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Méthodes d'évaluation de l'efficacité des antibiotiques
en biofilm
Françoise Van Bambeke, PharmD, PhD
Pharmacologie cellulaire et moléculaireLouvain Drug Research Institute
Université catholique de Louvain, Brussels, Belgium
<www.facm.ucl.ac.be>
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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2
Antibiotiques et biofilms en pratique clinique
échecs thérapeutiques pas rares …27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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3
Modèles statiques in vitro
pegs plaques multi-puits
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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4
Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms
Macià et al, Clin Microbiol Infect. 2014 Apr 26
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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5
Modèles statiques: “Calgary Biofilm Device”
Détermination de la “Minimal Biofilm Eradication Concentration”
(MBEC)
Ceri et al, J. Clin. Microbiol. 1999; 37:1771-6; Herrmann et al, J Infect Dis. 2010;202:1585-9227/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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6
Activité antibiotique: cultures planctoniques vs. biofilms
Takei et al, J Infect Chemother (2013) 19:504–9
MIC
MBCMBEC
MIC MBC
MBEC
ampicilline et lévofloxacine vs. H. influenzae (< liquide de l’oreille moyenne)
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7
Modèles statiques: plaques à 96 puits en polystyrène
colorantsappropriés pour évaluer
la biomasseou la charge bactérienne
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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8
Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm
crystal violet
biomasse
Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26
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Mesure de la biomasse / viabilité dans le biofilm
crystal violet
resazurin
resorufine
activité métabolique
fluoresceine diacetate
fluoresceine
Gram(+) Gram(-)
Christensen et al, Infect. Immun. 1982; 37:318–26
Tote et al, 2008; Lett. Appl. Microbiol. 46:249–254 Wanandy et al, J Microbiol Methods 2005;60:21-30
biomasse
9
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10
Distinction entre effets statique et cidal
Comptage des UFC
Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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11
Distinction entre effets statique et cidal
S. pneumoniae
Libération de NADH
NADH oxidase(NOX)
NADH oxidase
NADH NAD+
Hardrson et al, Nature Protocols 2010; 5:1236-54 Yu et al, Microbiology. 2001;147(Pt 2):431-8
Comptage des UFC
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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12
Comptage des UFC vs. fluorescence de RF
relation between fluorescenceand bacterial inoculum for S. aureus
2 3 4
6
7
8
9
10
11
-2.5
-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
30 min. incubation
log resorufin fluorescence
log
CFU
/ml log O
D620 nm
Van den Driessche et al, J.Micr. Meth. 2014; 98:31–4Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726-37;
an exemple pour S. aureus
UFC & signal RF proportionnels Sensibilité ~ temps d’incubation
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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13
NADH oxidase vs. fluorescence de RF
Vandevelde et al, ECCMID 2014; eP288
bactéries mortes bactéries vivantes restantes
un exemple pour S. pneumoniae
-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00
20
40
60
80
100
120
CLRMXF
log10 concentration (X MIC)
Res
oruf
in fl
uore
scen
ce(%
con
trol
val
ue)
-7.5 -5.0 -2.5 0.0 2.5 5.00
20
40
60
80
100
120
CLRMXF
log10 concentration (X MIC)
NA
DH
abs
orba
nce
(% c
ontr
ol v
alue
)
clarithromycin (bacteristatic) vs moxifloxacin (bactericidal)
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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16/09/2014 antibiotic activity in biofilms 14
Etudes PK/PD : quelques exemples
PK/PDeffet vs temps
Temps
Effe
t
0
1
0
Pharmacodynamiqueconc. vs effet
10-3Conc. (log)
Effe
t
Pharmacocinétiqueconc. vs temps
Con
c.
Temps0 250.0
0.4
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15
Modèle pharmacodynamique en bref
an exemple avec un biofilm jeune de S. aureus
vancomycin
CT0
20
40
60
80
100
120
RFCV
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0log10 concentration (X MIC)
% c
ontr
ol v
alue
Emax« efficacité maximale »
Bauer, Siala et al, Antimicrob Ag Chemother. 2013;57:2726-37
C25-50-75« puissance
relative »
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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16
Biofilms de S. pneumoniae: influence de la maturité
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
120
day 2day 11
Log10 concentration (X MIC)
% c
ontr
ol v
alue
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
120
Log10 concentration (X MIC)
metabolic activity biomass
Vandevelde et al, Antimicrob Ag Chemother. 2014; 58:1348-58
Emax avec la maturité
moxifloxacine
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17
Biofilms de S. pneumoniae: influence de la maturité
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
120
day 2day 11
Log10 concentration (X MIC)
% c
ontr
ol v
alue
-5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
120
Log10 concentration (X MIC)
metabolic activity biomass
Vandevelde et al, Antimicrob Ag Chemother. 2014; 58:1348-58
Puissance relative avec maturité
moxifloxacine
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18
Biofilms de P. aeruginosa: influence du milieu
Log10 concentration (X MIC)
Basseres et al, ICAAC 2014
Puissance relative réduite dans ASM
beef infusion solids, casein hydrolysate,
starch
mucin, DNA, DTPA,
casaminoacids, NaCl, KCl, tris base, egg yolk
emulsion.
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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16/09/2014 antibiotic activity in biofilms 19
Biofilms de P. aeruginosa: influence du milieu
Basseres et al, ICAAC 2014
Interaction avec les constituants du milieu
antibiotiqueCMI (mg/L)
contrôle + mucine + ADN + jaune d’oeuf
CIP 0.06 0.06 0.5 4
CST 1 16 1 1
AMK 1 1 64 64
CAZ 1 64 1 4
MEM 0.5 0.5 0.5 > 64
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20
Paramètres PK/PD dans les biofilms
cathéter, os, peau, valve cardiaque,…
nutriments &
oxygène
pharmacocinétique
diffusibilité ~ matrice biodisponibilité dans le biofilm accès aux bactéries efflux hors des bactéries
pharmacodynamique
réponse bactérienne(activité métabolique) expression d’activité antibiotique(environnement local [O2, pH, ..])
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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21
Modèles dynamiques in vitro
remplacement unidirectionnel
de fluide
apportpermanent
de fluide
conditionsconstantes
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22
Modèles dynamiques: bioréacteurs
Réacteur du CDC:• mélange constant expériences de cinétique avec changement de la composition du milieu
• forces de cisaillement élevées
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23
Activité antibiotique en mimant l’exposition chez l’homme
Parra-Ruiz et al, J Antimicrob Chemother 2012; 67:2682–5
Cultures planctoniques Biofilm (CDC reactor)
S. aureus
LZDDAP
LZD+
DAP
LZDDAP
LZD+
DAP
Dosages simulés: DAP (10 mg/kg 1x/jour) / LZD (600 mg 2X/jour)
Réacteur du CDC
Combination plus utile sur les biofilms que les cultures planctoniques
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24
Modèles dynamiques: bioréacteurs
Goeres et al, Nature Protocols 2009; 4: 783-8
Réacteur à perfusion (drip flow reactor) :• changement progressif et unidirectionnel du milieu• faibles forces de cisaillement
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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25
Sélection de populations résistantes
Macià et al, Antimicrob. Ag. Chemother. 2013; 55:5230–7
Réacteur à perfusion P. aeruginosa
Amplification des mutants pendant le traitement antibiotiqueet accumulation de mécanismes de résistance
PAO1 hypermutator
Concentrations fixes en ciprofloxacine (MPC)
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26
Modèles dynamiques: bioréacteurs
Lüdecke et al, PLoS One 2014; 9(1):e84837
Fermenteur à profondeur (non)-constante:• conditions constantes• faibles forces de cisaillement• ~ biofilms sur implants
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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27
Selection of resistant populations
Hill et al, J. Antimicrob. Chemother. 2010; 65:1195-206
Fermenteur à profondeur (non)-constante
Activité faible à des concentrations cliniques
Concentrations fixes en function du temps; biofilm multi-espèces (souches isolées de blessures humaine)
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28
Conclusions
nombreuses méthodes pour évaluer la biomasse / la survie bactérienne
pas de consensus reel sur les meilleures options
nombreux modèles de biofilms in vitro
comparison entre études difficile
modèle le plus pertinent ?
Smith et al, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013 ; 32:1327–3227/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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29
Conclusions
nombreuses méthodes pour évaluer la biomasse / la survie bactérienne
pas de consensus réel sur les meilleures options
nombreux modèles de biofilms in vitro
comparison entre études difficile
modèle le plus pertinent ?
activité antibiotique sur biofilms <<< bactéries planctoniques
peu ou pas d’effet sur la matrice
determination des paramètres PK: diffusion / biodisponibilité
determination des paramètres PD: expression d’activité / réponse bactérienne
27/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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16/09/2014 antibiotic activity in biofilms 30
Conclusions
nombreuses méthodes pour évaluer la biomasse / la survie bactérienne
pas de consensus réel sur les meilleures options
nombreux modèles de biofilms in vitro
comparison entre études difficile
modèle le plus pertinent ?
activité antibiotique sur biofilms <<< bactéries planctoniques
peu ou pas d’effet sur la matrice
determination des paramètres PK: diffusion / biodisponibilité
determination des paramètres PD: expression d’activité / réponse bactérienne
combination avec des agents modifiant la matrice / l’état métabolique des bactéries ?
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31
Nouvelles stratégies …
Kostakioti et al. Cold Spring Harb Perspect Med 2013;3:a01030627/11/2014 Antibiotiques et biofilms
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27/11/2014 Antibiotiques et biofilms 32
Combination avec des polycations
Siala et al, Antimicrob. Ag. Chemother. 2014; 58:6385-6398
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27/11/2014 Antibiotiques et biofilms 33
Remerciements
Julia Bauer Yvan Diaz IglesiasWafi Siala Nathalie Vandevelde Eugénie Basseres