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Conhecimentos atualizados sobre o mormo: Resultados projeto da estação quarentenária de
CananéiaBrasília, DF 24/09/2019
Edviges Maristela Pituco
Coordenadora do Laboratório de Referência OIE/FAO para Febre Aftosa e Estomatite Vesicular do PANAFTOSA-OPS/OMS
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Centro Panamericano de Fiebre Aftosa
Salud Pública VeterinariaOPS OMS
PROJETO MORMO EQC CANANÉIA
Acordo de cooperação: MAPA/ Panaftosa/Instituto Biológico
Início: Junho de 2015
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COLABORADORES Projeto MORMO: AVALIAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, ANATOMOPATOLÓGICA E
MICROBIOLÓGICA
Nome Formação/Cargo Instituição
1- Edviges Maristela Pituco Médica Veterinária-PqC Panaftosa-OPS/OMS 2- Liria Hiromi Okuda Médica Veterinária-PqC LVB/IB3- Adriana Nogueira Romaldini Médica Veterinária-PqC LVB/IB4- Eliana De Stefano Bióloga-PqC LVB/IB5- Alessandra Nassar Médica Veterinária-PqC Bact/IB 6-Daniela Pontes Chiebao Médica Veterinária – Pqc LVB/IB7- Claudia Del Fava Médica Veterinária-PqC LAP/IB8- Guilherme H.F. Marques Médico Veterinário Panaftosa-OPS/OMS9- Judi Maria da Nóbrega Médica Veterinária DSA/SDA/MAPA10- Mateus C. S. Araújo Médico Veterinário SQC/DDA/SFA-SP11- Hellen M. da Q. Simões Médica Veterinária SQC/DDA/SFA-SP12- Júlio Pompei Médico Veterinário Panaftosa-OPS/OMS13- Anna Paula Alvim Bióloga Panaftosa-OPS/OMS 14- Marina Rosa Bióloga Panaftosa-OPS/OMS 14- Manuel Sanchez Médico Veterinário Panaftosa-OPS/OMS 15- Alfonso Clavijo Médico Veterinário CFIA - Canadá
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MORMO: AVALIAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, ANATOMOPATOLÓGICA E MICROBIOLÓGICA
OBJETIVO GERAL
Estudar equinos com resultado diferente de negativo para mormo (positivos, suspeitos eanticomplementares).
A seleção dos animais foi baseada em resultados de FC e/ou WB (Detecção de anticorpos anti-B. Mallei com kit’s importados Alemanha e EUA) e teste da maleína.
• Estudo longitudinal para avaliar a dinâmica da resposta imune humoral, repetibilidade e
reprodutibilidade dos testes em equinos naturalmente infectados.
• Disponibilizar novas metodologias para diagnóstico e vigilância do mormo
• Disponibilizar material de referência (banco de soros e cepas)
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MORMO: AVALIAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, ANATOMOPATOLÓGICA E MICROBIOLÓGICA
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:1. Acompanhamento clínico, anatomopatológico, epidemiológico e detecção direta e indireta do agente;
2. Avaliar a reação de fixação de complemento (FC) utilizando antígenos de diferentes origens (CcproAlemanha e USDA/EUA);
3. Desenvolver, padronizar e validar os métodos de ELISA indireto e WB para detecção de anticorposanti-B.Mallei;
4. Comparar os resultados dos testes de ELISA e Western Blotting com os de FC;
5. Comparar resultados dos Kit’s de ELISA de diversos fornecedores com o desenvolvido pela equipe doprojeto;
6. Desenvolver, padronizar e validar métodos moleculares para identificação da B. mallei;
7. Promover cursos para profissionais nacionais e internacionais
8. Produzir material didático para auxiliar nas ações de Educação Sanitária.
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CONTRIBUIR COM AS MEDIDAS SANITÁRIAS
Gerar conhecimento:
Agente, patogenia, patologia estrutural e funcional,diagnóstico e assim contribuir para tornar maisefetivas ações para controle / erradicação domormo no Brasil
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BIOSSEGURANÇA
USO DE EPIs
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INSTALAÇÕES - ESTAÇÃO QUARENTENÁRIA
Baias dos equinos
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MORMO DOENÇA REEMERGENTE
A doença recentemente foi qualificada como reemergentedevido ao aumento do número de casos relatados em váriaspartes do mundo nos últimos anos (Brasil, China, Índia, Irã,Iraque, Mongólia, Paquistão, Turquia e Emirados Árabes),além disso há suspeita que a doença pode estar presenteem várias áreas do Oriente Médio, Ásia, África e outrospaíses da América do Sul).
Algumas áreas apresentam focos (Faltam estudos paraavaliar a prevalência).
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MORMO Doença transmissível aguda ou crônica, causada pela bactéria Burkholderiamallei que quase sempre afeta vias aéreas anteriores e pulmões, mas podeatingir qualquer órgão.
O mormo agudo - caracteriza-se por um período de incubação curto, seguido do
aparecimento repentino de sinais gerais e severos de uma infecção grave, como febre,anorexia, depressão, letargia. Na forma aguda os animais morrem entre a primeira eterceira semanas.
Um abcesso desenvolve-se no ponto de inoculação e a bactéria dissemina-se deste localatravés dos vasos linfáticos ao linfonodos regionais. No trajeto dos linfáticos podemaparecer muito abcessos. A bactéria invade rapidamente a corrente sanguínea causandoabcessos em muitos órgãos, sobretudo pulmão, fígado, baço e músculos. Podem formar-se abcessos subcutâneos e superficiais em qualquer parte do corpo do animal.
O exame histopatológico revela uma piemia fulminante (Exsudação extensa e necrose).
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MORMO CRÔNICO
O mormo crônico têm início insidioso e caráter progressivo ourecidivante. Caracterizada por abcessos crônicos de pele,linfadenopatia, esplenomegalia e hepatomegalia, comaparecimento de abcessos granulomatosos.
Nas formas crônicas, uma infecção remitente (diminui deintensidade por intervalos), recidivante ou persistente podecontinuar durante anos. A maioria sucumbe à infecção.
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CURSO DA DOENÇA EM EQUINOS Em equinos a doença tende a ser crônica, sem ou com poucos sinais clínicosaparentes (especialmente em áreas endêmicas).
O equino tem resistência natural relativamente alta para a B. Mallei. Emconsequência, ao primeiro contato, a bactéria consegue porta entrada, mas noinício da infecção causa lesões triviais.
Outras doenças crônicas debilitantes (cardiopatias, problemas nutricionais,condições estressantes etc) concomitantes predispõem reativação da bactéria,neste caso os equinos podem apresentar doença com curso fatal em tempocurto.
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MORMO
Em muares e asininos a doença tem evolução aguda e asinfecções são geralmente fatais em curto intervalo de tempo.
B. Mallei é patogênica para humanos, de caráterextremamente agudo transmitido pelo contato com animaisinfectados (Fatores ocupacionais).
Quase todos os casos humanos de doença descritos resultamde uma via de entrada cutânea.
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DESAFIOS NO SORODIGNÓSTICO DE MORMO
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SENSIBILIDADE X ESPECIFICIDADE DOS MÉTODOS
• É A CAPACIDADE DE UM TESTE CLASSIFICAR COMO NEGATIVOQUEM É NEGATIVO
ESPECIFICIDADESENSIBILIDADE
• É A CAPACIDADE DE UM TESTE CLASSIFICAR COMO POSITIVO QUEM É POSITIVO
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SITUAÇÃO IDEALSENSIBILIDADE 100%
ESPECIFICIDADE 100%
Não infectados Infectados
Título de anticorpos
+_
Freq.
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Não infectadosInfectados
Título de anticorpos
Freq.
maior especificidade diagnóstica
maior sensibilidade diagnóstica
sens. espec. diagnóstica intermediária
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ESTUDO CLÍNICO-PATOLÓGICO DOS EQUINOS DO EXPERIMENTO
EM CANANÉIA
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ESTUDO CLÍNICO-PATOLÓGICO DOS EQUINOS DO EXPERIMENTO
• Os equinos são inspecionados diariamente pela equipe de funcionários de Cananéia
• E quinzenalmente pela equipe do Instituto Biológico, que realiza investigação clínica detalhada e colheita de amostras
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GRUPOS EXPERIMENTAIS (CANANÉIA)
Classificação grupos
De acordo com a condição de cada equino relativa a mormo com base emdados clínicos e sorodiagnóstico (vários testes)
02 grupos de equinos em fases distintas de evolução da doença + grupocontrole e potros:
• Infecção aguda (n=04)
• Infecção crônica (n=13)
• Negativos (n=12)
• Potros=13 nascidos na EQC• 06 de mães positivas (cronicamente infectadas)
• 07 de mães negativas (sentinelas)
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EQUINOS GRUPOS EXPERIMENTAIS (CANANÉIA)
Atualização em setembro de 2019
23 EQUINOS NA EQC (13 potros + 10 adultos)
03 Positivos (crônicos)
20 Negativos
Nascimento 13/10/17 (égua positiva e potro continua negativo)
Nascimento nov/18 (égua positiva e potro continua negativo)
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FORMA AGUDA DE MORMO
Detecção de anticorpos anti-B. mallei Positivo: ELISA, WB e FC
Detecção direta da bactéria
Positivo: PCR (Diferenciação de B. malleiX B. pseudomallei)
Secreção nasal muco-purulenta
Emagrecimento
Bacteremia - múltiplos órgãos afetados, principalmente tratorespiratório anterior e pulmões. Evolução rápida e morte por volta de20 dias.Também foi evidenciado aumento da concentração de fibrinogênio plasmático
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OUTRO CASO DE INFECÇÃO AGUDA
Descarga nasal muco-purulentaFoto Dra Mônica Fagundes C. K. Gunnewiek –SAA/CDA, agosto 2016.
Detecção de anticorpos anti-B. malleiPositivo: ELISA, WB e FC
Detecção direta da bactéria
Positivo: PCR (Diferenciação de B. mallei X B. pseudomallei)
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INFECÇÃO CRÔNICALinfangite em membros posteriores
Equinos com infecção crônica –monitorados diariamente desdejunho de 2015 – 70 amostras de sorospareados foram obtidas até omomento
Sorodiagnóstico
• Positivo: ELISA e WB (Panaftosa)
• Negativo: FC Tanto antígeno alemão quanto americano)
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ABSCESSO E NÓDULOS NA PELE DE EQUINO COM MORMO
Sorodiagnóstico
Positivo: ELISA e WB
Negativo: FC
PCR: positivo
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Granulomas na pele de equino com mormo
A necessidade de oxigênio da bactéria explica a súbita multiplicação em focos infectantes quando a lesão caseosa atinge a superfície.
Neste mesmo conceito explica a razão para localização preferencial nos pulmões bem aerados
Sorodiagnóstico
Positivo: ELISA e WB
Negativo: FC
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INFECÇÃO CRÔNICA
Lesão cutânea com fístulas, que drenamsecreção purulenta.
PCR positivo em amostra da secreção purulenta
Baixos títulos de anticorpos durante todoexperimento (06/2015 até 12/2018)
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Úlcera região do olho
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ANIMAL ASSINTOMÁTICO – INFECTADO PELA B. Mallei
Foto de equino infectado sem sinais clínicos aparentes.
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INFECÇÃO CRÔNICA
Garanhão - foto maio 2019
Garanhão - foto outubro 2015
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Sinais clínicos dos 30 equinos soro-reagentes aos testes de Elisa e WB para mormo, oriundos de São
Paulo e dos grupos experimentais de Cananéia
SINAIS CLÍNICOS EQUINOS
Estado nutricional Regular ou bom
Corrimento nasal e ocular (maioria
bilateral)
16
Ulcerações nas fossas nasais 11
Cicatrizes estreladas nas fossas nasais 02
Abscessos subcutâneos 08
Ulcerações cutâneas 05
Cicatrizes cutâneas 04
Espessamento de vasos linfáticos
(linfangite)
08
Sem sinais clínicos aparentes 12
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INFECÇÃO CRÔNICA
• Estado nutricional bom – (infectado x doente)
• Manifestações febris intermitentes
• Caquexia - mesmo com boa alimentação
• Edema dos membros - Linfangite
• Sinusite
Achados anatomopatológicos
• Abscessos pulmonares
• Abscessos hepáticos
• Abscessos esplênicos
• Miosite piogranulomatosa
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COLHEITA DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE LABORATORIAL
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COLHEITA DE AMOSTRAS
• Ante mortem - Colheitas quinzenais de sangue com e semanticoagulante, secreções nasais, oculares e punção de linfonodos;
• Os materiais são levados para o Laboratório de Viroses do InstitutoBiológico em São Paulo - SP. Este faz cadastramento das amostras,armazena as que serão mantidas na coleção e distribui fração paraos demais integrantes da equipe.
• Pos mortem - colheita de fragmentos de órgãos (pulmão, linfonodo,baço, fígado, rim, SNC, dentre outros). Parte mantida refrigerada eparte em formol.
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COLHEITA DE AMOSTRAS PARA DETECÇÃO DIRETA DA B. MALLEI
Secreção nasal, ocular, punção abscesso e fragmento de órgãos e úlcera
Úlcera em BHIMEIO MEM (Earle)
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Amostra para Sorodiagnóstico
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PRODUÇÃO E VALIDAÇÃO DE MATERIAL DE REFERÊNCIA
Colheita de sangue em bolsa (sem anticoagulante) para obtenção de soro
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COLHEITA DE AMOSTRAS DE SANGUE
• No período de junho de 2015 a maio de 2019 foram colhidas por volta de 3300 amostras de sangue para obtenção soro (Detecção anticorpos anti- B.Mallei por FC, ELISA e WB).
AUMENTO DA TAXA DE FIBRINOGÊNIO PLASMÁTICO
FIBRINOGÊNIOPLASMÁTICO NORMAL
O aumento da concentração defibrinogênio plasmático é umindicador de processo inflamatórioem equinos.Nos equinos do grupo na fase aguda,foi evidenciado esse aumento defibrinogênio, dificultando a obtençãode soro dos equinos deste grupo.
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PRODUÇÃO DE MATERIAL DE REFERÊNCIA Fibrinogênio -
É uma proteína sintetizada pelo fígadoA concentração plasmática aumenta por vários dias durante o processo de inflamação aguda,
atingindo o pico entre o sétimo e décimo
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PUNÇÃO ABSCESSOS SUBCUTÂNEOS
Foto Dra. Mônica Fagundes C. K. Gunnewiek – SAA/CDA, agosto 2016
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PRINCIPAIS ACHADOS A NECROPSIA
POS MORTEM
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ESTUDO ANÁTOMO - HISTOPATOLÓGICO
Dos animais necropsiados foram colhidosfragmentos de órgãos.
Para detecção direta da B.mallei por PCR ecultivo microbiológico
Exame histopatológico
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CASO DE MORMO
Secreção purulenta traqueia
Abcesso no baço
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ÚLCERA NA MUCOSA DA NARINA
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NECROPSIA – FRAGMENTOS DE ÓRGÃOS
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ACHADOS ANATOMOPATOLÓGICOS
Lesão na traqueiaAbscessos na traqueia de equino mormo PCR positivo.
Foto Pituco, E.M. 2016
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LESÕES EM PULMÃO E LINFONODOS
Necrose em linfonodo do epiplon
Processo inflamatório no pulmão elinfonodos do epiplon (aumentadose com necrose).
Fotos Pituco, E. M., LVB/IB 2015
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CASO AGUDO MORMO ABCESSOS NO PULMÃO DE EQUINO
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DIAGNÓSTICO
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DIFÍCIL ISOLAMENTO
Em 04 anos de experimento foi possível isolamento em amostras de apenas
03 equinos
Algumas substâncias produzidas durante a infecção in vivo podem ter
efeitos inibidores sobre a multiplicação da bactéria in vitro, particularmente
no pH 6,5. Esse pH ácido é facilmente atingido nos focos inflamatórios, e nas
áreas de caseose.
A progressiva acidose local e o aumento da anaerobiose podem contribuir
para o desaparecimento da bactéria nas áreas centrais das lesões caseosas.
Já se demonstrou, in vitro, que os ácidos lático e acético tem efeitos
inibidores sobre a multiplicação da bactéria.
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PCR
Equinos positivos = 67% (28/42)
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DESAFIOS NO DIAGNÓSTICOINFECÇÃO CRÔNICA
Quais testes detectam o equino com infecção crônica?
Equinos cronicamente infectados mantém carga bacteriana baixa, pouco
estímulo imunogênico, portanto título baixo de anticorpos (IgG).
FC identifica IgM e IgG. Não detecta a maioria dos equinos com infecção
crônica (prova pouco sensível e específica).
Há variação grande no desempenho dos testes (depende do antígeno utilizado
no ELISA ou FC).
Portanto há necessidade de avaliar o desempenho dos testes para uso na rotina
diagnóstica.
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Títu
loan
tico
rpo
s
SOROCONVERSÃO
DETECCÃO DE ATICORPOS NOS SENTINELAS APÓS INFECÇÃO POR B. MALLEI
↑ IgM
↓ IgM + ↑ IgG
IgG
IgG
IgG
09/2019(experimento continua)
20100
3207680
1603200
ELIS
A (
IgG
)
FC (
IgM
e Ig
G)
*Infecçãoaguda
(primária)
Infecção latente(crônica)
07/2015(início do experimento)
• Uma pequena porcentagem da população infectada apresenta doença clínica (distinguir infecção/doença).• Uma grande porcentagem da população infecção latente• Equinos velhos a doença geralmente representa ativação de infecção latente adquirida quando joven (Estimar qual
porcentagem de casos que apresentaram doença clínica são decorrentes de infecção latente).
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MANUAL TERRESTRE DA OIE – CAPÍTULO 3.5.11 (2019)MORMO E MELIOIDOSE (VERSÃO ATUALIZADA EM MAIO DE 2018)
Métodos prescritos para diagnóstico do mormo e seu propósito (comércio internacional)
1 Apenas Amostras de equinos – a prova debe ser
interpretada com cuidado quando analisadas amostras
de muares e asininos.
Legenda:
+++ = método recomendado, validado para o fim
indicado;
++ = método adequado, porem necessita validação;
+ = pode ser utilizado em certas situações contudo o
custo, confiabilidade ou outros fatores limitam sua
aplicação;
– = não adequado para esta finalidade;
n/a = não aplicável para o fim indicado.
ELISA=enzimoimunoanálise;
PCR= reação em cadeia da polimerase.
“Métodos de Referência”
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• Institute for Bacterial Infections and Zoonoses, Friedrich-Loeffler-Institute,Jena Alemanha - Dr Heinrich Neubauer
• ANSES Maisons-Alfort – Aprovado OIE em 2019 - Dr Karine Laroucau
• Central Veterinary Research Laboratory, Prof. Ulrich Wernery, P.O. Box 597,Dubai, UNITED ARAB EMIRATES.
Papel harmonizar metodologias e de constituir um painel de soros dereferência internacional que permita a padronização do diagnóstico demormo.
LABORATÓRIOS DE REFERÊNCIA OIE PARA MORMO
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RESULTADOS DO PROJETO DE CANANÉIA
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MÉTODOS DE ANÁLISE
•Fixação do complemento
•Teste ELISA
•WB
• Isolamento microbiológico
•PCR
•AnatomopatológicoHistopatológico
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DETECÇÃO DIRETA DA BACTÉRIA
Suabe nasal e ocular - Foram colhidas de animais “latentemente” infectado por volta de 3500 amostras.
RESULTADO NA PCR - TODAS NEGATIVAS
Sucesso na detecção da B.mallei por PCR apenas em amostras de equinos que apresentaram doença clínica tanto aguda quanto crônica (conteúdo de abscesso e fragmento de órgãos com lesão, traqueia, pulmão, fígado, baço, peritônio).
Feto = Fígado + liq. Estomacal
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MORMO: AVALIAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, ANATOMOPATOLÓGICA E MICROBIOLÓGICA
Imunodiagnóstico:
• Fixação do complemento
•Elisa indireto (03 fornecedores externos + desenvolvido nessa pesquisa)
•Western Blotting
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FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO
Evidenciamos resultados falso-positivos na fixação decomplemento e o equino permaneceu positivo por meses.
Pode reagir com epítopos semelhantes de outras bactérias(Streptococcus equi, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderiathailandensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomalleietc).
Após maleinização por período variável (FC positiva foi por até 90dias).
Sensibilidade de 90 a 95% e uma especificidade questionável
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WB FC
Data coleta Id.soro LVB PP RESULT
06/08/2015 11401 -1,3 -NEG NEG positivo (10++++)
20/08/2015 12684 -4,9 -NEG NEG positivo (20++)
01/09/2015 13440 -7,5 -NEG NEG positivo (5++++)
15/09/2015 14724 -5,0 -NEG NEG positivo (10++++)
28/09/2015 15898 -7,3 -NEG NEG positivo (10++++)
15/10/2015 16777 -4,7 -NEG NEG positivo (10++++)
26/10/2015 17164 -4,4 -NEG NEG positivo (10++++)
09/11/2015 18947 -0,4 -NEG NEG positivo (10++++)
23/11/2015 19057 -6,3 -NEG NEG positivo(20++++)
08/12/2015 20902 -1,7 -NEG NEG positivo (10++++)
14/12/2015 21305 -9,9 -NEG NEG positivo (20+++)
07/01/2016 94 -5,7 -NEG NEG positivo (10++++)
20/01/2016 1387 0,6 NEG NEG positivo (10++++)
02/02/2016 3822 -8,1 -NEG NEG positivo (10++++)
23/02/2016 5210 -2,3 -NEG NEG AC
10/03/2016 6641 -3,0 -NEG NEG positivo (10++++)
30/03/2016 9349 -6,0 -NEG NEG AC
19/04/2016 17473 -6,7 -NEG NEG positivo (10+++)
11/05/2016 19909 -11,2 -NEG NEG negativo
31/05/2016 20731 -10,0 -NEG NEG positivo (20++++)
14/06/2016 21650 -11,1 -NEG NEG negativo
28/06/2016 22078 -8,5 -NEG NEG positivo (20++++)
20/07/2016 23017 -11,8 -NEG NEG negativo
04/08/2016 23547 -10,0 -NEG NEG negativo
12/08/2016 23941 -11,3 -NEG NEG AC
30/08/2016 24522 -10,4 -NEG NEG positivo (20++)
28/09/2016 27301 -11,7 -NEG NEG positivo (10+++)
07/10/2016 27762 -12,1 -NEG NEG negativo
26/10/2016 28267 -11,9 -NEG NEG negativo
09/11/2016 28803 -10,6 -NEG NEG positivo (10+)
22/11/2016 29452 -7,2 -NEG NEG negativo
Dados amostra ELISA
Exemplo equino
falso positivo
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NECESSIDADE DE SUBSTITUIR FIXAÇÃO COMPLEMENTO POR TESTE COM MELHOR DESEMPENHO
PROJETO MORMO CANANÉIA
Validação testes: ELISA E WB
https://nacoesunidas.org/centro-da-onu-desenvolve-metodo-de-diagnostico-do-mormo-doenca-de-equideos-que-pode-matar-humanos/
Elaborado dossiê para pleitear o registro dos Kits junto a OIE
Apresentaram alta sensibilidade, especificidade e fácil execução para identificação de equinos mormo positivos, tanto com infecção crônica como aguda.
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ELISA (TESTE TRIAGEM)
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Sensibilidade foi 1 (100%; IC 99% - 100)
Especificidade 1 (100%; IC 99% - 100)
Prevalência de mormo estimada de 5%Valor preditivo positivo foi (99%; IC 98% - 100%)Valor preditivo negativo foi (99%; IC 99% - 100%)
Prevalência de mormo estimada de 1%Valor preditivo positivo foi (97%; IC 92 % - 99%)Valor preditivo negativo foi (99%; IC 99% - 100%)
ELISA INDIRETO
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PANAFTOSA-OPS/OMS
WESTERN BLOTTING
ANTÍGENO RECOMBINANTE OU B. MALLEI SEMIPURIFICADA
Diferentes plataformas para expressão de proteínas recombinantes
(Ex E. coli)
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ESPECIFICIDADE DO WB
O WB é um método baseado em imunotransferência que fornecealta especificidade quando utilizados antígenos proteicosimunodominantes clonados para sorodiagnóstico de mormo.
O método torna-se mais específico (menos reações cruzadas)quando antígeno é recombinante.
Teste confirmatório ideal para esclarecer os falso-positivos no ELISAe FC.
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WB DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI- B. MALLEI
Ag n
ão
pu
rificado
Ag
con
centrad
o
Ag p
urificad
o
Marcad
or
Apresenta melhor especificidade que o teste de triagem
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WESTERN BLOTTING – MORMO - TESTE CONFIRMATÓRIO
Proteína LPS da B.mallei com peso molecular aprox.30 KDA,produzidas em E. coli, pelas técnicas de DNA recombinante,purificadas por eletroforese (PANAFTOSA).
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WESTERN BLOT- MORMO
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WESTERN BLOTTING MORMO
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WESTERN BLOT – EQUINO NEGATIVO
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6 h12 h18 h24 h15 dias 30 dias45 dias70 diasquinzenal
pós nascimento
Positivo = banda claramente visível 30KDa
Negativa = se nenhuma banda for visualizada
WESTERN BLOTTING –FÊMEA PRENHE E POTRO ATÉ 6 MESES
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SOROREVERSÃO EQUINOS SENTINELAS –FOCO SP – INFECÇÃO AGUDA
Fator predisponente
Positivo
Negativo
Resultado WB em soro equino. Mormo Positivo = presença de banda na tira de nitrocelulose.Negativo = ausência de banda.
WESTERN BLOTTING
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CONCORDÂNCIA ENTRE FC X WBFOCO SP - EQUINOS COM DOENÇA CLÍNICA
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Animal Data coleta ELISA WB FC (Ag Alemão)
DO 10% RESULT RESULT RESULT
1113 22/07/2015 0,0674 -7,50 -NEG NEG negativo
23/07/2015 0,1354 7,59 NEG NEG negativo
06/08/2015 0,0985 -0,60 -NEG NEG negativo
20/08/2015 0,0994 -0,40 -NEG NEG inc
01/09/2015 0,1135 2,73 NEG NEG negativo15/09/2015 0,1324 6,93 NEG NEG negativo
28/09/2015 0,1357 7,66 NEG NEG negativo
15/10/2015 0,0789 -4,95 -NEG NEG negativo
26/10/2015 0,0846 -3,69 -NEG NEG positivo (10+)
09/11/2015 0,0756 -5,68 -NEG NEG positivo (20+++)
23/11/2015 0,0954 -1,29 POS POS positivo (20+++)
08/12/2015 0,1426 9,19 POS POS positivo (20+++)
14/12/2015 0,1102 2,00 POS POS positivo (5++++)
07/01/2016 0,1129 2,60 POS POS positivo (5++++)
20/01/2016 0,1453 9,79 POS POS positivo (10++)
02/02/2016 0,1122 2,44 POS POS positivo (10++)
23/02/2016 0,1308 6,57 POS POS negativo
10/03/2016 0,1656 14,30 POS POS negativo
30/03/2016 0,1743 16,23 POS POS negativo
19/04/2016 0,2605 35,37 POS POS negativo
11/05/2016 0,2154 25,36 POS POS negativo
31/05/2016 0,3036 44,94 POS POS negativo
14/06/2016 0,1944 20,69 POS POS negativo
Soroconversão
equino sentinela
Grupo experimental
de Cananéia
(Infecção crônica)
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PANAFTOSA - Salud Pública Veterinaria
Títu
loan
tico
rpo
s
SOROCONVERSÃO
DETECCÃO DE ATICORPOS NOS SENTINELAS APÓS INFECÇÃO POR B. MALLEI
↑ IgM
↓ IgM + ↑ IgG
IgG
IgG
IgG
09/2019(experimento continua)
20100
3207680
1603200
ELIS
A (
IgG
)
FC (
IgM
e Ig
G)
*Infecçãoprimária
Infecção latent (crônica)
07/2015(início do experimento)
• Uma pequena porcentagem da população infectada apresenta doença clínica (distinguir infecção/doença).• Uma grande porcentagem da população infecção latente• Equinos velhos a doença geralmente representa ativação de infecção latente adquirida quando joven (Estimar qual
porcentagem de casos que apresentaram doença clínica são decorrentes de infecção latente).
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Comparaçãodos resultadosFC, ELISA e WB
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CONSIDERAÇÕES
FC apresentou maiores variações emdiferentes colheitas do mesmo animal.
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SENSIBILIDADE E ESPECIDADE ANALÍTICA DOS MÉTODOS FC, ELISA
E WB
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TÍTULO DE ANTICORPOS ANTI- B.MALLEI EM SOROS DE EQUINOS VERDADEIROS POSITIVOS PELOS MÉTODOS FC, ELISA E WB
Equinos Id.soro LVB ELISA WB FC
1 25345 1600 1600 320
2 25591 800 6400 320
3 25362 1600 1600 160
4 25600 6400 12800 160
5 25586 6400 6400 320
6 25622 3200 6400 80
7 25626 3200 12800 80
8 25629 12800 12800 80
9 25632 1600 3200 160
10 25630 6400 12800 320
11 25584 3200 1600 20
12 25350 3200 6400 20
13 25628 1600 3200 320
14 25361 1600 3200 160
15 25360 800 1600 80
16 25608 12800 12800 80
17 25641 Repetir Repetir AC
18 25625 Repetir Repetir Ac
19 25634 1600 3200 10
20 25638 1600 6400 320
21 25640 400 800 10
22 1874 800 200 Menor 5
CORRELAÇÃO TÍTULOS ENTRE OS MÉTODOS
DESENVOLVIDOS E A FC (método padrão OIE)
Comparação média títulos de
anticorpos de 20 equinos positivos
na FC na PCR
Elisa foi 24 vezes mais sensível que a fixação
de complemento.
WB foi 39 vezes mais sensível que a fixação de
complemento.
PARA AVALIAR SENSIBILIDADE ANALÍTICA DO ELISA e WB
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SENSIBILIDADE ANALÍTICA – QUANTITATIVO (TITULAÇÃO DE ANTICORPOS )
Avaliar o limiar de detecção do teste Foram analisados 20 soros reagentes fortes, de equinos verdadeiros positivos (PCR positivos).
Diluição soros para ELISA e WB 1:100 até 1/12800 Diluição soros para FC 1:5 até 1:320
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SENSIBILIDADE ANALÍTICA• Menor quantidade do elemento em análise que o teste é capaz de
detectar (capaz de gerar um sinal).
Exemplo:
RFC 0,05 μg/ μL de anticorpos
ELISA 0,005 μg/ μL anticorpos.
WB/RIA 0,0005 μg / μL de anticorpos
ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
• Capacidade que o teste tem de detectar só o elemento de análise e não
detectar elementos de análise semelhantes. Difícil mensuração.
Exemplo:
• Teste A detecta só o antibiótico x entre 10 semelhantes (+ esp. analítica)
• Teste B detecta antibióticos x, y e z entre 10 semelhantes (- esp.
analítica)
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PARA AVALIAR ESPECIFICIDADE ANALÍTICA
Equinos do projeto mormo de Cananéia foram vacinados com as vacinas abaixo relacionadas:
• VACINA CONTRA GARROTILHO
• VACINA LEPTO EQUUS
• VACINA ANTI-RAIVA
• VACINA LEXINGTON 8 (Vírus da ENCEFALOMIELITE EQÜINA leste e oeste, INFLUENZA EQÜINA cepa A/equine1/Praga/1/56, A/equine2/Miami 1/63 e HERPES VÍRUS EQÜINO tipo 1 e 4, e adicionadas de betapropiolactonapara inativação dos vírus e de 50 U.I. de TOXÓIDE TETÂNICO por dose da vacina).
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DIAGNÓSTICO DIFERENCIALOs sinais clínicos por si só não permitem um diagnóstico definitivo especialmente nas fases iniciais ou “latente” da doença.
Adenite equina (garrotilho - Streptococcus equi) – afeta trato respiratório, produz secreção mucopurulenta vias aéreas anteriores,
linfadenite dos gânglios, formação de abscessos.
Linfangite ulcerativa (Corynebacterium pseudotuberculosis) – pouca descrição em equinos, endêmico em caprinos e ovinos (linfadenite
caseosa) - abscessos superficiais externos, abscessos internos ou forma visceral, e a linfangite ulcerativa propriamente dita.
Staphylococcus aureus e outros agentes podem estar associados Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli). Infecção granulomatosa,
supurativa, que afeta a pele e os tecidos subcutâneos. Sinusite piogranulomatosa.
Esporotricose (fungo Sporotrix schenkii) - múltiplas lesões de pele e mucosas
Pseudotuberculose (Yersinia pseudotuberculosis)
Linfangite epizoótica dos equinos (Histoplasma farciminosum) – patógeno piogênico que afeta acomete os vasos linfáticos, principalmente
na região distal dos membros.
Varíola equina (Horsepox - Orthopoxvirus )
Tuberculose (Mycobacterium tuberculosis e M. bovis.) - hospedeiro acidental
Trauma e alergia
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O sistema ELISA/WB é recomendado tanto para confirmação de casos agudos de mormoquanto para casos crônicos (alta sensibilidade, especificidade e fácil execução)
A FC identifica apenas casos agudos de mormo. Os resultados da FC apresentaramvariações em diferentes colheitas do mesmo animal.
ELISA e WB apresentaram excelente desempenho, repetibilidade, reprodutibilidade eestabilidade inclusive em fêmeas prenhes em qualquer fase da gestação.
ELISA e WB detectam anticorpos colostrais em potros até 70 dias de vida, enquanto a FCnão detectou.
Elisa (fácil execução e boa sensibilidade) - teste recomendado para estudos de prevalênciae controle da movimentação de equinos.
WB - Teste confirmatório, a ser realizado apenas nos soros positivos no ELISA, apresentamelhor especificidade que o teste de triagem.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
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PROJETO MORMO CANANÉIAARTIGOS PUBLICADOS
EM FEVEREIRO DE 2018INFORME SOBRE EL DESEMPEÑO DEL TEST ELISA-BKM16
https://nacoesunidas.org/centro-da-onu-desenvolve-metodo-de-diagnostico-do-mormo-doenca-de-equideos-que-pode-matar-humanos/
Elaborado dossiê para pleitear o registro dos Kits junto a OIE
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Artigos em elaboração ou submetidos a revistas cientificas# Assunto Tema Data Responsável Autores
1Fixação de complemento quente e frio para monitoramento sistemático de
equinos suspeitos para mormo;
revista OIE Enviado em
julho 2019
Alessandra Alessandra, Diego, Aline, Daniela, Adriana, Daniela, Matheus,
Claudia, Anna Paula, Julio, Guilherme e Maristela.
2Validação do ELISA BKM16 contra um painel conhecido (USA, Cananéia e focos
com PM/PCR; possiblidade de incluir comparação com FC);
laboratório/doenças
infecciosas
Set-Dez 2019 Manuel Primeiro Manuel, Segundo Anna Paula, Último Maristela
3Estimativa da sensibilidade e especificidade do ELISA BKM16 pelo método
latent class/bayesian;
serviços
veterinários/doenças
infecciosas
Out-Fev 2019-
2020
Karla, Beatriz e
Manuel
Primeiro Karla, Segundo Manuel, Terceiro Anna Paula,
Penúltimo Beatriz, Último Maristela
4Validação do WB: Mormo contra um painel conhecido (USA, Cananéia e focos
com PM/PCR) e estratégia de confirmação de mormo no contexto dos
programas nacionais;
serviços
veterinários/doenças
infecciosas
Nov-Fev 2019-
2020
Maristela, Anna Paula
e Manuel
Primeiro Anna Paula, Segundo Maristela, Último Manuel
5Detecção da Burkholderia mallei por isolamento e PCR; laboratório Nov-Fev 2019-
2020
Alessandra Primeiro Alessandra, Último Maristela
6Relato de caso: transmissão transplacentária de mormo; reprodução/doenças
infecciosas
Nov-Fev 2019-
2020
Claudia Primeiro Claudia,Segundo Anna Paula, Último Maristela
7Perfil sorológico dos anticorpos colostrais em potros de éguas com mormo; reprodução/doenças
infecciosas
Nov-Fev 2019-
2020
Adriana Primeiro Adriana, Segundo Anna Paula, Último Maristela
8Evidências clínicas e confirmação de diagnóstico de animais em fase crônica e
aguda do mormo;
doenças
infecciosas/cavalos
Nov-Fev 2019-
2020
Claudia e Mateus Primeiro Mateus, Último Claudia
9Correlação das lesões histopatológicas e detecção da B. mallei por PCR em
equinos verdadeiramente positivos;
doenças
infecciosas/cavalos/patolo
gia
Nov-Fev 2019-
2020
Claudia e Alessandra Primeiro Alessandra, Último Claudia
10
Uma comparação dos testes de fixação do complemento, ELISA e Western
Blot. Desafios no diagnóstico de rotina para tomada de decisão na vigilância e
controle do mormo; (Estudo longitudinal animais eutanasiados)
doenças
infecciosas/cavalos
Mar-Jul 2020 Julio, Maristela,
Manuel e Daniel
Primeiro Maristela, Segundo Daniel/Anna Paula
Último Julio/Manuel
11Descrição de surtos nos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Mato Grosso
pelos métodos de ELISA e WB;
doenças
infecciosas/cavalos
Jun-set 2020 Julio Primeiro Julio, Segundo Anna Paula
12Transmissão por contato animais crônicos e animais negativos; (swab nasal e
ocular)
doenças
infecciosas/cavalos
Jun-set 2020 Anna Paula e Daniel Primeiro Anna Paula, Segundo Maristela
Último Alessandra
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FUTURO
• Organizar ensaios de proficiência
• Fornecer material de referência certificado
• Banco genético do agente etiológico
Produção de conhecimento
• Sequenciamento do genoma completo
• Estudar patogenicidade das cepas
• Estabelecer o mecanismo envolvendo transmissão transplacentária e disseminação pelo sêmen
• Epidemiologia da doença
• Qualificação de pessoal
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PANAFTOSA
Centro Panamericano de Fiebre Aftosa
Salud Pública VeterinariaOPS OMS
I SEMINARIO INTERNACIONAL DE MORMO NA EQC
Foto aula prática colheita de material equino mormo positivo
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PANAFTOSA
Centro Panamericano de Fiebre Aftosa
Salud Pública VeterinariaOPS OMS
3ª Capacitação sobre mormo para técnicos dos laboratórios credenciados MAPA
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Acuerdo de cooperación
Laboratório de referência OIE/FAO de febre Aftosa e EV– PANAFTOSA – PAHO/WHO
Compartilhamos as instalações da Unidade de Biossegurança Nível 4
OIE - Laboratório Federal de Defesa Agropecuária - MG (LFDA-MG).
Endereço:
Av. Romulo Joviano, s/n - CEP 33600-000 - Pedro Leopoldo -
MG – Brasil, Tel.: (5521) 3661-9064 - (5531) 3660-9649