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Montagne Sainte Geneviève Plateforme Génomique
http://transcriptome.ens.fr Atelier Épigénétique, UPMC, Mars 2011
Stéphane Le Crom ([email protected])
Institut de Biologie de l’École normale supérieure (IBENS) Plateforme Génomique de la Montagne Sainte Geneviève
Atelier Epigénétique Université Pierre et Marie Curie
Le séquençage à haut débit Mars 2011
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Le séquençage par la méthode Sanger
• Méthode par synthèse enzymatique inventée en 1977 par Frédérick Sanger (Angleterre, nobel de Chimie 1980).
• Initiation de la polymérisation de l’ADN à l'aide d'une amorce complémentaire.
• Élongation de l’amorce par des ADN polymérases thermostables (PCR).
• Addition des quatre désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) et d’une faible concentration de l'un des quatre didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP).
• Ces ddNTP une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, empêchent la poursuite de l’élongation. La terminaison se fait de manière statistique sur toutes les positions possibles.
D’après The Scientist
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Lecture de la séquence
• On obtient un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes qui se terminent tous au niveau d'une des bases dans la séquence.
• Ces fragments sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
• La détection des fragments synthétisés se fait en incorporant un traceur dans l'ADN synthétisé.
• Initialement ce traceur était radioactif, attachés soit à l'oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide.
• Environ 1 kb d’ADN par lecture en 6-8 heures. Une lecture par échantillon.
A C G T Du plus grand
Au plus petit
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Les séquenceurs à capillaires
• Les séquenceurs capillaires sont apparus dans les années 90 grâce au remplacement du marqueur radioactif par un marqueur fluorescent.
• Utilisation des tubes capillaires de verre de seulement quelques microns de diamètre, sur plusieurs dizaines de centimètres de longueur (30 à 50 cm), pour séparer l'ADN durant l'électrophorèse.
• Les quatre nucléotides passent dans le même tube capillaire à l’aide de quatre marqueurs fluorescents différents.
• 300 kb d’ADN par lecture en 3 heures. Un grand nombre d’échantillons en parallèle.
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Les nouvelles méthodes de séquençage à haut débit
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Historique des technologies en présence
• Principe : obtention de séquences courtes en très grand nombre.
• Roche : 454 GS FLX
• Illumina/Solexa : Genome Analyzer
• Applied Biosystems : SOLiD
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La technologie 454 (préparation)
• Fractionnement aléatoire de l’ADN de l’échantillon à analyser en morceaux de 300 à 800 pb pour obtenir une banque d’ADN simple brin matrice.
• Préparation en ajoutant des adaptateurs spécifiques des extrémités 3' et 5’.
• Immobilisation de chaque brin sur une bille. Un fragment d’ADN = une bille.
• Émulsion des billes avec les produits d’amplification dans un mélange eau-huile. Création de microréacteurs contenant une seule bille.
• PCR en émulsion. Amplification de chaque séquence dans son microréacteur. Amplification de toute la banque en parallèle. Plusieurs millions de copies par bille.
Mardis (2008) Trends Genet.
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La technologie 454 (séquençage)
• Purification et chargement des fragments sur plaque. Le diamètre des puits ne permet qu’une seule bille à la fois.
• Ajout des enzymes de séquençage et envoi des nucléotides individuels les uns après les autres.
• Les bases complémentaires du brin matrice s’ajoutent une ou plusieurs à la fois.
• Le signal chimie luminescent est enregistré par une caméra CCD.
• Séquençage par synthèse avec émission de lumière, on parle de pyroséquençage.
Mardis (2008) Trends Genet.
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La technologie 454 (lecture)
• La lecture est effectuée en simultanée sur plusieurs bases incorporées. Le « flowgram » est alors lu pour obtenir la séquence.
• On obtient : - 400 000 lectures ; - chacune de 250 bases ; - 100 Mb par run.
• Les erreurs majeures de séquences proviennent avec cette méthode des homopolymères.
http://www.454.com/
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La technologie Illumina/Solexa (préparation)
• Génération d’une banque d’ADN double brin à partir de l’échantillon à analyser par fractionnement aléatoire en morceaux de 200 pb.
• Ajout d’adaptateurs spécifiques aux extrémités.
• Dénaturation de l’ADN en simple brin.
• Fixation de l’extrémité des simples brins aléatoirement à la surface du « flowcell ».
• PCR « bridge » en phase solide. Création d’un double brin. Dénaturation et création de groupes (clusters) denses où les fragments sont amplifiés.
http://www.illumina.com/
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La technologie Illumina/Solexa (séquençage)
• Le premier cycle de séquençage commence en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués, les amorces et l’ADN polymérase.
• Après excitation par un laser, la fluorescence émise par chaque cluster est récupérée et la première base est lue.
• Le cycle suivant continue en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués.
• Après excitation l’image est acquise de la même façon et la deuxième base est lue.
• Les cycles de séquences sont répétés pour lire chaque base les unes après les autres.
http://www.illumina.com/
Vidéo présentation Illumina/Solexa
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La technologie Illumina/Solexa (lecture)
• La lecture est effectuée à chaque position sur toutes les séquences en parallèle.
• On obtient : - 45 000 000 de lectures ; - chacune de 36 bases ; - 1 Gb par run.
• Les erreurs majeures de séquences proviennent d’erreur de séquençage (99%)
http://www.illumina.com/
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La technologie SOLiD (préparation)
• Fabrication de deux types de banque : classique ou « mate-paired ».
• Ajout d’adaptateurs.
• PCR par émulsion comme dans la méthode 454.
• Enrichissement des billes amplifiées.
• Modification en 3’ pour permettre la fixation covalente sur une lame.
• Dépôts des billes sur la lame qui peut-être séparée en chambres.
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/
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La technologie SOLiD (séquençage)
• Séquençage par ligation.
• Des amorces s’hybrident sur les adaptateurs présents sur la matrice.
• Un jeu de 4 sondes de 2 bases marquées en fluorescence sont associées aux amorces.
• La spécificité des sondes de 2 bases s’effectue avec les 1ère et 2nd bases de chaque réaction de ligation.
• Plusieurs cycles de ligation, détection et clivages sont effectués.
• Les produits d’extension sont retirés et une nouvelle amorce complémentaire de la positon n-1 est utilisée pour un second tour de ligations.
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/
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La technologie SOLiD (séquençage)
• Cinq tours de remise à zéro des amorces sont effectués pour chaque séquence.
• À chaque nouvelle mise à jour le primer utilisé interroge la position n-1.
• Dans ce processus chaque base est interrogée dans deux réactions de ligation indépendantes par deux différentes amorces.
• Par exemple la base en position 5 est mesurée par l’amorce 2 dans le cycle de ligation 2 et par l’amorce 3 dans le cycle de ligation 1.
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/
Vidéo présentation SOLiD
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La technologie SOLiD (séquençage)
• Le codage des résultats est effectué sur 2 bases dans un espace de 4 couleurs.
• La lecture des séquences est effectuée dans un espace de couleur.
• À partir du moment où l’on connaît la première base, la conversion de l’espace des couleurs vers celui des bases est possible.
• La séquence de référence est codée dans l’espace de couleur. L’alignement et la séquence consensus sont aussi effectués dans cet espace.
http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiDSystemSequencing/
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La technologie SOLiD (lecture)
• Le système de codage de la lecture sur deux bases permet une très grande fidélité de la lecture des résultats.
• Avec ce système on peut faire la différence entre les erreurs de séquençages et les variants réels (SNP, insertions et délétions).
• On obtient : - 80 000 000 de lectures ; - chacune de 30 bases ; - 3 Gb par run.
• Le système de codage dans l’espace de couleur rend l’analyse informatique relativement complexe.
Mardis (2008) Trends Genet.
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Comparaison des différentes technologies
Mardis (2008) Trends Genet. Et http://www.agencourt.com/services/nextgen/
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Les améliorations actuelles
• Augmentation de la densité des éléments (puits, clusters, billes).
• Utilisation du système « paired-end tags » (PET) ou « mate-pair ».
• Amélioration des logiciels de détections.
Fullwood (2009) Genome Res.
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Comparaison des dernières générations
454 GS FLX SOLiD 5500XL HiSeq 2000 Run Time 10 heures 14 jours 8 jours
Taille des lectures (pb) 1000 2x 75 2x 100
Nombre de lectures 1 106 1,4 109 1 109
Données générées 1 Gb 300 Gb 200 Gb
Débit 1 Gb/jour 15 Gb/jour 25 Gb/jour
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L’évolution des technologies de séquençage
Stratton (2009) Nature
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L’évolution des technologies de séquençage
Stratton (2009) Nature
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Coû
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Les prochaines générations
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Le séquençage en temps réel
• Technologie de séquençage en temps réel sur molécule unique grâce à l’immobilisation au fond d’un puits d’une molécule d’ADN polymérase.
• L’incorporation de chaque base associée à un fluorochrome est mesuré en temps réel grâce à une caméra CDD placée sous la plaque support.
Eid (2009) Science
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Pacific Biosciences
Vidéo de présentation de Pacific Biosciences http://www.pacificbiosciences.com/
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Les applications
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Elles recouvrent les techniques précédentes
Kahvejian et al. (2008) Nat. Biotech.
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Elles peuvent se regrouper en 2 catégories
Rothberg et Leamon (2008) Nat. Biotech.
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Le séquençage de novo
• Les nouvelles technologies permettent de séquencer plus vite et pour moins cher qu’avec la méthode de Sanger.
• Seulement les lectures sont plus petites et chaque méthode à ses propres limites.
• La combinaison de plusieurs méthodes différentes permet pour de petits génomes d’obtenir des brouillons de bonne qualité.
=> Combinaison 454 et Illumina.
• Taux d’erreur faible et couverture uniforme car absence des biais introduits par le clonage dans la méthode Sanger.
• Les erreurs sont différentes entre les deux méthodes.
Aury et al. (2008) BMC Genomics
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Les applications de reséquençage
• Leurs buts : analyser différents génomes en les comparant à une souche de référence.
• Recherche de polymorphismes dans une population, d’identification de mutations en biotechnologie, d’analyse d’évolution d’organismes, de différenciation d’une cellule au cours du temps, de la découverte d’ADN anciens …
• Métagénomique : caractériser les différents génomes présents dans un échantillon.
• Le champs des applications de cette approche est important : caractériser les micro-organismes pathogènes présents chez un patient (sang, tissus, …), définir l’ensemble des espèces présents dans l’environnement (écologie, dépollution, …), comprendre l’évolution des espèces, …
http://www.jgi.doe.gov/News/lake_washington_microbes.jpg
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Les applications fonctionnelles
Wold et al. (2008) Nat. Methods
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Les applications sont très nombreuses …
Shendure et Ji (2008) Nat. Biotech.
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Le traitement informatique
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L’analyse des données
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L’analyse des données
• L’obtention de données en très grand nombre nécessite la mobilisation de ressources informatiques importantes.
• Les systèmes d’analyse produisent des To de données à chaque expérience (nombreuses images à forte résolution).
• Les seuls fichiers de résultats prennent beaucoup d’espace (4Go compressé avec Illumina) empêchant les transferts par le réseau de façon efficace.
• L’alignement des lectures sur les génomes de grande taille demande beaucoup de mémoire vive et de temps de calcul.
http://www.geospiza.com/finchtalk/labels/Next Generation Sequencing.html
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Les nouvelles technologies de séquençage • Avantages
• Pas de sous-clonage ni d’utilisation de bactérie comme hôte :
- plus de biais ; - banques plus simples.
• Chaque séquence provient d’une molécule d’ADN unique :
- quantification ; - gamme dynamique plus grande.
• Résolution importante pour un très grand nombre de types d’expériences différentes.
• Amélioration considérable dans la vitesse et dans le coût comparé à la méthode de Sanger.
• Inconvénients
• Les séquences obtenues sont plus courtes :
- par rapport à Sanger ; - paramètres du « base calling » ; - analyses bioinfo à repenser.
• La quantité de données générées pose de vrai problème d’informatique :
- plusieurs To par run ; - utilisation de temps CPU ; - Choisir ce qui doit être archivé.
• La technologie évolue sans cesse ce qui pose des problèmes pour l’amortissement des appareils.
• La fabrication des banques n’est pas une étape si simple.
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Quel avenir pour les puces à ADN ?
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Les puces à ADN vont elles disparaître ?
• Les applications du séquençage recouvrent celles des puces à ADN.
• La technologie est plus sensible pour détecter les gènes faiblement exprimés. La gamme dynamique est plus large (pas de saturation).
• Elle est plus précise, plus rapide et moins couteuse pour détecter les SNP dans de grands génomes.
• Les puces à ADN nécessitent de connaître la séquence à analyser.
Ledford (2008) Nature et Shendure (2008) Nat. Methods
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A complémentaire de T G complémentaire de C
Deux séquences complémentaires peuvent s’apparier (hybrider).
L’hybridation est influencée par de nombreux paramètres : • Spécificité (cross-hybridation) • Sensibilité (Tm, structure secondaire, …) • Séquences choisies (taille, composition)
Certains paramètres peuvent être contrôlés par la stringence du milieu d’hybridation (température, concentration saline et présence d’agents déstabilisant les liaisons H comme la formamide).
Le séquençage s’affranchit de l’hybridation
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Comparaison des forces en présence
Wang et al. (2009) Nat. Rev. Genet.
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Des applications dédiées
• Les puces à ADN vont de plus en plus se tournées vers des applications de diagnostique ou de criblage.
• On peut imaginer avec le couplage de l’hybridation et de l’analyse en temps réel que des solutions rapides et mobiles seront disponibles dans le futur.
• L’augmentation de la densité et surtout du multiplexage va permettre de diminuer le coût de chaque hybridation (moins de 100 euros).
• Des applications de capture pour ensuite séquencer sont aussi en cours de validation.
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