Vrijednost imunohistokemijskog određivanja gustoće novostvorenih krvnih i limfnih žila,

ciklooksigenaze-2 i matriks metaloproteinaze-2 u karcinomima kolona

Mr.sc. Željko Šundov dr.med.

Epidemiologija

• Na 3. mjestu po učestalosti među zloćudnim novotvorinama kod muškaraca, a na 2. mjestu iza karcinoma dojke kod žena.

• Godišnje u svijetu umire oko 550 000 ljudi.1

• Incidencija raste sa starošću, nakon 40-te godine života, a doseže vrh u dobi od 50 do 75 godina.

• Stopa incidencije u RH za 2006. godinu iznosi 48,0/100 000.2

1 Jemal A i sur. CA Cancer J Clin, 2006.2 Strnad M i sur. Bilten HZJZ 2008.

Klinička slika

- abdominalna bol - rektalno krvarenje- promjene u pražnjenju stolice

Prognostički pokazatelji

- klinički stadij bolesti

- stupanj histološke diferencijacije tumora

- histološki tip

- broj metastazama zahvaćenih limfnih čvorova

- nalaz tumora u ekstramuralnim krvnim žilama

- perineuralna invazija

- peritumorska limfocitna infiltracija

- stanični i molekulski pokazatelji

Model kolorektalne kancerogeneze

• Kolorektalna je karcinogeneza stupnjevit proces u kojem kumulativne mutacije gena dovode do promjena na fenotipskoj razini koje se manifestiraju rastom crijevne sluznice, displastičnim promjenama i konačno invazivnim potencijalom neoplastične lezije.

Fearon E, Vogelstein B. Cell 1990.

Osnovne odrednice ishoda bolesti oboljelih od karcinoma kolona su:

• invazivnost tumora

• metastatski potencijal

Čimbenici uključeni u ove procese kandidati su za nove prognostičke pokazatelje.

Angiogeneza

Angiogeneza je uključena u:

• Tumorsku progresiju• Tumorsku invaziju• Metastaze

Folkman J. N Engl J Med, 1971.

1-2 mm debljine

Proangiogeni čimbenici Angiogeni inhibitori

VEGF- A-D

FGF-1,2

Angiopoietini-1,2

IL- 8

Estrogeni

Trombospondini-1,2

Angiostatin

Endostatin

Interferon

Vazostatin

Fumagillin/TNP-470

IL-12

NSAR-i

Vincent and Rafii, Cancer Cell, 2004

Limfangiogeneza

Različite uloge COX-1 & COX-2

Arachidonic Acid

COX-1(constitutive)

Homeostasis• Stomach/GI protection• Platelet aggregation• Renal blood flow

COX-2(inducible)

Pathophysiology• Inflammation, Pain• Fever• Cancer• Morbus Alzheimer• Ischemia (CNS)

CIKLOOKSIGENAZA (COX-1 i -2)

Interes za istraživanje COX pojavio se kad je u nekoliko epidemioloških studija zamijećena niža incidencija kolorektalnog karcinoma među ljudima koji su uzimali NSAR.

Giardiello FM. N Engl J Med, 1993., Giovannuccci E. Ann Intern Med, 1994.

Uloga COX-2 u progresiji karcinoma kolona

Normalniepitel

Karcinom

Rani adenom Kasni adenom

APCmutacija

TGFß IIRhMSH

K-rasmutacija

p53mutacija

- COX-2 +/- COX-2 ++ COX-2 +++ COX-2

Gubitak COX-2 genske

regulacije

COX-2 pojačana ekspresija

Porast PG

Sinicrope FA, Gill S. Cancer Metastasis Rev 2004;23:63-75

• Porast razine COX-2 nađen je u 40 % kolorektalnih adenoma i 60-80 % kolorektalnih karcinoma u ljudi

Ebehart i sur. Gastroenterology 1994

- Primjenom COX-2 inhibitora u FAP-u smanjenje broja polipa

Steinbach i sur. N Engl J Med, 2000.

- Ekspresija COX-2 povezana je s kliničko-patološkim osobitostima povezanih s lošijom prognozom

Masunaga i sur. Clin Canc Res, 2000.

Matriksne metaloproteinaze (MMP)

MMP-e su proteolitički enzimi koji imaju glavnu ulogu u diseminaciji malignih tumora. Poremećena regulacija ovih enzimskih sistema povezana je s tumorskom progresijom.

Egebald M.Nat Rev Cancer, 2002.

Gelatin (collagen)Membrane-type MMP-1MMP-14/MT1-MMP

Collagens I, II, IIICollagenase 3MMP-13

ElastinMacrophage elastaseMMP-12

alpha1-proteinase inhibitor, (not ECM)

Stromelysin 3MMP-11

FibronectinStromelysin 2MMP-10

Collagen IV, VGelatinase BMMP-9

Collagen INeutrophil collagenaseMMP-8

Syndecan-1 (lung)MatrilysinMMP-7

Collagen IV (not I), Fibronectin, Laminin

Stromelysin 1MMP-3

Collagen IVGelatinase A MMP-2

Collagens I, II, IIICollagenase 1 MMP-1

SubstratesFamilyMMP Number

MMP-4 through MMP-6 do not exist.

Matrix Metalloproteinases and Substrates

Nagase et al., Matrix Suppl. 1: 421-424, 1992

Matriks metaloproteinaza 2 (MMP-2)

- MMP-2 pripada porodici gelatinaza

- Cijepa kolagen tip IV, sudjeluje u remodeliranju epitelnih i vaskularnih bazalnih membrana pri čemu nastaju proteolitički fragmenti koji potiču mobilnost stanica.

Nakajima i sur. Cancer Res,1988.

- Cijepa i laminin 5 koji je neophodan za invaziju i metastaziranje.

Egebald i sur. Nat Rev Cancer, 2002.

Problematika istraživanja

In vitro studije i studije na životinjskim modelima objašnjavaju moguću ulogu COX-2 i MMP-2 proteina u nastanku karcinoma:

1. poticanjem angiogeneze,

2. inhibicijom apoptoze,

3. poticanjem stanične proliferacije i

4. povećanjem invazivnosti tumorskih stanica degradacijom i remodeliranjem staničnog matriksa.

Gustoća novostvorenih krvnih žila –mean vascular density (MVD)

U karcinomima kolona broj novostvorenih krvnih žila uglavnom povezan sa uznapredovalim kliničkim stadijem, pojavom metastaza i kraćim preživljavanjem.

Guetz GD i sur. 2006.

• Osnovni nedostatak studija:– neujednačena metodologija– primjena antitijela različite specifičnosti,– brojenje krvnih žila unutar tumora a ne na invazivnim rubovima

tumora.

Gustoća novostvorenih limfnih žila - lymphovascular density (LVD)

• Vrijednost gustoće novostvorenih limfnih žila (LVD) kao potencijalnog prognostičkog pokazatelja u karcinomima kolona neistražena je.

• Samo jedna studija u kojoj je nađena povezanost LVD-a primjenom imunohistokemijskog bojenja preparata tumora antitijelom LYVE-1 s metastazama u limfne čvorove i kraćim preživljavanjem.

Duff SE i sur. Colorectal Dis,2007.

COX-2 i MMP-2 vs. MVD/LVD

• Prema početnim istraživanjima COX-2 i MMP-2 povezani su s porastom MVD-a

• Povezanost s LVD do sada nije istraživana

U prikazanom istraživanju prvi puta je ispitivana:

• povezanost imunohistokemijskog profila COX-2/MMP-2 proteina s angiogenezom i limfangiogenezom mjerenom (MVD i LVD)

• povezanost ovih biomarkera s kliničkopatološkim osobitostima tumora

Ciljevi istraživanja

1. Odrediti imunohistokemijski profil COX-2/MMP-2

2. Odrediti stupanj angiogeneze (MVD) i limfangiogeneze (LVD)

3. Odrediti povezanost imunohistokemijskog profila COX-2/MMP-2 sa MVD i LVD

4. Odrediti povezanost COX-2/MMP-2 i MVD i LVD s kliničko-patološkim osobitostima karcinoma kolona

5. Povezanost COX-2/MMP-2 profila, MVD i LVD s dužinom preživljavanja (uzimajući u obzir primijenjene metode liječenja)

6. Procijeniti vrijednost COX-2/MMP-2 profila, MVD i LVD kao potencijalnih nezavisnih prognostičkih pokazatelja

Hipoteza

Određivanjem imunohistokemijskog COX-2/MMP-2 profila i gustoće novostvorenih krvnih i limfnih žila (MVD i LVD) uz definiranje granične vrijednosti broja krvnih/limfnih žila izdvojit će se skupina bolesnika sa:

- biološki agresivnijim karcinomom kolona- povećanim rizikom nastanka recidiva - pojavom limfogenih i hematogenih metastaza

posebice bolesnika u terapijski i dijagnostički najslabije definiranom kliničkom stadiju Dukes B.

Ispitanici

- Oboljeli od karcinoma kolona operirani na Klinici za kirurgiju KB Split od 1997. do 2000. godine

- Iz povijesti bolesti i protokola liječenja prikupljeni su klinički podaci: dob, spol, datum operacije, lokalizacija tumora, postojanje udaljenih metastaza i klinički stadij.

- Prema dobnim skupinama bolesnici su svrstani u dvije kategorije : ≤60 i >60 godina.

- Prema lokalizaciji karcinoma bolesnici će biti svrstani u pet kategorija : cekum, uzlazni kolon, poprečni kolon, silazni kolon i sigma

Isključeni su bolesnici s karcinomom kolona:

- kod kojih je učinjen palijativni kirurški zahvat

- kod kojih je pregledano manje od 6 limfnih čvorova

- koji su prije operacije zračeni ili su primali kemoterapiju

- bolesnici u kliničkim stadijima Dukes A, C i D

- bolesnici kod kojih je karcinom bio lokaliziran u rektumu.

Patohistološka analiza

Iz patohistološkog izviješća prikupljeni su patohistološki podaci:

- kliničko-patološki stadij- veličina tumora- histološki tip- stupanj diferencijacije- nalaz vaskularne invazije- tip limfocitnog upalnog infiltrata- broj tumorom zahvaćenih limfnih čvorova/broj izoliranih

limfnih čvorova.

KLASIFIKACIJA DUKES

Stupanj diferencijacije

Niski gradus ( 50% žlijezda) Visoki gradus (< 50% žlijezda)

Vaskularna invazija

Nakupine tumorskih stanica unutar endotelom obloženih prostora

na invazivnom rubu tumora.

• Podatke o primijenjenom onkološkom liječenju dobili smo uvidom u povijesti bolesti bolesnika liječenih u Centru za onkologiju KBC Split.

• Bolesnici kod kojih je uz kirurško primjenjivano i adjuvantno liječenje svrstani su prema primijenjenom liječenju u dvije kategorije:

– adjuvantna kemoterapija,– liječenje metastaza.

• Podatke o preživljavanju dobili smo iz povijesti bolesti, uvidom u smrtne listiće i direktnim kontaktom s liječnicima bolesnika. 

• Periodom praćenja dužine bolesti smatrano je vrijeme od datuma operacije (datum postavljanja dijagnoze) do datuma zadnje kontrole ili datuma smrti (do 31.12.2007.)

COX-2

Imunoreaktivnost na COX-2:

- nalaz smeđe obojenosti citoplazme tumorskih stanica

- analiziran je intenzitet bojenja i postotak obojenih stanica.

MMP-2

Pozitivna ekspresija MMP-2 proteina smatrana je:

- citoplazmatska i/ili membranska obojenost više od 10% tumorskih stanica

MVD i LVD

• Novostvorene krvne ilimfne žile obilježene su antitijelima na CD34 i LYVE-1, a područja najgušće neovaskularizacije na invazivnim rubovima tumora tzv. vruće točke određena su pregledom histoloških preparata pod malim povećanjem (x40).

• Potom su brojene na površini od 0,25mm2 pod povećanjem od 200x.

• MVD i LVD izraženi kao broj novostvorenih krvnih i limfnih žila na površini od 0,25mm2

Imunohistokemijski profil

1. MMP-2 – / COX-2 –

2. MMP-2 + / COX-2 –

3. MMP-2 – / COX-2 +

4. MMP-2 + / COX-2 +

Statistička obrada

- χ2 test povezanosti varijabli- multipla logistička regresija- analiza preživljavanja (Kaplan-Meierova krivulja, Log rank test)- univarijatna Cox-ova regresija ( Cox stepwise

Forward: Wald)- multivarijatna Cox-ova regresija (Cox stepwise

Forward: Wald)- razina značajnosti p < 0,05- statistička obrada s programom SPSS for Windows

REZULTATI

Multipla logistička regresija

Cox-2

61vs 87 mj

MMP-2

45 vs 100 mj

MVD

<25 - 92 mj25-38 – 7739-52 – 64≥53 – 40

LVD

<6 - 94 mj6-10 - 8611-17 - 57≥18 - 45

ZAKLJUČCI

1. Primjenom metode imunohistokemije u karcinomima kolona kliničkog stadija Dukes B pronađena je pozitivna ekspresija COX-2 proteina u 66 % karcinoma, a MMP-2 proteina u 55 % karcinoma

2. Medijan gustoće novostvorenih krvnih žila (MVD) iznosio je 39,5, medijan gustoće novostvorenih limfnih žila iznosio je 11,5 u 0,25 mm2

3. Pozitivna ekspresija COX-2 i MMP-2 povezana je s porastom MVD-a i LVD-a

4. Pozitivna ekspresija MMP-2, visoki stupanj (high grade) diferencijacije tumora, porast MVD-a povezani su s nalazom vaskularne invazije (VI) tumora

5. Analizom preživljenja (Log rank test) kraći interval bez bolesti (DFS) imali su: muški spol, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a

6. Analizom preživljenja (Log rank test) kraće vrijeme preživljenja (OS) imali su: dob >60 g, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a

7. Cox regresijskom univarijatnom analizom s kraćim intervalom bez bolesti (DFS) povezani su: dob>60 g, ekspresija MMP-2, profil MMP-2+/COX-2+, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a

8. Cox regresijskom univarijatnom analizom s kraćim preživljenjem (OS) povezani su: muški spol, dob>60 g, ekspresija MMP-2, ekspresija COX-2, visoki stupanj diferencijacije, vaskularna invazija tumora i porast MVD-a i LVD-a

9. Cox regresijskom multivarijatnom analizom kao NEZAVISNI PREDIKTORI za DFS pokazali su se: ekspresija MMP-2 i vaskularna invazija, a kao NEZAVISNI PREDIKTORI za OS: ekspresija MMP-2, vaskularna invazija, visoki stupanj diferencijacije i porast MVD-a

10. Navedeni pokazatelji mogu pomoći u izdvajanju biološki agresivnijih karcinoma kolona u kliničkom stadiju Dukes B koji bi imali koristi od adjuvatne terapije

HVALA NA PAŽNJI