin®,

méthyl-p-hydroxybenzoate, méthyl-4-hydroxybenzoate, p-hydroxybenzoate de méthyle, ...

Cependant, dans les produits alimentaires et cosmétiques, la législation prévoit une

appellation commune sous les noms de méthyl, éthyl, propyl et butylparabens [2].

Leur première utilisation en tant que conservateur remonte à 1920. Selon la définition de

la Communauté Européenne [3], on entend par conservateur toute substance “ qui prolonge

la durée de conservation des denrées alimentaires en les protégeant des altérations dues

aux micro-organismes ”.

L'absence de problèmes liés à leur utilisation depuis cette date en font des substances

considérées comme sûres.

Ce n'est que dernièrement que des études ont remis en cause leur utilisation et lancé la

polémique actuelle, suite à la découverte de leur effet oestrogénisant et de leur présence

dans des cellules cancéreuses.

Notre travail consistera en la synthèse de divers travaux sur le sujet afin de faire le point

sur l'état des connaissances actuelles.

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Page 4: Monographie Parabens

Structure générale

R Methyl Ethyl Propyl Butyl

N° CAS 99-76-3 120-47-8 94-13-3 94-26-8

N° EINECS 202-785-7 204-399-4 202-307-7 202-318-7

N° INS/E(ester / sel)

E218 / E219 E214 / E215 E216 / E217 -

Masse Molaire

(g.mol-1)152,05 166,06 180,08 194,09

Pf (°C) 131 116-118 96-98 68-69

Peb (°C) 270-280 297-298 - -

Solubilité dans l'eau à

25°C0,25 % 0,17 % 0,05 % 0,02 %

pKa 8,17 8,22 8,35 8,37

Apparence(à 25°C)

Cristaux incolores sans odeur et sans goût

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des principaux parabens

OR

HO

O

Page 5: Monographie Parabens

1. Que sont les parabens :

1.1. Propriétés et structures chimiques :

Comme nous l'avons déjà vu, les parabens constituent la famille des esters de l'acide

p-hydroxybenzoïque.

Les différentes propriétés physico-chimiques des parabens les plus couramment utilisés

sont regroupées dans le tableau 1. Cependant, on trouve aussi l'isopropyl, l'isobutyl et le

benzylparaben qui ne sont pas détaillés dans le tableau du fait de leur faible emploi.

Les produits cosmétiques et alimentaires sont généralement sous forme liquide ou gel et

ont un pH compris entre 5 et 7 (pour les produits H/E). Avec un pKa moyen de 8,2, les

parabens sont des acides faibles. Ils se trouvent donc sous leur forme acide dans ce

domaine de pH. À température ambiante, ils se présentent sous la forme de cristaux, il

faudra donc les solubiliser dans un solvant adéquat pour les incorporer dans la matrice

souhaitée. Leur solubilité dans l'eau étant assez faible, on emploie souvent des solubilisants

et on les substitue, notamment en alimentaire, par leurs sels.

Compte tenu de leurs hauts points d'ébullition, supérieurs à 270°C, les parabens sont

stables à la température, ils peuvent donc être employés dans des produits destinés à la

cuisson [4].

1.2. Emploi :

Les parabens sont employés dans un grand nombre de produits alimentaires et

cosmétiques pour leurs propriétés antifongiques et antimicrobiennes [5][6].

De plus, leur faible toxicité, leur large spectre d'activité (sur les bactéries, levures,

moisissures et champignons), leur bonne stabilité chimique (vis-à-vis du pH et de la

température), leur biodégradabilité et leur faible coût en font des conservateurs très

employés [4].

Ils peuvent être utilisés dans des produits en contact avec la peau, les muqueuses, les

cheveux, les ongles, les aisselles. Ils sont actuellement utilisés dans 80 % des formulations

cosmétiques [2].

En alimentaire, on les trouve dans les pâtisseries, les glaces, les boissons non

alcoolisées, les crèmes, les confitures et gelées, les conserves, les sirops, ... Les parabens

méthyliques et propyliques sont les plus utilisés dans ce domaine [4].

Ils sont très efficaces contre les champignons et les bactéries. Cependant, ils sont plus

actifs contre les bactéries Gram-positives que contre les Gram-négatives. Ils sont souvent

employés en combinaison avec d'autres conservateurs comme des précurseurs du

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Page 6: Monographie Parabens

formaldéhyde, des isothiazolinones ou du phénoxyéthanol afin de compléter leur spectre

d'action [7].

Leur solubilité dans l'eau décroît et leur pouvoir antibactérien augmente avec la longueur

de leur chaîne alkyle. Ainsi, les méthyl et éthylparabens, bien que présentant les plus faibles

actions antimicrobiennes, sont les plus utilisés du fait de leur grande solubilité en phase

aqueuse. En effet, les attaques microbiennes sont majoritaires dans cette phase [6][8].

C'est pourquoi, en formulation, on préfère souvent utiliser une combinaison des

différents parabens, à chaînes alkyles courtes et moyennes, plutôt qu'un seul. La protection

de toutes les phases (aqueuse et huileuse) est ainsi assurée [9].

1.3. Mode d'action :

Le mécanisme d'action des parabens sur les bactéries est à l'heure actuelle encore mal

connu. Toutefois, certaines études proposent un modèle expliquant la lyse cellulaire.

Les études actuelles permettent de postuler un mécanisme d'activation moléculaire du

canal MscL [10]. Pour rappel, les organismes procaryotes possèdent une membrane

plasmique constituée, entre autre, de trois familles de canaux mécanosensibles (MscM,

MscS et MscL). Ceux-ci sont impliqués dans la régulation de la pression osmotique de la

bactérie.

Une étude menée par Nguyen et al. [6] explique que les parabens activeraient les

canaux MscL et MscS en diminuant leur seuil d'activation. Les canaux s'ouvrent alors

anormalement pour tenter de réguler la pression osmotique et une partie du contenu

cytoplasmique, indispensable à la survie de la bactérie, est expulsée. Ceci conduit à la lyse

de la cellule.

Cependant, ce mode d'action n'est pas complètement admis et d'autres études proposent

des mécanismes différents de lyse cellulaire.

1.4. Législation :

Leur emploi en tant qu'additifs alimentaires est régi par la directive Européenne 95/2/CE

du 20 Février 1995 [3]. Ainsi, l'isopropyl, le butyl, l'isobutyl et le benzylparaben ne sont pas

autorisés pour cet usage et ne portent, par conséquent, pas de numéros d'additifs

alimentaires.

La directive 76/768/CEE du 27 Septembre 1976 [11] régit, quant à elle, l'utilisation des

esters de l'acide para-hydroxybenzoïque et de ses sels dans les produits cosmétiques et fixe

leur emploi à 0,4 % (en acide) pour un ester et 0,8 % (en acide) pour les mélanges

d'esters.

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Page 7: Monographie Parabens

Température(°C)

Pourcentage

Acide SalicyliqueAcide

p-hydroxybenzoïqueAcide

4-hydroxyisophtalique

Na1 K Na K Na K

100 942 46 4 54 2 0

150 97 54 2 44 1 2

200 96 79 2 16 2 5

250 95 67 1 1 4 32

1 : Les symboles Na et K se référent respectivement à la carboxylation du phénolate de sodium et de potassium.

2 : Ces valeurs rapportent les pourcentages d'acides isolés dans le mélange.

Tableau 2: Carboxylation du phénol (D'après Lindsey et Jeskey, 1957)

Figure 2: Mécanisme (a) et diagramme d'énergie (b) de la réaction de Kolbe-Schmitt. A et E représentent respectivement les réactifs et les produits ; B, C et D représentent les intermédiaires, alors que o-TS1, TS2 et TS3 sont les états de transition (D'après Marković et al., 2002)

Page 8: Monographie Parabens

2. Moyens d'obtention possibles :

2.1. Synthèse industrielle :

Les parabens, en tant qu'esters, sont préparés à partir de l'acide p-hydroxybenzoïque et

l'alcool correspondant à la chaîne alkyle souhaitée. Le procédé industriel utilise le phénol

comme précurseur de l'acide, selon la réaction de Kolbe-Schmitt.

Cette réaction consiste en la carboxylation à chaud et sous pression du phénol en

présence d'un sel métallique et de dioxyde de carbone (figure 1).

Figure 1: Réaction de Kolbe-Schmitt [12]

Un mécanisme probable de réaction a été mis en évidence par les travaux de Z. Marković

et al. [13]. Celui passe par la formation d'un complexe entre le phénol, le sel et le dioxyde

de carbone (figure 2a).

Cette publication comprend également une étude thermodynamique de la réaction de

Kolbe-Schmitt. Celle-ci suppose que la formation du para passe par un intermédiaire

réactionnel moins stable, nécessitant une énergie d'activation plus élevée que dans le cas

de la formation de l'ortho (figure 2b). On assisterait alors à une déformation du cycle

permettant la formation d'un chélate, orientant la réaction en para. Cette déformation

pourrait être à l'origine de la formation préférentielle du composé ortho.

Malgré tout, il reste possible d'orienter l'addition en ortho ou en para en fonction du sel

utilisé. Lindsey et Jeskey, dans une de leurs études [14], ont ainsi comparé l'influence du

sel métallique utilisé dans la régiosélectivité de la réaction. Leurs résultats montrent que

l'addition se fait préférentiellement en para avec le sel de potassium. Dans le tableau 2, on

remarque que, pour des températures comprises en 100 et 150°C, les proportions de l'acide

p-hydroxybenzoïque sont au moins 13 fois supérieures lors de l'emploi de sel de potassium

à la place du sel de sodium, d'où l'emploi de KOH comme base dans la synthèse industrielle.

Dans cette même étude, les auteurs ont aussi étudié l'influence de la pression et de la

température sur les proportions finales d'acide p-hydroxybenzoïque. On détermine ainsi les

conditions idéales de synthèse aux alentours de 140°C sous une pression de 5 atm

(tableau 3).

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Page 9: Monographie Parabens

Température(°C)

Pression(atm)

Pourcentage

Acide Salicylique Acide p-hydroxybenzoïque

140 5 60 40

210 5 76 24

240 5 93 5

180 40 97 3Le mélange réactionnel a été chauffé pendant 4h à la température indiquée, la période de préchauffage étant d'environ 15 heures.

Tableau 3: Carboxylation du phénolate de potassium (D'après Lindsey et Jeskey, 1957)

Figure 3: Concentrations en harmine, harmaline et méthylparaben contenus dans différentes parties de la plante et de ses exsudats. Les traitements ont été les suivants : 1, plante entière; 2, contenu intracellulaire des racines non-transformées; 3, contenu intracellulaire des feuilles non-transformées; 4, contenu intracellulaire des pousses non-transformées; 5, contenu intracellulaire des tubercules non-transformés; 6, exsudats des racines modifiées; 7, contenu intracellulaire des racines modifiées; 8, exsudats dans la terre de plants d'Oca élevés en serre. (D'après H. P. Bais et al., 2003)

Page 10: Monographie Parabens

L'acide p-hydroxybenzoïque est ensuite engagé dans une réaction d'estérification. L'acide

sulfurique y est employé industriellement en tant que catalyseur [15]. En variant l'alcool

utilisé, on peut ainsi obtenir toute la famille des parabens.

La réaction s'effectue à chaud, non pas pour améliorer le rendement car l'estérification

est une réaction pratiquement athermique mais afin d'atteindre plus rapidement l'état

d'équilibre [16].

2.2. Biosynthèse :

Les parabens se trouvent à l'état naturel dans les plantes et certaines bactéries.

L'étude de Ali et al. montre la présence de méthylparaben et de propylparaben chez

Stocksia Brahuica (famille des Sapindaceae, qui compte également les litchis) [17]. On

retrouve également la présence du méthylparaben dans les graines de pamplemousse [18],

le mûrier, le passiflore, le myrtillier, la vanille [4] et dans les plants d'Oca (Oxalis

Tuberosa).

L'étude de Bais et al. [19] menée sur des plants d'Oca, non-modifiés et modifiés à l'aide

de Agrobacterium rhizogenes, met en évidence la présence de méthylparaben, ainsi que

d'harmine et d'harmaline. Ces trois molécules sont reconnues pour leur activité

antibactérienne et antifongique.

La figure 3 montre que celles-ci sont trouvées principalement dans leurs racines, et plus

particulièrement dans leurs exsudats. Les auteurs notent la présence d'une concentration

élevée de ces molécules dans la terre de culture. Ils ne montrent pas d'activité

antimicrobienne pour le méthylparaben, mais seulement une activité antifongique à partir

d'une concentration de 40 µg.mL-1. La figure 4 montre que la modification apportée par A.

rhizogenes permet à la plante de produire le méthylparaben en plus grande quantité. Après

28 jours de culture, la concentration en méthylparaben est environ 10 fois plus importante

pour un plant modifié.

Peng et al. [15] montrent que les parabens peuvent aussi être synthétisés par un certain

nombre de bactéries marines (figure 5), notamment la souche A4B-17 pour laquelle la

production est la plus importante.

La biosynthèse de l'acide p-hydroxybenzoïque, en tant que métabolite secondaire, peut

passer par deux voies distinctes. La première passe par la transformation du chorismate par

l'intermédiaire de la chorismate lyase. La seconde transforme les cinnamates en benzoates

grâce à la coenzyme-A, puis A. niger fournit l'acide p-hydroxybenzoïque. La spécificité de

A4B-17 résiderait dans l'utilisation d'une enzyme de type estérase pour la production de

parabens.

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Page 11: Monographie Parabens

Figure 4: Une courbe typique de croissance et de production dans les racines de culture d'Oca en fonction du temps : Harmine, harmaline et methylparaben contenus dans les exsudats des racines modifiées comparés à celles non-modifiées. (D'après H. P. Bais et al., 2003)

Figure 5: Cinétique de la synthèse de 4HBA et de ses esters par la souche A4B-17. (D'après Peng et al., 2006)

Figure 6: Zone d'inhibition de la souche A4B-17 contre Bacillus subtilis subsp. subtilis IFO1379 (D'après Peng et al., 2006)

Page 12: Monographie Parabens

La figure 6 montre que ces bactéries utilisent les parabens comme moyen de défense

vis-à-vis des autres micro-organismes. En effet, il n'y a pas de développement de B. subtilis

dans un rayon de 0,4 cm autour de A4B-17.

3. Méthodes officielles de dosage et d'analyse :

Les méthodes de dosage et d'identification des parabens sont réglementées par la

directive Européenne 96/45/CE du 2 juillet 1996 [20], basée sur les travaux de De Kruijf et

al. [21][22]. Celle-ci, en tant que directive, laisse toutefois le soin aux états membres de

mettre en place les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires,

notamment la vérification, par des contrôles officiels, de la bonne application des méthodes

qu'elle décrit.

3.1. Identification :

L'identification des parabens se fait par Chromatographie sur Couche Mince (CCM).

3.1.1. Solution de référence :

Sept solutions différentes à 0,1% m/v contenant respectivement les méthyl, éthyl,

propyl, butyl et benzylparaben, le phénoxy-2-éthanol et le phénoxy-1-propanediol sont

préparées afin de servir de point de comparaison pour le calcul des rapports frontaux.

3.1.2. Échantillon :

L'échantillon est dans un premier temps acidifié pour éliminer les sels puis mis en

solution dans de l'acétone afin de solubiliser le plus grand nombre de composés.

L'échantillon est ensuite filtré.

Le filtrat est ensuite mélangé à de l'eau et le pH est ensuite amené à 10 afin de faire

passer les conservateurs dans la phase aqueuse (formation de phénolates). Les parabens ne

sont pas hydrolysés lors de cette opération car celle-ci se déroule à froid.

Les acides gras sont ensuite précipités en milieu alcalin sous forme de sels de calcium. La

solution est de nouveau filtrée puis le filtrat est une première fois extrait à l'éther

diéthylique afin d'éliminer tous les produits organiques.

On récupère la phase aqueuse, contenant les conservateurs, que l'on tamponne à pH 2

avec de l'acide chlorhydrique. Les parabens repassent dans la phase organique et celle-ci

est une dernière fois extraite à l'éther diéthylique. L'échantillon est ainsi prêt pour être

analysé.

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Page 13: Monographie Parabens

Composé Rf x100 Couleur

Acide p-hydroxybenzoïque 11 Rouge

méthylparaben 12 Rouge

benzylparaben 16 Rouge

éthylparaben 17 Rouge

propylparaben 21 Rouge

butylparaben 26 Rouge

phénoxy-2-ethanol 29 Jaune

phénoxy-1-propanediol 50 Jaune

Tableau 4: Exemple de Rf pouvant être obtenus (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)

Page 14: Monographie Parabens

L'analyse se fait par CCM avec un éluant apolaire afin d'améliorer la migration des

composés : la Commission Européenne préconise l'utilisation d'un mélange n-pentane/acide

acétique 88:12. La plaque est révélée chimiquement en utilisant une solution commerciale

de réactif de Millon (nitrate mercurique).

3.1.3. Exploitation des résultats :

Lorsque la plaque est correctement révélée, on peut calculer les rapports frontaux des

différentes taches obtenues et les comparer à ceux des solutions de référence. Les

parabens ainsi que l'acide p-hydroxybenzoïque apparaissent sous forme de taches rouges. Il

est possible qu'une coélution existe entre l'acide et le méthylparaben ou bien entre le benzyl

et l'éthylparaben. Le tableau 4 présente à titre indicatif des valeurs de Rf pouvant être

obtenues.

3.2. Dosage :

Le dosage des parabens et d'autres conservateurs (phénoxy-2-éthanol et

phénoxy-1-propanediol) s'effectue par HPLC en phase inverse. Il s'agit d'un dosage par

étalonnage externe utilisant un étalon interne : l'hydroxy-4-benzoate d'isopropyle.

Dimensions de la colonne L = 12,5 cm ; Ø = 4,6 mm

Phase stationnaire Nucléosil 5C18 ou équivalent

Phase mobile THF/MeOH/MeCN/H2O (5/10/25/60 v/v)

Débit PM 1,5 mL.min-1

Détecteur UV à 280 nm

Tableau 5: Caractéristiques de l'appareillage HPLC utilisé.

Les parabens sont des composés apolaires comportant un chromophore, l'utilisation

d'une colonne apolaire et d'un détecteur UV sont donc particulièrement adaptés.

Le tetrahydrofuranne (THF) est utilisé comme co-solvant, permettant alors de

s'affranchir des différences de polarité entre les conservateurs. La séparation repose

maintenant uniquement sur l'hydrophilie des composés analysés. Le méthanol et

l'acétonitrile permettent de moduler la polarité de l'eau et, ainsi, d'optimiser les conditions

de séparation. Ils sont utilisés également dans le but d'augmenter la viscosité de la phase

mobile de façon à augmenter la résolution en diminuant l'agitation moléculaire (première

Loi de Fick).

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Page 15: Monographie Parabens

Figure 8: Séparation des pics (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)

Figure 9: Facteur d'asymétrie des pics (D'après la septième directive 96/45/CE du 2 Juillet 1996)

Figure 7: Chromatogramme d'un shampooing. Présence de PhEt (Rt=4,0 min), MePa (Rt=4,6 min), EtPa (Rt=7,4 min), PrPa (Rt=13,4 min), BuPa (Rt=25,9 min). (D'après Borremans et al., 2004)

Page 16: Monographie Parabens

3.2.1. Gamme étalon :

On prépare 5 solutions étalons diluées dans un mélange éthanol/eau (9/1 v/v) contenant

l'étalon interne et les conservateurs suivants : méthyl, éthyl, propyl, butyl, benzylparabens,

phénoxy-2-éthanol et phénoxy-1-propanediol. Puis on effectue l'analyse HPLC de ces

solutions, ce qui permet d'obtenir les différentes courbes d'étalonnage.

3.2.2. Échantillon :

La préparation de l'échantillon pour le dosage HPLC est plus simple que celle nécessaire

pour l'identification. En effet, cette technique permet l'analyse d'un plus grand nombre de

composés. Ceci permet de s'affranchir des étapes de purification longues entraînant la perte

possible d'une partie des produits à doser.

L'échantillon est acidifié, notamment afin d'éliminer les sels de parabens. Il est ensuite

mis en solution dans un mélange éthanol/eau. On effectue un chauffage suivi d'un

refroidissement rapide sous un flux d'air froid puis il est stocké pendant une heure au

réfrigérateur. On augmente ainsi la solubilité des conservateurs dans l'éthanol. L'échantillon

est ensuite filtré afin d'éliminer toute particule solide restante. Il est enfin injecté après

avoir pris soin d'y ajouter l'étalon interne.

3.2.3. Exploitation des résultats :

La figure 7 est un exemple de chromatogramme pouvant être obtenu grâce à cette

méthode. On remarque que la préparation de l'échantillon est efficace car il y a peu de pics

parasites.

La méthode est générale et s'applique donc à tous les produits. Ceci implique que la

résolution des pics ne soit pas toujours optimale. Un facteur de séparation des pics et un

facteur d'asymétrie sont donc introduits par cette directive.

Le facteur de séparation, défini par la figure 8, doit être d'au moins 0,90 pour que

l'analyse soit acceptée, alors que le facteur d'asymétrie (As), défini par la figure 9, doit lui

aller, pour tous les pics, de 0,9 à 1,5. Le texte précise que la composition de la phase

mobile peut être optimisée dans le but d'obtenir la séparation souhaitée.

Compte tenu de la qualité du chromatogramme obtenu et en se basant sur la théorie de

la répartition gaussienne, le calcul des concentrations ne s'effectuera pas en tenant compte

des aires des pics mais en reportant les hauteurs des pics sur les courbes étalons. Le

résultat obtenu, exprimé en pourcentage par rapport à la masse, est, en toute rigueur,

minoré mais les travaux de Borremans et al. [23] montrent que l'on peut considérer cette

minoration comme non significative.

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Page 17: Monographie Parabens

Figure 10: Chromatogramme illustrant l'interférence de l'acide sorbique dans un échantillon cosmétique ; MePa (Rt=4,7 min), acide sorbique (Rt=4,8 min) (D'après Borremans et al., 2004)

Espèces Voie Méthyl paraben

Éthyl paraben

Propyl paraben

Butyl paraben

Souris Oral >8000 -6 322 à >8000

13 200

SourisOral (sel de sodium)

2000 1500 3700 950

Souris Sous-cutanée 125–1200 - 1650 -

Souris Sous-cutanée (sel de sodium)

1200 1650 1650 2500

Souris Intra-péritonéal 760–960 - 640 -

Rat Oral 2100–8000 4300 >8000 -

Lapin Oral 3000a 4000a 6000a -

Chien Oral 3000a 5000a 4000a -a : DL100 ou dose léthale

Tableau 6: DL50 (mg/kg) des parabens sur différentes espèces animales par différentes voies d'admission. (D'après Soni et al., 2005)

Page 18: Monographie Parabens

Cette même étude éprouve la reproductibilité et la répétabilité de cette méthode qui

semblent significativement améliorées en comparaison des résultats originaux. Les auteurs

expliquent ces différences par les performances accrues des dernières colonnes

chromatographiques, les travaux de De Kruijf et al. datant de 1989.

Elle met aussi en avant qu'il peut exister une coélution entre le méthylparaben et l'acide

ascorbique ou le sorbate de potassium, qui sont eux-aussi des conservateurs utilisés dans

les formulations cosmétiques (figure 10). Ce phénomène est résolu en utilisant un gradient

de phase mobile : MeOH/MeCN/H2O (10/15/75, v/v/v) pendant 10 min, puis gradient

linéaire d'une minute jusqu'à MeOH/MeCN/H2O (15/30/55, v/v/v) puis isocratique jusqu'à la

fin de l'analyse. L'augmentation de la séparation s'explique par l'augmentation du caractère

hydrophile de la phase mobile : les conservateurs étudiés étant hydrophobes, leur

interaction avec la phase stationnaire sera plus importante.

4. Toxicité :

4.1. DJA, DL 50 et doses absorbées :

Soni et al., dans leur rapport sur la sécurité des parabens [4], regroupent les résultats

de différentes études portants sur la détermination des DL50. Ces résultats sont présentés

dans le tableau 6. En raison de problèmes de solubilité des parabens, les études ont

principalement portées sur leurs sels sodés. Pour cette raison, les valeurs concernant les

sels sont plus précises que celles de leurs homologues non-sodés, dont les valeurs sont

absentes, approximées ou contenues dans un intervalle relativement large. On remarque

que, dans le cas d'une administration orale, la DL50 diminue avec l'augmentation de la

chaîne alkyle alors que la tendance est inversée pour une administration sous-cutanée.

Au vu de ces résultats, les autorités européennes de sécurité des aliments (EFSA) fixent

une DJA groupée de 10 mg/kg pour les esters méthylique et éthylique de l'acide

p-hydroxybenzoïque et de leurs sels de sodium, n'étant pas en mesure de fixer une DJA

pour le paraben propylique étant donné les études récentes supposant sa toxicité. Elles

conviennent, ainsi que l'AFSSAPS, qu’il est peu probable que le propylparaben présente un

risque pour la santé, compte tenu de son utilisation limitée [2][24].

La commission de cosmétologie du 29 Septembre 2005 autorise, quant à elle, la

poursuite de l'utilisation des parabens aux conditions prévues par la réglementation

actuelle, en excluant le benzylparaben compte tenu du manque de données le concernant et

de son manque d'intérêt. Elle propose également, à cette époque, une inscription

nominative des esters évalués favorablement à la place de l'appellation générique “ ester de

l'acide p-hydroxybenzoïque ”.

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Page 19: Monographie Parabens

Ces valeurs sont à comparer avec les valeurs trouvées par les différentes études qui se

sont penchées sur les doses totales d'exposition quotidienne. À l'heure actuelle, ces études

estiment cette exposition à 76 mg/j (soit 1,26 mg/kg/j pour un individu de 60 kg). La

participation des produits alimentaires est estimée à 1 mg/j (soit 0,017 mg/kg/j), celle des

cosmétiques à 50 mg/j (soit 0,833 mg/kg/j) et celle des médicaments à 25 mg/j (soit

0,417 mg/kg/j) [4].

4.2. L'hydrolyse des parabens

Les travaux de Ye [25] montrent que les parabens subissent une hydrolyse dans notre

organisme, dont le sous-produit majoritaire est l'acide p-hydroxybenzoïque qui peut être

ensuite excrété dans les urines sous sa forme propre ou sous forme de glycine, glucuronide

et de sulfates conjugués de l'acide p-hydroxybenzoïque. Lors d'une étude sur le lapin [26],

l'administration par gavage d'une dose unique de méthylparaben (0,4 ou 0,8 g/kg) conduit

après 24h à 39% d'acide p-hydroxybenzoïque libre, 15% d'acide p-hydroxyhippurique, 22%

de p-hydroxybenzoyle glucuronide, 10% de sulfate de p-carboxyphényle. Ils constatent

également que lors de l'augmentation de la longueur de la chaîne alkyle, le taux d'excrétion

urinaire de l'acide p-hydroxybenzoïque diminue.

Différentes études, portant sur la cinétique de l'hydrolyse des parabens montrent que la

détoxification s'effectue en deux étapes. La première consiste en l'hydrolyse proprement

dite des parabens pour les éliminer rapidement dans les urines sous forme d'acide

p-hydroxybenzoïque. La seconde passe par une excrétion métabolique conduisant aux

autres produits précédemment cités.

Les parabens peuvent également subir une hydrolyse lors de leur administration par voie

cutanée. Ainsi, Wooi et al. [27] et Seko et al. [28] rapportent que 70% du propylparaben

appliqué sur la peau de rats est métabolisé. En employant du diisopropyl fluorophosphate

(inhibiteur d'estérase), ils constatent l'absence de métabolites et montrent ainsi que les

carboxyl estérases, présentes dans la peau et la graisse sous-cutanée [1], sont

responsables de cette métabolisation.

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Figure 11: Les différentes formes de l'acide p-hydroxybenzoïque après hydrolyse des parabens.

HN

O

O

OH

HO

acide p-hydroxyhippurique

S

O

O

O

OHO

OH

sulfate de p-carboxyphényle

O

OH

OH

HO

O

O

HO

O

OH

p-hydroxybenzoyle glucuronide

Page 20: Monographie Parabens

Figure 12: Réponse oestrogénique d'une cellule soumise à l'action de différents parabens. Les réponses maximales (A540 ~ 2,7) à la concentration maximale ne sont pas montrées. (A) Le graphe décrit l'absorbance en fonction de la concentration logarithmique du 17β-estradiol dilué en série de 10 nM à 5 pM, et des methyl, ethyl, propyl, butyl et 4-n-dodecylparabens dilués de 500 µM à 250 nM, mesurée après 3 jours d'incubation. (B) Comparaison de l'effet oestrogénique du butylparaben avec ceux de l'acide p-hydroxybenzoïque (dilué de 500 µM à 250 nM) et du 4-nonylphénol (dilué de 2 mM à 1 µM). Le blanc montre la réponse de base dans l'essai. (D'après Routledge et al., 1998)

Page 21: Monographie Parabens

On sait également que la capacité des parabens à passer à travers le stratum corneum

(barrière la plus externe de la peau) augmente avec la longueur de la chaîne

ester [8][29][30]. Même si cette pénétration reste faible, la surface d'application étant

importante, la dose administrée ne peut être négligée [9].

Cependant, il est fréquent de leur associer des tensioactifs afin de mieux les solubiliser

dans les produits cosmétiques, ce qui a pour effet de diminuer leur pénétration à travers la

peau. En effet, une étude sur la peau du cochon de Guinée [31] a montré que la présence

de solubilisants tels que le polysorbate 80, le polyethylène glycol ou le PEG 400 diminue

l'absorption des parabens, notamment le butylparaben, alors que leur activité

antimicrobienne augmente.

4.3. Toxicité de l'acide p -hydroxybenzoique :

Compte tenu de la quantité de métabolites produits lors de l'hydrolyse des parabens, il

est intéressant de se pencher en priorité sur la toxicité de l'acide p-hydroxybenzoïque étant

donné qu'il représente à lui seul la majeure partie des métabolites.

D'après un rapport de l'Organisation de Co-opération et de Développement Economique

[32], rassemblant les données actuelles sur l'acide p-hydroxybenzoïque, sa DL50 est de

6000 mg/kg et sa NOAEL (No Observed Adverse Effect Level) est de 1000 mg/kg/jour.

Ce même rapport indique qu'il est peu irritant pour la peau et moyennement pour les

yeux. C'est aussi un sensibilisant modéré. Les études montrent qu'il est 100% biodégradé

après 28 jours. Son log(P) de 1,37 à 25°C montre qu'il a une bioaccumulation assez faible.

Il présente également peu d'effets oestrogénisant comme le suggèrent les travaux

(figure 12B) de Routledge et al. [8], de Byford et al. [33] et de Darbre et al. [34]. Celui-ci

ne présente donc pas d'effet sur la fertilité, le ratio des sexes ou la morphologie des

enfants.

L'acide p-hydroxybenzoïque n'est pas tératogène, ni génotoxique et est donc classé dans

les substances à priorité faible pour les travaux à venir [32].

4.4. Bioaccumulation :

On a vu cependant que la totalité des parabens n'était pas hydrolysée. Il faut donc

maintenant se pencher sur le devenir de ces parabens. D'après l'Agence Française de

Sécurité SAnitaire et des Produits de Santé (AFFSAPS) : “ en raison de leur hydrolyse dans

l'organisme, ils ne sont pas susceptibles de s'accumuler dans les tissus ”.

Dans une étude, portant sur des chiens, des doses de 100 mg/kg/j de méthyl, éthyl,

propyl et butylparaben ont été administrées par intraveineuse. Les auteurs constatent la

présence des esters dans le cerveau, la rate et le pancréas et de métabolites dans le foie et

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Page 22: Monographie Parabens

Tableau 7: Limites de confiance des concentrations moyennes (ng.g-1) de parabens dans 20 tumeurs mammaires.(D'après Darbre et al., 2004)

Page 23: Monographie Parabens

les reins. Par contre lors de l'administration par voie orale de doses pouvant aller jusqu'à

1 g/kg, les auteurs ne constatent aucune accumulation. D'autres études sur la toxicité

chronique et aiguë portant sur le rat, la souris, le lapin et le chat ont montré qu'il n'y avait

aucune accumulation des parabens ou de leurs métabolites dans l'organisme [35].

Ainsi, à ce jour, aucune étude n'a prouvé l'accumulation de parabens dans les tissus

sains. Cependant, il n'en est pas de même pour des tissus cancéreux. En effet, Darbre et al.

[34] publient en 2004 une étude qui sera à l'origine de la polémique actuelle visant à

interdire leur emploi. Celle-ci met en évidence la présence de parabens dans des tissus

cancéreux du sein. Ils trouvent ainsi des concentrations de parabens pouvant aller de 0 à

12,8 ng/g (tableau 7), ainsi qu'une concentration de PCBs (pesticide PolyChloroBiphényls)

de 267 ng/g et de OCPs (Pesticides OrganoChlorés) de 707,5 ng/g. Les auteurs ne

fournissent pas d'explications quant à l'origine systémique ou non des parabens et ne

peuvent conclure à une éventuelle corrélation entre la présence de parabens et la formation

de la tumeur. C'est pourquoi, ils préconisent de refaire une étude avec un groupe plus large

que les 20 utilisés et avec la présence d'un groupe témoin. Par ailleurs, le méthylparaben

est celui qui est retrouvé en plus forte quantité. Ceci s'explique soit par le fait qu'il fait

partie des deux parabens les plus employés (avec le propylparaben) [34][25], soit par le

fait qu'il s'absorbe mieux dans les graisses [34].

Selon le dernier rapport de sécurité sur les parabens [4], les études de toxicologie aiguë,

subaiguë ou chronique actuelles ont montré que, leur pouvoir oestrogénisant mis à part, les

parabens ne montraient pas d'effets toxiques par les différentes voies d'administration.

4.5. L'effet oestrogénisant :

Même si les parabens sont reconnus comme des substances relativement sûres

[4][8][36], leur effet oestrogénisant est très controversé à l'heure actuelle. Celui-ci est

néanmoins considéré comme faible par les études toxicologiques sur le sujet

[4][8][36][34]. Cet effet a été étudié du fait de leur structure similaire à d'autres produits

connus pour être “ oestrogène-like ” : les alkylphénols. En effet, la présence d'un

groupement alcool en para sur le cycle aromatique est considéré comme une condition

importante pour observer un effet oestrogénique [36].

Leur effet oestrogénisant augmente avec la longueur de la chaîne alkyle [33]. Routledge

et al. [8] ont comparé l'effet oestrogénique des quatre parabens les plus utilisés avec celui

du 17β-estradiol, principal oestrogène naturel (figure 12A). Leurs résultats indiquent que les

méthyl, éthyl, propyl et butylparabens sont respectivement 2 500 000, 150 000, 30 000 et

10 000 fois moins oestrogénique que le 17β-estradiol. Ils remarquent sans pouvoir

l'expliquer que le 4-n-dodécylparaben se montre inactif dans la gamme de concentration

testée, ce qui est en contradiction avec l'effet observé précédemment.

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Page 24: Monographie Parabens

Figure 13: Effets des administrations sous-cutanée de methyl et butylparaben sur le poids des utérus secs de rats immatures. Estradiol (E2) (0,04 mg/kg, sc) a été utilisé pour un contrôle positif. Le groupe de contrôle (C) a reçu exclusivement de l'huile d'arachide. (D'après Routledge et al., 1998)

Page 25: Monographie Parabens

Une autre étude menée par Byford et al. [33] sur des cellules du sein montre que la

concentration en paraben doit être de 100 000 (butyl, propyl) à 500 000 (éthyl, méthyl) fois

supérieure à celle du 17β-estradiol pour que ceux-ci exercent leur effet.

Comme vu précédemment, le butylparaben est celui qui présente la plus forte toxicité.

Pour observer cet effet, Routledge et al. administrent à des rats immatures des doses

variables de parabens et en mesure les effets sur l'utérus des animaux.

Pour une dose orale de 800 mg/kg/j, aucun effet n'est observé pour le méthyl alors que

le butyl provoque une faible augmentation du poids de l'utérus.

Pour des doses sous-cutanée de butylparaben comprises entre 400 et 1200 mg/kg/j, on

on observe une augmentation pouvant atteindre 170%. La plus faible dose induisant une

réponse est de 200 mg/kg/j, alors qu'une dose de 800 mg/kg/j de méthylparaben n'induit

toujours aucun effet (figure 13).

L'exposition aux oestrogènes naturels ou synthétiques peut affecter défavorablement la

santé de l'homme, et particulièrement les fonctions de reproduction. Oishi [36][37] montre

ainsi que les butyl et propylparabens ont un effet sur le système de reproduction des souris

mâles et qu'ils endommagent les dernières étapes de la spermatogènese dans les testicules.

Pour des doses de 1504, 146 et 14,4 mg/kg/j, tous les groupes présentent une

détérioration de leurs spermatozoïdes. À la plus forte dose, une augmentation du poids de

l'épididyme est observé alors qu'il n'y a aucun effet sur le foie, la prostate et les vésicules

séminales. Dans sa dernière étude [29], pour des doses de 1000 mg/kg/j, il n'observe pas

d'effet avec les méthyl et éthylparabens.

4.6. Parabens et cancer du sein :

Darbre, dans un de ses articles étudiant l'effet des différents oestrogènes

environnementaux sur l'apparition du cancer du sein [38], émet l'hypothèse d'une relation

entre la présence de parabens dans des cellules cancéreuses [34] et l'apparition de tumeurs

mammaires. Elle suppose que l'origine des parabens serait liée à l'application de produits

cosmétiques sous les aisselles, tels que les antitranspirants.

Cependant, elle conclue, qu'à l'heure actuelle, aucune étude n'a pu prouver une relation

entre la présence de substances chimiques et le développement du cancer du sein. Le CTFA

(Cosmetic, Toiletries and Fragrance Administration), la FDA (Food And Drug Administration)

et l'ACS (American Cancer Society) valident cette conclusion [39][40].

4.7. L'effet allergisant

De nombreux cas individuels d'allergies cutanées de type IV (retardées) ont pu être

rapportés. Les individus sensibles aux parabens sont souvent capables de les tolérer lors de

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Page 26: Monographie Parabens

leur emploi dans les produits cosmétiques s'ils sont appliqués sur une peau saine.

Cependant, les personnes présentant déjà un problème de peau à l'endroit de l'application

peuvent subir une réaction allergique. Ce paradoxe a été mis en évidence par Fischer qui le

nomme “ paraben paradox ”. Dans le cas d'ingestion d'aliments ou de médicaments

contenant des parabens, seuls quelques rares cas d'allergies ont pu être rapportés. Le plus

souvent, cela provoque un eczéma localisé et sans gravité [1].

On observe également des allergies de type I (immédiates) lors de l'application cutanée

de solutions de parabens. Ces réactions allergiques provoquent des urticaires localisés pour

la plupart. Toutefois, dans certaines de ces études, les parabens sont mis en cause sans

preuve véritable de leur effet. En 1979, Henry et al. décrivent un cas d'allergie immédiate à

des solutions de parabens. Celles-ci comportent cependant des doses élevées de méthyl et

éthylparaben (5%) [41]. Les doses employées commercialement sont jugées trop faible

pour induire une réaction allergique sur une peau saine. Il existe également des cas isolés

d'allergie de type I lors d'administration parentérale (voie autre que l'ingestion). Là encore,

les réactions sont localisées et bénignes [1].

5. Produits de substitution :

Nous avons vu les différents problèmes liés à l'utilisation des parabens, il semble

maintenant important de regarder les différents produits dont nous disposons aujourd'hui

pour les substituer. A l'heure actuelle, la famille de l'alcool benzylique est une autre grande

famille de conservateur que l'on trouve dans les produits cosmétiques. On trouve aussi au

sein de cette famille l'acide benzoïque et son sel, le benzoate de sodium. Ces produits ont

une DJA de 5mg/kg/j [42], plus faible que celle fixée pour les parabens. Nair [42] rapporte

que les conservateurs de cette famille ont des propriétés cancérigènes et tératogènes

avérées, et qu'ils sont également allergènes à des doses cutanées de 5%. L'auteur note

l'absence d'étude de toxicité chronique ainsi que le manque de données sur l'ingestion de

ces produits et encourage les recherches, compte-tenu des effets connus à cours terme.

On emploie aussi souvent le phénoxy-2-éthanol pour protéger les produits formulés.

Celui-ci présente une DL50 de 1,26 g/kg et est aussi considéré comme tératogène, allergène

et irritant notamment pour les yeux. On lui connaît aussi des effets sur le sperme des

poissons à des doses de 0,05%. Toutefois, la pénétration à travers la peau reste assez

faible [43].

On peut également utiliser des conservateurs naturels comme le linalol. Celui-ci a été

classé comme substance allergène [44] par la Commission Européenne dans la directive

2003/15/CE [45], qui oblige ainsi les industriels à signaler la présence de ce produit dans

les formulations. De plus, son spectre d'action peu large en fait un conservateur peu

efficace et ses propriétés organoleptiques peuvent parfois être indésirables.

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Page 27: Monographie Parabens

6. Conclusion :

Les parabens sont donc largement utilisés dans les domaines alimentaires,

pharmaceutiques et cosmétiques pour leurs propriétés antifongiques et antibactériennes.

Leur emploi est strictement réglementé au niveau Européen et les doses d'emploi sont

fixées à 0,4% individuellement et à 0,8% en mélange. Pour vérifier cela, une méthode de

dosage obligatoire a été éditée. Celle-ci repose sur une méthode HPLC en phase inverse et

doit être précédée d'une identification par CCM.

Les parabens sont obtenus industriellement à partir du phénol, selon la réaction de

Kolbe-Schmitt, puis par estérification avec l'alcool portant la chaîne alkyle voulue. Certaines

études montrent qu'ils sont également trouvés à l'état naturel dans différents aliments et

plantes ainsi que dans certaines espèces de bactéries, ce qui pourrait éventuellement, selon

les auteurs, conduire à une voie d'obtention biosynthétique.

L'emploi des parabens depuis plus de 80 ans en tant que conservateur, leur toxicité

relativement faible et leur hydrolyse rapide dans l'organisme en ont fait des substances

reconnues comme sûres. Même si leur effet oestrogénisant est démontré, celui-ci reste

considéré comme faible, aux doses d'emploi, comparé aux oestrogènes naturels tel que le

17-β-estradiol.

La bioaccumulation des parabens dans les tissus sains n'a pu être démontrée. Darbre et

al. ont, par contre, démontré leur présence dans les tissus cancéreux. Aucune étude n'a, à

ce jour, pu démontrer une relation de cause à effet entre la présence de parabens et

l'apparition d'une tumeur cancéreuse.

Comme pour toute substance, il existe des cas d'allergies aux parabens mais celles-ci

sont bénignes et localisées. Depuis 1920 et malgré leur emploi massif dans les différents

produits, seuls quelques cas spécifiques ont pu être rapportés à l'heure actuelle.

Les DJA, DL50 et toutes les doses utilisées pour les études de toxicité sont largement

supérieures aux doses d'exposition quotidiennes estimées. C'est pourquoi, au vu de leur

rapport bénéfice/risque, aucune autorité n'a interdit leur utilisation, d'autant plus qu'aucun

substitut présentant un spectre d'action aussi large, une aussi bonne stabilité et un risque

moindre n'a été trouvé. La substitution des parabens n'est donc pas si simple.

Toutefois, le manque d'études récentes et la découverte, il y a peu, d'une possible

bioaccumulation requière de nouvelles études plus larges et menées sur un plus long

terme ...

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Page 28: Monographie Parabens

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[41] J. C. Henry, E. H. Tschen, L. E. Becker ; Contact urticaria to parabens ; Arch. Dermatol.; 2 (1979) ; 115-1231 (Cité par Cashman and Warshaw, 2005)

[42] B. Nair ; Final report on the safety assessment of Benzyl Alcohol, Benzoic Acid, and Sodium Benzoate ; Int. J. Toxicol. 20 Suppl 3 (2001) ; 23-50

[43] United states National Library of Medicine - Hazardous Substances Data Bank ; http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/search/r?dbs+hsdb:@term+@rn+122-99-6 (25 mars 2007)

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[45] Directive 2003/15/CE du parlement Européen et du conseil du 27 février 2003 modifiant la directive 76/768/CEE du Conseil concernant le rapprochement des législations des états membres relatives aux produits cosmétiques ; JO n° L66/26 du 11 Mars 2003; 1-10

Page 31: Monographie Parabens

RÉSUMÉ :

Les parabens sont les esters de l'acide p-hydroxybenzoïque. Ce sont des substances chimiques stables, aussi bien au pH qu'à la température, largement employés pour leurs propriétés antibactériennes et antifongiques. Leur mode d'action est encore mal connu, toutefois une hypothèse sur leur action sur la membrane plasmique des cellules a été formulée. Le parlement Européen a mis en place un cadre législatif décrivant leur emploi en alimentaire et en cosmétique.

Ils sont obtenus industriellement par estérification de l'acide p-hydroxybenzoïque, lui-même produit selon la réaction de Kolbe-Schmitt à partir du phénol. On les retrouve naturellement dans différentes plantes et bactéries, ce qui a permis de mettre en évidence leur biosynthèse.

Suite à leur emploi massif dans les différentes industries, le parlement Européen a publié une méthode d'identification et de dosage, reposant respectivement sur deux techniques d'analyse chimique que sont la CCM et l'HPLC en phase inverse.

Leur effet toxique est faible. Ainsi, la DJA groupée est fixée à 10 mg/kg, alors que la dose d'exposition est estimée à 1,26 mg/kg/jour. Ils sont, par ailleurs, principalement hydrolysés dans le corps en acide p-hydroxybenzoïque et celui-ci ne présente pas d'effet toxique important. On les considère actuellement comme faiblement allergisants et on ne prouve pas la présence d'effets tératogènes et cancérigènes. Toutefois, récemment la découverte d'un effet oestrogénique a remis en cause leur utilisation. Cet effet est 100 000 à 500 000 fois plus faible que le 17-β-estradiol. Il est à l'origine de l'hypothèse d'un possible lien entre l'exposition aux parabens et l'apparition de cancer du sein, lien qui n'a pu être démontré à l'heure actuelle.

Au vu des connaissances actuelles, il semble que le rapport bénéfice/risque favorise la poursuite de l'emploi des parabens, car leur substitution n'est pas si simple, compte tenu des effets des autres produits. Ce résultat réclame des études toxicologiques plus larges et la découverte de nouveaux conservateurs pourrait permettre de limiter leur utilisation.