Physiologie bactérienne appliquée

à l’identification

Sophie Blevesbleves@imm.cnrs.fr

Microbiologie Biologie des µorganismes

!levures, moisissures, champignons

(mycètes)

!algues

!protozoaires (amibes, parasites)

eucaryotes inférieurs (protistes)

!bactéries

procaryotes 2 groupes taxonomiques

eubactériesarchées

c épithéliales (35!m) GR (8!m) Bactéries (1!m) Virus (10-100nm) 1 000 b sur 1 mm

Comment observer les bactéries?

- microscopie optique (G 1 000-1 500 fois)

- microscopie électronique (G >10 000 fois)

Microscopie optique

Etat frais

Contraste de phase

E. coli

Bleu de méthylène

Fixation + Coloration

Acinetobacter(cocci isolés ou en chaîne entourés d’une capsule)

bactéries d’un frottis de yaourt

Encre de chine!

bacillescoques sprirales

incurvées

bâtonnets fuseau

sphériques

Formes différentes selon les espèces Coloration de Gram

Peptidoglycane: réseau delongues chaînes polysaccharidespontées par peptides

épaisse couche de PG fine couche relâchée de PG (7 à 8 nm) dans lepériplasme + membrane externe

épaisse couche de PG fine couche dans le périplasme relâchée+ membrane externe

Coloration de Gram

Peptidoglycane

Membrane plasmique(bicouche symétrique dephospholipides)

Périplasme

ou Mb interne

Mb externe(bicouche asymétriquephospholipides et LPS)

Gram +Gram -

Coloration spores(vert de malachite, contre

coloration fushine)Bacillus thuringiensis

Autres colorations

Coloration flagellaire(Leifson, fuschine basique)

Vibrio

Microscopie électronique à balayage E. coli x30 000

Microscopie électronique à transmissionE. coli

Microscopie électronique

Identification de bactéries

Echantillon -------------------------> Identification ?

Identification de bactéries

Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments- environnement- …

EnrichissementIsolement

Identification(culture pure)

Il existe de nombreuses espèces bactériennes, qu’on peut classer d’aprèsquelques critères fondamentaux :

- morphologie des colonies- forme & taille des cellules- coloration GRAM- quelques caractères biochimiques simples d’orientation- mode respiratoire- mobilité

Croissance et maintien des µorganismes en laboratoire- aliments essentiels (acides aminés, peptides, bases nucléiques, sucres…),- éléments minéraux : fer, phosphore, soufre, magnésium,....-facteurs de croissance (sang, protéines, vitamines)

Système tampon pour éviter les variations importantes du pH

Milieu liquide ou semi-solide ou solide (agar)

Les milieux de culture

1-milieux complexes (ou riches) : composition chimique inconnue (croissance dela plupart des µorganismes)peptones (hydrolysats de protéines à partir digestion viande, caséine, soja,gélatine....) = source C et énergie

ex LB (Luria Broth), bouillon au soja

2-milieux synthétiques (ou minimums)composés chimiques purs (phosphate, azote, soufre....) en solution dans l’eauex milieu M9

Plusieurs espèces dans l’échantillon1- Isoler la bactérie d’intérêt2-Enrichir

Une espèce dans l’échantillon1- Enrichir

--> Morphologie des colonies

Morphologie des colonies

Couleur

Aspect (sec, gras, transparent…)

Les types de milieux de culture

Milieux solides pour l’isolement liquides pour culture de bactéries pures ou lors d’infection monoµbienne

!: bactéries incultivables (Mycobacterium leprae: intracellulaire obligatoire)

1- milieux sélectifs empêchent la croissance de certaines bactéries et favorisentla croissance de celles d’intérêt = SELECTION

E. coli et Proteus mirabilis(Drigalski)

S. aureus (Chapman)

ex AntibiotiqueDrigalski (cristal violet) : croissance G-SS (sels biliaires) : croissance Salmonella, ShigellaChapman (75% NaCl) : croissance Staphylococcus

Antibiogramme (inhibition croissance)

La température peut être sélective

Serratia marcescensE. coliBacillus stearothermophilus

Pshycrophiles

Mésophiles

Thermophiles

Extrêmophiles

4°C37°C 60°C

2- milieux différentiels: distinction de différents groupes de bactéries(caractéristiques biologiques) = IDENTIFICATION

Mee propriétés biochimiques d'une bactérie pour commencer à l'identifier: étudedu métabolisme respiratoire, des glucides, des protéines, des lipides....

Les types de milieux de culture

Lac+ (colonies rouges)

Lac- (colonies incolores)

Utilisation du LactoseMacConkey utilisation --> "pH(indicateur coloré, rouge neutre)

Caractère fermentaire (2 &3) ou oxydatif (1) Dégradation Glu -->déchets acides (indicateur de pH, rouge de phénol) Production soit de CO2 soit de CO2 et H2 (insoluble)

Fermentation - +- + + +Production H2 - - - + +

test catalase (addition H2O2 )+: dégagement H2

milieu jaune d’oeuf!: hydrolyse des lipides

Bacillus +

E. coli -

Alcaligenes -

test uréase!:Production NH3 --> "pH (indicateurcoloré, rouge de phénol)

E. coli - Proteus vulgaris +

gélose au sang!: bactéries hémolytiques ounon

E. coli - S. aureus +

mobilité (0,5% agar)

Effet de l’oxygène

Pseudomonas, Acinetobacter,Neisseria

Campylobacter, Mycobacteriaceae

Entérobactéries (Escherichia,

Salmonella), streptocoques,staphylocoques

Bactéries intestinales (Bacteroides,

Fusobacterium, Clostridium) et florecommensale

Exemples

Accepteur final d’électrons lorsrespiration aérobie (réduit en eau)

Nécessaire à < 0,2 atm (PP < celle air)

Pas nécessaire, mais utilisé (switch)(oxydation des substrats et fermentation)

Pas nécessaire, non utilisé (fermentation)

Toxique (fermentation, respirationanaérobie, photosynthèse)

Culture sous atmosphère réductrice

-

-

+

+

+

+

+-

+

+

-

Aérobie strict(1)

Microaérophile(3)

Aéro-anaérobiefacultatif (2)

Anaérobieaérotolérant

Anaérobiestrict (4)

Effet de l’O2+ O2+ O2

231 4

- milieux de culture dont la composition permet de mee une activité enzymatique: ß-galactosidase (ONPG), lysine décarboxylase (LDC), ornithine décarboxylase (ODC), uréase(URE)

- activité fermentaire est révélée avec un milieu type contenant un sucre, unindicateur coloré des changements de pH (fermentation sucre " pH)

Tests d’identification en microméthodeGalerie API20-E (Biomérieux)

plus sensiblesmesures photométriques en continu --> identification des principales bactéries isolées en pratique médicale en moins de 5 h

Systèmes automatisés

caractères morphologiques

caractères physiologiques et métaboliques

caractéristiques moléculaires :- composition en bases des AN (GC%)- amplification-séquençage gène codant ARN16S(phylogénie moléculaire : appareils de traduction sonttrès conservés, non échangés par transfertshorizontaux)- comparaison de protéines (séquençage, Ac)

Identification de bactéries

Echantillon- biologique (sang, urines...)- eaux- aliments--environnement…

EnrichissementIsolement

Identificationsur culture pure

Gram +

12 groupes de bactéries

G-

G+

Gram-Proteobacteria

HelicobacterAgrobacteriumEnterobacteriaPseudomonads

DesulfovibrioThiobacillus

Catalase (+ ou -)

Oxydase (+ ou -)

Coagulase (+ ou -)

Indole (+ ou -)

Utilisation des sucres (fermentation on non)

Activité enzymatique ou non (uréase, gélatinase, nitrate réductase…)

Production d’H2S …..

Tous ces caractères permettent d’obtenir une identification de plus en plusprécise, et finalement exacte de la bactérie

Caractères biochimiques simples

Gram +

Coques Gram +

Staphylococcus aureus(supuration, septicémie)

En amas : Staphylocoques (grappe de raisins)

Streptococcus pyogenes(angine, scarlatine)

En chaînettes: Streptocoques, entérocoques

Streptococcus pneumoniae(otite, pneumonie, méningite)

En diplocoques: Pneumocoques

Commensaux (peau, muqueuses, tube digestif)

Clostridium difficile (diarrée post antibiotique)

Bacilles Gram +

Listeria monocytogenes(méningite, avortement)

Bacillus anthracis(maladie du charbon,herbivores transmissible àl’homme)

Gram -

Coques Gram -

Neisseria meningitidis (méningocoque: méningite, septicémie)

Neisseria gonorrhoe (gonocoque, MST)

Entérobactéries

Gram -

Bacilles Gram -

2 familles importantes en pathologie humaine :

Les entérobactéries (Enterobacteriacae) Les Pseudomonas (Pseudomonacae)

Pseudomonas aeruginosaBurkholderiaPathogènes opportunistes(infections nosocomiales etmucoviscidose)

E. coli - commensal (infection urinaire)

- ETEC, EHEC, EIEC (gastro, speticémie)

Salmonella (infection digestive simple à fièvre thyphoïde)

Shigella dysenteriae (infection digestive mineure à grave-

Yersinia pestis

Vibrio cholerae (eau, épidémie Choléra)

Bordetella pertussis (coqueluche)

Mycobactéries Bacilles acido-alcoolo résistants ou «BAAR» Gram impossible --> coloration : Ziehl Nielsen

Mycobacterium tuberculosis (bacille de Koch)

Mycobacterium leprae

SpirochètesTreponema pallidum (syphilis)

Borrelia burgdorferi (maladie de Lyme, morsure tique)

Autres genres importants en pathologie humaine

Mycoplasma pneumoniae

Chlamydia pneumoniae Chlamydia trachomatis (MST)

Rickettsia conorii (fièvre boutonneuse-tiques-) Rickettsia typhi (typhus -puces et poux)

Bartonella henselae: maladie des griffes du chat

Germes intracellulaires : exemples