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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293

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Tesis Doctoral

Métodos ópticos no destructivosMétodos ópticos no destructivospara monitoreo de salud vegetalpara monitoreo de salud vegetal

Cordon, Gabriela Beatriz

2009

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Cordon, Gabriela Beatriz. (2009). Métodos ópticos no destructivos para monitoreo de saludvegetal. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

Cita tipo Chicago:

Cordon, Gabriela Beatriz. "Métodos ópticos no destructivos para monitoreo de salud vegetal".Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2009.

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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física

MÉTODOS ÓPTICOS NO DESTRUCTIVOS PARA

MONITOREO DE SALUD VEGETAL

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el

área de Química Inorgánica, Analítica y Química Física

Gabriela Beatriz Cordon

Directora de tesis: Dra. María Gabriela Lagorio

Buenos Aires, diciembre de 2009

II

Para Luca que ilumina mi vida

III

AGRADECIMIENTOS

Me gustaría expresar mi gratitud a todas las personas que me ayudaron para la

concreción de esta tesis.

En primer lugar quiero agradecerle profundamente a mi directora de tesis, la Dra. María

Gabriela Lagorio por el apoyo que recibí de ella durante todos los años que

compartimos. Siempre sentí que apuntalarme en mi trabajo de tesis era su prioridad

número uno a pesar de las numerosas tareas que tuviera en docencia e investigación. El

respaldo incondicional que me brindó en el trabajo de investigación así como el cariño

que recibí cotidianamente hicieron posible la finalización de esta tesis y crearon un lazo

de amistad que perdurará eternamente. Gabriela: gracias por todo lo que me enseñaste!

También me gustaría agradecerle al Grupo de Fotoquímica. Todos y cada uno de los

miembros del grupo están dispuestos a ayudar siempre. Gracias por ser las personas más

solidarias del mundo, me hicieron sentir como en casa.

Analía, compartimos juntas el momento más importante en la vida de una mujer: los

embarazos y los nacimientos de Mateo y Luca. Gracias por tu amistad!

Bea, compartimos mucho más que horas de estudio de Fotoquímica, gracias a esa

materia gané dos amigas geniales como vos y Andrea.

Betty, sos el ejemplo vivo de la solidaridad del grupo. Siempre dispuesta a dejar lo que

estás haciendo para ayudar, gracias!

Enrique, los almuerzos no son almuerzos sin las charlas de cada mediodía. Gracias por

el voto de confianza!

Euge, admiro la pasión con la que encarás la vida. Tu compromiso con la gente, con la

ciencia, con la facultad son innegables, gracias por dejarme conocerte!

Hernán, quizás por estar en el mismo cuarto del fluorómetro estás un poco obligado a

responder preguntas al respecto y a socorrer a los usuarios pero nadie te obliga a que lo

hagas con una sonrisa. Gracias por tu buena onda!

Lelia, tu paz y tu serenidad son un bálsamo entre tanta aceleración cotidiana. Por favor

no cambies esa filosofía de vida.

Martín, otro ejemplo de solidaridad y compañerismo en el grupo. Gracias por ser así.

IV

Noelia, desgraciadamente no tuvimos mucho tiempo para conocernos pero siempre fue

muy lindo conversar con vos. Gracias!

Pablo, recurrí a vos ante cada problema que tuve con la tecnología y pese a tu

descontento simulado siempre obtuve la mejor de las respuestas, gracias por ser un tipo

buena onda camuflado!

Pedro, cada comentario que recibí de vos en los seminarios de grupo me llevó a un

nuevo tema interesante para explorar en mi investigación. Mil gracias!!!

Sergio, siempre es muy lindo charlar con vos. Sos una persona muy amable y sobre todo

divertido, gracias por tantas conversaciones tan agradables!

Vir, que te puedo decir… gracias por permitirme ser tu amiga, por abrirme tu

corazoncito.

Gracias a INQUIMAE y al Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química

Física por brindarme un lugar de trabajo tan agradable.

Agradezco especialmente la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica y

al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas por las becas doctorales

que me permitieron realizar esta tesis.

A mi familia por estar siempre dispuestos a ayudarme:

A Alejandro que es el amor de mi vida y siempre está a mi lado para apuntalarme ante

cada nuevo desafío. Gracias por compartir tu vida conmigo.

A Luca que me ilumina la vida con su sonrisa. Te amo hijo hermoso!

A mi mamá que es incondicional y es la mejor mamá del mundo (no es una frase hecha

es la pura verdad). Tu amor me ayuda a vivir.

A mi papá que me inculcó que sin estudio no se llega lejos. Seguro estás festejando este

logro conmigo desde el cielo.

A mi hermano, mi hada madrina, mi padrino y mi abuela porque siempre confiaron en

mi, me apoyaron y sin su cariño no hubiera llegado tan lejos.

A Frenchu por ser mi Frenchu y por existir, sin tu amistad nada sería lo mismo. Te

adoro.

Gracias a todos por su confianza y por su amor, sin ustedes no podría haber logrado

esto.

V

PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A CONGRESOS ORIGINADOS A

PARTIR DE ESTE TRABAJO DE TESIS

A- Publicaciones internacionales con referato

1) Yaryura P., Cordon G., Leon M., Kerber N., Pucheu N., Rubio G., García A.,

Lagorio M. G. 2009. Effect of phosphorus deficiency on reflectance and chlorophyll

fluorescence of cotyledons of oilseed rape (Brassica napus L.). Journal of Agronomy

and Crop Science. 195: 186-196

2) Cordon Gabriela, Lagorio María Gabriela. 2007. Optical properties of the adaxial and

abaxial faces of leaves. Chlorophyll fluorescence, absorption and scattering coeffients.

Photochemical and Photobiological Sciences. 6: 873-882

3) Cordon Gabriela, Lagorio María Gabriela. 2007. Absorption and Scattering

Coefficients. A Biophysical-chemistry experiment using Reflectance Spectroscopy.

Journal of Chemical Education. 85: 1167-1170

4) Cordon Gabriela, Lagorio María Gabriela. 2006. Re-absorption of chlorophyll

fluorescence in leaves revisited. A comparison of correction models. Photochemical and

Photobiological Sciences. 5: 735-740

Este artículo fue elegido tapa de la edición de agosto de 2006 de PPS

B- Trabajo en redacción

Pablo M. Yaryura, Gabriela B. Cordón, Mariana León, Norma L. Kerber, Norma L.

Pucheu, María Gabriela Lagorio, Gerardo Rubio, Augusto F. García.

Fluorescent compounds excreted by roots and seeds in crop plants

C- Presentaciones a congresos

1) Título: Phosphorus deficiency and fluorescence compounds excreted by roots and

seeds exudates in crops plants

VI

Autores: Pablo Yaryura, Gabriela Cordon, Mariana León, Norma Kerber, Norma

Pucheu, M. Gabriela Lagorio, Gerardo Rubio, Augusto García

XLV Reunión Anual SAIB

Lugar y fecha: Tucumán. 10 al 13 de noviembre de 2009

Organizada por: Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica y Biología Molecular

(SAIB)

Tipo de trabajo: póster

2) Título: Efecto de la deficiencia de fósforo en las propiedades ópticas de cultivos de

Colza

Autores: Gabriela Cordon y M. Gabriela Lagorio

Congreso de Ciencias Ambientales. COPIME 2009

Lugar y fecha: Buenos Aires. 7 al 9 de octubre de 2009

Organizada por: Consejo profesional de ingeniería mecánica y electricista

Tipo de trabajo: ponencia

3) Título: Aplicación de modelos físico-matemáticos para interpretar la reflectancia y

fluorescencia de hojas de Schefflera arborícola variegata

Autores: Gabriela B. Cordon y M. Gabriela Lagorio

XVI Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica

Lugar y fecha: Salta. 18 al 21 de mayo de 2009

Organizada por: Asociación Argentina de Investigación Fisicoquímica


4) Título: Photosystems ratio in Schefflera arboricola variegata leaves. Fluorescence

spectra and optical properties

Autores: Gabriela Cordon and M. Gabriela Lagorio

IX Encuentro Latinoamericano de Fotoquímica y Fotobiología

Lugar y fecha: San Pablo. Brasil. 2 al 7 de noviembre 2008

Organizada por: Sociedad Latinoamericana de Fotoquímica y Fotobiología


5) Título: Fluorescent seed and root exudates from soybean and its antifungal effect

against Macrophomina phaseolina

VII

Autores: Pablo M. Yaryura, Mariana León, Gabriela B. Cordon, Gabriela M. Lagorio,

Norma L. Kerber, Norma L. Pucheu, Augusto F. García

V Congreso Argentino de Microbiología General

Lugar y fecha: Rosario. 25 y 26 de septiembre 2008

Organizada por: Sociedad Argentina de Microbiología General


6) Título: Fluorescencia de hojas expuestas a la acción de herbicidas

Autores: Gabriela Cordon y M. Gabriela Lagorio

V Congreso Iberoamericano de Física y Química Ambiental

Lugar y fecha: Mar del Plata. 14 al 18 de abril de 2008

Organizada por: Sociedad Iberoamericana de Física y Química Ambiental


7) Título: Effect of phosphorous deficiency on chlorophyll fluorescence of cotyledon

and root exudates of rape

Autores: Pablo Pablo Yaryura, Gabriela Cordon, Mariana León, Gerardo Rubio, Norma

Kerber, Norma Pucheu, Augusto García, M. Gabriela Lagorio

XLIII Reunión Anual SAIB

Lugar y fecha: Mar del Plata. 17 al 20 de noviembre de 2007


(SAIB).


8) Título: Comparación de las propiedades ópticas para las caras adaxial y abaxial de

hojas. Fluorescencia, coeficiente de absorción y coeficiente de dispersión de luz


XV Congreso Argentino de Fisicoquímica y Química Inorgánica

Lugar y fecha: Tandil. 17 al 20 de abril de 2007


Tipo de trabajo: Presentación oral del trabajo

9) Título: Determinación de coeficientes de absorción y de dispersión en hojas. Teoría

de Kubelka-Munk y Modelo de Pila de Platos

VIII






10) Título: Comparación de modelos para corregir reabsorción de la fluorescencia de

clorofila en hojas






11) Título: Fluorescence in root exudates of soybean seedling is influenced by

phosphate starvation

Autores: Pablo Yaryura, Mariana León, Gabriela Cordon, M. Gabriela Lagorio, Norma

Kerber, Norma Pucheu, Augusto García, Gerardo Rubio.

XLII Reunión Anual SAIB

Lugar y fecha: Rosario. 12 al 15 de noviembre de 2006


(SAIB)


IX

LISTADO DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS MÁS UTILIZADOS

d: espesor considerado del medio, en este caso espesor de las hojas

Fred: máximo de fluorescencia del espectro de emisión de hojas alrededor de 685 nm

Ffar-red: máximo de fluorescencia del espectro de emisión de hojas alrededor de 735 nm

Fred/Ffar-red: relación de máximos de intensidad de fluorescencia, se utiliza Fred/Ffar-red

como una generalidad porque los máximos de fluorescencia no aparecen siempre en

posiciones fijas. Se utiliza red y far-red en lugar de rojo y rojo lejano debido a que es

ampliamente difundido en literatura de esta manera.

FSI: fotosistema I

FSII: fotosistema II

FSII/FSI: relación de fotosistemas, cantidad de fotosistema II respecto del fotosistema I

F(R): función de remisión

k: coeficiente de absorción de las hojas

r: reflectancia correspondiente a una sola hoja

R: fracción de luz reflejada por las hojas, reflectancia

R�: fracción de luz reflejada por un colchón de hojas, reflectancia infinita de las hojas

(transmitancia de las hojas nula)

s: coeficiente de dispersión de las hojas

X

t: transmitancia correspondiente a una sola hoja

T: fracción de luz transmitida por las hojas, transmitancia

MA: modelo de corrección por procesos de reabsorción de luz desarrollado por Agati y

colaboradores en 1993

MG: modelo de corrección por procesos de reabsorción de luz desarrollado por Gitelson

y colaboradores en 1998

ML: modelo de corrección por procesos de reabsorción de luz desarrollado por Lagorio

y colaboradores en 1998

M.V.: metil viológeno

rcorr: anisotropía de fluorescencia corregida por el factor de sensibilidad del sistema de

detección (G)

RGB: coordenadas de color rojo, verde y azul, por sus siglas en inglés Red, Green y

Blue

�exc: longitud de onda de excitación

�emi: longitud de onda de emisión

�: función de corrección por procesos de reabsorción y remisión de luz del modelo de

Lagorio y colaboradores de 1998

+P: sistema control para plantas de colza (Brassica napus L.), con fosfato de potasio en

la solución mineral donde crecieron las plantas

-P: sistema carente de fósforo para plantas de colza (Brassica napus L.), sin fosfato de

potasio en la solución mineral donde crecieron las plantas

XI

METODOS ÓPTICOS NO DESTRUCTIVOS PARA MONITOREO DE SALUD

VEGETAL

El desarrollo de métodos ópticos analíticos para monitoreo de salud vegetal ha

crecido notablemente debido a que estas técnicas permiten ahorrar mucho tiempo y

trabajo en el laboratorio. Actualmente, es relevante la posible aplicación de estas

metodologías en el monitoreo a distancia de la vegetación.

Esta tesis propone un acercamiento al monitoreo de la salud vegetal desde la

óptica química-física. El objetivo principal del presente trabajo es la interpretación de la

interacción de la luz con el material vegetal en forma rigurosa desde el punto de vista

físico y matemático para desarrollar procedimientos de diagnóstico.

En particular, se exploraron en profundidad los métodos ópticos basados en

determinaciones de reflectancia y en la espectroscopía de fluorescencia. Se encontraron

correlaciones entre los espectros de reflectancia con el contenido de pigmentos

presentes en las hojas y con el contenido de agua de las mismas. Además, se demostró

la aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y del modelo de Pila de Placas en hojas.

Se efectuó un estudio exhaustivo de la emisión de fluorescencia de clorofila-a

presente en el tejido foliar, prestando especial atención al desarrollo y aplicación de

modelos adecuados para efectuar correcciones por procesos de reabsorción de luz.

Las características morfológicas y fisiológicas de las hojas se ven reflejadas en

sus propiedades ópticas; por lo tanto se evaluaron los parámetros fotofísicos de hojas

expuestas a diversas condiciones naturales a fin de ahondar los conocimientos existentes

al respecto. Adicionalmente, se estudió la variación de los parámetros fotofísicos de las

hojas frente a situaciones de tensión tales como: senescencia, carencia de nutrientes y

presencia de herbicidas.

Finalmente, se desarrolló un método para obtener la distribución espacial de los

pigmentos foliares dentro de las hojas. Las imágenes utilizadas se obtuvieron a partir de

un escáner comercial lo que facilita la implementación de esta metodología con un bajo

costo de operación.

Palabras claves: Fluorescencia de hojas, reflectancia, imágenes de color de hojas,

monitoreo óptico

XII

NON-DESTRUCTIVE OPTICAL METHODS FOR MONITORING PLANT

HEALTH

The development of optical-methods for monitoring plant health has grown

markedly since these techniques can save time and work in the laboratory. At present,

these methodologies are relevant in connection with the remote sensing of vegetation.

This thesis proposes an approach to the monitoring of plant health from a

physicochemical perspective. The main objective of the present work is the

interpretation of the interaction of the light with plant material from a physical and

mathematical point of view to build up diagnostic procedures.

In particular, optical methods based on reflectance and fluorescence

spectroscopy were explored in depth. Correlations between reflectance spectra and both

the pigment content and the water content of leaves were found. In addition, the

applicability of the Kubelka-Munk theory and of the Pile of Plate model on plant

material was tested.

An exhaustive study of chlorophyll-a fluorescence from plant tissues was

performed by focusing on the development and application of appropriated corrections

models to account for light re-absorption processes.

The morphological and physiological features of leaves are revealed in their

optical properties; therefore we evaluated the photophysical parameters of leaves

exposed to different natural conditions in order to deepen existing knowledge about it.

Additionally, we studied the variation in the photophysical parameters of the leaves

under stress situations such as senescence, nutrient deficiency and the presence of

herbicides.

Finally, we developed a method for obtaining the spatial distribution of pigments

concentration from color images of leaves. The images used were obtained from a

commercial scanner which facilitates the implementation of this methodology with a

low cost of operation.

Keywords: fluorescence of leaves, reflectance, leaf color images, optical monitoring

XIII

ÍNDICE GENERAL

Capítulo 1. INTRODUCCIÓN GENERAL DE LA TESIS

1.1. Importancia del tema de investigación…………………………………………. 2

1.2. Métodos ópticos utilizados en la tesis…………………………….……..……… 2

1.2.1. Reflectancia y fluorescencia………………………………………………….… 2

1.2.2. Imagen de hojas………………………………………………………………… 3

1.3. Objetivos de la tesis……………………………………………………….…….. 4

1.4. Bibliografía……………………………………………………………...….….… 4

Capítulo 2. REFLECTANCIA Y TRANSMITANCIA DE HOJAS

2.1. Introducción…………………………………………………………….……..… 8

2.1.1. Un poco de historia…………………………………………….………….…… 8

2.1.2. Conceptos básicos sobre la luz reflejada y transmitida por las hojas………...… 8

2.1.3. Espectros de reflectancia y transmitancia de hojas………………………….… 10

2.1.4. Correlación de la reflectancia con los contenidos de pigmentos y de agua

de las hojas……………………………………………………………………………. 12

2.1.5. Modelos que explican la interacción de la luz con las hojas………….……… 15

2.1.6. Teoría de Kubelka-Munk……………………………………………………… 16

2.1.7. Modelo de Pila de Placas……………………………………………………… 17

2.2. Base teórica de los modelos que describen la interacción de la luz con

las hojas…………………………………………………………………………… 17

2.2.1. Teoría de Kubelka-Munk…………………………………………………… 17

2.2.2. Modelo de Pila de Placas…………………………………………….……… 20

2.3. Materiales y métodos………………………………………………….……… 22

2.4. Resultados y discusión………………………………………………………. 24

2.4.1. Aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y modelo de Pila de Placas en

hojas……………….………………………………………………………….……. 24

2.4.2. Correlaciones entre el contenido de pigmentos y el contenido de agua de las hojas

con la función de remisión a longitudes de onda específicas………………...……... 30

2.5. Conclusiones………………………………………………………….…..…… 43

2.6. Bibliografía……………………………………………………….…….……… 44

XIV

Capítulo 3. FLUORESCENCIA DE HOJAS

3.1. Introducción………………………………………………………….………. 51

3.1.1. Un poco de historia…………………………………………………….….…. 51

3.1.2. Conceptos básicos de fotosíntesis……………………………………….…… 52

3.1.3. La absorción de luz y el transporte de electrones…………………….……… 53

3.1.4. Fluorescencia de clorofila-a………………………………………….…….… 55

3.1.5. Correcciones por reabsorción………………………………………….….… 56

3.1.6. Modelos de corrección por reabsorción de luz………………………….…… 57

3.1.7. Espectros de fluorescencia de clorofila-a en ausencia de reabsorción………. 58

3.1.8. Anisotropía de fluorescencia.……………….…………………..…….……… 60

3.2. Base teórica de los modelos para corrección por procesos de reabsorción de

luz………………………………………………………..…………………….…… 62

3.3. Materiales y métodos………………………………………………….…....… 68

3.3.1. Experimentos preliminares………………………………………….……..… 68

3.3.2. Modelos de corrección por reabsorción de luz, validación de los modelos de

corrección…………………...……………………………………………..……..… 68

3.3.3. Espectros de fluorescencia de clorofila-a en ausencia de reabsorción……..… 70

3.3.4. Anisotropía de fluorescencia……………………………………………....… 71

3.4. Resultados y discusión………………………………………………..……… 71

3.4.1. Experimentos preliminares…………………………………………..……… 71

3.4.1.1. Variación de la relación Fred/Ffar-red con la intensidad de la luz de

excitación………………….………………………………………………..……….. 72

3.4.1.2. Cambios en los espectros de hojas excitados a diferentes longitudes de

onda…........................................................................................................................ 74


corrección………………….…………………………………………………...…… 75

3.4.2.1. Análisis de la influencia de la emisión de fluorescencia en los datos de reflectancia

y transmitancia usados para corregir la relación de fluorescencia Fred/Ffar-red…...…. 85

3.4.3. Espectros de fluorescencia de clorofila-a en ausencia de reabsorción………. 86

3.4.3.1. Suspensión de hoja……………………………………………………….… 86

3.4.3.2. Suspensión de hoja depositada………………………………………..…… 87

3.4.4. Anisotropía de fluorescencia……………………………………………....… 89

3.5. Conclusiones…………………………………………………………………… 91

3.6. Bibliografía…………………………………………………………………..… 92

XV

Capítulo 4. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE HOJAS,

IMPLICANCIAS FISIOLÓGICAS Y MORFOLÓGICAS

Sección A

4.A. Propiedades ópticas de las caras adaxial y abaxial de hojas. Fluorescencia de

clorofila, coeficientes de absorción y de dispersión de luz…………….………… 98

4.A.1. Introducción………………………………………………………...……..… 98

4.A.1.1. Comparación de las propiedades ópticas de las caras adaxial y abaxial de

hojas…………………….……………………………………………………...….….. 99

4.A.2. Materiales y métodos………………………………………………..….…… 100

4.A.3. Resultados y discusión……………………………………………..…..….… 101

4.A.4. Conclusiones………………………………………………………...…….… 125

4.A.5. Bibliografía……………………………………………………………....….. 126

Sección B

4.B. Estudio de las propiedades ópticas de hojas variegadas……………..…..… 130

4.B.1. Introducción………………………………………………………..……….. 130

4.B.2. Materiales y métodos…………………………………………………..……. 131

4.B.3. Resultados y discusión………………………………………….……..….… 133

4.B.4. Conclusiones………………………………………………………..…….… 143

4.B.5. Bibliografía…………………………………………………………..……… 143

Capítulo 5. VARIACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE HOJAS FRENTE

A SITUACIONES DE TENSIÓN AMBIENTAL

Sección A

5.A. Hojas expuestas a la acción de herbicidas………………………………… 147

5.A.1. Introducción………………………………………………………….…… 147

5.A.2. Materiales y métodos………………………………..…………………… 150

5.A.3. Resultados y discusión……………………………………………….…… 151

5.A.4. Conclusiones……………………………………………………………… 157

5.A.5. Bibliografía…………………………………………………………..…… 157

XVI

Sección B

5.B. 5.B. Efecto de la deficiencia de fósforo en la reflectancia y fluorescencia de

clorofila de cotiledones de colza (Brassica napus L.)…………………...……… 160

5.B.1. Introducción………………………………………………………….…… 160

5.B.2. Materiales y métodos…………………………………………………….. 162

5.B.2.1. Condiciones de crecimiento de las plantas………………………….…… 162

5.B.2.2. Determinación del contenido de pigmentos…………………………..… 162

5.B.2.3. Mediciones de reflectancia……………………………………………… 163

5.B.2.4. Mediciones de fluorescencia…………………………………………..…. 163

5.B.3. Resultados y discusión………………………………………………….… 163

5.B.3.1. Determinación del contenido de pigmentos……………………………. 163

5.B.3.2. Mediciones de reflectancia……………………………………………… 165

5.B.2.3. Mediciones de fluorescencia………………………………………..…… 169

5.B.4. Conclusiones……………………………………………………..…..…… 178

5.B.5. Bibliografía…………………………………………………………..…… 179

Capítulo 6. IMÁGENES DE HOJAS

6.1. Introducción……………………………………………………...…………. 186

6.1.1. Conceptos básicos sobre color y visión de color…………………………… 187

6.1.2. El programa de procesamiento de imágenes utilizado: ERDAS IMAGINE 8.4 189

6.2. Materiales y métodos………………………………………………..……… 189

6.3. Resultados y discusión……………………………………………………… 192

6.4. Conclusiones………………………………………………………………… 213

6.5. Bibliografía………………………………………………………………..… 214

Capítulo 7. CONCLUSIONES GENERALES

Conclusiones generales…………………………………………………………. 217

Bibliografía…………………………………………….………………………… 219

Apéndice. DEL ESPECTRO DE REFLECTANCIA A LOS VALORES DE RGB

A.1. Del espectro de reflectancia a los valores de XYZ……………………...… 222

A.2. De los valores de XYZ a los valores de RGB………………….…………… 224

A.3. Bibliografía……………………………………………………………..……. 224

Capítulo 1.

INTRODUCCIÓN GENERAL

2

Capítulo 1. INTRODUCCIÓN GENERAL

1.1. Importancia del tema de investigación

La investigación de técnicas no invasivas, que permitan el monitoreo vegetal

tiene gran relevancia en la actualidad. En los últimos años se ha manifestado una

demanda creciente de prácticas que permitan el control de la salud vegetal usando

métodos ópticos rápidos y no destructivos. La ventaja de estas metodologías radica, por

un lado, en la simplicidad y rapidez del análisis al evitar el tratamiento por vía húmeda

y por otro lado, en la posible aplicación de estas técnicas en el monitoreo a distancia de

muestras intactas.

A diferencia de la mayoría de los trabajos encontrados en bibliografía sobre

fisiología vegetal y temas afines, que son de enfoque básicamente biológico, esta tesis

propone un acercamiento al monitoreo de la salud vegetal desde la óptica química-

física. Tiene como objetivo general la interpretación de la interacción de la luz con el

material biológico en forma rigurosa desde el punto de vista físico y matemático. A la

vez, se propone obtener correlaciones entre las señales ópticas procedentes de esa

interacción y la composición química del sistema.

Esta tesis sienta las bases para el desarrollo de métodos analíticos no

destructivos dirigidos a evaluar el contenido de agua, de pigmentos fotosintéticos y

posiblemente de otros componentes contenidos en la planta, que puedan reemplazar a

los métodos tradicionales por vía húmeda.

1.2. Métodos ópticos utilizados en la tesis

1.2.1. Reflectancia y fluorescencia.

Los métodos ópticos basados en determinaciones de reflectancia y la

espectroscopía de emisión de luz por los pigmentos que contienen hojas y frutos son

excelentes candidatos como métodos no destructivos para evaluar material vegetal.

Cuando la luz incide sobre una hoja, una parte de dicha luz es reflejada, otra

parte se transmite a través de ella y una tercera es absorbida por los pigmentos que

contiene.

3

La luz reflejada en el visible está relacionada con el contenido de pigmentos

fotosintéticos, mientras que en la región del IR cercano, la reflectancia está determinada

por la estructura de la hoja (700-1350 nm) y por el contenido de agua (1350-2500 nm)

(Slaton et al., 2001; Kumar et al., 2001). Se han encontrado relaciones empíricas entre

valores de reflectancia para hojas a distinta longitud de onda, que correlacionan muy

bien con la salud del vegetal (Woolley, 1971; Gausman y Allen, 1973; Knapp y Carter,

1998). Estas relaciones (índices) se utilizan en monitoreo satelital (Carter y Miller,

1994; Starks et al., 2006; Hatfield et al., 2008). Existen también trabajos donde se

relacionan empíricamente valores de reflectancia con el contenido de diversos

pigmentos contenidos en las hojas (Richardson et al., 2002; Gitelson et al., 2002 y

2003; Merzlyak et al., 2003). En este trabajo de tesis se intenta obtener nuevas

correlaciones basadas en aspectos fisicoquímicos más rigurosos capaces de describir la

interacción luz-materia.

La luz absorbida por el vegetal, por otro lado, es colectada por los pigmentos de

la hoja y transferida a la clorofila-a. El exceso de energía de la clorofila-a excitada

puede iniciar el proceso de fotosíntesis, disiparse como calor o emitirse como

fluorescencia. Como estos tres procesos ocurren en competencia, el análisis de la

fluorescencia de la clorofila puede dar información sobre los cambios en la eficiencia

fotosintética y la disipación de calor (Oxborough, 2004; Agati et al., 2005; Pedrós et al.,

2008).

1.2.2. Imagen de hojas

Los métodos descriptos en el apartado 1.2.1 se basan en la obtención de una

señal promedio proveniente del material vegetal. Cada espectro de fluorescencia, de

reflectancia o de transmitancia difusa, es un espectro promedio de la zona de la hoja

muestreada y por lo tanto, no permite obtener resolución espacial de la misma. Como

una primera aproximación para lograr la localización espacial de la señales se diseñaron

en esta tesis, experimentos de “imágenes de color de hojas”.

Por medio de la técnica de imagen de color de hojas pueden detectarse

fácilmente gradientes o irregularidades superficiales causadas por la propia

heterogeneidad del material, por enfermedades o por daños localizados. Existen

antecedentes en la utilización de la tecnología digital en agricultura, por ejemplo, para

caracterizar color en manzanas (Schrevens y Raeymaeckers, 1992) y para identificar

4

cambios de color asociados con su almacenamiento (Vervaeke, 1994). También se

utiliza para distinguir hierbas de cultivos (Perez et al., 2000).

Los cambios de color de las hojas constituyen un indicador importante del

estado de salud vegetal. Recientemente, con el desarrollo de las imágenes digitales

obtenidas ya sea con cámaras digitales o con el uso de un escáner se ha iniciado una

nueva tendencia en el análisis del color en las plantas (Murakami et al., 2005).

1.3. Objetivos de la tesis

El objetivo general de esta tesis es estudiar y desarrollar métodos analíticos

ópticos, no destructivos para obtener información sobre materiales biológicos.

Particularmente, se estudian las propiedades fotoquímicas y fotofísicas de hojas intactas

para correlacionar sus señales ópticas con la salud vegetal de plantas o con sus

características fisiológicas.

Los objetivos específicos de la tesis son:

• Realizar un estudio exhaustivo de la fluorescencia estacionaria como posible

herramienta para el monitoreo no destructivo del vegetal.

• Llevar a cabo el análisis y la interpretación de la absorción y emisión de luz por el

material vegetal intacto para monitorear su estado fisiológico.

• Desarrollar y aplicar modelos adecuados para efectuar correcciones por

reabsorción de la fluorescencia.

• Analizar la variación de los parámetros ópticos de las hojas en función de factores

de estrés aplicados a la planta: senescencia, deficiencia de nutrientes y acción de

herbicidas.

• Estudiar la correlación entre espectros de reflectancia y fluorescencia con el

contenido de pigmentos fotosintéticos y otros componentes presentes en las plantas.

• Dar los pasos iniciales en la estimación cuantitativa del contenido de pigmentos

vegetales por técnicas de visión computacional. Desarrollar nuevas metodologías de

análisis químico basadas en adquisición de imágenes a través de un escáner comercial.

5

1.4. Bibliografía

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7

Capítulo 2.

REFLECTANCIA Y TRANSMITANCIA DE HOJAS

8

Capítulo 2. REFLECTANCIA Y TRANSMITANCIA DE HOJAS

2.1. Introducción

2.1.1. Un poco de historia

Willstätter y Stoll, en 1918, fueron los primeros en explicar la interacción de la

radiación solar con las hojas. De acuerdo con su teoría, una parte de la radiación

incidente sobre las hojas es reflejada especularmente. Mientras que la otra parte, penetra

en la hoja y es sometida a múltiples dispersiones debido a discontinuidades en el índice

de refracción entre las paredes celulares y el aire, y entre las paredes celulares y el agua

existente dentro del tejido foliar. Una porción de la radiación dispersada puede escapar a

través de la epidermis inferior de las hojas, recibiendo el nombre de radiación

transmitida. El remanente de la radiación continúa sufriendo procesos de dispersión

dentro de la hoja o escapa a través de la epidermis superior (luz reflejada difusa),

formando parte de la radiación reflejada total (Willstätter y Stoll, 1918; Kumar et al.,

2001).

Las investigaciones en esta área continuaron hasta que a mediados de la década

del 60, durante el siglo pasado, surgieron trabajos fundamentales en los que se

relacionan las propiedades ópticas de plantas con sus características morfológicas. Los

trabajos de Allen, Gates, Gausman y Woolley fueron trabajos pioneros en el uso de

radiación visible y del infrarrojo cercano para obtener información de cultivos vegetales

(Gates et al., 1965; Allen y Richardson, 1968; Allen et al., 1969; Gausman et al., 1969;

Gausman y Allen, 1973; Gausman, 1974; Woolley, 1971).

2.1.2. Conceptos básicos sobre la luz reflejada y transmitida por las hojas

Una hoja típica está formada por diferentes tipos de tejidos (ver figura 2.1). La

capa superior de células se denomina epidermis y en algunas especies se halla cubierta

por una capa gruesa de cera a la cual se denomina cutícula cerosa y que previene de la

pérdida de humedad. Luego de la epidermis se encuentran las células del mesófilo en

empalizada, que son células cilíndricas perpendiculares a las células epiteliales

densamente empaquetadas. Las células del tejido en empalizada poseen gran cantidad

de cloroplastos (la unidad funcional de la fotosíntesis) y un alto contenido de clorofila.

El tejido esponjoso se encuentra a continuación de las células en empalizada. Está

9

formado por una red de células distribuidas al azar y separadas por grandes espacios de

aire entre sí. Usualmente los cloroplastos del mesófilo esponjoso poseen menor

contenido de clorofila que las células del tejido en empalizada. Por último, se ubican las

células epiteliales inferiores y los estomas, los cuales se abren y cierran para permitir el

intercambio gaseoso de las plantas con el ambiente (Starr y Taggart, 2004).

Si bien la estructura básica de las hojas se describe en el párrafo anterior, todas

las hojas no son iguales debido a sus diversos contenidos en pigmentos, agua y otros

constituyentes lo que puede verse plasmado en diferencias en sus propiedades ópticas.

Las múltiples formas de interactuar de la radiación electromagnética con las diferentes

partes de las hojas en función de la longitud de onda determinan la respuesta espectral

de la vegetación y es lo que posibilita su estudio a partir de espectros de reflectancia y

transmitancia de luz.

Figura 2.1. Representación esquemática de la anatomía de una hoja dicotiledónea

La radiación que llega a la superficie de una hoja puede ser reflejada en la capa

más superficial (células epiteliales) o puede propagarse hacia su interior. Una vez dentro

de la hoja, parte de la radiación es absorbida por los pigmentos presentes en ella, el resto

de la radiación puede ser reflejada y refractada muchas veces en todas direcciones ya

que una hoja es un sistema heterogéneo (Woolley, 1971). Esto implica que algo de la

energía dispersada emerge del material por la misma superficie por donde penetró como

radiación difusa, es decir, se suma a la radiación reflejada por la capa superficial

(reflectancia especular). La suma de estas dos contribuciones constituye la radiación

total reflejada (Wendlandt, 1966). Otra parte de la radiación dispersada emerge a través

de la superficie opuesta a la superficie de entrada. Esta es la radiación difusa transmitida

por la hoja (Woolley, 1971). De acuerdo con la ley de conservación de la energía, la

Mesófilo en empalizada

Tejido esponjoso

Corte transversal de la hoja

Células epidérmicassuperiores

Células epidérmicasinferiores

Mesófilo en empalizada

Tejido esponjoso

Corte transversal de la hoja

Células epidérmicassuperiores

Células epidérmicasinferiores

10

suma de las fracciones de luz absorbida, reflejada y transmitida debe ser igual a uno

(Lee y Graham, 1986).

La naturaleza y la cantidad de la luz reflejada, absorbida o transmitida dependen

de la longitud de onda de la radiación incidente y de su ángulo de incidencia, de la

rugosidad de la superficie de la hoja (Kumar et al., 2001) y de diferencias en los índices

de refracción de la cutícula en el caso de las hojas que poseen cutículas cerosas (Hoque

y Remus, 1996). Además, son influenciadas por la estructura interna de la hoja, por el

contenido de pigmentos y su distribución dentro de la hoja y por la cantidad y calidad

de los cloroplastos. El ángulo de exposición de las hojas controla la difusión o la

dispersión y el paso óptico de la luz incidente (Hoque y Remus, 1996). Para finalizar, el

contenido de agua de la hoja, tanto la concentración como su distribución, controla el

índice de refracción en el rango visible del espectro electromagnético y la absorbancia

en el infra-rojo cercano (Hoque y Remus, 1996).

2.1.3. Espectros de reflectancia y transmitancia de hojas. Generalidades

Por todo lo antes dicho, las características de las hojas determinan sus

propiedades ópticas y esto se ve reflejado en las diferentes regiones del espectro de

reflectancia y del espectro de transmitancia, ver figuras 2.2 y 2.3, respectivamente:

Longitud de onda (nm)

500 1000 1500 2000 2500

Ref

lect

anci

a (%

)

0

20

40

60

80

100

Ficus benjamina

Ligustrum vulgare L.

Figura 2.2. Espectros de reflectancia de hojas verdes (Ficus benjamina) y de hojas rojas

(Ligustrum vulgare)

11


500 1000 1500 2000 2500

Tra

nsm

itan

cia

(%)

0

10

20

30

40

50

Ficus benjamina

Ligustrum vulgare L.

Figura 2.3. Espectros de transmitancia de hojas verdes (Ficus benjamina) y de hojas

rojas (Ligustrum vulgare)

La reflectancia y la transmitancia en la región visible del espectro

electromagnético están caracterizadas por valores bajos debido a la fuerte absorción

producida por los pigmentos foliares (Kumar et al., 2001). La reflectancia entre 400 y

700 nm está determinada mayormente por los pigmentos fotosintéticos (Carter, 1991;

Slaton et al., 2001). La radiación visible azul y roja excita a los centros de reacción

encargados de la fotosíntesis. La mayoría de la luz verde, en cambio no es absorbida

eficientemente por la clorofila (Neill y Gould, 2003) y este efecto es el responsable del

color de la vegetación (Campbell, 1996). En la figura 2.2, en el espectro de reflectancia

de Ficus benjamina se puede observar mínimos de reflectancia (máximos de absorción)

en 490 nm (luz azul) y 660 nm (luz roja). Además se puede distinguir un pequeño

máximo de reflectancia alrededor de 550 nm (luz verde).

En la misma figura (figura 2.2), el espectro de reflectancia de Ligustrum vulgare

presenta un pequeño máximo alrededor de 660 nm (en la zona del rojo del espectro

electromagnético) debido a la presencia de antocianinas en estas hojas. Sin embargo,

resulta interesante destacar que la mayoría de las hojas rojas no se ven de ese color

debido a un aumento en la reflectancia en la zona del rojo del espectro, sino a la

12

sustracción de las longitudes de onda del verde y del amarillo en el espectro de

reflectancia según Neill (Neill y Gould, 1999).

En la región del Infra-rojo cercano, entre 700 y 1300 nm, la reflectancia y la

transmitancia de hojas poseen valores altos. Esta zona del espectro electromagnético es

afectada principalmente por la estructura de la hoja. Dentro de la hoja, la luz es

dispersada en las interfases existentes entre las paredes celulares y los espacios de aire,

el índice de refracción varía de un valor de 1.47 en las paredes celulares de una célula

totalmente hidratada a un índice de refracción de 1.00 en los espacios intercelulares.

(Gausman y Allen, 1973; Gausman et al., 1974; Slaton et al.; 2001). Según Gausman, la

reflectancia en el infra-rojo cercano depende del tejido esponjoso de las hojas debido a

que esta radiación puede pasar a través del mesófilo. Cuanto mayor es el número de

espacios de aire existente entre las células del tejido esponjoso, mayor es la cantidad de

luz que puede ser reflejada o transmitida por esa hoja en el infra-rojo cercano. Por este

motivo, la reflectancia en esta zona del espectro varía considerablemente entre las

diferentes especies y resulta así muy efectiva para clasificar especies eficientemente

(Gausman et al., 1974). Experimentos realizados infiltrando hojas con agua han

demostrado que la reflectancia disminuye en esta región, ya que el agua llena los

espacios de aire, disminuyendo tanto las discontinuidades entre los índices de refracción

como los fenómenos de dispersión (Knipling, 1970).

La reflectancia en la región del Infra-rojo medio esta caracterizada por la fuerte

absorción del agua presente en las hojas. Se pueden observar bandas características de

absorción ubicadas alrededor de 1200 nm, 1940 nm y 2500 nm, las cuales disminuyen

la reflectancia a medida que aumenta el contenido de agua en las hojas (Kumar et al.,

2001; Carter 1991).

2.1.4. Correlación de la reflectancia con los contenidos de pigmentos y de agua de las

hojas

Usualmente, la determinación del contenido de pigmentos en material vegetal se

realiza por vía húmeda, es decir, por métodos químicos de extracción de pigmentos con

solventes orgánicos y la posterior determinación de la absorbancia de dichas soluciones

por métodos espectrofotométricos a longitudes de onda establecidas (Lichtenthaler,

1987; Sims y Gamon; 2002). Obviamente este tipo de técnicas consumen mucho tiempo

y trabajo en el laboratorio, y resultan destructivas implicando la pérdida de la muestra.

13

Por lo tanto, durante los últimos años ha habido un esfuerzo creciente en la

utilización de la espectroscopía de reflectancia para estimar el contenido de pigmentos

(Hatfield et al., 2008). Es común hallar trabajos en los que se relacionan estos dos

parámetros (reflectancia y concentración).

Además de este tipo de correlaciones se han hecho considerables esfuerzos en

desarrollar algoritmos o índices de vegetación los cuales utilizan relaciones o

combinaciones de diferentes bandas espectrales y permiten de esta manera conocer el

contenido de distintos componentes de las hojas (Gitelson y Merzlyak, 1994a, 1994b y

1996; Datt, 1998; Gamon y Surfus, 1999; Gitelson et al., 2001; Gitelson et al., 2002;

Gitelson et al., 2003). Estos índices están basados en los conocimientos empíricos sobre

cómo varía el espectro de reflectancia con el contenido de los diferentes componentes

bioquímicos de las hojas (Hatfield et al., 2008). La espectroscopía de reflectancia es un

método más ventajoso que los métodos de extracción húmeda porque permite conocer

las concentraciones de pigmentos sin necesidad de destruir la muestra. Adicionalmente,

la obtención de los espectros es prácticamente instantánea por lo que permite ahorrar

apreciable tiempo y trabajo de laboratorio.

Sólo en la zona del verde (alrededor de 550 nm) y en la zona del rojo lejano

(alrededor de 700 nm) la reflectancia es sensible a la variación de clorofila. Esto se debe

a que los coeficientes de absorción de la clorofila en estas regiones del espectro

electromagnético son suficientemente bajos para permitir que la luz penetre

profundamente en la hoja (Gaussman y Allen, 1973; Gitelson y Merzlyak, 1994b) y por

lo tanto la sensibilidad de la absorción y la reflectancia a estas longitudes de onda es

máxima, permitiendo una evaluación muy precisa del contenido de clorofila. Los

índices vegetales basados en estas bandas espectrales son propuestos y utilizados para

estimar el contenido de clorofila en las hojas de varias especies (Gitelson y Merzlyak,

1994a, 1994b y 1996; Gamon y Surfus, 1999; Gitelson et al., 2001; Sims y Gamon,

2002; Gitelson et al., 2003).

Por otro lado, valores altos en los coeficientes de absorción específicos para los

pigmentos fotosintéticos en la región del azul (400-500 nm) y en la región del rojo

(alrededor de 670 nm) (ver figura 2.4) ocasionan que la profundidad de penetración de

la luz de estas longitudes de ondas sea muy baja (Vogelmann, 1993). Esto produce que

incluso bajas concentraciones de pigmentos sean suficientes para saturar la absorción y

la reflectancia de las hojas en esa zona espectral, es decir, ambos tipos de espectros se

vuelven insensibles al incremento o disminución de la clorofila. En la región azul y rojo

14

del espectro electromagnético absorben las moléculas de clorofila-a y de clorofila-b.

Adicionalmente entre 400 y 500 nm también absorben los carotenoides (Lichtenthaler,

1987).

Es importante destacar que en esta tesis se intentó buscar correlaciones entre las

concentraciones de pigmentos y los parámetros espectroscópicos, que tuvieran soporte

en modelos físicos que describen la interacción luz-hoja. Esto constituye una diferencia

con los trabajos bibliográficos cuyas correlaciones se basan en fundamentos empíricos

(Gitelson y Merzlyak, 1994a y 1994b; Carter y Knapp, 2001; Gitelson et al., 2001 y

2002; Carter y Spiering, 2002; Merzlyak et al., 2003; Gitelson et al., 2003)

Figura 2.4. Coeficientes de absorción de la clorofila-a y clorofila-b en solución

(Figura extraída y modificada de la página http://sel18.hut.fi/304/Valomylly/bio.htm)

� Existe un índice que presenta una gran potencialidad en la aplicación de estudios

ecológicos, es el índice de reflectancia fotoquímico (PRI por sus siglas en inglés

Photochemical Reflectance Index). Este índice fue desarrollado por Gamon y

colaboradores en 1992 (Gamon et al., 1992) para estimar cambios rápidos en los niveles

relativos de los pigmentos del ciclo de las xantofilas y por lo tanto como estimador de la

eficiencia en el uso de la luz. El PRI mide la reflectancia relativa a cada lado del pico en

la zona del verde del espectro (550 nm), compara la reflectancia en la zona del azul

(absorción de clorofila y carotenoides) con la reflectancia en la zona del rojo (absorción

de la clorofila solamente) (Garbulsky et al., 2008) y fue definido de la siguiente manera:

PRI = (R531 – R570)/ (R531 – R570), donde R531 y R570 se refieren a los valores de

reflectancia a 531 y 570 mn.

Según el trabajo de Gamon en escalas temporales breves (diaria), la actividad del

ciclo de las xantofilas se encuentra relacionada con la reflectancia a 531 nm (Gamon et


Coe

fici

ente

de

abso

rció

n (c

m-1

M-1

)


Coe

fici

ente

de

abso

rció

n (c

m-1

M-1

)

15

al., 1992). Los carotenoides modulan el flujo de energía hacia y desde el sistema

fotosintético. La violaxantina absorbe luz azul y transfiere la energía hacia las

moléculas de clorofila-a para iniciar la fotosíntesis. Por otro lado la zeaxantina remueve

el exceso de energía. Cuando la intensidad de luz que llega a las plantas es excesiva, la

violaxantina se convierte reversiblemente en zeaxantina (Sims y Gamon, 1999). Este

proceso conduce a un aumento en la disipación de la energía como calor, que se

considera un mecanismo de protección contra la fotodegradación (Demmig-Adams y

Adams 2006).

El PRI también podría estar evaluando otros cambios en los pigmentos ya que se

encuentra relacionado con el cociente carotenoides/clorofila en hojas verdes (Sims y

Gamon, 2002; Filella et al. 2004). La variación de PRI podría así ser una función

combinada de cambios a corto plazo (diurnos) en los niveles del pigmento del ciclo de

la xantofila y de cambios relativos de largo plazo (estacionales) del contenido de

carotenoides y de clorofilas a lo largo de varias semanas (Garbulsky et al., 2008).

Adicionalmente, trabajos realizados a nivel de hoja y de planta muestran que es

posible estimar de forma remota la eficiencia en el uso de la radiación a partir del PRI

(Garbulsky et al., 2008). Otros trabajos plantean la posibilidad de explorar la aplicación

del PRI para detectar posibles daños foliares (Ustin et al., 2009).

Es evidente la necesidad vital que poseen las plantas de disponer de cantidades

suficientes de agua para su desarrollo y su supervivencia. En cultivos agronómicos, la

utilización de la reflectancia para evaluar síntomas de tensión provocados por la falta de

agua es una aplicación muy relevante en la actualidad. Esta técnica se emplea en la

estimación del estrés y la concomitante corrección mediante la irrigación adecuada de

los cultivos (Hunt y Yilmaz, 2007). En cuanto a las áreas forestadas, el estrés producido

por falta de agua es un fuerte indicador del incremento en el potencial combustible de

los bosques y por lo tanto de la probabilidad de ocurrencia de incendios forestales

(Chuvieco et al., 2004).

2.1.5. Modelos que explican la interacción de la luz con las hojas

Para explicar la compleja interacción que existe entre la luz con las

características ópticas de las hojas se han desarrollado diversos modelos de complejidad

variable ya que las características ópticas de las hojas son difíciles de simular debido a

su intrincada estructura (Wang et al., 2005). Básicamente existen dos grandes grupos de

modelos, por un lado tenemos los modelos descriptivos o empíricos los cuales han sido

16

creados principalmente para llevar adelante estudios teóricos (Kumar et al., 2001). Por

el otro lado, nos encontramos con los modelos basados en descripciones físicas de la

interacción de la radiación con la hoja. La ventaja de estos últimos es que permiten la

simulación del comportamiento de hojas y de coberturas vegetales. Adicionalmente, son

ventajosos frente a los modelos empíricos porque pueden plantearse en modo directo,

variando los parámetros de entrada para observar cómo varía la reflectancia simulada, o

de modo inverso, a partir de la reflectancia medida permiten estimar qué cantidad de

una determinada variable estaba presente en la hoja observada o en un área de

vegetación en el caso de simulaciones de cobertura vegetal (Yebra y Chuvieco, 2008).

Dentro de este último grupo se encuentran los modelos basados en la teoría de

Kubelka-Munk y el modelo de Pila de Placas. Estos dos modelos describen la

transferencia de la radiación dentro de la hoja utilizando diversos coeficientes o

parámetros. El cálculo detallado y la utilización de estos parámetros serán explicados

más adelante al introducir las bases teóricas de ambos modelos. Además, este tipo de

modelos pueden ser fácilmente invertidos para conocer las características de las hojas a

partir de los datos de reflectancia y transmitancia medidos (Kumar et al., 2001).

2.1.6. Teoría de Kubelka-Munk

La teoría de Kubelka-Munk (K-M) considera la hoja como una capa de material

absorbente y dispersante (Kubelka y Munk, 1931, Kumar et al., 2001). Para eliminar

efectos de borde se considera que la extensión lateral es infinita y que no hay

fenómenos de reflección en el borde superior e inferior de la capa de material

considerado, en este caso, una hoja. La teoría proporciona las formulas analíticas

simples para la reflexión difusa y la transmitancia en términos del coeficiente de

absorción, k, del coeficiente de dispersión, s, y del espesor del medio, d.

De acuerdo con Slater, la teoría de K-M es exacta sólo para un flujo incidente

perfectamente difuso y en un medio difusivo ideal y por este motivo es aplicable en el

caso de un set de hojas apiladas irradiadas por un haz de luz colimado en un

espectrofotómetro ya que la primera hoja del set convierte a la mayoría de la radiación

directa en radiación difusa (Slater, 1980).

En este trabajo de tesis se utilizó un modelo de dos flujos similar al desarrollado

por Allen y Richardson en 1968, el cual considera que la radiación dentro de la hoja se

propaga en dos flujos de direcciones opuestas. Este tipo de modelos describe

adecuadamente las propiedades ópticas de hojas. Sin embargo, Allen y Richardson

17

extendieron la aproximación de dos flujos añadiendo un tercer parámetro al considerar

la radiación solar directa (Allen et al., 1970). El modelo de tres flujos fue descripto por

ecuaciones diferenciales llamadas ecuaciones de Duntley (Welles y Norman, 1991) y

cinco coeficientes. Yamada y Fujimara (1991) usaron la teoría de K-M para desarrollar

un modelo sofisticado en el cual cada hoja es descripta como si estuviera formada por

cuatro capas: la cutícula superior, el mesófilo en empalizada, el mesófilo esponjoso y la

cutícula inferior. Los valores calculados de reflectancia y transmitancia por este modelo

muestran una buena coincidencia con los espectros obtenidos experimentalmente.

El modelo de dos flujos utilizado en la tesis permitió calcular los parámetros

ópticos de las hojas con adecuada exactitud. Los modelos de más de dos flujos aportan

la ventaja adicional de permitir la extrapolación al nivel de cobertura vegetal (Verhoef,

1984).

2.1.7. Modelo de Pila de Placas

El modelo de Pila de Placas desarrollado por Allen y colaboradores en 1969

representa una hoja como una placa absorbente pero no difusiva, con una superficie

rugosa lo que simularía la difusión Lambertiana. Los procesos de la radiación en este

modelo fueron descriptos por medio de dos parámetros: un índice de refracción efectivo

y un coeficiente de absorción efectivo. Sin embargo, este modelo sólo sirve para

reproducir el espectro de reflectancia de una hoja compacta (Allen et al., 1969). Allen y

colaboradores en 1970 extendieron el modelo anterior para reproducir la reflectancia de

hojas no compactas, representándolas por múltiples placas (o una Pila de Placas) donde

ocurren numerosas reflexiones de la radiación difusa entre las interfaces de las placas

(Allen et al., 1970).

2.2. Base teórica de los modelos que describen la interacción de la luz con las hojas

2.2.1. Teoría de Kubelka-Munk

Según lo visto anteriormente, la teoría de K-M se aplica usualmente para

describir la absorción de la luz en un medio dispersivo. En esta aproximación, se

consideran dos flujos los cuales viajan en direcciones opuestas y perpendicularmente a

la superficie irradiada, ver figura 2.5.

18

Figura 2.5. Representación de la capa de material absorbente y dispersante. La

superficie es iluminada en x = 0

Se considera la atenuación del flujo radiante positivo denotado I, el cual se

mueve en la dirección de la luz incidente, y del flujo radiante negativo denotado como

J, el cual se mueve en la dirección de la luz reflejada por la superficie irradiada. Las

ecuaciones diferenciales que representan las atenuaciones en ambos flujos son:

dxsxJdxskxIxdI )()()()( ++−= (2.1)

dxsxIdxskxJxdJ )()()()( ++−=− (2.2)

donde k y s son los coeficientes de absorción y de dispersión de la muestra,

respectivamente: k = 2εεεε y s = 2�. Donde εεεε es la fracción de la luz absorbida y � es la

fracción de luz dispersada por unidad de paso óptico de la muestra, en este caso hojas.

La ecuación 2.1 es resuelta para J y se sustituye en la ecuación 2.2, obteniéndose

de esta manera:

022

2

=− Idx

Idκ (2.3)

En forma análoga:

Io

Jo

I(x)

J(x)

o d

x

dx

Io

Jo

I(x)

J(x)

o d

x

dx

19

022

2

=− Jdx

Jdκ (2.4)

donde )2( skk +=κ (2.5)

A partir de la resolución de las ecuaciones 2.3 y 2.4 y considerando las

condiciones de borde tales que I = I0 para x = 0 y J = 0 para x = d, se obtienen las

ecuaciones 2.6 y 2.7 para la transmitancia (T) y la reflectancia (R):

( ) dd

d

eeI

IT

κκ ββ

β−−−+

==22

0 )1(1

4 (2.6)

( ) ( )( ) dd

dd

ee

ee

I

JR

κκ

κκ

ββ

β−

−

−−+

−−==

22

2

0

0

)1(1

1 (2.7)

donde ( )sk 2+= κβ (2.8)

Se puede ver que cuando d ∞ (una capa infinita), T 0 y

β

β

+

−=∞ 1

1R (2.9)

y

( )s

k

R

RRF =

−=

∞

∞

2

1)(

2

(2.10)

La magnitud k/s dada por la ecuación 2.10 usualmente es denominada función

de remisión F(R). Midiendo la reflectancia infinita, es decir, la reflectancia de un set de

hojas apiladas, es posible obtener la relación k/s. Sin embargo, la teoría de Kubelka-

Munk no permite obtener los coeficientes k y s en forma separada. Una posibilidad para

obtener estos dos parámetros es asumiendo el modelo de Pila de Placas para describir la

interacción de la luz con el sistema (Stokes, 1862; Wendlandt, 1966; Allen y

20

Richardson, 1968; Gausman y Allen, 1973). Las bases teóricas subyacentes al modelo

de Pila de Placas serán analizadas en la siguiente sección.

2.2.2. Modelo de Pila de Placas

Este modelo considera la muestra como si estuviera compuesta de un gran

número de placas o capas paralelas.

Si consideramos un par de placas (i y j), cuando un haz de luz choca con la capa

i, una fracción de esta luz Ri es reflejada y otra porción de luz es transmitida Ti, ver

figura 2.6.

Figura 2.6. Imagen representativa de la interacción de la luz con dos placas (i y j), de

acuerdo con el modelo de Pila de Placas. La fracción de luz reflejada es denotada como

R y la fracción de luz transmitida es denotada como T. Los subíndices i y j se refieren a

las placas respectivas

El haz transmitido Ti interactúa ahora con la placa j, allí una fracción es

transmitida Tij y otra fracción es reflejada TiRj. Esta fracción alcanza la placa i y una

fracción TiRjTi emerge de i. Una fracción TiRjRi es reflejada en la parte inferior de i.

Continuando de esta manera, con la descripción de la interacción de la luz con las placas

i y j es posible obtener las expresiones para la transmitancia y reflectancia de dos capas

de la muestra:

( )22, 1... RjRRRTTTRRTTTT ijijijijijiji ++=++= (2.11)

ji

ji

jiRR

TTT

−=

1, (2.12)

21

( )...1 2222, ++++=+++= jijijiiiiijiiji RRRRRTRTRRTRTRR (2.13)

ji

ji

ijiRR

RTRR

−+=

1

2

, (2.14)

En las ecuaciones 2.11 y 2.13 se utilizan series geométricas infinitas. Stokes

deduce que para una muestra de espesor d, las ecuaciones 2.12 y 2.14 conducen a la

ecuación 2.15 (Stokes, 1862; Allen y Richardson, 1968):

1// −− −=

− aa

T

bb

Rldld

(2.15)

donde l es el espesor de cada placa en el modelo de Pila de Placas, R y T son la

reflectancia y la transmitancia y los parámetros a, b y � están dados por las ecuaciones

2.16-2.18 para un sistema compuesto por d/l números de placas:

r

tra

2

1 22 ∆+−+= (2.16)

t

rtb

2

1 22 ∆+−+= (2.17)

( ) ( ) ( ) ( )[ ]trrttrtr −−−+−+++=∆ 11112 (2.18)

En las ecuaciones 2.16-2.18, r y t se refieren a la reflectancia y transmitancia de

una sola hoja. Entonces, considerando el modelo de Pila de Placas es posible obtener

una relación entre los parámetros de Stokes (a y b) y los datos medidos (reflectancia y

transmitancia de una hoja).

La teoría de Kubelka-Munk, a través de la resolución de las ecuaciones

diferenciales, conduce a las ecuaciones 2.6 y 2.7 para T y R, respectivamente, mientras

que el modelo de Pila de Placas conduce a la ecuación 2.15. Comparando las ecuaciones

22

2.6 y 2.7 con la ecuación 2.15, se concluye que para un sistema descripto

simultáneamente por ambas aproximaciones

blog=κ (2.19)

y

1

1

+

−=

a

aβ (2.20)

Las ecuaciones 2.19 y 2.20 son los nexos claves entre los parámetros de K-M (�

y �) y los parámetros de Stokes a y b. Finalmente, como � y � están relacionados con k

y s (ecuaciones 2.5 y 2.8), es posible escribir las ecuaciones 2.21 y 2.22:

( )( )

ba

ak log

1

1

+

−= (2.21)

ba

as log

1

22 −

= (2.22)

En resumen, midiendo la reflectancia difusa, r, y la transmitancia difusa, t, de

hojas individuales es posible calcular los coeficientes k y s a partir de las ecuaciones

2.16-2.18, 2.21 y 2.22.

2.3. Materiales y métodos

Los experimentos ópticos realizados en esta tesis se efectuaron sobre hojas

intactas. El procedimiento realizado fue siempre el mismo: se seleccionaron las hojas de

interés en cada caso, las cuales se lavaron con agua destilada y se secaron con papel

absorbente teniendo cuidado de no dañarlas; luego se obtuvieron los espectros

correspondientes.

Los espectros de reflectancia difusa se obtuvieron como una función de la

longitud de onda para hojas individuales y para colchones de hojas. Se determinaron

también los espectros de transmitancia difusa para hojas individuales como función de

23

la longitud de onda. Las medidas de reflectancia y de transmitancia se realizaron con un

espectrofotómetro Shimadzu UV3101PC equipado con una esfera integradora de luz

Shimadzu ISR-3100. El esquema de la esfera integradora se muestra en la figura 2.7.

Figura 2.7. Esquema de la esfera integradora utilizada (Shimadzu SRI-3100)

Para ajustar el 100% de reflectancia se utilizó sulfato de bario como estándar de

referencia. Para realizar la corrección por línea de base se colocó entonces el sulfato de

bario en la posición de muestra y en la posición de referencia. Luego, se retiró el sulfato

de bario de la posición de muestra y en su lugar se colocaron las hojas o colchones de

hojas para determinar los espectros de reflectancia difusa. Los espectros de

transmitancia se realizaron manteniendo los portamuestras con sulfato de bario en la

posición de muestra y en la posición de referencia y colocando la hoja en la ventana de

entrada de la esfera.

En la esfera integradora utilizada, el ángulo incidente sobre la muestra (hojas o

colchones de hojas) es de cero grados de manera que la luz reflejada en forma especular

por la muestra (reflectancia especular) es eliminada por la ventana de entrada

permitiendo la determinación de la componente difusa de la reflectancia.

Para cada especie estudiada se determinó el contenido de clorofila-a, clorofila-b,

carotenoides y antocianinas. Para ello se pesaron aproximadamente 0.4 g de hojas y se

molieron en un mortero con 5 ml de acetona 80% v/v. La suspensión obtenida fue

Rayo de muestra

Rayo de referencia

Portamuestra con BaSO4 (POSICIÓN DE REFERENCIA)

Hoja o colchón de hojas

VENTANA DE ENTRADA

FOTOMULTIPLICADOR (EN EL FONDO)

Portamuestra con BaSO4 (POSICIÓN DE MUESTRA)

24

filtrada por succión y el residuo fue tratado nuevamente con acetona 80% v/v hasta que

se logró la extracción de todos los pigmentos del filtrado. Se determinó la absorbancia

de la solución en función de la longitud de onda utilizando un espectrofotómetro UV

160A Shimadzu. Por último, se calculó la concentración de la clorofila-a (Clor a),

clorofila-b (Clor b), carotenoides y antocianinas a partir de las absorbancias medidas,

usando las siguientes ecuaciones (Sims y Gamon 2002):

647537663 003046.0000897.001373.0 AAAaClor ⋅−⋅−⋅= (2.23)

663537647 005507.0004305.002405.0 AAAbClor ⋅−⋅−⋅= (2.24)

( )26.119

)asAntocianin479.9)(1.17(( 470 ⋅−+⋅−=

bCloraClorAesCarotenoid (2.25)

663647537 002228.000697.008173.0 AAAasAntocianin ⋅−⋅−⋅= (2.26)

donde Ax es la absorbancia de la solución con los pigmentos extraídos a la longitud de

onda x. La absorbancia se midió en una cubeta de 1 cm de paso óptico.

Los contenidos de clorofilas, carotenoides y antocianinas calculados según las

ecuaciones (2.23) a (2.26) están expresados en µmol ml-1. La unidad de concentración

de pigmentos utilizada en este capítulo de tesis es mmol/cm2 de hoja. Para expresar de

este modo las concentraciones se determinó el área de cada una de ellas.

Se determinó también el contenido de agua de las hojas. Este parámetro se

obtuvo por diferencia de peso entre las hojas húmedas y las mismas hojas secadas

durante 72 horas a 70 °C en una estufa de laboratorio. Luego de secadas las hojas se

mantuvieron en un desecador hasta que alcanzaron peso constante.

2.4. Resultados y discusión

2.4.1. Aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y modelo de Pila de Placas en hojas

En un trabajo publicado en el año 2007 en el Journal of Chemical Education

(Cordon y Lagorio, 2007) se calcularon separadamente los coeficientes k y s en función

de la longitud de onda a partir del modelo de Pila de Placas (ecuaciones 2.16-2.18, 2.21

y 2.22) y su relación (k/s) fue comparada con la función de remisión calculada a partir

25

de valores de reflectancia difusa de la muestra en condiciones de transmitancia nula, R�,

utilizando la ecuación 2.10 de la teoría de Kubelka-Munk.

Se graficaron simultáneamente la función F(R) obtenida para un colchón de

hojas con el cociente del coeficiente de absorción y el coeficiente de dispersión de una

hoja, para diferentes especies vegetales: Citrus aurantium, Ficus benjamina, Gardenia

jasminoides, Hedera helix y Ligustrum vulgare. Los gráficos para las diferentes especies

se muestran en la figura 2.8.

La coincidencia de F(R) con k/s a lo largo de todo el espectro estudiado y para

todos los casos estudiados muestran la aplicabilidad de ambos modelos en las hojas

estudiadas.

También se calcularon los coeficientes de absorción (k) y de dispersión (s) en

función de la longitud de onda, ver figura 2.9. La determinación de k y s en forma

independiente es relevante en diferentes áreas de la ciencia. En particular, k y s son

importantes en el estudio de las hojas donde se hallan conectados con el transporte de

fotones dentro de las hojas y por lo tanto brindan información de cómo influye la

distribución de la luz en la fotosíntesis (Gausman y Allen, 1973; Ustin et al., 2001).

El coeficiente de absorción es linealmente dependiente de la concentración de

cromóforo (Wendlandt, 1966), por lo tanto los valores de k en función de la longitud de

onda están conectados con el contenido de los pigmentos presentes en las hojas. La

distribución espectral de k para Citrus aurantium, Ficus benjamina, Gardenia

jasminoide y Hedera helix resultaron similares, indicando por lo tanto una composición

de pigmentos similares. El perfil de k en función de la longitud de onda para Ligustrum

vulgare mostró una mayor absorción alrededor de 550 nm debido a la presencia de

antocianinas en este tipo de hojas (Neill y Gould, 1999 y 2003).

Los valores de los coeficientes de dispersión para todas las especies estudiadas

fueron similares, con valores de s bajos y aproximadamente constantes a lo largo de

todo el espectro electromagnético, indicando que las estructuras de las especies elegidas

y los contenidos de agua son muy similares entre sí.

26

Longitud de onda/ nm

450 550 650 750

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


450 550 650 750

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


450 550 650 750

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


450 550 650 750

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


450 550 650 750

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12

Ficus benjamina

Gardenia jasminoides Hedera helix

Ligustrum vulgare

Citrus aurantium

Figura 2.8. Función de remisión ( ) y k/s ( ) en función de la longitud de onda

27


450 550 650 7500

1

2

3


450 550 650 7500

1

2

3


450 550 650 7500

1

2

3


450 550 650 7500

1

2

3


450 550 650 7500

1

2

3

k

s

k

s

k

s

s

s

k

k

Ficus benjamina


Citrus aurantium

Ligustrum vulgare

Figura 2.9. Coeficientes de absorción ( ) y de dispersión ( ) en función de la

longitud de onda

28

Luego de publicar estos resultados en el Journal of Chemical Education (Cordon

y Lagorio, 2007) se realizó una extensión de los mismos a fin de corroborar la

aplicabilidad de ambas teorías en la zona del infrarrojo cercano del espectro

electromagnético. Para ello se obtuvieron los espectros de reflectancia de las mismas

especies vegetales utilizadas oportunamente (Citrus aurantium, Ficus benjamina,

Gardenia jasminoides, Hedera helix y Ligustrum vulgare.). Nuevamente se calcularon

por separado los coeficientes k y s en función de la longitud de onda utilizando el

modelo de Pila de Placas (ecuaciones 2.16-2.18, 2.21 y 2.22). Luego la relación de los

coeficientes de absorción y de dispersión (k/s) fue graficada junto con la función de

remisión calculada a partir de valores de reflectancia difusa de la muestra en

condiciones de transmitancia nula, R�, utilizando la ecuación 2.10 de la teoría de

Kubelka-Munk. Estos resultados se muestran en la figura 2.10.

29


850 1250 1650 2050 2450

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


850 1250 1650 2050 2450

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


850 1250 1650 2050 2450

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


850 1250 1650 2050 2450

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12


850 1250 1650 2050 2450

F(R

)

0

2

4

6

8

10

12

Ficus benjamina


Ligustrum vulgare

Citrus aurantium

Figura 2.10. Función de remisión ( ) y k/s ( ) desde la zona del visible hasta el

infrarrojo cercano del espectro electromagnético (450-2500 nm)

30

2.4.2. Correlaciones entre el contenido de pigmentos y el contenido de agua de las hojas

con la función de remisión a longitudes de onda específicas

Como ya se mencionó anteriormente, en bibliografía se ha estudiado

exhaustivamente la correlación entre la reflectancia con el contenido de pigmentos de

las hojas y con su contenido de agua. No obstante, la mayoría de este tipo de

correlaciones ha sido desarrollada y probada en una especie vegetal o en especies

altamente emparentadas (Sims y Gamon, 2002). Por lo tanto, en esta tesis se planeó la

búsqueda de correlaciones que pudieran ser generalizadas para ser utilizadas en una

amplia variedad de especies vegetales. Para lograr este objetivo se utilizó la función de

remisión, la cual se relaciona en forma directa con la concentración de pigmentos en un

medio sólido (ver ecuación 2.10).

Se utilizaron los valores de la función de remisión a 550 nm y 700 nm. Estas

longitudes de onda han sido propuestas en numerosos trabajos como las más apropiadas

para determinar concentraciones de clorofila (Gitelson y Merzlyak, 1994a, 1994b y

1996; Gamon y Surfus, 1999; Gitelson et al., 2001; Sims y Gamon, 2002; Gitelson et

al., 2003). Se utilizaron hojas con diferentes contenidos de pigmentos. Se seleccionaron

hojas con diferentes tonos de verde, hojas amarillentas y hojas con zonas rojas de varias

especies: Hedera helix, Liquidambar styraciflua, Populus alba, Rosa sp., Gardenia

jasminoides, Schefflera arborícola, Aloysia triphylla y Ficus benjamina. Se utilizaron

hojas de diferentes especies ya que las diferencias estructurales entre las distintas hojas

pueden tener efectos significativos en esas correlaciones (Sims y Gamon, 2002). Este es

un punto importante a tener en cuenta para que las correlaciones halladas tengan una

validez amplia en posibles estudios ecológicos. En literatura existen numerosas

relaciones entre reflectancia y contenido de pigmentos que han sido desarrolladas y

testeadas sólo para una o algunas especies muy cercanas (Blackburn 1998a y 1998b;

Gamon y Surfus, 1999; Gitelson y Merzlyak, 1994a), teniendo estas relaciones

obviamente una aplicabilidad muy limitada.

Los gráficos de F(R) a 550 nm y 700 nm versus la concentración de clorofila-a,

clorofila-b y clorofila total son lineales, sin embargo, se esperaba que las correlaciones

entre el producto de la función de remisión y el coeficiente de dispersión (F(R)* s = k)

con el contenido de pigmentos fueran más efectivas para cuantificar pigmentos. Las

figuras 2.11, 2.12 y 2.13 muestran las correlaciones halladas entre F(R) a 550 con el

contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total, respectivamente. Las figuras 2.14,

31

2.15 y 2.16 presentan las correlaciones entre la función de remisión calculada a 700 nm

con el contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total, respectivamente.

F(R) a 550 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5

Figura 2.11. Clorofila-a cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 550 nm

F(R) a 550 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

Figura 2.12. Clorofila-b cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 550 nm

Hedera helix

Liquidambar styraciflua

Populus alba

Rosa sp.

Gardenia jasminoides

Schefflera arboricola

Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

32

F(R) a 550 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Figura 2.13. Clorofila total cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 550

nm

F(R) a 700 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5

Figura 2.14. Clorofila-a cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 700 nm

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

33

F(R) a 700 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

Figura 2.15. Clorofila-b cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 700 nm

F(R) a 700 nm

0 2 4 6

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Figura 2.16. Clorofila total cuantificada por método húmedo en función de F(R) a 700

nm

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

34

A continuación se muestran las correlaciones halladas entre el producto de la

función de remisión a 550 ó 700 nm y los valores correspondientes de coeficiente de

dispersión (s). El producto F(R) * s a 550 nm vs. el contenido de clorofila-a, clorofila-b

y clorofila total se presentan en las figuras 2.17, 2,18 y 2.19, respectivamente. Los

gráficos de F(R) * s a 700 nm versus el contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila

total se muestran en las figuras 2.20, 2.21 y 2.22, respectivamente.

[F(R) * s] a 550 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5

Figura 2.17. Clorofila-a cuantificada por método húmedo en función del producto de

F(R) por el coeficiente de dispersión (s) a 550 nm

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

35

[F(R) * s] a 550 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

Figura 2.18. Clorofila-b cuantificada por método húmedo en función del producto de


[F(R) * s] a 550 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Figura 2.19. Clorofila total cuantificada por método húmedo en función del producto de


Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

36

[F(R) * s] a 700 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5

Figura 2.20. Clorofila-a cuantificada por método húmedo en función del producto de


[F(R) * s] a 700 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

37

Figura 2.21. Clorofila-b cuantificada por método húmedo en función del producto de


[F(R) * s] a 700 nm

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Figura 2.22. Clorofila total cuantificada por método húmedo en función del producto de


La tabla 2.1 resume los parámetros de ajuste de las regresiones lineales de las

figura 2.11 a 2.16. En dichas figuras se graficaron las concentraciones de clorofila en

función de los valores de F(R) a 550 y 700 nm.

Tabla 2.1. Parámetros correspondientes a las correlaciones lineales entre el contenido de

clorofila de las hojas frente a los valores de función de remisión a 550 y 700 nm

y = y0 + a * x Valor de a

Desviación estándar

de a

Valor de y0


de y0

R2

F(R) a 550 nm vs. Clor-a 1.1E-5 1E-6 -7.5E-7 4E-6 0.920

F(R) a 700 nm vs. Clor-a 1.1E-5 6E-7 8.3E-7 2E-6 0.972

F(R) a 550 nm vs. Clor-b 4.6E-6 5E-7 1.1E-6 2E-6 0.921

F(R) a 700 nm vs. Clor-b 4.3E-6 3E-7 1.8E-6 1E-6 0.965

Hedera helix


Populus alba

Rosa sp.



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

38

F(R) a 550 nm vs. Clor. total 1.6E-5 2E-6 3.6E-7 5E-6 0.926

F(R) a 700 nm vs. Clor. total

1.5E-5

8E-7

2.6E-6

3E-6

0.976

La tabla 2.2 resume los datos de las regresiones lineales de las figuras 2.17 a

2.22. En estas figuras se presenta la relación existente entre el contenido de clorofila con

el producto entre los valores de F(R) y los valores del coeficiente de dispersión para

cada hoja particular. Los valores de F(R) se tomaron a 550 y 700 nm en esta ocasión.

Tabla 2.2. Parámetros correspondientes a las correlaciones lineales de los diferentes

contenidos de clorofila de las hojas frente a los valores del producto de la función de

remisión con sus respectivos coeficientes de dispersión (s), a 550 y 700 nm

y = y0 + a * x Valor de a


de a

Valor de y0


de y0

R2

F(R) * s a 550 nm vs. Clor-a 5.7E-5 4E-6 -9.9E-6 3E-6 0.963

F(R) * s a 700 nm vs. Clor-a 5.1E-5 2E-6 -4.1E-6 2E-6 0.981

F(R) * s a 550 nm vs. Clor-b 2.3E-5 2E-6 -1.9E-6 2E-6 0.923

F(R) * s a 700 nm vs. Clor-b 2.1E-5 2E-6 3.3E-7 1E-6 0.941

F(R) * s a 550 nm vs. Clor. total 8.1E-5 6E-6 -1.2E-5 5E-6 0.956

F(R) * s a 700 nm vs. Clor. Total 7.1E-5 4E-6 -3.8E-6 3E-6 0.974

Los valores de F(R) y de F(R) * s a 700 nm siempre resultaron con un mayor

coeficiente de regresión lineal que los mismos parámetros a 550 nm. Estos resultados

pueden verse claramente en la tabla 2.1 y en la tabla 2.2. Este resultado era esperable ya

que a 700 nm sólo absorben las clorofilas mientras que a 550 nm además de las

clorofilas se ubica la absorción de las antocianinas (Sims y Gamon, 2002), las cuales

distorsionan la linealidad de la correlación.

Las siguientes figuras muestran la variación de k y de s con la concentración de

clorofila total, figura 2.23 y 2.24, respectivamente:

39

Concentración de clorofila total (mmol/cm2)

0.00000 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.00010 0.00012

Val

ores

de

k

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Valores de k a 550 nmValores de k a 700 nm

Figura 2.23. Valores del coeficiente de absorción en función del contenido de clorofila

total de las hojas, a 550 nm y 700 nm

Contenido de clorofila total (mmol/cm2)

0.00000 0.00002 0.00004 0.00006 0.00008 0.00010 0.00012

Val

ores

de

s

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Valores de s a 550 nmValores de s a 700 nm

40

Figura 2.24. Valores del coeficiente de dispersión en función del contenido de clorofila

total de las hojas, a 550 nm y 700 nm

Los valores de los coeficientes de absorción de las hojas elegidas, según lo

esperado muestran una dependencia lineal con la concentración de clorofila total a 550

nm y a 700 nm, figura 2.23. Sorprendentemente, los valores de los coeficientes de

dispersión de las hojas permanecen prácticamente constantes tanto a 550 nm como a

700 nm (ver figura 2.24), pese a haber utilizado hojas con diferencias estructurales muy

marcadas, con diferentes contenidos de agua y diferentes espesores. De acuerdo con

estos resultados, no debería existir diferencias apreciables entre graficar F(R) ó F(R) *

s. Efectivamente no se obtienen mejores correlaciones graficando F(R) * s como se

había especulado inicialmente.

Dentro del mismo conjunto de datos se halló una correlación lineal entre el

índice de reflectancia fotoquímico (PRI) y la relación de carotenoides con el contenido

de clorofila total (Carotenoides/Clorofila total), figura 2.25. Los valores de los

parámetros de ajuste se muestran en la tabla 2.3.

PRI = (R531-R570)/(R531+R570)

-0.1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

Car

oten

oide

s/C

loro

fila

tota

l

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

Hedera helix

Liquidambar stryraciflua

Populus alba

Rosa sp



Aloysia triphylla

Ficus benjamina

Figura 2.25. Relación entre el contenido de carotenoides y el contenido de clorofila total

cuantificada por método húmedo en función del índice de reflectancia fotoquímico

41

Tabla 2.3. Parámetros obtenidos del ajuste lineal entre el contenido de

Carotenoides/Clorofila total y el índice de reflectancia fotoquímico (PRI)

y = y0 + a * x Valor de a Desviación estándar

de a

Valor de y0


de y0

R2

PRI vs. Carotenoides/Clorofila total

2.67 0.16 0.44 0.02 0.983

Este resultado es relevante ya que permite calcular la relación de carotenoides y

el contenido de clorofila total utilizando un índice espectral que sólo requiere dos

valores de reflectancia para calcularlo. La importancia de esto radica en la dificultad

para estimar el contenido de carotenoides en forma no destructiva en hojas. Según el

trabajo de Sims y Gamon (Sims y Gamon, 2002) estimar el contenido de carotenoides a

partir de la reflectancia es mucho más difícil que estimar el contenido de clorofila

debido al solapamiento que existe entre las bandas de absorción de ambos pigmentos y

porque la concentración de clorofila es mucho mayor que la concentración de

carotenoides en la mayoría de la hojas. Por lo tanto, en literatura es difícil hallar

parámetros que permitan calcular el contenido de carotenoides adecuadamente o sólo

pueden hacerlo en hojas senescentes donde el contenido de clorofila es bajo (Sims y

Gamon, 1999).

Por último, utilizando los espectros de reflectancia que fueron obtenidos

barriendo desde 450 hasta 2500 nm, es decir, hasta la zona del infrarrojo cercano (cuyas

funciones de remisión se muestran en la figura 2.11) también fue posible encontrar una

correlación lineal entre el contenido de agua de las hojas y los valores de la función de

remisión a 1456 nm. Los resultados se muestran en la figura 2.26.

42

F(R) a 1456 nm

0 2 4 6

Con

teni

do d

e ag

ua (

mm

ol/c

m2)

0.0

4.0e-4

8.0e-4

1.2e-3

1.6e-3

2.0e-3

2.4e-3

Figura 2.26. Correlación entre el contenido de agua y los valores de la función de

remisión a 1456 nm

Los valores de los parámetros de ajuste entre el contenido de agua de las hojas y

los valores de la función de remisión a 1456 nm se muestran en la tabla 2.4.

Tabla 2.4. Parámetros obtenidos del ajuste lineal entre el contenido de agua de las hojas

y los valores de F(R) a 1456 nm

y = y0 + a * x Valor de a Desviación estándar

de a

Valor de y0


de y0

R2

F(R) a 1456 nm vs. Contenido de agua

3.0E-4 6E-5 2.0E-4 1E-4 0.938

Este resultado es lógico y esperable ya que a la longitud de onda estudiada (1456

nm) existe un máximo de absorción correspondiente a las moléculas de agua que

contiene el tejido foliar. La figura 2.10 permite observar este pequeño máximo de

absorción en todas las especies vegetales utilizadas en esta experiencia (Citrus

aurantium, Ficus benjamina, Gardenia jasminoides, Hedera helix y Ligustrum vulgare)

43

2.5. Conclusiones

De acuerdo con la teoría de Kubelka-Munk, para cada longitud de onda los

valores de la función de remisión coinciden con k/s. El cumplimiento de esta igualdad

muestra que ambos modelos (K-M y Pila de Placas) son aplicables para describir

correctamente las propiedades ópticas de las hojas. Esto fue demostrado en primer lugar

en la zona visible del espectro electromagnético (desde los 450 nm hasta los 800 nm) y

luego se amplió el rango de los espectros hasta los 2500 nm, validando así la

aplicabilidad de ambas teorías aún hasta la zona del infrarrojo cercano.

A partir del modelo de Pila de Placas es posible calcular los coeficientes de

absorción y de dispersión de las hojas y las diferencias encontradas en ambos

coeficientes para las distintas especies vegetales pueden ser interpretadas en términos de

la composición de pigmentos y de la estructura de las hojas.

Las correlaciones lineales encontradas entre las propiedades ópticas de las hojas

con el contenido de los pigmentos vegetales presentes en las mismas, presentan ventajas

prácticas asociadas. Ya que permiten el potencial monitoreo no destructivo de la

concentración de dichos pigmentos. Una relevancia similar posee la correlación hallada

entre la función de remisión y el contenido de agua del tejido foliar.

Estas correlaciones permiten ahorrar mucho tiempo y evitar tedioso trabajo de

laboratorio en la cuantificación tradicional de pigmentos por vía húmeda. Para la

estimación del contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total el parámetro más

adecuado resultó ser F(R) a 700 nm. A diferencia de lo esperado multiplicar F(R) por el

coeficiente de dispersión de las hojas no introdujo una mejora significativa en las

correlaciones halladas.

Es importante destacar que fue posible hallar una correlación lineal con un

coeficiente de determinación muy alto (para muestras biológicas) entre el índice de

reflectancia fotoquímico (PRI) y la relación Carotenoides/Clorofila total. Este resultado

es relevante debido a la carencia que existe en literatura de métodos ópticos para

determinar el contenido de carotenoides de forma confiable.

En este trabajo se muestra entonces que es posible deducir el contenido de

pigmentos fotosintéticos y de agua de las hojas a partir de la medición de reflectancia

difusa de un colchón de hojas y posterior cálculo de la función de remisión, o bien a

partir de la reflectancia y transmitancia difusa de una sola hoja y posterior cálculo de los

coeficientes k y s.

44

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50

Capítulo 3.

FLUORESCENCIA DE HOJAS

51

Capítulo 3. FLUORESCENCIA DE HOJAS

3.1. Introducción

3.1.1. Un poco de historia

En la actualidad, la fluorescencia de clorofila-a es una herramienta útil como

método no invasivo para monitorear salud vegetal. Además de ser una metodología no

destructiva, esta técnica tiene las ventajas de ser rápida y altamente sensible.

La detección de la fluorescencia de clorofila-a en hojas se remonta a dos siglos

de antigüedad. En 1833, Sir David Brewster informó a la Royal Society de Edimburgo

un nuevo fenómeno descubierto por él, al cual denominó “dispersión interna”. Haciendo

pasar un rayo de sol, mediante un sistema de lentes, a través de un extracto alcohólico

obtenido a partir de hojas frescas de laurel, Brewster observó que un cono de luz rojo

brillante era emitido desde el fluido verde, como consecuencia del paso de la luz

incidente. También observó que haciendo pasar el rayo de sol por espesores mayores del

fluido verde, la luz que emanaba del mismo se tornaba naranja.

El reconocido científico Govindjee, quien dedicó su vida al estudio de la

fotosíntesis, en un “viewpoint” publicado en la revista Australian Journal of Plant

Physiology (1995) explica que el extracto de laurel seguramente contenía clorofila, el

pigmento de las hojas verdes y señala que el término “clorofila” fue acuñado por los

científicos Pelletier y Caventou en 1818. En su trabajo, Govindjee considera que

Brewster no sólo había descubierto la fluorescencia de la clorofila en solución, sino que

también había observado por primera vez el fenómeno de reabsorción de luz en

muestras de mayor espesor (Govindjee, 1995).

La investigación en fluorescencia de clorofila continuó hasta que en 1931, un

trabajo de no más de una página revolucionó los conocimientos en esta área. El trabajo

de Kautsky y Hirsch, titulado “New experiments on carbon dioxide assimilation”

(Nuevos experimentos en la asimilación de dióxido de carbono, en castellano)

correlaciona al menos cualitativamente la fluorescencia de clorofila de hojas,

previamente adaptadas a la oscuridad, con la asimilación de dióxido de carbono. En

palabras de Govindjee, las observaciones de Kautsky y Hirsch resultaron un punto de

partida en la historia de la fotosíntesis (Govindjee, 1995). La figura 3.1 proveniente del

trabajo de Kautsky y Hirsch se muestra a continuación:

52

Figura 3.1. Proveniente del trabajo de Kautsky y Hirsch, esta figura ilustra las

principales conclusiones extraídas por ellos

La figura 3.1 muestra el comportamiento de hojas previamente mantenidas en la

oscuridad cuando se excitaban con luz: la zona entre A y B mostraba el rápido aumento

de la fluorescencia de clorofila hasta un máximo. Esta porción de la curva reflejaba la

reacción fotoquímica primaria de la fotosíntesis y por este motivo permanecía inalterada

por la temperatura y por el envenenamiento con ácido cianhídrico. A partir de cierto

instante (punto B), se recuperaba el transporte de electrones con disminución de la

fluorescencia. Esto se observa entre los puntos B y C. Los autores sugirieron que cuanta

más energía química se producía a partir de los fotones absorbidos menos fluorescencia

de clorofila se observaba.

3.1.2. Conceptos básicos de fotosíntesis

Los organismos autótrofos transforman la energía solar en energía química por

medio de la fotosíntesis. Estos organismos pueden ser bacterias, algas o plantas y son

ellos los que sustentan la vida en la Tierra.

En las células vegetales de las plantas superiores, objeto de estudio de este

trabajo de tesis, los orgánulos encargados de la fotosíntesis son los cloroplastos. En sus

membranas tilacoidales se encuentran los cuatro complejos estructurales especializados

encargados de absorber la energía lumínica y convertirla en energía química: los

fotosistemas I y II, el citocromo b/f y la ATP-sintasa (De Las Rivas, 2000). La figura

3.2, intenta mostrar en forma esquemática el sitio donde tiene lugar la fotosíntesis:

53

Figura 3.2. Esquema simplificado del sitio donde tiene lugar la fotosíntesis.

(Fotosistema I: FSI, fotosistema II: FSII, centro de reacción del fotosistema II: P680, centro de reacción

del fotosistema I: P700, primer aceptor de electrones, plastoquinona A: QA, segundo aceptor de la cadena

transportadora de electrones, plastoquinona B: QB, plastocianina: Pc)

La fotosíntesis es un proceso que consta de dos fases, la primera fase es un

proceso que depende de la luz (reacciones luminosas) y ocurre en los tilacoides de los

cloroplastos. Esta etapa produce los transportadores que son utilizados en la segunda

fase, la cual es independiente de la luz (reacciones de oscuridad) y ocurre en el estroma

de los cloroplastos.

3.1.3. La absorción de luz y el transporte de electrones

Durante la fotosíntesis, el fotosistema I (FSI) y el fotosistema II (FSII) absorben

energía luminosa en forma independiente, sin embargo, cooperan en serie en una cadena

transportadora de electrones.

Cada fotosistema está formado por un centro reactivo y por un complejo antena.

El centro reactivo está constituido por pigmentos, proteínas y un par especial de

moléculas de clorofila-a encargadas en forma directa de la conversión de energía

fotoquímica en energía electroquímica. El par de clorofila-a en el FSI tiene un máximo

de absorción a 700 nm y se lo conoce como P700, mientras que el par de clorofila-a en

Estroma

Membrana Tilacoidal

Grana

Espacio intermembrana

Membrana interior

Membrana exteriorFSII FSI

ATPsintetasa

P680 P700

QA

QB

PC

Estroma

Lumen

Parénquima en empalizada

Parénquima esponjoso

Cloroplasto

Vacuola

Núcleo

Hoja Corte transversal de la hoja

Cloroplasto

Fotosistemas

Célula vegetal

Estroma

Membrana Tilacoidal

Grana

Espacio intermembrana

Membrana interior

Membrana exteriorFSII FSI

ATPsintetasa

P680 P700

QA

QB

PC

Estroma

Lumen

Parénquima en empalizada

Parénquima esponjoso

Cloroplasto

Vacuola

Núcleo

Hoja Corte transversal de la hoja

Cloroplasto

Fotosistemas

Célula vegetal

54

el FSII tiene un máximo de absorción a 680 nm y se lo denomina P680 (De Las Rivas,

2000).

Las antenas colectoras de luz de los fotosistemas son complejos especializados

compuestos por pigmentos y estructuras proteicas. Además de moléculas de clorofila-a,

las antenas, están formadas por los llamados pigmentos accesorios: clorofila-b y los

carotenoides (xantofilas y carotenos). Estos pigmentos absorben luz de menor longitud

de onda que la clorofila-a y se la transfieren, incrementando de esta manera el espectro

disponible para la fotosíntesis. La transferencia de energía ocurre desde los

carotenoides, los que presentan un máximo de absorción a 540 nm, hacia las moléculas

de clorofila-b, con su máximo de absorción en el rojo a 650 nm, y desde éstas hacia las

moléculas de clorofila-a, las que absorben a 670 nm. Ver los espectros de absorción de

los pigmentos, figura 3.3, para una mejor comprensión.

Figura 3.3. Espectros de absorción de los pigmentos de hojas.

(Imagen tomada y modificada del sitio: https://eapbiofield.wikispaces.com/Chapter+10+Review+Macon)

En ambos fotosistemas el primer evento fotoquímico de la fotosíntesis es la

generación de un excitón, el cual resulta de la absorción de un fotón por una molécula

de clorofila-a u otro pigmento ubicado en la antena. La transferencia del excitón desde

un pigmento accesorio hasta una molécula de clorofila es muy rápida, unos pocos

picosegundos. Además, puede ser trasferido a todas las moléculas de clorofila que

forman el complejo antena y del centro de reacción por resonancia de energía en un

lapso de tiempo que va desde 1 a 5 nanosegundos (De Las Rivas, 2000; Oxborough,

2004).

Esta transferencia de energía ocurre por transferencia excitónica y se debe a una

interacción dipolo-dipolo entre la molécula que ha sido excitada y una molécula vecina.

Cuando la energía del excitón llega al centro de reacción, P700 o P680, finaliza la

Clorofila-a

Clorofila-b

Carotenoides


Can

tida

d de

luz

abso

rbid

a

Clorofila-a

Clorofila-b

Carotenoides


Can

tida

d de

luz

abso

rbid

a

55

transferencia de energía y se produce la primera separación de cargas y transferencia del

electrón (De Las Rivas, 2000). A partir de este punto, el exceso de energía del estado

excitado puede iniciar el proceso fotoquímico, puede perderse por decaimiento no

radiativo (pérdida de calor) o por fluorescencia (emitiendo un fotón de menor energía al

fotón absorbido inicialmente). Estos tres procesos ocurren en competencia y es lo que

permite obtener información de la maquinaria fotosintética a partir de mediciones de

fluorescencia (Maxwell y Johnson, 2000; Oxborough, 2004). Si bien la cantidad de

fluorescencia de clorofila-a es sólo 1-2% del total de luz absorbida (Maxwell y Johnson,

2000) debido a la alta sensibilidad que posee este método esta cantidad es suficiente

para obtener información relevante del material vegetal.

3.1.4. Fluorescencia de clorofila-a

Existen diversos métodos analíticos que utilizan la fluorescencia de clorofila-a

para el estudio de hojas intactas, aprovechando la elevada sensibilidad de esta técnica.

En uno de los métodos más difundido se registra el espectro de emisión fluorescente del

material vegetal luego de mantenerlo en oscuridad por 20 minutos irradiándolo con una

muy baja intensidad de luz para evitar la inducción de la fotosíntesis. De esta manera se

obtiene un espectro de emisión de hojas constante en el tiempo (generalmente conocida

como fluorescencia inicial).

Los espectros que se obtienen bajo estas condiciones, en función de la longitud

de onda de emisión muestran dos bandas características: una en la región del rojo del

espectro, con un máximo de emisión alrededor de 685 nm y otra banda en la región del

IR cercano, con un máximo en 735 nm aproximadamente (Pfündel, 1998; Franck et al.,

2002). La relación de intensidad de estos dos picos de fluorescencia (F685/F735) es un

parámetro muy utilizado en literatura que es correlacionado con factores de tensión y

con el contenido de clorofila (Govindjee, 1995; Lichtenthaler, 1999; Agati et al.; 2000).

Sin embargo, la interpretación de los resultados obtenidos de las señales de

fluorescencia y la correlación con el estado de salud de la planta puede estar afectada de

errores debido a los complejos procesos que ocurren durante la interacción de la luz con

la materia cuando existen procesos de dispersión de luz. En este sentido, los fenómenos

de dispersión de luz favorecen la reabsorción de la emisión en las hojas donde hay una

elevada concentración de cromóforo (clorofilas).

El espectro de absorción, o sea la función de remisión en función de la longitud

de onda (ver Capítulo 2, sección 2.2.1. Teoría de Kubelka-Munk) se superpone con el

56

espectro de emisión de fluorescencia de la clorofila-a de las hojas (ver figura 3.4). Esto

causa que los espectros experimentales de emisión de fluorescencia de hojas

normalmente muestren un descenso de la banda ubicada en el rojo debido a los procesos

de reabsorción y reemisión de luz. Por lo tanto, el espectro obtenido experimentalmente

difiere del espectro real que se produjo inicialmente en los cloroplastos, dentro de la

hoja.

Figura 3.4. Espectros de absorción y de emisión de hojas

Los procesos de reabsorción afectan la intensidad observada de fluorescencia en

forma diferente a distintas longitudes de onda. Resulta evidente que la banda ubicada

alrededor de 685 nm (Fred) sufre más reabsorción que la banda ubicada alrededor de 735

nm (Ffar-red), debido a una mayor superposición de la banda ubicada en el rojo con el

espectro de absorción de las hojas. Esto causa que la relación Fred/Ffar-red medida sufra

distorsiones con respecto a la relación emitida por la clorofila-a en los cloroplastos. Por

lo tanto, para alcanzar diagnósticos correctos es necesario, no sólo estudiar las

variaciones espectrales en función de los efectos producidos por un daño determinado,

sino también corregirlas por este tipo de distorsiones.

3.1.5. Correcciones por reabsorción

En la mayoría de los trabajos que aparecen en literatura se omiten

consideraciones cuantitativas sobre la reabsorción de la fluorescencia y aparecen

ambigüedades en aquellos donde se intenta efectuar alguna corrección de este tipo

(Agati et al., 1993; Gitelson, 1998; Lichtenthaler, 1999). Es común encontrar en

literatura un incremento en la relación Fred/Ffar-red cuando se somete a un estrés a las


400 500 600 700 800

F(R

) o

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

F(R) Emisión de clorofila-a


400 500 600 700 800

F(R

) o

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

F(R) Emisión de clorofila-a

57

plantas. Este hecho experimental es explicado en términos de un descenso en la

concentración de clorofila-a en los cloroplastos producido por el estrés. Según estos

trabajos, la disminución de clorofila produce una reducción en los procesos de

reabsorción de luz (Buschmann y Lichtenthaler, 1998). Es así evidente la necesidad de

desarrollar modelos de corrección si se desea obtener correlaciones adecuadas entre los

espectros de fluorescencia de plantas con el estado fisiológico de las mismas, para

reunir información a nivel molecular sobre la emisión de la clorofila-a unida al

fotosistema I o al fotosistema II. La aplicación de estos modelos de corrección también

permitiría obtener información valiosa sobre la destrucción preferencial de alguno de

los fotosistemas o sobre la redistribución de energía entre ellos (Pfündel 1998; Franck

2002; Allen, 2003).

Dentro de nuestro grupo de investigación, se desarrolló un modelo de corrección

por reabsorción de fluorescencia (Lagorio et al., 1998), el cual fue correctamente

validado en hojas (Ramos y Lagorio, 2004). También fue desarrollado otro modelo para

corregir reabsorción de fluorescencia en manzana Granny Smith (Ramos y Lagorio,

2004).

3.1.6. Modelos de corrección por reabsorción de luz

La aplicación de modelos de corrección de reabsorción de luz a los espectros de

emisión de fluorescencia de clorofila-a en hojas está sujeta a controversias en literatura.

Estas incertezas producen grandes discrepancias en la distribución espectral de la

fluorescencia corregida y consecuentemente en la interpretación de las características

fisiológicas relacionadas en las plantas.

En un trabajo publicado en 2006 por nuestro grupo de investigación (Cordon y

Lagorio, 2006), se realizó una comparación exhaustiva de tres modelos encontrados en

literatura para corregir reabsorción de luz en espectros de emisión de fluorescencia de

hojas intactas. Este trabajo es relevante ya que fue elegido como portada del fascículo

de agosto de ese año de la revista Photochemical and Photobiological Sciences.

En años recientes, se han publicado varios métodos que tienen en cuenta los

procesos de reabsorción de luz en hojas intactas (Agati, 1993; Gitelson, 1998; Ramos y

Lagorio, 2004). Desafortunadamente las metodologías de corrección no son

equivalentes y producen diferentes resultados. Por lo tanto, es difícil para los fisiólogos

entender cuál es el método más eficaz para analizar sus datos experimentales.

58

El objetivo de nuestro trabajo (Cordon y Lagorio, 2006) fue producir una

solución a este problema analizando detalladamente la aplicación de los tres modelos

más difundidos en literatura: el modelo de Agati et al. (MA), el modelo de Gitelson et

al. (MG) y el modelo producido en nuestro grupo de investigación Lagorio et al. (ML) a

los espectros obtenidos del mismo set de hojas. Fundamentalmente, se compararon y

discutieron las aproximaciones y los marcos teóricos subyacentes de cada modelo.

3.1.7. Espectros de fluorescencia de clorofila-a en ausencia de reabsorción

En la actualidad aún se discute cual es la verdadera distribución espectral de la

fluorescencia, es decir, el espectro de emisión de fluorescencia de la clorofila-a libre de

procesos de reabsorción. Idealmente, este espectro verdadero debería poder obtenerse

dentro de la hoja, muy cerca de donde se produce la emisión de luz: en los cloroplastos.

Sin embargo, hasta la fecha el instrumental del que se dispone para obtener espectros de

fluorescencia de hojas sólo permiten registrar una distribución espectral distorsionada.

Esta distorsión surge de la superposición existente entre el espectro de absorción y el

espectro de emisión de luz de las hojas, el alto contenido de clorofila dentro de las hojas

determina que los procesos de reabsorción y reemisión de luz sean muy importantes.

Para poder determinar que un modelo de corrección por procesos de reabsorción

de luz cuantifica adecuadamente estos procesos es necesario contar con una referencia

contra la cual comparar los espectros de fluorescencia ya corregidos. Lo óptimo sería

poder determinar experimentalmente cual es el espectro verdadero dentro de las hojas.

Si el modelo de corrección es válido ambos espectros deberían coincidir. Sin embargo,

existe una gran dificultad para conocer el espectro verdadero de las hojas de manera

experimental. Por el momento continúa la búsqueda de sistemas donde los procesos de

reabsorción de luz sean despreciables para utilizarlos como referencia contra la cual

comparar los espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas corregidos por los

diferentes modelos de cuantificación de la reabsorción.

Uno de estos sistemas se utilizó en el trabajo de Ramos y Lagorio en 2004 para

validar la aplicabilidad en hojas del modelo desarrollado por Lagorio y colaboradores en

1998, el cual corrige procesos de reabsorción y reemisión de luz en sistemas en fase

sólida (Lagorio et al., 1998; Ramos y Lagorio, 2004). En el trabajo de Ramos y Lagorio

se procedió a la extracción de los cloroplastos presentes en las hojas y a la posterior

determinación de la fluorescencia que emitían estos cloroplastos depositados sobre

placas de cuarzo. Cuando superpusieron los espectros de emisión de los cloroplastos

59

aislados con los espectros de emisión de hojas enteras corregidos por el modelo de

Lagorio ambos espectros coincidían en todo el rango de medición dentro del error

experimental, demostrando así la validez del modelo de corrección en hojas intactas.

Siguiendo la misma metodología, en este trabajo de tesis se validó la aplicabilidad del

modelo de Lagorio en hojas variegadas, los resultados se muestran en las figuras 4.B.9 y

4.B.10 de la sección 4.B. Estudio de las propiedades ópticas de hojas variegadas en

el Capítulo 4 de esta tesis.

En la corrección de los espectros de emisión de clorofila-a propuesta por

Gitelson y colaboradores en 1998, la validación del método de corrección se realiza

mediante la comparación de los espectros de emisión de hojas corregidos por su modelo

con la emisión de fluorescencia de una solución diluida de clorofila-a extraída con un

solvente orgánico. De esta manera justifican relaciones de intensidad de fluorescencia

Fred/Ffar-red tan altas como 10 (Gitelson et al., 1998). Estrechamente relacionado con la

cuestión de cual es el espectro verdadero dentro de las hojas y cual es el mejor sistema

de referencia contra el cual validar los modelos de corrección se encuentra el tema de

cual es el origen de ambas bandas de emisión en el espectro de fluorescencia de las

hojas (Para más detalles consultar la sección 3.2. Base teórica de los modelos para

corrección por procesos de reabsorción de luz).

Una revisión reciente de Buschmann (Buschmann, 2007) y una nota técnica

actual de Pedrós y colaboradores (Pedrós et al., 2008) reflejan la relevancia que tienen

estas cuestiones no sólo para los fisiólogos vegetales sino también para las aplicaciones

de la fluorescencia de hojas en bioespectroscopía y monitoreo satelital.

Al igual que Gitelson, Buschmann sostiene que a temperatura ambiente el origen

de ambas bandas en la fluorescencia de las hojas corresponde a la emisión de la

clorofila-a unida al fotosistema II, la contribución del fotosistema I es pequeña y por lo

tanto la distribución espectral de la fluorescencia de las hojas intactas tiene la misma

forma y la misma relación de máximos que una solución muy diluida de clorofila-a

(Buschmann, 2007).

Por el otro lado, el trabajo de Pedrós y colaboradores, así como los modelos de

corrección propuestos por Agati y Lagorio sugieren que aún a temperatura ambiente la

emisión del fotosistema I no es despreciable y por lo tanto la distribución espectral de

las hojas enteras presenta contribuciones importantes de ambos fotosistemas (Agati et

al., 1993; Lagorio et al., 1998 y Pedrós et al., 2008). De esta manera se descarta la

posibilidad de usar una solución de clorofila-a en algún solvente orgánico como sistema

60

de referencia libre de reabsorción. En la sección 5.A. Hojas expuestas a la acción de

herbicidas del Capítulo 5 de este trabajo de tesis, mediante la utilización de herbicidas

se pudo determinar el origen de la distribución espectral de las hojas a temperatura

ambiente. Si bien fue posible hallar una respuesta a esta cuestión tan importante aún

queda por dilucidar cual es el mejor sistema de referencia contra el cual comparar los

espectros de emisión de fluorescencia de hojas corregidos por procesos de reabsorción y

reemisión de la radiación.

Una alternativa a la extracción de cloroplastos planteada por el trabajo de Ramos

y Lagorio (Ramos y Lagorio, 2004) es la preparación de una suspensión acuosa muy

diluida de hojas. De acuerdo con Weis, es posible preparar un polvo de hoja diluido a

fin de evitar artefactos debido a la reabsorción de fluorescencia en hojas (Weis, 1984).

En este capítulo de tesis se evaluó la emisión de fluorescencia de una suspensión acuosa

de hoja muy diluida preparada según el trabajo de Weis. Adicionalmente, la suspensión

de hoja se depositó cuidadosamente en placas de cuarzo para estudiar la emisión de

fluorescencia de este sistema.

3.1.8. Anisotropía de fluorescencia

Las ondas electromagnéticas son ondas transversales, esto significa que tanto el

vector campo eléctrico como el vector magnético están orientados perpendicularmente a

la dirección de propagación de la onda que conforman en el vacío.

El fenómeno de polarización de la luz implica que la orientación del vector

campo eléctrico oscila en un solo plano determinado (Tkachenko, 2006). El grado de

polarización que posee una muestra química generalmente es descripto en términos de

la anisotropía (r) (Lakowicz, 1999). Que algo sea anisótropo significa que presenta

propiedades físicas dependientes de la dirección en que es examinado.

En ciertas muestras ocurre que las moléculas fluorescentes que la conforman

luego de ser excitadas con luz polarizada emiten luz también de manera polarizada. En

primer lugar, se excitan preferentemente los fluoróforos cuyos momentos de transición

de absorción se hallan orientados a lo largo del vector eléctrico de la luz incidente. De

esta manera, la población de fluoróforo ya no se encuentra orientada aleatoriamente y

esto provoca que las moléculas emitan fluorescencia con un momento de transición de

emisión también polarizado. Las muestras que poseen valores de anisotropía distintos

de cero presentan emisión fluorescente polarizada (Lakowicz, 1999).

61

Z

X

Y

Monocromadorde excitación

Monocromadorde emisiónI

��= IZ

I� = IX = IY

Z

X

Y

Monocromadorde excitación

Monocromadorde emisiónI

��= IZ

I� = IX = IY

Figura 3.5. Esquema simplificado utilizado para las mediciones de anisotropía de

fluorescencia

De acuerdo con la figura 3.5, la muestra se excita con luz verticalmente

polarizada (se coloca un polarizador a la salida del monocromador de excitación), por lo

tanto el vector eléctrico se encuentra orientado en forma paralela al eje vertical Z.

Luego de interactuar con la muestra, se registra la intensidad de emisión que atraviesa el

monocromador de emisión, si se ubica un polarizador orientado en forma paralela a la

dirección del polarizador de excitación la intensidad obtenida se denomina I// . Cuando

el polarizador de emisión es perpendicular a la excitación la intensidad se llama I�. La

anisotropía de la muestra se calcula a partir de estos valores de acuerdo con la ecuación

3.1.

(3.1)

Como puede observarse, la anisotropía es una cantidad adimensional e

independiente de la intensidad total de la muestra. Esto se debe a que la diferencia (I// -

I�) se encuentra normalizada por la intensidad total (I// - 2I�). Una discusión más

rigurosa sobre este tema se puede obtener del capítulo 10 (Fluorescence anisotropy) del

libro Principles of fluorescente spectroscopy de Lakowicz (Lakowicz, 1999).

Finalmente, es importante destacar la necesidad de calcular el factor de simetría

del sistema, denominado G. Este factor de corrección debe tomarse en cuenta dado que

el monocromador de emisión puede tener diferente eficiencia de transmisión para la

radiación polarizada de manera vertical u horizontalmente (Lakowicz, 1999). El factor

G se define como la relación de la sensibilidad del sistema de detección para la luz

polarizada verticalmente (SV) y la luz polarizada horizontal (SH): G = SV/SH.

r I�- I�

I�

- 2I�

=r I

�- I�

I�

- 2I�

=

62

El factor G se determina de manera experimental fácilmente a partir de

mediciones que utilizan luz de excitación polarizada de manera horizontal. Es necesario

determinar la componente IHV, que corresponde a la excitación de la muestra con

radiación polarizada horizontalmente y detectada con el polarizador de emisión

colocado de manera vertical, de ahí surgen los subíndices H y V. Por otro lado, es

necesario determinar IHH, donde la radiación de excitación se encuentra polarizada de

manera horizontal mientras que el polarizador de emisión también se coloca de manera

horizontal. Finalmente el factor G se calcula a partir de la ecuación 3.2:

(3.2)

Las diferencias entre IHV con IHH se deben a las propiedades de detección del

sistema (Lakowicz, 1999).

Por último los valores de anisotropía corregidos por la respuesta de sensibilidad

del sistema de detección (rcorr) se calculan de acuerdo con la ecuación 3.3.

(3.3)

3.2. Base teórica de los modelos para corrección por procesos de reabsorción de luz

Para aplicar cada modelo de corrección, los espectros experimentales de emisión

de fluorescencia deben ser corregidos por la respuesta del detector, Ife (�) para luego

corregir los procesos de reabsorción de luz, Ifc (�), usando las diferentes ecuaciones

pertenecientes a cada modelo.

De acuerdo con MG, el espectro experimental se corrige según la ecuación 3.4:

( )( )

)()( λλ

λλ

tr

II

e

fc

f+

= (3.4)

donde r(�) y t(�) se refieren a la reflectancia y la transmitancia de una hoja,

respectivamente. Tanto r(�) como t(�) corresponden a la longitud de onda de emisión.

De la lectura del trabajo original de Gitelson (Gitelson et al., 1998) surge que no

existe base teórica que sustente este modelo el cual es básicamente empírico. El

G IHV

IHH=

G IHV

IHH=

r corr I�- GI�

I�

- 2GI�

=r corr I

�- GI�

I�

- 2GI�

=

63

espectro experimental simplemente se corrige dividiéndolo por la suma de la

reflectancia y la transmitancia de una hoja a cada longitud de onda de emisión.

La corrección propuesta por MG es independiente de la longitud de onda de

excitación. Esto implica un punto débil en el desarrollo del modelo ya que las

propiedades de absorción de luz a la longitud de onda de excitación determinan la

profundidad de penetración de la luz en la hoja y consecuentemente el paso óptico

efectivo que a su vez establece el grado de re-absorción de la luz.

Si la luz de excitación penetra profundamente en la hoja porque es absorbida

débilmente por los pigmentos presentes en ella, esto causará un mayor camino óptico

donde existirá mayor probabilidad de que ocurran procesos de reabsorción y reemisión

de luz. Por el contrario, si la longitud de onda de excitación de la luz que incide sobre

una hoja es absorbida fuertemente por los pigmentos presentes en la superficie, esta luz

penetrará poco en el tejido celular y la fluorescencia originada superficialmente será

reabsorbida en menor proporción que en el caso anteriormente citado (Ramos y

Lagorio, 2004; Cordon y Lagorio, 2006). Sin embargo, de acuerdo con Gitelson el

factor de corrección r� + t� sólo depende de la longitud de onda de emisión y

asombrosamente, dos espectros de fluorescencia de hojas obtenidos a dos longitudes de

onda de excitación diferente deberían ser corregidos dividiéndolos por el mismo factor.

Este es un punto crucial en contra de este modelo.

Por último, la validación de MG se basó en la comparación de los espectros

corregidos según su modelo con los espectros de emisión de fluorescencia de una

solución de clorofila-a diluida. La validez de esta comparación es al menos cuestionable

ya que la emisión de la clorofila-a en hojas está asociada a la emisión de los FSI y FSII.

Es esperable que existan diferencias entre la emisión de la clorofila-a unida a los

fotosistemas con respecto la emisión de la clorofila-a libre en solución. Los entornos del

fluoróforo son diferentes, lo cual modifica los espectros obtenidos y hace prácticamente

incomparables a ambos sistemas (Valeur, 2002).

Gitelson muestra en su trabajo (figura 3.6.B, Gitelson, 1998) que el espectro de

emisión de una hoja corregido por su modelo se asemeja al espectro de una solución

fuertemente diluida de clorofila-a en etanol y sostiene que este resultado esta de acuerdo

con el conocimiento clásico de que la fluorescencia de clorofila-a en hojas in vivo se

origina exclusivamente de la clorofila-a unida al fotosistema II (Rabinowitch y

Govindjee, 1969; Lichtenthaler, 1986). Además sostiene que sólo la posición del

máximo de emisión es diferente (673 nm para clorofila-a en solución de etanol y 685

64

nm en hojas). Sin embargo, en literatura es ampliamente conocido que la emisión de

fluorescencia de hojas corresponde a la emisión de ambos fotosistemas (Pfündel, 1998;

Franck et al., 2002).

Además, según fue publicado previamente en otros trabajos (Pfündel, 1998;

Agati, 2000) la contribución del FSI a la banda ubicada alrededor de 735 nm en el

espectro de fluorescencia inicial puede ser desde un 20% hasta un 50% de acuerdo con

la especie vegetal estudiada y por lo tanto no puede ser despreciada como sugiere

Gitelson.

Para corregir los espectros de acuerdo con MA se utilizan las ecuaciones 3.5 y

3.6:

( ) fIIe

f

c

f ⋅= )(λλ (3.5)

)()(1

1

)(1ln

)(1ln)(

1ln

00

00

00

00

λλλλ

λλ

λλ

λλλλ

trtr

tr

tr

trtrf

++−

−−

+

++

+= (3.6)

donde r�0 y t�0 se refiere a la reflectancia y transmitancia de una hoja respectivamente, a

la longitud de onda de excitación, r� y t� se refiere a la reflectancia y transmitancia de

una hoja, respectivamente, a la longitud de onda de emisión.

El procedimiento de corrección utilizado en MA está basado en una descripción

teórica de la interacción de la luz con la hoja. Esencialmente, el modelo se sustenta en

las siguientes premisas:

(i) considera una capa infinitesimal dentro de la hoja, (ii) el haz de excitación es

atenuado exponencialmente dentro de la hoja, (iii) el haz de fluorescencia generado en

la capa infinitesimal dentro de la hoja es atenuado exponencialmente por la absorción

de luz, (iv) la fluorescencia es emitida isotrópicamente dentro de la hoja, (v) la

dispersión de luz en la hoja se tiene en cuenta al considerar un paso óptico efectivo, (vi)

la perdida de luz lateral es despreciable, (vii) la fracción de radiación no absorbida está

relacionada con los datos experimentales (r� + t�).

La validación de MA se realizó comparando los espectros de emisión corregidos

por reabsorción de hojas de tomate mutantes con la especie silvestre, los cuales difieren

en la concentración de clorofila y en la ultra-estructura de los cloroplastos.

65

Para corregir los espectros de acuerdo con ML se utilizan las ecuaciones 3.7 y

3.8:

( )( )

( )0,λλγ

λλ

e

fc

f

II = (3.7)

( )( )( )2)().(

2)().(1

1

2)(

)(1

1,

00

0

+

++

⋅

++

=

λλ

λλ

λ

λ

λλγ

RFRF

RFRF

RF

RF (3.8)

donde F(R�0) se refiere a la función de remisión a la longitud de onda de excitación y

F(R�) a la función de remisión a la longitud de onda de emisión. �(�, �0) es la función

de corrección aplicada a los espectros experimentales (Ife (�)) para corregirlos por

reabsorción de luz. Notar que � depende de la longitud de onda de excitación y de

emisión.

La función de remisión F(R) se calcula a partir de los datos de reflectancia

difusa de un colchón de hojas de acuerdo con la ecuación 3.9:

( ))(2

)(1)(

2

λ

λ

∞

∞−=

R

RRF (3.9)

donde, R� es la reflectancia de un colchón de hojas (transmitancia cero).

El procedimiento de corrección utilizado en ML al igual que el MA está basado

en una descripción física de la interacción entre la luz con las hojas. Este modelo

considera que las hojas son un sistema que además de absorber luz la dispersan y por lo

tanto se basa en la Teoría de Kubelka-Munk para describirlo (Lagorio et al., 1998).

Esta aproximación consiste en un modelo de dos flujos basado en las siguientes

aproximaciones:

(i) Las hojas se comportan como un dispersor ideal, (ii) la emisión de

fluorescencia es producida en cada elemento de volumen y se descompone en dos flujos

de fotones, los cuales tienen la misma magnitud pero direcciones opuestas.

El modelo fue validado en hojas comparando los espectros de fluorescencia

corregidos por los procesos de reabsorción con los espectros de fluorescencia de una

66

capa delgada de cloroplastos donde los procesos de reabsorción se consideran

despreciables (Ramos y Lagorio, 2004).

De acuerdo con Kubelka-Munk, se consideran dos flujos, el flujo I en la misma

dirección que la luz incidente y el flujo J en la dirección de la luz reflejada. Se

considera que ambos flujos se mueven en direcciones opuestas y perpendiculares a la

superficie irradiada. La atenuación de ambos flujos esta dada por:

dxsxJdxskxIxdI )()()()( ++−= (3.10)

dxsxIdxskxJxdJ )()()()( ++−=− (3.11)

donde k y s son los coeficientes de absorción y de dispersión de la muestra

respectivamente.

Cuando se resuelven las ecuaciones diferenciales (3.10 y 3.11) para una capa de

hojas suficientemente opaca, es decir, cuando la transmitancia es nula, y considerando

además irradiación monocromática se obtiene la ecuación 3.12:

( )s

k

R

RRF =

−=

∞

∞

)(2

)(1)(

2

λ

λ (3.12)

donde R� como ya mencionamos antes, es la reflectancia difusa de un colchón de hojas,

es decir, la relación entre el flujo reflejado en la superficie y el flujo de luz incidente. La

función de remisión relaciona la reflectancia medida con los coeficientes de absorción,

k, y de dispersión, s, de luz (Wendlandt, 1966, Lagorio y San Román, 2002).

La ecuación 3.12 surge de considerar el balance de energía sobre la muestra, en

este caso, sobre las hojas. Se supone que un haz de luz de intensidad I0 incide

directamente sobre la superficie de las hojas produciendo el siguiente balance: I0 = IR +

Ia + IT, donde IR es la intensidad de luz reflejada y dispersada por la hoja, Ia es la

intensidad de luz absorbida por las hojas y IT es la intensidad de luz transmitida por

ellas. Es condición del modelo utilizar un colchón de hojas, que impida la transmitancia

de luz a través de ellas. De esta manera, IT = 0 y Ia = I0 - IR (Lagorio y San Román,

2002).

67

En el trabajo de Lagorio de 1998 se muestra que cuando un fluoróforo se

encuentra en un medio dispersivo, en este caso la clorofila-a en la hoja, la emisión se

produce en cada elemento de volumen. Además, esta emisión también puede ser

descompuesta en dos flujos de fotones (i y j), ver ecuaciones 3.13 y 3.14:

dx

dIfjsisk

dx

di aφλ)(2

1)( +++−= (3.13)

dx

dIfisjsk

dx

dj aφλ)(2

1)( +++−=− (3.14)

donde dIa /dx es el flujo diferencial de fotones absorbidos por la especie emisora, f es la

distribución espectral normalizada de la emisión y φ es el rendimiento cuántico de

fluorescencia verdadero.

Integrando las ecuaciones 3.13 y 3.14 y cumpliendo con las condiciones de

borde: i(�, x = 0) = 0 y j(�, x = �) = 0 se obtiene el flujo primario reemitido de

radiación (ver ecuación 3.15):

),()1()()0,( 000 λλγλφλ λRIfxj −== (3.15)

� (�, �0) ya ha sido definida por la ecuación 3.8. Reordenando la ecuación 3.15 se

obtiene la ecuación 3.16:

)1()(),(

)0,(00

0λλφ

λλγ

λRIf

xj−=

= (3.16)

que muestra el espectro de emisión corregido por procesos de reabsorción, es decir, el

espectro verdadero de las hojas en el miembro izquierdo de la igualdad (Ramos, 2004).

En la parte derecha de la ecuación vemos como se relaciona el espectro verdadero de las

hojas con la distribución espectral normalizada de la emisión, el rendimiento cuántico

de fluorescencia verdadero y la intensidad de luz absorbida por las hojas expresada

como el producto de la intensidad del haz de luz incidente, I0, y la fracción de luz

reflejada (1- R�0) (Lagorio y San Román, 2002; Ramos y Lagorio, 2004). Esta última

parte surge del balance de energía planteado anteriormente.

68

La inclusión de la fluorescencia en el modelo de Kubelka-Munk fue presentada

por primera vez por Lagorio en 1998, desde entonces el modelo de corrección de

reabsorción de fluorescencia ha sido aplicado en numerosos trabajos a sistemas de

colorantes adsorbidos en polvos (Lagorio et al., 2001; Iriel et al., 2002; Mirenda et al.,

2004; Rodriguez et al., 2004). Si bien estos sistemas difieren de las hojas en sus

propiedades ópticas y en la estructura, sirven como ejemplos donde ML resultó efectivo

para corregir procesos de reabsorción de luz en material dispersante.

No obstante, el modelo fue correctamente aplicado y validado en hojas en un

trabajo previo de Ramos y Lagorio en 2004. Además, fue comparado como ya se

mencionó con los otros dos modelos, MG y MA, en un trabajo de Cordon y Lagorio del

2006. Este último trabajo fue elegido tapa de la revista Photochemical and

Photobiological Sciences, lo cual demuestra la relevancia de este tema en el área de la

fotofísica y fotobiología de plantas.


3.3.1. Experimentos preliminares

Las experiencias preliminares se efectuaron sobre hojas intactas. Las hojas se

mantuvieron en oscuridad durante 20 minutos antes de determinar cada espectro de

emisión de fluorescencia (espectrofluorómetro de estado estacionario PTI). La

geometría de medición utilizada fue de “front face”.

Se obtuvieron los espectros de reflectancia para un colchón de hojas a fin de

poder corregir los espectros de emisión de fluorescencia de acuerdo con el modelo de

Lagorio, ecuaciones 3.7 a 3.9. Los espectros de refletancia difusa se determinaron en

función de la longitud de onda utilizando un espectrofotómetro UV 3101 PC, Shimadzu

equipado con una esfera integradora de luz Shimadzu ISR-3100.


corrección

Los experimentos de fluorescencia realizados para la validación de los tres

modelos de corrección por procesos de reabsorción de luz se efectuaron sobre hojas

intactas. Se seleccionaron las hojas de interés en cada caso, las cuales se lavaron con

agua destilada y se secaron con papel absorbente teniendo cuidado de no dañarlas.

69

Luego de mantener las hojas en oscuridad durante 20 minutos se registraron los

espectros de fluorescencia en función de la longitud de onda de emisión con un

espectrofluorómetro de estado estacionario PTI (Photon Technology International),

desde 600 a 800 nm. Los espectros de fluorescencia se corrigieron por la respuesta de

sensibilidad del detector por medio de una función incluida en el software del

espectrofotómetro. Se obtuvieron espectros de emisión de fluorescencia de hojas

individuales para aplicar los modelos de Agati y de Gitelson y los espectros de emisión

de fluorescencia de un colchón de hojas para aplicar el modelo de Lagorio (ver sección

3.2. Base teórica de los modelos para corrección por procesos de reabsorción de

luz).

La geometría de medición utilizada en todos los casos fue una geometría “front

face”, es decir, la muestra se ubicó en un ángulo de 30° con respecto al detector. La

longitud de onda de excitación se mantuvo constante en 460 nm, el monocromador de

excitación se ajustó con un ancho de rendija de 1 nm mientras que el ancho de rendija

del monocromador de emisión se mantuvo suficientemente abierto para obtener una

señal apreciable. El flujo de fotones de excitación fue menor a 20 µmol m-2 s-1 de

manera tal que todos los aceptores de electrones en las unidades fotosintéticas

estuvieran abiertos, y se evitó de ese modo la inducción de la cinética de fluorescencia

o cinética de Kautsky. Todos los espectros se registraron a temperatura ambiente.

Para cada especie estudiada se determinó el contenido de clorofila-a y clorofila-

b, para ello se pesaron aproximadamente 0.4 g de hojas y se molieron en un mortero con

5 ml de acetona 80% v/v. La suspensión obtenida se filtró por succión y el residuo se

trató nuevamente con acetona 80% v/v hasta que se extrajo toda la clorofila del filtrado.

Se determinó la absorbancia de la solución en función de la longitud de onda utilizando

un espectrofotómetro UV 160A Shimadzu. Por último, se calculó la concentración de la

clorofila-a (Clor a) y clorofila-b (Clor b) a partir de las absorbancias medidas, usando

las siguientes ecuaciones (Lichtenthaler y Wellburn, 1983):

Clor a (µg ml-1) = 12.21*A663 - 2.81*A646 (3.17)

Clor b (µg ml-1) = 20.03*A646 - 5.03*A663 (3.18)

donde A� es la absorbancia a la longitud de onda �.

70

También se determinó el contenido de humedad pesando hojas antes y después

de secarlas 72 horas a 70°C en una estufa. Luego se secarlas en la estufa las hojas se

colocaron en un desecador para enfriarlas (Gausmann y Allen, 1973).

Por último, se registraron los espectros de reflectancia difusa de hojas

individuales y de colchones de hojas y los espectros de transmitancia difusa de hojas en

función de la longitud de onda con un espectrofotómetro UV 3101 PC, Shimadzu

equipado con una esfera integradora de luz Shimadzu ISR-3100. Para ajustar el 100%

de reflectancia se utilizó sulfato de bario como estándar de referencia. Los espectros de

reflectancia y transmitancia de hojas individuales se utilizaron para corregir los

espectros de emisión de fluorescencia de una sólo hoja. De acuerdo con el trabajo de

Gitelson se utilizó la ecuación 3.4 y para corregir la reabsorción de los espectros de

emisión de acuerdo con el trabajo de Agati se utilizaron las ecuaciones 3.5 y 3.6. Los

espectros de reflectancia difusa de colchones de hojas se utilizaron para corregir los

espectros de fluorescencia por reabsorción de luz de acuerdo con el modelo desarrollado

por Lagorio, ecuaciones 3.7 a 3.9 (sección 3.2. Base teórica de los modelos para

corrección por procesos de reabsorción de luz).

Las mediciones de reflectancia, transmitancia, fluorescencia y las extracciones

de pigmentos se realizaron dentro de las 5 horas posteriores a la escisión de las hojas de

las plantas.


Las suspensiones acuosas de hojas se prepararon modificando ligeramente el

procedimiento descripto originalmente por Weis en su trabajo de 1984. En primer lugar

se obtuvo el espectro de reflectancia de la hoja a partir de la cual se deseaba preparar la

suspensión diluida. Con el valor de reflectancia a 700 nm (colchón de hojas) se calculó

la función de remisión a esa longitud de onda y utilizando la correlación lineal hallada

entre el contenido de clorofila total con los valores de F(R) se determinó la

concentración de clorofila total de esa hoja (Tabla 2.1 de la sección 2.4.2.

Correlaciones entre el contenido de pigmentos y el contenido de agua de las hojas

con la función de remisión a longitudes de onda específicas del Capítulo 2 de esta

tesis).

Se cortó un cuadrado de 1 cm2 de hoja el cual se colocó en un mortero

previamente enfriado con nitrógeno líquido. Se agregó nitrógeno hasta cubrir totalmente

el pedacito de hoja. Luego se procedió a moler el material vegetal congelado, se agregó

71

1 ml de agua destilada para homogeneizar el polvo de hojas. Finalmente, de acuerdo con

los valores obtenidos de concentración de clorofila total calculados a partir de los

valores de F(R) y teniendo en cuenta el área de tejido vegetal utilizado (1 cm2) se

agregó la cantidad de agua necesaria para obtener una suspensión aproximada de 7 µM.

Ésta concentración es suficientemente baja para evitar procesos de reabsorción (Weis,

1985, Pfündel, 1998). Adicionalmente, se comprobó con un espectrofotómetro que la

absorbancia de las suspensiones preparadas no superara el valor de 0.05. De esta manera

se aseguró una suspensión suficientemente diluida.

Para determinar la emisión de fluorescencia de la suspensión de hoja depositada

en placa de cuarzo simplemente se introdujo un pincel en la suspensión de hoja con el

que se extendió delicadamente la suspensión sobre las placas de cuarzo como si se

estuviera pintando sobre ellas. Se tuvo especial cuidado en lograr una capa delgada y

homogénea sobre el cuarzo.

Tanto la suspensión diluida de hoja como la suspensión de hoja depositada en

placa se mantuvieron en oscuridad durante 20 minutos antes de registrar cada espectro

de emisión de fluorescencia.


Se realizaron mediciones de anisotropía de fluorescencia sobre hojas intactas,

suspensión de cloroplastos aislados, suspensión de hoja acuosa muy diluida y sobre la

suspensión diluida depositada sobre placas de cuarzo. Para realizar estas

determinaciones se utilizó el espectrofluorómetro de estado estacionario (PTI (Photon

Technology International). Las mediciones de emisión de fluorescencia sobre hoja

intacta y sobre suspensión de hoja depositada en placa de cuarzo se realizaron utilizando

geometría “front face”, la emisión de fluorescencia de la suspensión de efectuó en una

celda de 1 cm de paso óptico utilizando la geometría usual de forma de “L” (el detector

a 90° respecto del monocromador de excitación). En todos los casos se utilizaron dos

polarizadores ubicados a la salida del monocromador de excitación y a la entrada del

monocromador de emisión (ver figura 3.5), ambos polarizadores forman parte de los

accesorios provistos en el equipamiento utilizado. Los valores de anisotropía (rcorr) se

calcularon mediante el empleo de la ecuación 3.3 utilizando el software del

espectrofluorómetro PTI.

72


3.4.1. Experimentos preliminares

Antes de realizar las mediciones de fluorescencia definitivas fue necesario

realizar experiencias preliminares para poner a punto las condiciones de medición de los

espectros de emisión de fluorescencia de hojas enteras.

Para comenzar, fue necesario definir un ancho de ranura tal, en el

monocromador de excitación y en el monocromador de emisión, que permitiera obtener

una buena intensidad en la señal, es decir, una señal del orden de 1 x 104 cuentas de

fluorescencia o mayor (en unidades arbitrarias). Pero además de obtener una señal

adecuada era necesario evitar la inducción de la fluorescencia, por lo tanto, se requirió

de un flujo de fotones menor a 20 µmol m-2 s-1.

Para identificar las condiciones adecuadas en los monocromadores se obtuvieron

los espectros de emisión de fluorescencia barriendo desde los 600 nm hasta los 800 nm

manteniendo un ancho de ranura fijo de 24 nm en el monocromador de emisión y

fijando el monocromador de excitación en 1 nm, 2 nm, 3 nm ó 4 nm. Antes de barrer

cada espectro las hojas permanecieron en oscuridad durante 20 minutos.

Por otro lado, como ya se mencionó en el punto 3.2. (Base teórica de los

modelos para corrección por procesos de reabsorción de luz), es importante definir

correctamente la longitud de onda de excitación ya que la luz de distintas longitudes de

onda interactúa de manera diferente con el sistema. Para obtener la longitud de onda

adecuada para excitar a las hojas, se barrieron espectros de emisión de fluorescencia

excitando desde 400 nm hasta los 620 nm. Se eligió la longitud de onda de excitación a

460 nm porque de esa manera se obtenía el mejor espectro de emisión (mayor

intensidad y menor ruido). Nuevamente, se mantuvieron a las hojas en oscuridad por 20

minutos antes de cada medición.

3.4.1.1. Variación de la relación Fred/Ffar-red con la intensidad de la luz de excitación

La intensidad de los espectros de fluorescencia de hojas aumentó a medida que

se incrementó de intensidad de la luz de excitación (figura 3.6). La relación de picos

también se incrementó con el flujo fotónico de irradiación. Sin embargo las relaciones

entre los máximos de fluorescencia no cambiaron para 1 o 2 nm de ancho de banda.

Las condiciones apropiadas de medición sólo se mantienen con 1 o 2 nm en el

ancho de ranura del monocromador de excitación. Para mayores aperturas de rendija las

73

distribuciones espectrales no se mantienen constantes en el tiempo (con 3 nm ó 4 nm se

induce la cinética de fluorescencia). En ese caso, los aceptores de electrones no se

encuentran todos en las mismas condiciones y por lo tanto responden de manera disímil

modificando la distribución espectral de fluorescencia de manera aleatoria. La figura 3.7

muestra los espectros de emisión de fluorescencia normalizados a 737 nm para lograr

una comparación visual más rápida.

Se decidió entonces obtener los espectros de emisión de fluorescencia de hojas

fijando el ancho de ranura del monocromador de excitación en 1 nm o 2 nm y el del

monocromador de emisión en 24 nm ya que con esta configuración se pudieron obtener

distribuciones espectrales de fluorescencia invariables en el tiempo. De esta manera se

pudo asegurar una intensidad en el flujo fotónico suficientemente baja para evitar la

inducción de la cinética de Kautsky.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2e+7

4e+7

6e+7

8e+7

1e+8

1 nm 2 nm3 nm 4 nm

Figura 3.6. Espectros de emisión de fluorescencia de hojas obtenidos con distintos

anchos de rendija en el monocromador de excitación (1, 2, 3 y 4 nm)

74


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

1 nm2 nm3 nm4 nm

Figura 3.7. Espectros de emisión de fluorescencia de hojas excitados con diferente

ancho de rendija (1, 2, 3 y 4 nm). Espectros normalizados a 737 nm

3.4.1.2. Cambios en los espectros de hojas excitados a diferentes longitudes de onda

Se obtuvieron espectros de emisión fluorescente de hojas a distintas longitudes

de onda de excitación. Como ejemplos se muestran los espectros a tres longitudes de

onda de excitación en la figura 3.8. Los espectros se muestran normalizados a fin de

lograr una fácil visualización de los resultados.

Se eligió finalmente 460 nm como longitud de onda de excitación para las

experiencias de la tesis ya que el máximo de absorción de la clorofila-a en hojas se

ubica en esa región del espectro electromagnético. Además esa longitud de onda

permitió la obtención de espectros con buena intensidad de señal.

75


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Excitación a 460 nmExcitación a 520 nmExcitación a 600 nm

Figura 3.8. Espectros de emisión de fluorescencia de hojas excitados a diferentes

longitudes de onda. Espectros normalizados a 737 nm


corrección

La figura 3.9 más abajo, muestra los espectros de hojas de Gardenia jasminoides

experimentales corregidos por la respuesta del detector y los mismos espectros

corregidos por los tres modelos, hay que tener en cuenta que en el caso de MG y MA

tanto los espectros de fluorescencia como los espectros de reflectancia y transmitancia

utilizados para corregir pertenecen a una sola hoja, mientras que los espectros de

emisión de fluorescencia y los espectros de reflectancia utilizados por el ML

corresponden a un colchón de hojas. Los resultados obtenidos para las otras especies

resultaron similares pero no se muestran (Ficus benjamina, Citrus aurantium,

Ligustrum vulgare e Hydrangea macrophylla).

76

0

10

20

30

40

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

5


600 650 700 750 8000

2

4

6

8

10

MG

MA

ML

Figura 3.9. Espectro de emisión de fluorescencia de hojas de Gardenia jasminoides.

Espectros experimentales corregidos por la respuesta del detector ( ) y espectros

corregidos por re-absorción de luz de acuerdo con MG ( ), MA ( ) y ML ( ).

Excitación a 460 nm

Según lo esperado, observamos que usando cualquiera de los tres modelos F685

aumenta más que F737 luego de la corrección. La relación experimental F685/F737 es

menor que uno, luego de corregir por reabsorción esta relación es mayor que la unidad.

Este comportamiento fue encontrado para todas las especies estudiadas y para los tres

métodos de corrección aplicados.

77

Para comparar los resultados obtenidos con los diferentes modelos en la relación

Fred/Ffar-red, las siguientes figuras muestran los espectros corregidos por los tres modelos

simultáneamente y normalizados a 737 nm para todas las especies estudiadas: Figura

3.10 Ficus benjamina, Figura 3.11 Hedera helix, Figura 3.12 Gardenia jasminoides,

Figura 3.13 Citrus aurantium, Figura 3.14 Ligustrum vulgare y Figura 3.15 Hydrangea

macrophylla.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10

12

14

corregido por MLcorregido por MAcorregido por MG

Figura 3.10. Espectro de emisión de fluorescencia de Ficus benjamina corregido por los

tres modelos. Espectros normalizados a 737 nm

78


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10


Figura 3.11. Espectro de emisión de fluorescencia de Hedera helix corregido por los tres

modelos. Espectros normalizados a 737 nm


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20


Figura 3.12. Espectro de emisión de fluorescencia de Gardenia jasminoides corregido

por los tres modelos. Espectros normalizados a 737 nm

79


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10

12

14


Figura 3.13. Espectro de emisión de fluorescencia de Citrus aurantium corregido por

los tres modelos. Espectros normalizados a 737 nm


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10

12

14


Figura 3.14. Espectro de emisión de fluorescencia de Ligustrum vulgare corregido por

los tres modelos. Espectros normalizados a 737 nm

80


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8


Figura 3.15. Espectro de emisión de fluorescencia de Hydrangea macrophylla corregido

por los tres modelos. Espectros normalizados a 737 nm

Las figuras 3.10 a 3.15 muestran los espectros corregidos por reabsorción para

las distintas especies, los gráficos se normalizaron a 737 nm para mostrar

explícitamente como la elección de uno u otro modelo afecta la relación de máximos

Fred/Ffar-red. A partir de estas figuras pudimos observar que los resultados producidos por

MG son totalmente diferentes de los resultados producidos por MA y ML. Además,

pudimos observar que MA y ML producen resultados similares para especies que

difieren en sus propiedades ópticas y en su concentración de clorofila. Por último,

pudimos notar que los valores de las relaciones Fred/Ffar-red obtenidos con MA son un

poco inferiores a los valores predichos por ML en todos los casos.

Las diferencias observadas entre los tres modelos se deben a las discrepancias

existentes en la teoría subyacente a cada uno de ellos. Estas diferencias fueron

descriptas y analizadas más arriba (sección 3.2. Base teórica de los modelos para

corrección por procesos de reabsorción de luz) pero hay otros puntos que discutir, los

cuales serán tratados aquí. Por ejemplo, un punto interesante para ser comparado es el

hecho que los valores experimentales de la relación Fred/Ffar-red obtenidos antes de la

corrección por los procesos de reabsorción son diferentes en los manuscritos originales

81

usando MG, MA y ML. En el trabajo original de Gitelson los valores experimentales de

Fred/Ffar-red están en el rango de 1 a 2.2 para una longitud de onda de excitación de 430

nm. En los artículos de Agati y Lagorio, las relaciones experimentales son de alrededor

de 0.6 a 0.8. Estas diferencias pueden deberse a diferencias en el flujo fotónico que

incide sobre la hoja en cada en caso. Lichtenthaler y colaboradores reportaron en sus

trabajos de 1987 y 1992 (Lichtenthaler y Buschmann, 1987 y Szabó et al., 1992) que la

relación de máximos de fluorescencia cambia durante el aumento y el descenso de la

cinética de Kautsky. Por lo tanto, sólo es posible realizar una correcta comparación bajo

condiciones estables bien definidas.

En MG, se utilizó una apertura en la rendija del monocromador de excitación de

15 nm, mientras que en ML se utilizó una amplitud de la rendija de 1 nm. En MA y ML,

el flujo de fotones para la excitación fue mantenido más bajo que 20 µmol m-2 s-1. En

GM, no hay indicaciones del flujo fotónico utilizado pero es un punto importante a ser

controlado en los experimentos para obtener los espectros de fluorescencia iniciales de

hojas (F0).

Otros factores pueden afectar el valor experimental de Fred/Ffar-red, como las

diferencias en la concentración de clorofila en las especies utilizadas en cada trabajo

original o diferencias en la longitud de onda de excitación. En el trabajo original de

Gitelson et al. se excitó a las hojas a 430 nm, en el de Agati et al. se utilizó 458 nm

como longitud de onda de excitación y en el trabajo de Cordon y Lagorio se utilizó luz

de 460 nm.

La tabla 3.1 presenta los valores de clorofila-a, clorofila-b, la relación clorofila

a/b y el contenido de agua para las distintas especies estudiadas. Los errores se

calcularon de la desviación estándar resultante de tres determinaciones.

Tabla 3.1. Contenido de pigmentos y de agua de las hojas estudiadas

Especies Contenido de agua Clor a Clor b Clor a/Clor b

(%) (mg/g) (mg/g) (mg/g)

Ficus benjamina 63.5 ± 0.7 13.2 ± 0.2 3.6 ± 0.1 3.60

Hedera helix 56.4 ± 0.9 18.0 ± 0.2 6.6 ± 0.1 2.70

Gardenia jasminoides 62.7 ± 0.8 19.1 ± 0.2 7.3 ± 0.1 2.58

Citrus aurantium 44.9 ± 0.9 24.1 ± 0.3 7.2 ± 0.2 3.40

Hydrangea macrophylla 80.0 ± 1.5 29.2 ± 0.5 13.5 ± 0.4 2.16

Ligustrum vulgare 52.9 ± 1.0 18.7 ± 0.2 6.5 ± 0.1 2.89

82

La tabla 3.2 muestra los valores de los coeficientes de absorción y de dispersión

de luz además de las relaciones de máximos de fluorescencia corregidas por los tres

modelos. Los errores en k y s surgen de la desviación resultante luego de medir siete

veces los valores de reflectancia y transmitancia de una hoja simple. Los errores

calculados para las relaciones Fred/Ffar-red se estimaron midiendo siete espectros para un

mismo conjunto de hojas o para una sola hoja dependiendo del modelo aplicado. La

máxima dispersión en la relación Fred/Ffar-red experimental (obtenida de siete espectros

medidos) fue de alrededor de 10% en todos los casos. El error en los factores de

corrección calculados se consideraron despreciables comparados con la variabilidad de

la fluorescencia. Este hecho produjo un error relativo del porcentaje de 10% para las

relaciones Fred/Ffar-red corregidas. En este caso particular Fred = F685, es decir, el máximo

de fluorescencia a 685 nm, mientras que Ffar-red = F737 corresponde al máximos de

fluorescencia a 737 nm.

Tabla 3.2. Parámetros ópticos de las hojas estudiadas

Especies k s F685/F737 MG F685/F737 MA F685/F737 ML

Ficus benjamina 1.30 ± 0.07 0.26 ± 0.03 13 ± 1.3 1.41 ± 0.14 2.04 ± 0.20

Hedera helix 1.41 ± 0.07 0.40 ± 0.04 9 ± 0.9 1.54 ± 0.15 2.34 ± 0.23

Gardenia jasminoides 1.45 ± 0.06 0.22 ± 0.02 19 ± 1.9 1.69 ± 0.17 2.10 ± 0.21

Citrus aurantium 1.43 ± 0.05 0.36 ± 0.03 12 ± 1.2 1.51 ± 0.15 2.40 ± 0.24

Hydrangea macrophylla 1.09 ± 0.08 0.16 ± 0.02 6.7 ± 0.7 1.02 ± 0.10 1.51 ± 0.15

Ligustrum vulgare 1.76 ± 0.09 0.24 ± 0.04 11 ± 0.1 1.35 ± 0.13 2.00 ± 0.20

Los siguientes gráficos muestran la relación Fred/Ffar-red obtenida por los tres

modelos en función de los coeficientes de absorción, Figura 3.16, en función de los

coeficientes de dispersión, Figura 3.17, y en función del contenido de clorofila total,

Figura 3.18.

83

k

1.0 1.2 1.4 1.6 1.8

F 685

/ F 7

37

0

5

10

15

20

25

Figura 3.16. Relación Fred/Ffar-red obtenida por los tres modelos en función de los

coeficientes de absorción (k). MG (�), MA (�) y ML (�)

k vs AM k vs LM k vs GM

s

0.1 0.2 0.3 0.4 0.50

5

10

15

20

25

F 685

/ F 7

37

Figura 3.17. Relación Fred/Ffar-red obtenida por los tres modelos en función de los

coeficientes de dispersión (s). MG (�), MA (�) y ML (�)

84

Concentración de clorofila total (ug/cm2)

15 20 25 30 35 40 450

5

10

15

20

25

F 685

/ F 7

37

Figura 3.18. Relación Fred/Ffar-red obtenida por los tres modelos en función del contenido

de clorofila total. MG (�), MA (�) y ML (�)

Las figuras 3.16, 3.17 y 3.18 muestran que las relaciones de fluorescencia

predichas por el MA y por el ML son muy similares para diferentes valores de

coeficientes de absorción, coeficientes de dispersión y concentraciones de clorofila

total. En forma opuesta, el MG no puede eliminar adecuadamente la dependencia de las

relaciones Fred/Ffar-red corregidas con el contenido de clorofila total y con los parámetros

ópticos. El análisis de este comportamiento es que MG sobreestima la relación Fred/Ffar-

red corregida.

Los errores relativos son de alrededor del 10% para todos los resultados, sin

embargo, en las figuras 3.16 a 3.18 se graficaron los errores absolutos, por lo tanto las

variaciones en los datos producidos por MG parecen mayores debido a que los valores

de los errores absolutos son mayores para las relaciones Fred/Ffar-red derivadas a partir de

este modelo.

Los resultados obtenidos del MA son siempre ligeramente inferiores a los

resultados obtenidos con el ML. Si bien en nuestro trabajo (Cordon y Lagorio, 2006) no

se pudo encontrar ninguna correlación entre la magnitud de las diferencias con los

parámetros medidos para cada planta: contenido de agua, concentraciones de pigmentos

y con los parámetros ópticos (k y s) para ambos métodos, en general, la aproximación

de Agati (MA) subestima marginalmente la relación de máximos de fluorescencia

comparada con el ML. Mientras que MA considera la luz de excitación viajando en una

85

sola dirección y la luz de emisión en la dirección opuesta, el ML considera la

posibilidad de ambas direcciones ya sea para la luz de excitación y para la emisión de

luz dentro de la hoja (modelo de dos flujos).

3.4.2.1. Análisis de la influencia de la emisión de fluorescencia en los datos de

reflectancia y transmitancia usados para corregir la relación de fluorescencia Fred/Ffar-red

Es importante analizar cómo la emisión de la banda ubicada en el rojo puede

afectar las mediciones de reflectancia y la transmitancia que son usadas para corregir los

datos experimentales de fluorescencia por reabsorción de luz y consecuentemente cómo

la emisión en el rojo podría afectar finalmente a la relación corregida Fred/Ffar-red.

La influencia de la emisión roja en los valores de reflectancia y transmitancia a

la longitud de onda de excitación (460 nm) fue completamente despreciable en todas las

experiencias realizadas. De hecho, cuando se registran los valores de reflectancia y

transmitancia en la región azul, el detector no sólo recibe luz azul reflejada o trasmitida

sino que también recibe luz fluorescente roja. Debido a que el detector del

espectrofotómetro presenta una muy baja sensibilidad para la luz roja comparada con la

luz azul (sensibilidad a la luz roja/sensibilidad a la luz azul � 0.1), es posible considerar

al detector casi ciego a la fluorescencia roja bajo estas condiciones. En contraste, la

emisión roja puede afectar los datos de reflectancia y transmitancia entre 650 y 800 nm.

Para estimar el error introducido por la emisión en los valores de reflectancia y

transmitancia se utilizaron resultados previamente publicados por Zarco-Tejada y

colaboradores y por Buschmann y colaboradores (Zarco-Tejada et al., 2000 y

Buschmann et al., 1994).

De acuerdo con estos trabajos, los valores de reflectancia y transmitancia a 680

nm pueden verse afectados en un 18% (en exceso) mientras que la reflectancia a 737 nm

puede ser afectada en alrededor de un 8% (en exceso). Estos datos representan un error

máximo de alrededor de un 2 y un 2.4% para la relación Fred/Ffar-red corregida por el

modelo de Agati y por el modelo de Lagorio, respectivamente. Para la relación Fred/Ffar-

red corregida por el modelo de Gitelson el error podría alcanzar un 32%. La tabla 3.3

muestra en detalle la influencia de la fluorescencia en la relación Fred/Ffar-red corregida

por reabsorción.

86

Tabla 3.3. Porcentaje de error estimado en la relación Fred/Ffar-red corregida por

reabsorción debido a la presencia de fluorescencia roja en los valores de reflectancia y

transmitancia.

Porcentaje de error estimado en Fred/Ffar-red debido a la fluorescencia roja (%)

Especie

Modelo de Gitelson

Modelo de Agati

Modelo de Lagorio

Ficus benjamina 28 0.6 2.4

Hedera helix 16 2.0 1.6

Gardenia jasminoides 32 0.3 2.2

Citrus aurantium 25 2.0 0.3

Hydrangea macrophylla 20 0.9 0.2

Ligustrum vulgare 26 2.0 0.3

En la tabla 3.3 se puede ver que cuando se utilizan para corregir los modelos de

Agati o de Lagorio, la emisión de fluorescencia en los datos de reflectancia y

transmitancia es despreciable dado que el error introducido es menor que el error

experimental en las medidas de fluorescencia (10-15%). El error introducido por la

emisión de fluorescencia en los datos de reflectancia y transmitancia es importante si se

aplica el modelo de corrección de Gitelson. Sin embargo, es necesario notar que la

corrección de los datos de reflectancia y transmitancia por la emisión de luz roja es

incapaz de explicar las diferencias halladas en las relaciones Fred/Ffar-red corregidas por

los modelos de Gitelson, Agati o Lagorio.


Para evaluar los espectros de emisión de fluorescencia de sistemas en ausencia

de reabsorción se preparó una suspensión acuosa de hoja muy diluida. En este caso se

utilizaron hojas de Ficus benjamina.

3.4.3.1. Suspensión de hoja

En la figura 3.19 se presenta el espectro de emisión de fluorescencia de la

suspensión diluida de hoja.

87


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

5

Suspensión de hoja

Figura 3.19. Espectro de emisión de fluorescencia de una suspensión acuosa diluida de

hoja de Ficus benjamina. El espectro se muestra normalizado a 737 nm

3.4.3.2. Suspensión de hoja depositada

En la figura 3.20 se presenta el espectro de emisión de fluorescencia para un

colchón de hojas corregido por procesos de reabsorción y de reemisión de luz utilizando

el modelo de Lagorio (Lagorio et al. 1998) junto con el espectro de emisión de

fluorescencia de la suspensión de hoja depositada sobre una placa de cuarzo. La

suspensión depositada proviene de la misma suspensión diluida cuyo espectro de

fluorescencia se muestra en la figura 3.19. En esta figura también se incluyó el espectro

de emisión de fluorescencia experimental, es decir, no corregido por procesos de

reabsorción de luz para mostrar la magnitud de la corrección efectuada.

88


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Emisión hoja sin corregirEmisión hoja corregidoSuspensión de hoja depositada

Figura 3.20. Espectros de emisión de fluorescencia de un colchón de hojas sin corregir y

corregido por reabsorción de luz, y de una suspensión de hoja depositada sobre una

placa de cuarzo. Los tres espectros se muestran normalizados a 737 nm

La emisión fluorescente de la suspensión diluida de hoja depositada sobre una

placa de cuarzo coincide dentro del error experimental con el espectro de emisión de

fluorescencia de hojas corregido de acuerdo con la ecuaciones 3.10 a 3.12. El mismo

comportamiento se observó para los cloroplastos aislados y depositados sobre una placa

de cuarzo cuando se comparaba su fluorescencia contra el espectro de emisión corregido

por reabsorción de hojas (Ramos y Lagorio, 2004). Por lo tanto, una suspensión

suficientemente diluida de hoja y depositada sobre una placa de cuarzo también podría

servir como sistema ideal (ausencia de reabsorción) para validar la aplicabilidad de

modelos de corrección por reabsorción de luz.

Sin embargo, la emisión de la suspensión depositada sobre la placa de cuarzo es

de baja intensidad y provoca como consecuencia una magnificación del ruido,

especialmente a longitudes de onda largas, cuando se la normaliza y compara con la de

hojas intactas.

Resulta llamativa la diferencia observada en la relación de máximos de

intensidad entre la suspensión diluida de hoja y la misma suspensión depositada sobre

89

una placa de cuarzo. A partir de las figuras 3.19 y 3.20 es posible determinar que la

relación Fred/Ffar-red para la suspensión diluida de hoja presenta un valor de 4.20 mientras

que la relación de máximos Fred/Ffar-red para la misma suspensión de hoja depositada es

de 2.01 (Fred/Ffar-red para el espectro de emisión de la hoja entera corregida por

reabsorción es de 2.04). Esta misma discrepancia entre suspensión diluida y suspensión

depositada sobre placa de cuarzo se encontró para la especie: Schefflera arboricola

variegata, ver la sección 4.B. Estudio de las propiedades ópticas de hojas variegadas

del Capítulo 4 de esta tesis. Hasta el momento no se ha podido encontrar una respuesta

a las diferencias observadas.

La relevancia de investigar esta diferencia radica en la importancia que poseen

estos sistemas libres de reabsorción en la validación de los modelos de corrección por

procesos de reabsorción y reemisión de luz.


Se obtuvieron los valores de anisotropía corregidos por la sensibilidad del

detector (rcorr) de acuerdo con la ecuación 3.3 en función de la longitud de onda de

emisión desde los 600 nm y hasta los 800 nm. Sin embargo, sólo se informan los

valores de rcorr alrededor de los máximos de emisión de fluorescencia. Para hojas, entre

680 y 690 nm el valor promedio de rcorr es de 0.017 ± 0.005, mientras que el valor

promedio de rcorr entre 730 y 740 es de 0.016 ± 0.005. De acuerdo con estos resultados

es posible concluir que en hojas no existe polarización de la fluorescencia.

Adicionalmente, se calculó la relación de máximos de intensidad de

fluorescencia (Fred/Ffar-red) para los diferentes arreglos de polarizadores, dichas

relaciones se muestran a continuación en la tabla 3.4. En cada arreglo, ambos valores de

ángulos corresponden a la orientación de los polarizadores respecto del eje Z, ver figura

3.5.

Tabla 3.4. Valores de Fred/Ffar-red para los distintos arreglos de polarizadores de

excitación y emisión.

Arreglo de los polarizadores Fred/Ffar-red 0° - 0° 0.499 ± 0.078 0° - 90° 0.447 ± 0.082 90° - 0° 0.454 ± 0.080 90° - 90° 0.407 ± 0.086 0° - 54,7° 0.459 ± 0.071

90

El valor de la relación de máximos de intensidad Fred/Ffar-red sin utilizar

polarizadores es 0.487 ± 0.084 por lo que puede considerarse que esta relación no

depende de la polarización dentro del error experimental. De acuerdo con este resultado,

las mediciones de fluorescencia de hojas son independientes de la anisotropía y por lo

tanto es posible efectuar las determinaciones de fluorescencia sin la necesidad de

utilizar polarizadores (Fixler et al., 2006).

Además de las mediciones de anisotropía de fluorescencia en hojas se realizaron

mediciones de este tipo en una suspensión diluida de hoja y sobre la misma suspensión

depositada sobre una placa de cuarzo. El objetivo de estas medidas fue determinar si las

diferencias halladas en la relación Fred/Ffar-red de estos sistemas se debe a algún tipo de

artefacto producto de diferencias en la anisotropía de los sistemas.

El valor de anisotropía promedio, para una suspensión diluida de hoja entre 680

y 690 nm es de 0.077 ± 0.017, mientras que el valor promedio entre 730 y 740 nm es de

0.008 ± 0.041. De acuerdo con estos resultados no existe polarización en las

suspensiones de hojas.

Por otro lado, el valor de anisotropía entre 680 y 690 nm para la misma

suspensión diluida de hoja depositada sobre una placa de cuarzo es de 0.124 ± 0.015 y

para el intervalo comprendido entre 730 y 740 nm es de 0.295 ± 0.029. En este último

sistema se observa entonces un grado de polarización a tener en cuenta para evitar

interpretaciones incorrectas de los espectros de fluorescencia. En bibliografía se ha

encontrado que a mayor valor de anisotropía mayor es la distorsión en las medidas de

fluorescencia (Fixler et al., 2006). Sin embargo, existen relaciones matemáticas entre la

intensidad de fluorescencia detectada (obtenida experimentalmente) y la intensidad de

fluorescencia total en función de la anisotropía lo que permitiría considerar la influencia

de esta última en las mediciones de fluorescencia. El trabajo de Fixler y colaboradores

proponen una dependencia entre la fluorescencia medida y la fluorescencia total aún en

ausencia de polarizadores. Suponiendo este caso para evaluar la relación de máximos de

fluorescencia en la suspensión depositada sobre placa de cuarzo obtenemos la ecuación

3.17.

( )( )red

redfar

redfar

red

redfar

red

r

r

Fmedida

Fmedida

Ftotal

Ftotal

−

−=

−

−− 4

4 (3.17)

91

Reemplazando en la ecuación 3.17 la relación de máximos obtenida sin utilizar

polarizadores (F medidared/F medidafar-red = 0.801 ± 0.091) y los valores de anisotropía

informados más arriba, se obtiene una relación de máximos de fluorescencia total de

0.766 ± 0.084. El valor de fluorescencia total y el valor medido de fluorescencia de la

suspensión depositada se encuentran dentro del error experimental y por lo tanto es

posible concluir que no hay artificios en la distribución espectral de fluorescencia

debidos a anisotropía en ninguno de los tres sistemas estudiados: hojas intactas,

suspensión de hoja diluida y suspensión de hoja depositada sobre placa de cuarzo.

3.5. Conclusiones

Los valores de la relación Fred/Ffar-red obtenidos a partir de los espectros de

emisión corregidos por el MG difieren apreciablemente de aquellos obtenidos por el

MA y por el ML en todos los casos estudiados.

Los espectros corregidos por MA y ML son relativamente cercanos entre si y

producen valores similares en la relación Fred/Ffar-red. Ambos métodos poseen bases

teóricas aceptables y presentan adecuados métodos de validación. Sin embargo, se

encuentra que la elección del MA o del ML para corregir los espectros de emisión de

fluorescencia dependerá de la posibilidad de obtener espectros de una sola hoja o de un

grupo de hojas. Si se utiliza una hoja sola, entonces el MA es recomendado frente al

MG. Si es posible trabajar con un colchón de hojas apiladas, entonces se propone el ML

como la mejor opción a utilizar.

Aún no se ha podido hallar una respuesta definitiva a las diferencias encontradas

entres los espectros de emisión de fluorescencia de una suspensión de hoja diluida y la

misma suspensión de hoja depositada sobre una placa de cuarzo. Estas distorsiones

podrían deberse a infiltración de agua pero aún queda mucho por investigar en este tema

relevante relacionado con el espectro verdadero de las hojas.

Las mediciones de anisotropía de fluorescencia en hojas permiten concluir que la

emisión de fluorescencia de las hojas se encuentra despolarizada. Por lo tanto, es

posible efectuar mediciones de fluorescencia sobre ellas sin necesidad de utilizar

polarizadores para evitar artefactos debidos a anisotropía.

Las mediciones de anisotropía de fluorescencia de una suspensión de hoja

mostraron dispersión isotrópica de la luz. En la suspensión depositada en placa se

encontró anisotropía. No obstante, se pudo demostrar que esa anisotropía no es

92

responsable de distorsiones en la relación de máximos de fluorescencia. De esta manera

se descarta a la anisotropía como posible causa de las diferencias encontradas en la

relación de máximos de intensidad de fluorescencia entre ambos sistemas libres de

reabsorción.

3.6. Bibliografía

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97

Capítulo 4.

ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE HOJAS,


98



Sección A

4.A. Propiedades ópticas de las caras adaxial y abaxial de hojas. Fluorescencia de

clorofila, coeficientes de absorción y de dispersión de luz

La sección A de este capítulo surge de un trabajo publicado en la revista

Photochemical and Photobiological Sciences en el año 2007. Este trabajo fue llamado:

Optical properties of de adaxial and abaxial faces of leaves. Chlorophyll fluorescente,

absorption and scattering coefficients (Propiedades ópticas de las caras adaxial y

abaxial de hojas. Fluorescencia de clorofila, coeficientes de absorción y de dispersión de

luz) (Cordon y Lagorio, 2007).

4.A.1. Introducción

Las caras adaxial y abaxial de hojas (cara superior e inferior respectivamente)

muestran diferencias en su comportamiento óptico. Se ha reportado en literatura que

tanto la intensidad de fluorescencia como la relación de máximos de intensidad Fred/Ffar-

red son mayores para la cara abaxial que para la cara adaxial de hojas (Lichtenthaler y

Rinderle, 1988; Lang et al., 1991). El aumento de la fluorescencia en la región del rojo

del espectro electromagnético en la cara inferior de las hojas fue interpretada en

términos del menor contenido de clorofila, mayor cantidad de espacios entre las células

del mesófilo esponjoso y consecuentemente un menor impacto de los procesos de

reabsorción de luz en la cara abaxial (Lang et al., 1991). Más aún, tanto en el trabajo de

Lichtenthaler y Rinderle de 1988 como en el de Lang y colaboradores de 1991, se

atribuyeron los cambios en la relación experimental de Fred/Ffar-red para las diferentes

plantas estudiadas, a diferencias en el contenido de clorofila, lo que representaría

diferentes grados en la magnitud de la reabsorción de luz. Un artículo más actual que el

de Lang (Louis et al., 2006) interpreta las diferencias entre las caras adaxial y abaxial en

términos de la reabsorción y de los procesos de dispersión que tienen lugar dentro de la

hoja. Sin embargo, la distorsión por la reabsorción no fue corregida cuantitativamente

en ninguno de los casos reportados en literatura. Como consecuencia, no fue posible

99

comprobar si los procesos de reabsorción son responsables enteramente de la distorsión

observada.

Debido a la evidencia experimental y a las interpretaciones cualitativas que

aparecen en literatura surgen dos importantes interrogantes a ser contestados: ¿Deberían

las caras adaxial y abaxial de hojas tener la misma distribución espectral de

fluorescencia luego de corregir los procesos de reabsorción de luz? Y ¿Debería la

relación de máximos de fluorescencia (Fred/Ffar-red) corregida por reabsorción ser la

misma para todas las especies de plantas estudiadas?

4.A.1.1. Comparación de las propiedades ópticas de las caras adaxial y abaxial de hojas

El principal objetivo del trabajo enviado a Photochemical Photobiological

Sciences fue analizar si las diferencias en los espectros de emisión de fluorescencia de

las caras adaxial y abaxial de las diferentes especies eran debidas meramente a

diferencias en la magnitud de los procesos de reabsorción. Como un objetivo

secundario, para ambas caras de las hojas se analizaron parámetros ópticos como la

función de remisión y los coeficientes de absorción y de dispersión de luz.

También se efectuó el estudio de las propiedades ópticas de ambas caras de

hojas intactas de Ficus benjamina crecidas en dos condiciones de iluminación muy

diferenciadas: hojas de plantas expuestas a la luz solar durante todo su desarrollo y

hojas de plantas crecidas en la sombra.

Adicionalmente, se extendió el estudio de las propiedades ópticas de las caras de

hojas intactas de Ficus elástica en dos etapas de su crecimiento: hojas verdes, las cuales

se encontraban totalmente desarrolladas y hojas rojas, las que se hallaban en un estadío

temprano de su desarrollo.

Para completar el estudio, se determinaron las relaciones de máximos de

fluorescencia, Fred/Ffar-red, y los parámetros ópticos mencionados más arriba para las

caras adaxial y abaxial de hojas senescentes. Se estudiaron los procesos que tienen lugar

durante la senescencia de hojas ya que estos procesos son análogos a los que ocurren

cuando una planta es sometida a condiciones de tensión ambiental como contaminación,

falta de agua y acción de herbicidas entre otros (Subhash et al., 1999; Lichtenthaler y

Rinderle, 1988). Por lo tanto, los resultados que se obtienen de la información óptica

durante la senescencia puede ser una herramienta útil para correlacionarla con la salud

vegetal.

100

4.A.2. Materiales y métodos

Se realizaron estudios en hojas intactas elegidas de plantas crecidas en los

alrededores de Buenos Aires. Específicamente se estudiaron las siguientes especies:

Ficus benjamina (hojas de sol y de sombra), Ficus elástica (hojas verdes y rojas),

Gardenia jasminoides, Hedera helix, Gladiolus spp. y Dracaena cincta bicolor.

Las hojas se lavaron con agua destilada y se secaron con papel absorbente

teniendo cuidado de no dañarlas. Luego de mantener las hojas en oscuridad durante 20

minutos se registraron los espectros de fluorescencia en función de la longitud de onda

de emisión con un espectrofluorómetro de estado estacionario PTI (Photon Technology

International), desde 600 a 800 nm. Los espectros de fluorescencia se corrigieron por la

respuesta de sensibilidad del detector por medio de una función incluida en el software

del espectrofotómetro.










Los espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas fueron corregidos

por la respuesta del detector y por procesos de reabsorción de luz utilizando las

ecuaciones 3.6 y 3.7 del modelo de corrección de Lagorio et al. (1998) el cual ya fue

descripto en la sección 3.2. Base teórica de los modelos para corrección por procesos

de reabsorción de luz del Capítulo 3 de esta tesis.

Adicionalmente, se realizaron experimentos de fluorescencia a baja temperatura

en hojas intactas de Ficus benjamina. Una porción de hoja de alrededor de 3 cm de alto

por 2.5 mm de ancho se insertó en un tubo de vidrio (diámetro interno de 3 mm). El

tubo de vidrio se introdujo luego en un recipiente Dewar diseñado para realizar

mediciones de fluorescencia en un espectrofluorómetro. Finalmente, se registraron los

espectros de emisión de fluorescencia a temperatura ambiente (298K) y a 77K mediante

101

el llenado del recipiente Dewar con nitrógeno líquido para ambas caras (adaxial y

abaxial) utilizando una geometría de front face.

También se registraron los espectros de reflectancia difusa de hojas individuales

y de colchones de hojas y los espectros de transmitancia difusa de hojas en función de la

longitud de onda con un espectrofotómetro UV 3101 PC, Shimadzu equipado con una

esfera integradora de luz Shimadzu ISR-3100. Para ajustar el 100% de reflectancia se

utilizó sulfato de bario como estándar de referencia. Para mayor información sobre las

mediciones de reflectancia y transmitancia ver el punto 2.3 Materiales y métodos

del Capítulo 2 de esta tesis, allí también se muestra un esquema de la esfera integradora

utilizada (Figura 2.7).

La función de remisión se obtuvo a partir de los espectros de reflectancia difusa

para un colchón de hojas mediante la ecuación 2.10 (ver el punto 2.2.1. Teoría de

Kubelka-Munk del Capítulo 2 para más detalles de los cálculos). Por otro lado, se

utilizaron los espectros de reflectancia y transmitancia difusa para calcular los

coeficientes de absorción y de dispersión en función de la longitud de onda. Para ello se

utilizaron las ecuaciones 2.16 a 2.18 y también las ecuaciones 2.21 y 2.22 (para más

detalles de estos cálculos ver el punto 2.2.2. Modelo de Pila de Placas del Capítulo 2).

Las mediciones de reflectancia, transmitancia, fluorescencia se realizaron dentro

de las 5 horas posteriores a la escisión de las hojas de las plantas.

4.A.3. Resultados y discusión

En la figura 4.A.1 se muestran los espectros de emisión de fluorescencia de

Ficus benjamina. En (a) se observan los espectros de emisión de fluorescencia

experimentales corregidos por la respuesta de sensibilidad del detector, en (b) se

presentan las distribuciones espectrales luego de corregirlas por los procesos de

reabsorción de luz. Los espectros se muestran normalizados a 737 nm para analizar

fácilmente la relación Fred/Ffar-red corregida. En (a) también se pueden ver las funciones

de corrección (�) para ambas caras. Es importante destacar que estas funciones se

presentan como fueron obtenidas a partir de los datos de reflectancia, sin ningún

procedimiento de suavizado. El ruido en � es despreciable como puede notarse en la

figura 4.A.1 donde el ruido en los espectros es el mismo antes (a) y después de efectuar

la corrección (b).

102

0

1

2

3


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.) o

fun

ción

γ

0

1

2

3

Ficus benjamina

Ficus benjamina

a

b

Figura 4.A.1. Espectros pertenecientes a Ficus benjamina. (a) Espectro de emisión de

fluorescencia experimental corregido por la respuesta de sensibilidad del detector para

la cara adaxial ( ) y abaxial ( ) y la función de corrección (�) para la cara adaxial

( ) y abaxial ( ). (b) Espectros corregidos por reabsorción normalizados a 737 nm

de las caras adaxial ( ) y abaxial ( )

En las siguientes tres figuras se muestran los espectros de emisión de

fluorescencia (a) experimentales corregidos por la respuesta del detector y (b) los

espectros corregidos por reabsorción de fluorescencia para hojas intactas de plantas

103

dicotiledóneas: Ficus elastica en la figura 4.A.2, Gardenia jasminoides en la figura

4.A.3 y Hedera helix en la figura 4.A.4.

0

2

4

6

8


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4b

a

Figura 4.A.2. Espectros pertenecientes a Ficus elastica. (a) Espectro de emisión de


la cara adaxial ( ) y abaxial ( ). (b) Espectros corregidos por reabsorción

normalizados a 737 nm de las caras adaxial ( ) y abaxial ( )

104

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4


600 650 700 750 8000

1

2

3

4

a

b

Figura 4.A.3. Espectros pertenecientes a Gardenia jasminoides. (a) Espectro de emisión

de fluorescencia experimental corregido por la respuesta de sensibilidad del detector

para la cara adaxial ( ) y abaxial ( ). (b) Espectros corregidos por reabsorción


105

0

1

2


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

a

b

Figura 4.A.4. Espectros pertenecientes a Hedera helix. (a) Espectro de emisión de




En las cuatro figuras anteriores se puede observar que tanto la intensidad de

fluorescencia experimental como la relación Fred/Ffar-red experimental fueron menores

para la cara adaxial que para la cara abaxial. Este resultado que ya había sido observado

en literatura (Lang et al., 1991; Louis et al., 2006; Buschmann, 2007), ha sido

interpretado en base a una menor concentración de clorofila en la cara abaxial y

106

consecuentemente menor impacto de los procesos de reabsorción en la emisión de la

clorofila-a. Sin embargo, luego de la corrección cuantitativa de los procesos de

reabsorción de luz utilizando el modelo descripto en el trabajo de Lagorio et al. de 1998

(validado en hojas en el trabajo de Ramos y Lagorio en el año 2004) se observó que la

relación Fred/Ffar-red permaneció un poco mayor para la cara abaxial de todas las especies

dicotiledóneas estudiadas (Ficus benjamina, Ficus elastica, Gardenia jasminoides y

Hedera helix).

En las dos figuras siguientes se muestran los espectros de emisión de

fluorescencia (a) experimentales corregidos por la respuesta del detector y (b) los

espectros corregidos por reabsorción de fluorescencia para hojas intactas de plantas

monocotiledóneas: Gladiolus spp. en la figura 4.A.5 y Dracaena cincta bicolor en la

figura 4.A.6.

107

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6

8

10


600 650 700 750 8000

1

2

3

4

a

b

Figura 4.A.5. Espectros pertenecientes a Gladiolus spp. (a) Espectro de emisión de




108

600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

2

4

6


600 650 700 750 8000

1

2

3

4

a

b

Figura 4.A.6. Espectros pertenecientes a Dracaena cincta bicolor. (a) Espectro de

emisión de fluorescencia experimental corregido por la respuesta de sensibilidad del

detector para la cara adaxial ( ) y abaxial ( ). (b) Espectros corregidos por

reabsorción normalizados a 737 nm de las caras adaxial ( ) y abaxial ( )

A diferencia de los resultados observados en hojas de plantas dicotiledóneas, en

las hojas de plantas monocotiledóneas la relación de máximos de intensidad de

fluorescencia Fred/Ffar-red resultó ser prácticamente la misma para ambas caras luego de

cuantificar la reabsorción de luz (ver tabla 4.A.1). Antes de corregir por reabsorción, los

espectros de fluorescencia también resultaron iguales para ambas caras.

109


ambas caras corregidos por procesos de reabsorción de luz en hojas de Ficus benjamina.

En (a) se observan los espectros de emisión de fluorescencia de hojas expuestas a alta

intensidad de luz durante todo su desarrollo, en (b) se observan los espectros de emisión

de fluorescencia de hojas de plantas crecidas a la sombra.

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4


600 650 700 750 8000

1

2

3

4

a

b

Figura 4.A.7. Espectros de emisión de fluorescencia corregidos por reabsorción de luz

normalizados a 737 nm de las caras adaxial ( ) y abaxial ( ) de (a) Ficus

benjamina de sol (b) Ficus benjamina de sombra

110

El espectro experimental de las hojas de sombra de Ficus benjamina muestra

una mayor relación Fred/Ffar-red para la cara abaxial que para la cara adaxial pero estos

valores se vuelven prácticamente idénticos luego de corregir la emisión de fluorescencia

por reabsorción.


ambas caras corregidos por procesos de reabsorción de luz en hojas de Ficus elastica.

En (a) se observan los espectros de hojas maduras (hojas verdes), en (b) se muestran los

espectros de hojas rojas, hojas en estadíos tempranos del desarrollo.

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4


600 650 700 750 8000

1

2

3

4

a

b

111

Figura 4.A.8. Espectros de emisión de fluorescencia corregidos por reabsorción de luz

normalizados a 737 nm de las caras adaxial ( ) y abaxial ( ) de (a) Ficus elastica

hoja verde (b) Ficus elastica hoja roja

La Tabla 4.A.1 presenta los valores numéricos de la relación Fred/Ffar-red antes de

corregir por reabsorción (Re) y luego de corregir por reabsorción (Rc). Los valores

dados son promedios de siete determinaciones.

Tabla 4.A.1. Valores de la relación Fred/Ffar-red sin corregir por procesos de reabsorción

de luz (Re) y corregidos por reabsorción (Rc)

Especies

Clasificación

Cara

Re = Ie

red / Ie

far-red Rc = (Ie

red / Ie

far-red)(�far-red /�red) Rc/Re = �far-red /�red

Ficus

benjamina hoja de sol

Angiosperma dicotiledónea

Adaxial Abaxial

0.73 ± 0.04 0.89 ± 0.05

2.12 ± 0.20 2.38 ± 0.23

2.90 ± 0.12 2.67 ± 0.11

Ficus

benjamina hoja de sombra


Adaxial Abaxial

0.79 ± 0.05 0.85 ± 0.05

2.33 ± 0.24 2.35 ± 0.23

2.95 ± 0.12 2.78 ± 0.11

Ficus elástica hoja madura


Adaxial Abaxial

0.65 ± 0.04 0.96 ± 0.06

2.01 ± 0.20 2.55 ± 0.26

3.09 ± 0.12 2.66 ± 0.11

Ficus elastica hoja joven


Adaxial Abaxial

0.80 ± 0.05 1.18 ± 0.07

2.45 ± 0.25 3.43 ± 0.34

3.06 ± 0.12 2.91 ± 0.12



Adaxial Abaxial

0.75 ± 0.04 1.41 ± 0.07

2.24 ± 0.21 3.46 ± 0.31

2.99 ± 0.12 2.45 ± 0.10

Hedera helix


Adaxial Abaxial

0.69 ± 0.04 1.08 ± 0.06

1.97 ± 0.19 2.86 ± 0.28

2.86 ± 0.11 2.65 ± 0.11

Gladiolus spp.

Angiosperma monocotiledónea

Adaxial Abaxial

0.84 ± 0.05 0.84 ± 0.05

2.53 ± 0.25 2.56 ± 0.25

3.01 ± 0.12 3.05 ± 0.12

Dracaena cincta bicolor

Angiosperma monocotiledónea

Adaxial Abaxial

0.80 ± 0.05 0.76 ± 0.05

2.12 ± 0.22 2.03 ± 0.22

2.65 ± 0.11 2.67 ± 0.11

Luego de corregir por reabsorción, las relaciones experimentales de

fluorescencia (Fred/Ffar-red) se vieron afectadas por un factor mayor para la cara adaxial

que para la cara abaxial. Esta observación puede verificarse en la columna Rc/Re = �far-red

/�red de la tabla 4.A.1. Esto se debe al mayor contenido de clorofila en la parte superior

de la hoja. La parte inferior de la hoja, por el contrario, contiene una menor

concentración de clorofila y consecuentemente la corrección por los procesos de

reabsorción es menos significativa.

112

Los errores en Rc y Re en la tabla 4.A.1 se obtuvieron a partir de la repetición de

los espectros de fluorescencia y de reflectancia, en cada especie estudiada.

Específicamente se realizó el siguiente procedimiento: se registraron siete espectros

experimentales de fluorescencia del mismo grupo de hojas colocando la muestra y

sacándola luego de tomar cada medición. La desviación estándar de Ief para una dada

longitud de onda obtenida del promedio de las siete mediciones fue de alrededor de un

15%. La relación de máximos de fluorescencia experimental Iered

/ Iefar-red se calculó a

partir de los espectros mencionados. En la tabla 4.A.1 se muestra el promedio de los

siete valores y la desviación estándar obtenida (6%) fue considerada como una

estimación del error. El error que afecta a la relación de máximos de fluorescencia

resultó menor que la que afectó a la intensidad de fluorescencia absoluta porque cada

relación fue calculada a partir de la intensidad de dos valores pertenecientes a la misma

distribución espectral.

Los valores de la función � a una longitud de onda específica y sus errores se

calcularon a partir de los espectros de reflectancia. De manera similar al procedimiento

efectuado para los datos de fluorescencia, se obtuvieron siete espectros de reflectancia

difusa del mismo grupo de hojas. Nuevamente, cada grupo de hojas fue colocado y

retirado del sitio de medición luego de cada medición. Se tuvo especial cuidado de

obtener los espectros de fluorescencia y de reflectancia de la misma área de la misma

hoja. Bajo estas condiciones, las mediciones de reflectancia obtenidas con el

espectrofotómetro comercial mostraron una excelente reproducibilidad alcanzando una

desviación estándar tan baja como el 2%. A partir de los siete espectros de reflectancia,

se calcularon siete funciones de corrección �. A partir de dichas función de corrección

se obtuvo una desviación estándar de alrededor del 4% para los cocientes medios �far-red

/�red. Finalmente, la relación de fluorescencia se corrigió como (Iered

/ Iefar-red)(�far-red /�red)

para cada especie y su error fue obtenido por propagación de errores.

Los resultados presentados en la tabla 4.A.1 muestran claramente que las

diferencias en la relación Fred/Ffar-red se debieron en parte, pero no completamente, a los

procesos de reabsorción de luz, dado que aún se observan diferencias luego de la

corrección las cuales no pueden atribuirse a error experimental.

De hecho, si la reabsorción de luz fuera la única responsable por la disparidad,

Rc debería tener el mismo valor para ambas caras dentro del error experimental. De la

tabla 4.A.1 se puede ver que esto sólo se cumple para las hojas de sombra de Ficus

benjamina, Gladiolus spp. y Dracaena cincta bicolor. Un estudio detallado de los

113

resultados presentados en la tabla muestra que las diferencias relativas del porcentaje en

Fred/Ffar-red entre las caras adaxial y abaxial de las hojas dicotiledóneas se redujeron en

todos los casos luego de la corrección por reabsorción: hojas de sol de Ficus benjamina

desde 20% hasta un 12%, hojas de sombra de Ficus benjamina desde 7% hasta un 1%,

hojas maduras de Ficus elastica desde un 39% a un 24%, hojas jóvenes de Ficus

elastica desde un 38% hasta un 33%, Gardenia jasminoides desde un 61% hasta un

43%, Hedera helix desde un 44% a un 37%. Las diferencias porcentuales remanentes en

estos casos (excepto para las hojas de sombra de Ficus benjamina) resultaron grandes

comparadas con el error experimental.

El hecho que Rc fuera siempre mayor para la cara abaxial en las hojas

dicotiledóneas muestra que la corrección espectral por procesos de reabsorción

utilizando el modelo de Lagorio et al. (1988) no produce un único espectro. Este

resultado, en principio podría resultar inesperado pero está de acuerdo con el hecho de

que la relación de fotosistemas (FSII/FSI) también es mayor para la cara abaxial

(Terashima y Inoue, 1985). De hecho, dado que Fred se debe a la emisión del fotosistema

II (FSII) y Ffar-red presenta contribuciones de ambos fotosistemas (FSII y FSI) (Agati,

1998; Agati et al., 2000; Peterson et al., 2001), la relación verdadera Fred/Ffar-red (es

decir, la relación corregida, Rc) debería correlacionar directamente con la relación

FSII/FSI en hojas.

Como ya es conocido, las hojas dicotiledóneas exhiben el parénquima en

empalizada (cercano a la cara superior, la cara expuesta a la luz solar) y parénquima

esponjoso (cercano a la cara inferior de la hoja, la cara menos expuesta a la luz solar)

organizado entre dos capas de células epidérmicas (ver figura 2.1. del Capítulo 2 esta

tesis y el texto correspondiente para una explicación más extensa sobre la anatomía de

las hojas) (Ustin et al., 2001). Se ha reportado en literatura que existen diferencias

bioquímicas y ultraestructurales entre los cloroplastos del tejido en empalizada y los

cloroplastos del tejido esponjoso. Los cloroplastos del mesófilo en empalizada se

asemejan a los cloroplastos de plantas expuestas al sol y tienen una menor proporción

de FSII/FSI. Por otro lado, los cloroplastos del mesófilo esponjoso se comportan como

los cloroplastos de plantas de sombra, mostrando una mayor relación FSII/FSI

(Terashima et al., 1986).

Una comparación interesante surge de los resultados obtenidos de las hojas de

Ficus benjamina expuestas a distribuciones espectrales de luz solar intensa y a

distribuciones espectrales de luz sombreada (enriquecida con longitudes de onda larga).

114

Se ha informado en literatura, que los cloroplastos desarrollados bajo la luz solar

contienen mayor relación de clorofila-a/clorofila-b que los cloroplastos de hojas

expuestas a la sombra (Lichtenthaler y Burkart, 1999). Los factores que producen esta

situación son similares a aquellos que producen mayor proporción de FSII en las caras

abaxiales. De hecho, los cloroplastos se adaptan a la luz ambiental dentro de una hoja de

manera similar que los cloroplastos de sol y de sombra se adaptan a la luz ambiental

dentro de la cobertura vegetal (Terashima et al., 1986; Pedrós et al., 2008). Esto podría

ser una explicación para el hecho de que los valores de Rc para la cara adaxial fueran

mayores para las hojas de sombra que para las hojas de sol y los valores de Rc para el

lado superior e inferior de hojas de plantas de sombra fueran muy similares entre sí.

Otra comparación interesante puede ser realizada entre hojas maduras y hojas

jóvenes de Ficus elastica. Las hojas jóvenes de esta planta usualmente presentan un

color verde-rojizo debido a la presencia de antocianinas. Las antocianinas absorben luz

en la región del verde, amarillo y azul del espectro electromagnético, actuando de esta

manera como un filtro interno. Como consecuencia, el mesófilo de las hojas que

contienen antocianinas puede desarrollar características de hojas adaptadas a la sombra

(Manetas, 2003). La relación FSII/FSI para las hojas jóvenes (hojas rojizas) resultó ser

mayor que para las hojas maduras (hojas verdes) expuestas al sol y similar a la relación

FSII/FSI obtenida para plantas de sombra. Los resultados muestran que efectivamente,

las hojas rojas de Ficus elastica exhiben un mayor valor de Rc para ambas caras que los

respectivos valores de las hojas maduras.

Como complemento de los datos anteriores también se efectuaron experimentos

a baja temperatura en hojas de Ficus benjamina. Los espectros de emisión de

fluorescencia para las caras adaxial (a) y abaxial (b) para ambas temperaturas: 298K y

77K, corregidos por la respuesta de sensibilidad del detector y normalizados a 737 nm

se muestran en la figura que sigue (figura 4.A.9).

115


600 650 700 750 800Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.4

0.8

1.2


600 650 700 750 8000.0

0.4

0.8

1.2 a b

298K298K

77K77k

Figura 4.A.9. Espectros de emisión de fluorescencia corregidos por la respuesta de

sensibilidad del detector y normalizados a 737 nm para (a) la cara adaxial y (b) la cara

abaxial de Ficus benjamina a 298K ( ) y 77K ( )

De acuerdo con Pfündel (1998), a temperatura ambiente la emisión proveniente

desde el FSI presenta varias bandas alrededor de 730 nm y un hombro a 690 nm,

mientras que el FSII muestra un máximo a 690 nm y una banda satélite vibracional a

longitudes de onda mayores que 700 nm.

A bajas temperaturas (77K), el rendimiento cuántico de fluorescencia para FSII

se incrementa mientras que para FSI aumenta varias veces a mayores longitudes de

onda que 700 nm y decrece sustancialmente a longitudes de onda más cortas que 700

nm (Strasser y Butler, 1977; Pfündel, 1998). Por lo tanto, a 77K, Fred/Ffar-red debería

decrecer con el aumento de la contribución de FSI.

Como se esperaba de literatura (Pfündel, 1998), se comprobó experimentalmente

que la relación Fred/Ffar-red decrece con la disminución de la temperatura (ver figura

4.A.9), mientras que la intensidad de fluorescencia en ambas bandas (rojo y rojo lejano)

aumentó (resultados no mostrados).

Los valores de Fred/Ffar-red a 77K relativos a los valores a temperatura ambiente

resultaron mayores para la cara abaxial que para la cara adaxial de las hojas, lo que

puede verse en la figura 4.A.10 a continuación:

116

298K 77K 77K/298K

F red

/Ffa

r-re

d

0.0

0.4

0.8

1.2

Cara abaxial de Ficus benjamina Cara adaxial de Ficus benjamina

Figura 4.A.10. Relación de máximos de fluorescencia experimental a diferentes

temperaturas para la cara adaxial y abaxial de hojas de Ficus benjamina

Cuando la contribución de FSI aumenta, la relación Fred/Ffar-red decrece a 77K

(Govindjee, 1995; Pfündel, 1998). Los resultados observados se interpretaron como una

mayor contribución del FSII para la cara abaxial que para la cara adaxial.

Para completar los datos experimentales, se muestran los resultados obtenidos a

partir del estudio de la senescencia de hojas de Ficus benjamina.

Durante los experimentos de senescencia, los valores experimentales de la

relación Fred/Ffar-red disminuyeron para ambas caras como muestra la figura 4.A.11:

117

Tiempo (días)

0 4 7 12

F 685

/ F73

7 co

rreg

ido

0

1

2

3

F 685

/ F73

7 no

cor

regi

do

0

1

2

3F 6

85/ F

737

no c

orre

gido

0

1

2

3Ficus benjaminaHojas de sol

Ficus benjamina

Hojas de sombra

Tiempo (días)

0 4 7

F 685

/ F73

7 co

rreg

ido

0

1

2

3Ficus benjamina

Hojas de solFicus benjamina

Hojas de sombra

Figura 4.A.11. Relaciones de máximos de intensidad de fluorescencia, corregido y no

corregidos por reabsorción de luz como una función del tiempo de senescencia. Para las

caras adaxial ( ) y abaxial ( ) de hojas de Ficus benjamina. Cada punto resulta del

promedio de siete mediciones

Esta disminución en la relación Fred/Ffar-red no se debió a cambios en los procesos

de reabsorción, dado que aún permanecen luego de su corrección. Se observa que el

descenso es más importante para las relaciones corregidas (Rc) que para las relaciones

experimentales (Re). Este hecho puede ser explicado teniendo en cuenta que la

reabsorción de la luz afecta en forma más importante a la banda ubicada en el rojo

(alrededor de 685 nm) en estadíos tempranos de la senescencia mientras que hacia el

final de la senescencia afecta en forma más importante la banda ubicada en el rojo

lejano (alrededor de 737 nm). Como un ejemplo de esto, los valores de � para la cara

abaxial de hojas de sombra aumentan desde 0.28 hasta 0.33 a 685 nm mientras que a

737 nm el valor de la función de corrección decrece desde 0.75 hasta 0.66.

Existe evidencia en literatura que muestra una dependencia inversa de esta

relación con el contenido de clorofila, la cual ha sido explicada en base a la reabsorción

118

de la luminiscencia (Lichtenthaler, 1999). Éste fue el caso para hojas senescentes de

Aurea tobacco, cuya relación experimental de fluorescencia F690/F740 aumenta con el

incremento del color amarillo (resultado opuesto al encontrado en los experimentos

presentados más arriba con hojas de Ficus benjamina). Sin embargo, en este caso no se

ha estimado cuantitativamente la reabsorción de la luz. Se encontró un descenso en la

relación experimental F690/F740 durante la irradiación de hojas verdes de maíz

(fotoinhibición) y fue atribuido a la descomposición de la proteína D1 en el fotosistema

II (Buschman y Lichtenthaler, 1998). También se encontró que en estadíos tempranos

de la senescencia en cotiledones de Cucumis, las proteínas del FSII D1 y D2 comienzan

a degradarse. Para estas especies las proteínas del centro de reacción del FSI fueron

relativamente más estables que las proteínas de los centro de reacción del FSII. Estos

resultados publicados por Jogadhem y colaboradores en 2001 indican una destrucción

temprana del FSII relativa al FSI durante la senescencia. Estos resultados podrían ser

compatibles con los obtenidos en este trabajo de tesis para Ficus benjamina. El arreglo

de los cloroplastos en las células influye en la reabsorción de luz en la emisión de

fluorescencia de la clorofila. Bartoskova y colaboradores en el año 1999 también

encontraron un descenso en la relación F685/F735 durante la desecación de hojas de

Rhizomium punctatum y en el tratamiento con DCMU (3-(3,4-diclorofenil)-1,1-

dimetilurea o diuron). Ellos explicaron sus resultados asumiendo un agrupamiento de

los cloroplastos durante el proceso que da lugar a la reabsorción de la fluorescencia

(principalmente a 685 nm). Sus resultados nuevamente son compatibles con los

resultados observados durante la senescencia de hojas de Ficus benjamina pero

probablemente sus conclusiones en el efecto de la reabsorción de fluorescencia deberían

ser reanalizados en términos de las contribuciones relativas de los fotosistemas II y I

durante el proceso de tensión. En este trabajo de tesis se interpretó el descenso de la

relación de fluorescencia corregida por reabsorción asumiendo un decrecimiento

relativo de la fluorescencia del FSII comparada con la del FSI durante la senescencia.

Esta interpretación es similar a la encontrada en un trabajo de Agati y colaboradores de

2000 (Agati et al., 2000). Los resultados fueron atribuidos a la transición del estado 1 al

estado 2 lo que reduce la fluorescencia del FSII e incrementa la del FSI durante el

proceso de enfriamiento de las hojas. En el trabajo de Agati (2000) un descenso en la

relación F685/F735 fue reportado cuando se disminuyó la temperatura a hojas de

Phaseolus vulgaris y Pisum stativum.

119

Los resultados presentados hasta aquí muestran que la distribución espectral de

la fluorescencia corregida por reabsorción en hojas debería depender de la relación de

fotosistemas (FSII/FSI) en el lado de la hoja estudiado.

La función de remisión (F(R)), una función relacionada con la luz que es

reflejada por las hojas se presenta en la figura 4.A.12 para todas las especies estudiadas.

120

0

4

8

12

Func

ión

de r

emis

ión

F(R

)

0

4

8

12


500 550 600 650 700 7500

4

8

12

Longiutd de onda (nm)

500 550 600 650 700 750

Ficus benjamina (hoja de sol) Ficus elastica (verde)

Ficus elastica (roja)


Gladiolus spp

Hedera helix

Dracaena cincta bicolor

0

4

8

12Ficus benjamina (hoja de sombra)

Figura 4.A.12. Función de remisión en función de la longitud de onda para las caras

adaxial ( ) y abaxial ( ) de todas las especies vegetales estudiadas

121

Se puede ver que la función de remisión resultó mayor para la cara superior que

para la cara inferior para todas las especies dicotiledóneas estudiadas, mientras que

presentaron valores similares para ambas caras en las especies monocotiledóneas. De

acuerdo con la teoría de Kubelka-Munk, F(R) es igual a la relación entre los

coeficientes de absorción y de dispersión (k/s) (Wendlandt y Hecht, 1966). Los valores

de estos coeficientes k y s se muestran en las figuras 4.A.13 y 4.A.14, respectivamente

para todas las especies estudiadas.

Se encontró que los valores de k fueron mayores para las caras adaxial que

abaxial en hojas de plantas dicotiledóneas de sol pero estas diferencias entre ambas

caras siempre fueron menores al 25%. En hojas de plantas monocotiledóneas y en hojas

sombra de plantas dicotiledóneas, los valores de k fueron similares para ambos lados de

las hojas. Por otro lado, los valores de los coeficientes de dispersión, s, fueron mucho

mayores para las caras abaxial que para las caras adaxial y muy similares para ambas

caras en monocotiledóneas. Este resultado es debido al hecho de que el tejido esponjoso

presente en la cara abaxial dispersa la luz más efectivamente (Knapp y Carter, 1998).

De hecho, el tejido en empalizada, ubicado debajo de la epidermis de la cara adaxial de

hojas consta de células cilíndricas densamente empaquetadas con muchos cloroplastos,

y cerca de un 5-20% de su volumen está ocupado por aire. El tejido esponjoso, ubicado

debajo de las células epiteliales de la cara abaxial de las hojas, consiste en pequeñas

células redondeadas menos empaquetadas y con menor cantidad de cloroplastos y

poseen desde un 50% hasta un 80% de su volumen ocupado por aire (Wooley, 1971).

Entonces, se concluye que las diferencias observadas en el coeficiente de dispersión

entre las caras adaxial y abaxial son las principales responsables de las diferencias

observadas entre ellas en la función de remisión. La dispersión es mayor para longitudes

de onda de absorción débil (alrededor de 750 nm) debido a la existencia de un mayor

camino óptico a esa longitud de onda (Terashima y Saeki, 1983).

122

0

2

4

Coe

fici

ente

s de

abs

orci

ón, k

0

2

4


500 550 600 650 700 7500

2

4


500 550 600 650 700 750

Ficus benjamina (hoja de sol) Ficus elastica (hoja verde)


Ficus elastica (hoja roja)

Hedera helix

Gladiolus spp Dracaena cincta bicolor

0

2

4Ficus benjamina (hoja de sombra)

Figura 4.A.13. Los valores del coeficiente de absorción en función de la longitud de

onda para las caras adaxial ( ) y abaxial ( ) de todas las especies vegetales

estudiadas

123

0.0

0.4

0.8

0.0

0.4

0.8


500 550 600 650 700 7500.0

0.4

0.8


500 550 600 650 700 750

Ficus benjamina (hoja de sol) Ficus elastica (hoja verde)


Ficus elastica (hoja roja)

Hedera helix

Gladiolus spp Dracaena cincta bicolor

Coe

fici

ente

s de

dis

pers

ión,

s

0.0

0.4

0.8

Ficus benjamina (hoja de sombra)

Figura 4.A.14. Los valores del coeficiente de dispersión en función de la longitud de

onda para las caras adaxial ( ) y abaxial ( ) de todas las especies vegetales

estudiadas

124

Durante la senescencia de Ficus benjamina, se encontró que la distribución

espectral del coeficiente de dispersión para ambas caras aumentaba (ver figura 4.A.15).

Este hecho está relacionado probablemente con la pérdida de agua y con un incremento

en el número de interfaces aire-células durante la senescencia que aumenta la dispersión

de luz dentro de las hojas (Wooley, 1971).

Por otro lado, el espectro del coeficiente de absorción se ensanchó durante la

senescencia debido a la destrucción de las moléculas de clorofilas y a la formación de

compuestos que absorben en la región del verde y amarillo del espectro

electromagnético (ver figura 4.A.16). Cuando las hojas mueren, los pigmentos marrones

(taninos) comienzan a formarse, la presencia de estas especies incrementa la absorción

en el rango desde los 500 nm hasta los 750 nm (Boyer, 1988).

Coe

fici

ente

s de

dis

pers

ión,

s

0.0

0.5

1.0


500 550 600 650 700 7500.0

0.5

1.0

Ficus benjamina adaxial

Ficus benjamina abaxial

Figura 4.A.15. Coeficientes de dispersión, s, de hojas de Ficus benjamina en función de

la longitud de onda y del tiempo de senescencia para las caras adaxial y abaxial. Día 0

( ), día 4 ( ) y día 7 ( )

125

Coe

fici

ente

s de

abs

orci

ón, k

0

1

2

3


500 550 600 650 700 7500

1

2

3

Ficus benjamina adaxial

Ficus benjamina abaxial

Figura 4.A.16. Coeficientes de absorción, k, de hojas de Ficus benjamina en función de

la longitud de onda y del tiempo de senescencia para las caras adaxial y abaxial. Día 0

( ), día 4 ( ) y día 7 ( )

4.A.4. Conclusiones

Las principales conclusiones obtenidas de este estudio pueden ser resumidas

como sigue:

Las diferencias en las relaciones experimentales de fluorescencia Fred/Ffar-red

entre las caras superior e inferior de hojas dicotiledóneas no son únicamente debidas a

diferencias en los procesos de reabsorción de luz. Esta hipótesis había sido planteada

previamente en literatura pero hasta el momento nunca había sido demostrado

fehacientemente. Luego de corregir por reabsorción, las caras abaxiales de hojas

dicotiledóneas muestran una intensidad de fluorescencia mayor, además de una mayor

relación corregida Fred/Ffar-red que las caras adaxiales (para todas las especies estudiadas

excepto para las hojas de Ficus benjamina de sombra). Si bien las diferencias que

126

permanecen luego de la corrección pueden ser consideradas pequeñas, éstas no pueden

atribuirse a error experimental. La evidencia experimental obtenida en este trabajo

apunta al hecho de que una mayor relación FSII/FSI para la cara abaxial podría ser la

responsable de la disparidad observada. Basados en estas observaciones, los valores

obtenidos para la relación Fred/Ffar-red luego de corregir por reabsorción deberían estar

relacionados a la proporción relativa de FSII respecto a FSI en cada planta. Como

consecuencia, incluso cuando los valores de Rc son cercanos a 2, no es esperable un

valor constante para todas las especies de plantas.

4.A.5. Bibliografía

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130



Sección B

4.B. Estudio de las propiedades ópticas de hojas variegadas

Los resultados presentados en esta sección del capítulo 4 no han sido publicados

hasta la fecha de presentación de esta tesis.

4.B.1. Introducción

Los cloroplastos de las hojas se diferencian a partir de proplastos. Los proplastos

son los plástidos de las células jóvenes. Los proplastos se encuentran en las células

meristemáticas (Taiz L. y Zeiger E. 2006) y su desarrollo ontogénico está regulado por

la luz a través de fitocromo. Cuando son expuestos a la luz solar, la membrana del

proplasto se invagina formando prolongaciones. La invaginación se aplasta y

evolucionan a estructuras típicas de tilacoides. Luego ocurre la síntesis de clorofila y

proteínas. Por el otro lado, cuando no reciben luz solar la diferenciación se detiene en

un estadio intermedio: los etioplastos (Taiz L. y Zeiger E. 2006). Los etioplastos son

incoloros y contienen protoclorofila, un precursor de la clorofila. Al aparecer la luz hay

una transformación directa de etioplastos a cloroplastos.

En ciertas especies vegetales existen pocos proplastos en las células

meristemáticas lo que ocasiona que algunas células hijas no reciban proplastos en la

división celular y entonces las generaciones de células derivadas de dichas células no

tienen cloroplastos. Esto origina parches blancos en las hojas, las cuales se denominan

hojas variegadas (http://www.biologia.edu.ar/botanica/tema8/8-4plastidios.htm), que

incluso en ciertas ocasiones puede dar lugar al caso de hojas totalmente blancas.

En esta sección del capítulo 4 se presentarán los resultados obtenidos a partir del

estudio de las propiedades ópticas de hojas provenientes de plantas variegadas.

Específicamente, se compararon las propiedades fotobiológicas de zonas verdes y de

zonas blancas del material vegetal para efectuar un aporte en el estudio de plantas

variegadas. En la actualidad existe escasa información bibliográfica de este tipo de

hojas.

131

4.B.2. Materiales y métodos

Se estudiaron las propiedades ópticas de hojas intactas de Schefflera arborícola

variegata. Las hojas se lavaron con agua destilada y se secaron con papel absorbente

teniendo cuidado de no dañarlas. Luego de mantener las hojas en oscuridad durante 20

minutos se registraron los espectros de fluorescencia en función de la longitud de onda

de emisión con un espectrofluorómetro de estado estacionario PTI (Photon Technology

International), desde 600 a 800 nm. Los espectros de fluorescencia se corrigieron por la

respuesta de sensibilidad del detector por medio de una función incluida en el software

del espectrofotómetro.






señal apreciable. El flujo de fotones de excitación fue menor a 20 µmol m-2 s-1.

Los espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas se corrigieron por la

respuesta del detector y por procesos de reabsorción de luz utilizando las ecuaciones 3.7

a 3.9 del modelo de corrección de Lagorio et al. (1998) el cual ya fue descripto en el

punto 3.2. Base teórica de los modelos para corrección por procesos de reabsorción

de luz del Capítulo 3 de esta tesis.

Adicionalmente, se realizaron experimentos de fluorescencia a baja temperatura

de suspensiones diluidas de hojas. Para tal fin se utilizó un recipiente Dewar. Las

suspensiones diluidas de hojas se prepararon según los trabajos de Weis de 1984 y

1985. Para más información sobre el procedimiento para preparar suspensiones acuosas

diluidas ver la sección 3.3.3. Espectros de fluorescencia de clorofila-a en ausencia de

reabsorción del Capítulo 3 de esta tesis.

Una vez preparada las suspensiones de una zona totalmente verde de hojas de

Schefflera arboricola variegata y de una zona albina (estas hojas son totalmente blancas

en la cara adaxial pero en su cara abaxial presentan un color verde muy claro), las

suspensiones se mantuvieron en oscuridad por 20 minutos antes del registro de los

espectros de emisión de fluorescencia.

132

Se obtuvieron espectros de emisión de fluorescencia de las suspensiones a

temperatura ambiente (298K) y a baja temperatura (77K). Para tal fin, las suspensiones

acuosas de hojas se introdujeron en tubos de RMN los cuales fueron a su vez

introducidos en el Dewar lleno de nitrógeno líquido o sin nitrógeno líquido en el caso de

las experiencias a temperatura ambiente.

También se registraron los espectros de reflectancia difusa de hojas individuales

y de colchones de hojas y los espectros de transmitancia difusa de hojas en función de la

longitud de onda con un espectrofotómetro UV 3101 PC, Shimadzu equipado con una

esfera integradora de luz Shimadzu ISR-3100. Para ajustar el 100% de reflectancia se

utilizó sulfato de bario como estándar de referencia. Para mayor información sobre las

mediciones de reflectancia y transmitancia ver el punto 2.3 Materiales y métodos

del Capítulo 2 de esta tesis, allí también se muestra un esquema de la esfera integradora

utilizada (Figura 2.7).

Se calculó la función de remisión a partir de los espectros de reflectancia difusa

obtenidos para un colchón de hojas mediante la ecuación 2.10 (ver el punto 2.2.1.

Teoría de Kubelka-Munk del Capítulo 2 para más detalles de los cálculos). Por otro

lado, se calcularon los coeficientes de absorción y de dispersión en función de la

longitud de onda a partir de los espectros de reflectancia y transmitancia difusa

utilizando las ecuaciones 2.16 a 2.18 y las ecuaciones 2.21 y 2.22 (para más detalles de

estos cálculos ver el punto 2.2.2. Modelo de Pila de Placas del Capítulo 2).

Las mediciones de reflectancia, transmitancia, fluorescencia se realizaron dentro

de las 5 horas posteriores a la escisión de las hojas de las plantas.

Se determinaron las concentraciones de pigmentos por medio de un método de

extracción y posterior determinación espectrofotométrica a longitudes de onda

establecidas. El método utilizado ya ha sido descripto en el Capítulo 2 (Sección 2.3

Materiales y métodos). Se utilizaron las ecuaciones 2.23 a 2.26 desarrolladas por Sims

y Gamon (2002).

Para validar la aplicación del modelo de corrección de reabsorción de luz

(Lagorio et al., 1998) en estas hojas de acuerdo con el trabajo de Ramos y Lagorio de

2004, se aislaron cloroplastos de ambos tipos de hojas. Los cloroplastos intactos se

aislaron de acuerdo con el trabajo de Más y colaboradores del año 2000 (Más et al.,

2000). Una vez aislados, los cloroplastos se depositaron sobre placas de cuarzo

asegurándose de formar una capa suficientemente delgada, donde los procesos de

reabsorción de la fluorescencia fueron considerados despreciables (la película de

133

cloroplastos fue diluida hasta que la distribución espectral de fluorescencia no cambió).

Finalmente, se obtuvieron los espectros de emisión de fluorescencia de los cloroplastos

aislados los cuales se compararon con los espectros de emisión de fluorescencia de

hojas intactas corregidos por el modelo de Lagorio (1998).

4.B.3. Resultados y discusión

La figura 4.B.1 muestra los espectros de reflectancia difusa pertenecientes a un

colchón de hojas totalmente verdes y para un colchón de hojas blancas (con una

tonalidad verdosa muy clara en la cara abaxial de ellas). Las figuras 4.B.2 y 4.B.3

presentan las funciones de remisión calculadas de acuerdo con la teoría de Kubelka-

Munk a partir de la reflectancia difusa de un grupo de hojas (F(R) = (1-R)2 / 2R) y las

funciónes de remisión calculadas como la relación del coeficiente de absorción (k) y el

coeficiente de dispersión (s), de acuerdo con el modelo de Pila de Placas (F(R) = k/s).

Para una explicación más extensa de ambos modelos ver los puntos 2.2.1 y 2.2.2 del

Capítulo 2 de esta tesis.

Los valores de reflectancia difusa para los grupos de hojas (colchones) se

determinaron por triplicado en todos los casos. Los espectros mostrados y utilizados en

el cálculo de F(R) son promedios de estas mediciones.

Los espectros de reflectancia y transmitancia difusa que se utilizaron en el

cálculo de de los coeficientes de absorción, k, y de dispersión, s, también resultaron del

promedio de tres determinaciones.

134


400 500 600 700 800

Ref

lect

anci

a (%

)

0

20

40

60

80

100

Hoja verdeHoja blanca

Figura 4.B.1. Espectros de reflectancia de grupos de hojas apiladas de hojas verdes y de

hojas blancas de Schefflera arborícola variegata


400 500 600 700 800

Func

ión

de r

emis

ión

0

2

4

6

8

10

12

14

16

F(R) = k/s

F(R) = (1-R)2/(2*R)

Figura 4.B.2. Funciones de remisión de hojas verdes de Schefflera arborícola variegata

calculadas según la teoría de Kubelka-Munk y según el modelo de Pila de Placas

135


400 500 600 700 800

Func

ión

de r

emis

ión

0

1

2

F(R) = k/s

F(R) = (1-R)2/(2*R)

Figura 4.B.3. Funciones de remisión de hojas blancas de Schefflera arborícola

variegata calculadas según la teoría de Kubelka-Munk y según el modelo de Pila de

Placas

Tanto en hojas verdes (figura 4.B.2) como en hojas blancas (figura 4.B.3), se

comprobó que la función de remisión calculada de acuerdo con Kubelka-Munk coincide

con la función de remisión calculada a partir del modelo de Pila de Placas. De esta

manera se verificó la aplicabilidad de ambos modelos para describir la compleja

interacción luz-materia en hojas variegadas. Este resultado permitió la utilización del

modelo de Pila de Placas para calcular los coeficientes de absorción y de dispersión en

forma independiente, algo que la teoría de Kubelka-Munk no permitía (Stokes, 1862;

Kubelka y Munk, 1931; Allen y Richardson, 1968).

Las figuras 4.B.4 y 4.B.5 muestran los valores de k y s en función de la longitud

de onda, respectivamente.

136


400 500 600 700 800

Coe

fici

ente

s de

abs

orci

ón, k

0

1

2

3

Figura 4.B.4. Valores de los coeficientes de absorción en función de la longitud de onda

de hojas verdes y de hojas blancas de Schefflera arborícola variegata.

Hojas verdes ( ), hojas blancas ( )


400 500 600 700 800

Coe

fici

ente

s de

dis

pers

ión,

s

0.0

0.5

1.0

Figura 4.B.5. Valores de los coeficientes de dispersión en función de la longitud de

onda de hojas verdes y de hojas blancas de Schefflera arborícola variegata.

137

Hojas verdes ( ), hojas blancas ( )

Los valores de k, relacionados con la concentración de pigmentos resultaron ser

mayores para las hojas verdes que para las hojas blancas. Por otro lado, los valores de s

relacionados con la interfase célula-aire fueron mayores para las hojas albinas. Estos

resultados concuerdan con los contenidos de pigmentos determinados por vía húmeda,

los cuales se muestran a continuación.

Las concentraciones de pigmentos de cuatro tipos de hojas se presentan en la

tabla 4.B.1. Para esta experiencia se eligieron hojas verdes, verdes oscuras, hojas

blancas y hojas amarillas.

Tabla 4.B.1. Concentraciones de clorofila de hojas de Schefflera arboricola variegata

Tipo de hoja

Clorofila-a mmol/cm2

Clorofila-b mmol/cm2

Clor a /Clor b mmol/cm2

Clorofila total mmol/cm2

Blanca 6.39E-6 ± 7E-7 8.59E-6 ± 9E-7 0.74 1.49E-5 ± 2E-6 Amarilla 4.30E-6 ± 5E-7 2.41E-6 ± 3E-7 1.79 6.71E-6 ± 7E-7 Verde 4.70E-5 ± 5E-6 2.88E-5 ± 3E-6 1.64 7.57E-5 ± 8E-6 Verde oscura 7.18E-5 ± 7E-6

3.35E-5 ± 3E-6

2.14

1.05E-4 ± 1E-5

La concentración de clorofila-b fue mayor en hojas verdes que en hojas blancas.

La relación Clor a/Clor b también fue mayor para las hojas verdes debido a un aumento

en la concentración de clorofila-a en ellas. En bibliografía se explica que un mayor

contenido de clorofila-b permite captar luz enriquecida con longitudes de onda larga

(más de 700 nm) (Terashima e Inoue, 1985; Lichtenthaler y Burkart, 1999). Por otro

lado, mayor contenido de clorofila-b correlaciona con un aumento en la proporción de

fotosistema II (FSII) relativo a la cantidad de fotosistema I (FSI) para compensar la

sobreexcitación del FSI por la luz enriquecida con longitudes de onda larga (Terashima

e Inoue, 1985; http://fds.oup.com/www.oup.co.uk/pdf/bt/ridge/ch02.pdf). Un aumento

en la proporción de FSII/FSI debería verse reflejado en la relación Fred/Ffar-red. Para

confirmar esta hipótesis se obtuvieron los espectros de emisión de fluorescencia de

hojas verdes y de hojas completamente blancas (Agati, 1998; Agati et al., 2000;

Peterson et al., 2001).

138

Los espectros de emisión de fluorescencia experimentales (a) y corregidos por

procesos de reabsorción de luz (b) para ambos tipos de hojas se muestran en la figura

4.B.6.

0

1

2

3

4

Hojas verdesHojas blancas


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

Hojas verdesHojas blancas

a

b

Figura 4.B.6. Espectros de emisión de fluorescencia experimentales (a) y corregidos por

reabsorción de luz (b) para hojas verdes y hojas blancas de Schefflera arborícola

variegata. Los espectros se muestran normalizados a 737 nm para lograr una

comparación rápida de las relaciones de máximos de intensidad

139

Los valores de la relación de máximos de fluorescencia, Fred/Ffar-red,

experimentales, sólo corregidos por la respuesta de sensibilidad del detector fueron de

0.66 para las hojas verdes y 1.91 para las hojas blancas. Luego de corregir los espectros

por reabsorción de luz, los valores de la relación de máximos (Fred/Ffar-red) aumentaron

hasta 1.53 para hojas verdes y 3.64 para hojas blancas. Por lo tanto, Fred/Ffar-red para las

hojas verdes aumentó 2.32 veces mientras que para las hojas blancas esta relación

aumentó 1.90 veces. Si bien este resultado era esperable, debido al mayor contenido de

pigmentos de las hojas verdes, resultó llamativo que la relación de máximos también

aumenta significativamente para las hojas blancas donde por ejemplo, la concentración

de clorofila total es casi diez veces menor a la existente en hojas verdes. A partir de este

resultado fue posible inferir que la concentración de pigmentos no es la única

responsable de las diferencias observadas en la relación Fred/Ffar-red. Se realizó otra serie

de experimentos para determinar si las diferencias se debían a distintas proporciones de

fotosistemas (FSII/FSI) en ambos tipos de hojas. Para ello se trabajó sobre suspensiones

diluidas de hojas donde es despreciable la reabsorción de luz.

La figura 4.B.7 muestra los espectros de emisión de luz de las suspensiones

diluidas de hojas a temperatura ambiente, mientras que la figura 4.B.8 presenta los

espectros de las mismas suspensiones obtenidos a baja temperatura.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

5

6

Suspensión verde a 298KSuspensión blanca a 298K

140

Figura 4.B.7. Espectros de emisión experimentales corregidos por la respuesta de

sensibilidad del detector de las suspensiones de hojas diluidas a temperatura ambiente

de Schefflera arborícola variegata.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

Suspensión verde a 77KSuspensión blanca a 77K

Figura 4.B.8. Espectros de emisión experimentales corregidos por la respuesta de

sensibilidad del detector de las suspensiones de hojas diluidas a baja temperatura de

Schefflera arboricola variegata

Las relaciones de Fred/Ffar-red a temperatura ambiente de las suspensiones acuosas

de hojas fueron de 3.83 para la suspensión verde y de 5.16 para la suspensión de hojas

blancas.

A baja temperatura los valores de la relación Fred/Ffar-red para la misma

suspensión verde (medida anteriormente a temperatura ambiente) fue de 0.50 mientras

que para la suspensión de hojas blancas la relación de Fred/Ffar-red fue de 0.83. De

acuerdo con bibliografía (Govindjee, 1985; Pfúndel, 1998), a bajas temperaturas el

rendimiento cuántico de fluorescencia para FSII se incrementa mientras que para FSI

aumenta varias veces a mayores longitudes de onda que 700 nm y decrece

sustancialmente a longitudes de onda más cortas que 700 nm. Por lo tanto, a 77K, es

posible obtener las contribuciones de ambos fotosistemas suficientemente separadas.

141

Una mayor relación de máximos para la suspensión de hojas blancas estaría indicando

un mayor contenido de FSII en ellas respecto de las hojas verdes.

Las figuras 4.B.9 y 4.B.10 muestran los espectros de emisión de fluorescencia de

hojas corregidos superpuestos a los espectros de emisión de fluorescencia de los

cloroplastos aislados de hojas verdes y de hojas blancas, respectivamente.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

Emisión de hojas corregidaEmisión de cloroplastos

Figura 4.B.9. Espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas corregidas por

reabsorción de luz y de los cloroplastos aislados de hojas verdes de Schefflera

arborícola variegata

142


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

Emisión de hojas corregidaEmisión de cloroplastos

Figura 4.B.10. Espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas corregidas por

reabsorción de luz y de los cloroplastos aislados de hojas blancas de Schefflera

arborícola variegata

Para las hojas verdes los espectros de fluorescencia corregidos coinciden con los

espectros de emisión de los cloroplastos aislados, validando de esta manera la

aplicación del modelo de Lagorio (1998) en ellas. Sin embargo, para las hojas albinas

no se observa la misma coincidencia. Por otro lado, los espectros de emisión de

fluorescencia de los pocos cloroplastos extraídos de las hojas blancas presentan la

misma distribución espectral de los cloroplastos extraídos de las hojas verdes. Por lo

tanto, no fue posible verificar la hipótesis de un mayor contenido de FSII en los

cloroplastos presentes en las hojas blancas.

Las diferencias observadas en los espectros de fluorescencia de los cloroplastos

aislados de hojas albinas pueden deberse a la presencia de plástidos con un patrón de

emisión distinto al de los cloroplastos. En literatura se ha mostrado la emisión de

fluorescencia de etioplastos tanto a temperatura ambiente como a baja temperatura

(Griffiths, 1975; Zeiger et. al., 1980; Boddi y Franck, 1997). Sorprendentemente, la

distribución espectral de fluorescencia de etioplastos presenta un máximo de emisión

entre 680 y 690 nm, las posición de este máximo aparentemente dependería del tipo de

143

protoclorofila presente en los etioplastos de las diferentes especies etioladas (Amirjani y

Sundqvist, 2006). La superposición del máximo de emisión de los etioplastos con el

máximo de emisión de los cloroplastos (típicamente alrededor de 685 nm) explicaría en

principio los altos valores hallados para la relación Fred/Ffar-red de las hojas blancas.

4.B.4. Conclusiones

Las principales conclusiones de este trabajo son:

Se probó la aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y del modelo de Pila de

Placas en hojas variegadas, algo que no se había realizado hasta el momento.

Adicionalmente, se pudieron calcular los coeficientes de absorción y de dispersión de

hojas los cuales pudieron ser relacionados con el contenido de pigmentos y con las

propiedades estructurales de las hojas.

Se pudo validar el modelo de corrección de reabsorción de luz en las hojas

verdes. En las hojas blancas esto no se verificó debido a la existencia de otros plástidos

además de los cloroplastos. De acuerdo con información bibliográfica, podrían tratarse

de etioplastos, los cuales presentan un máximo de emisión superpuesto a la emisión del

fotosistema II presente en los cloroplastos de hojas verdes y también en los pocos

cloroplastos hallados en hojas blancas (las emisiones de fluorescencia de los

cloroplastos aislados de ambos tipos de hojas muestran la misma distribución espectral).

El estudio realizado permite concluir que la emisión fluorescente de hojas

albinas debe tratarse en forma diferencial de la de hojas verdes y no pueden usarse para

las primeras los mismos patrones de interpretación.

4.B.5. Bibliografía


environmental factors and laser excitation wavelengths. Pure Appl. Opt.7: 797-807





144

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146

Capítulo 5.

VARIACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE

HOJAS FRENTE A SITUACIONES DE TENSIÓN

AMBIENTAL

147

Capítulo 5. VARIACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE HOJAS

FRENTE A SITUACIONES DE TENSIÓN AMBIENTAL

Sección A

5.A. Hojas expuestas a la acción de herbicidas

Los experimentos que componen esta sección del capítulo 5 no han sido

publicados al momento de presentación de esta tesis. Los temas estudiados en esta

sección poseen gran relevancia en la investigación de la contribución relativa de los

fotosistemas a la emisión de la fluorescencia de hojas intactas. Un tema que aún hoy se

encuentra en discusión y que podría comenzar a dilucidarse gracias al posible uso de

herbicidas como herramientas en el estudio de la distribución espectral verdadera de la

fluorescencia de hojas. Se entiende por fluorescencia verdadera, aquella fluorescencia

que se produce dentro de la hoja y la cual sufre distorsiones por procesos de reabsorción

de luz en su camino hacia los detectores ubicados mayormente fuera de las hojas

(Pedrós et al., 2008).

5.A.1. Introducción

Los espectros de emisión de fluorescencia de hojas intactas obtenidos irradiando

el material vegetal con una muy baja intensidad de luz presentan dos bandas

características, una ubicada en la zona del rojo (alrededor de 680 nm) del espectro

electromagnético y otra banda ubicada en la región del rojo lejano (entre 730-740 nm)

(Govindjee, 1995; Pfündel, 1998; Franck et al., 2002). Si bien esta información es

ampliamente conocida en la actualidad aún existen controversias en cuanto a cuál es el

origen de ambas bandas. Algunos autores sostienen que a temperatura ambiente la

fluorescencia de ambas bandas se debe únicamente a la emisión del fotosistema II

(FSII) y que la contribución del fotosistema I (FSI) es despreciable (Govindjee, 1995;

Gitelson et al., 1998; Buschmann, 2007). Otros autores sugieren que la contribución del

FSI a la banda ubicada en la porción del rojo lejano no es despreciable y que

dependiendo de la especie estudiada y de las condiciones de medición puede variar,

llegando a valores tan altos como 35% y hasta un 50% (Roelofs et al., 1992; Pfündel

1998; Agati et al., 2000; Peterson et al., 2001). Por lo tanto, según estos autores la

148

banda ubicada en el rojo correspondería a la emisión del FSII y la del rojo lejano a la

contribución de ambos fotosistemas (FSII + FSI). Para resolver estas controversias

resulta evidente la necesidad de determinar el origen de la distribución espectral de

hojas intactas. Adicionalmente, esto permitiría una mejor interpretación de la relación

de máximos de intensidad de fluorescencia (Fred/Ffar-red), que es una herramienta

ampliamente utilizada en monitoreo de salud vegetal (Govindjee, 1995; Lichtenthaler,

1999; Agati et al.; 2000), algo que ya pudimos mostrar en capítulos anteriores de esta

tesis.

La idea de utilizar herbicidas surge como una herramienta potencial en el estudio

de la distribución espectral de la fluorescencia de hojas. Utilizando herbicidas

adecuados, cuyos sitios de acción sobre la cadena de transporte de electrones de la

fotosíntesis son altamente específicos, se podrían estudiar los cambios en los espectros

de emisión de la fluorescencia y relacionarlos directamente con la emisión del FSII o

del FSI. Esto significa que si un herbicida en particular permite “apagar” la emisión de

un fotosistema específico, eso se vería reflejado en forma directa en la emisión de la

fluorescencia de hojas.

En este trabajo se utilizaron dos herbicidas cuyos sitios de acción son

ampliamente conocidos: atrazina y paraquat, también llamado metil-viológeno.

La atrazina tiene su sitio de acción en el FSII (Hess, 2000). Actúa inhibiendo el

transporte de electrones en el FSII (ver figura 5.A.1), lo que causa una sobreexcitación

de éste y produce un aumento en la fluorescencia como mecanismo para desactivar el

exceso de energía acumulada allí. Específicamente, la atrazina compite por el sitio de

unión en la proteína D1 con el segundo aceptor de electrones de la cadena fotosintética,

la plastoquinona B (QB) (Hess, 2000; Villarroya et al., 2001). La figura 5.A.2 muestra

el sitio de unión específico en el FSII y la figura 5.A.3 muestran las semejanzas entre

las estructuras químicas de la atrazina y de QB, respectivamente. Los herbicidas del

grupo de las triazinas como los derivados de la urea desplazan a la QB de su lugar de

unión e impiden de esta manera la re-oxidación del primer aceptor de electrones, la

plastoquinona A (QA), el cual permanece reducido y sin posibilidades de aceptar otros

electrones bloqueando de esta forma el flujo de electrones fotosintéticos (Villarroya,

2001). El exceso de energía acumulado se libera mediante una vía competitiva de la

fotosíntesis, en este caso, se incrementa notablemente la emisión de fluorescencia (la

otra vía posible, la disipación térmica no participa en este proceso

(http://www.ab.ipw.agrl.ethz.ch/~yfracheb/flex.htm).

149

5.A.1. Sitio de acción de la atrazina y del metil-viológeno (MV) en la cadena de

transporte de electrones fotosintéticos.

(Fotosistema I: FSI, fotosistema II: FSII, centro de reacción del fotosistema II: P680, centro de reacción del

fotosistema I: P700, primer aceptor de electrones, plastoquinona A: QA, segundo aceptor de la cadena transportadora

de electrones, plastoquinona B: QB)

5.A.2. Sitio de unión específico de la atrazina en la proteína D1 del fotosistema II.

Extraído del trabajo de Hess (Hess, 2000)

5.A.3. Formula química de la atrazina (a), y de la plastoquinona B (QB) (b)

�ESTRO

LUME

�

a b

150

El otro herbicida elegido fue el paraquat, también llamado metil-viológeno

(MV). La figura 5.A.4 presenta su estructura química. El paraquat es un desviador de la

energía fotosintética. Si bien no detiene el flujo de electrones fotosintéticos produce la

generación de radicales libres al capturar los electrones provenientes del FSI en lugar de

la ferrodoxina (Hess, 2000) (ver el sitio de acción del metil-viológeno (MV) en la figura

5.A.1). Las moléculas del paraquat se transforman en un monocatión radicalario cuando

son reducidas por los electrones provenientes del FSI, el catión radicalario rápidamente

dona los electrones hacia el oxígeno molecular que se encuentra en las células

produciendo el radical superoxido además de otras especies reactivas (peróxido de

hidrógeno, y radical hidroxilo) los que causan la degradación de la clorofila y de las

proteínas del FSII además de la disgregación de las membranas celulares (Hess, 2000;

Lin et al., 2007).

5.A.4. Formula química del metil-viológeno (MV) o paraquat.

5.A.2. Materiales y métodos

Se seleccionaron hojas sanas de dos especies vegetales: Ficus benjamina y

Hedera helix. Las hojas elegidas se lavaron con agua destilada y se secaron con papel

absorbente teniendo cuidado de no dañarlas. Luego se cortaron discos de hojas de 30

mm de diámetro los cuales fueron sumergidos en las soluciones de herbicidas durante

24 horas. Paralelamente se sumergieron discos de hoja de ambas especies en agua

destilada para ser utilizados como control. La concentración de la solución de atrazina

fue de 2.32 mM, mientras que la concentración de la solución de paraquat fue de 1 mM.

Transcurridas las 24 horas, los discos fueron secados y mantenidos en oscuridad durante

20 minutos antes de determinar los espectros de emisión de fluorescencia en función de

la longitud de onda de emisión con un espectrofluorómetro de estado estacionario PTI

(Photon Technology International), desde 600 a 800 nm. Los espectros de fluorescencia

se corrigieron por la respuesta de sensibilidad del detector mediante una función

incluida en el software del espectrofotómetro, dichos espectros fueron luego corregidos

por procesos de reabsorción de luz (Lagorio; 1998).

151










5.A.3. Resultados y discusión

Se obtuvieron los espectros de emisión de fluorescencia de hojas control y de

hojas tratadas con atrazina para dos especies vegetales: Ficus benjamina y Hedera helix.

La figura 5.A.5 muestra los espectros de emisión de fluorescencia

experimentales, sólo corregidos por la respuesta de sensibilidad del detector en (a) y los

espectros de emisión de fluorescencia corregidos por procesos de reabsorción de luz en

(b), para hojas de Ficus benjamina controles y para hojas tratadas con atrazina. Mientras

que la figura 5.A.6 muestra los mismos espectros pero en este caso para hojas de

Hedera helix.

Las figuras 5.A.7 y 5.A.8 presentan los espectros de emisión de fluorescencia

experimentales (a) y los espectros de emisión de fluorescencia corregidos por

reabsorción de luz para hojas controles y hojas tratadas con metil-viológeno (MV) para

hojas de Ficus benjamina y para hojas de Hedera helix, respectivamente.

Todas las figuras mencionadas se muestran normalizadas a 737 nm para permitir

una mejor comparación de las relaciones de máximos de fluorescencia Fred/Ffar-red.

152

600 650 700 750 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control sin corregirAtrazina sin corregir


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control corregidosAtrazina corregidos

a

b

Figura 5.A.5. Espectros de Ficus benjamina. Espectros de emisión de fluorescencia

experimentales corregidos por la respuesta de sensibilidad del detector (a) y espectros

de emisión de fluorescencia corregidos por procesos de reabsorción de luz (b) para

hojas control y para hojas tratadas con atrazina

153

600 650 700 750 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control sin corregirAtrazina sin corregir


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control corregidosAtrazina corregidos

a

b

Figura 5.A.6. Espectros de Hedera helix. Espectros de emisión de fluorescencia



hojas control y para hojas tratadas con atrazina

154

600 650 700 750 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control sin corregirMV sin corregir


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control corregidosMV corregidos

a

b

Figura 5.A.7. Espectros de Ficus benjamina. Espectros de emisión de fluorescencia



hojas control y para hojas tratadas con metil-viológeno (MV)

155

600 650 700 750 8000.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control sin corregirMV sin corregir


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Control corregidosMV corregidos

a

b

Figura 5.A.8. Espectros de Hedera helix. Espectros de emisión de fluorescencia



hojas control y para hojas tratadas con metil-viológeno (MV)

156

Las hojas tratadas con atrazina mostraron una relación de máximos Fred/Ffar-red

mayor que los respectivos controles en ambas especies vegetales. Este resultado es

lógico ya que el bloqueo de electrones entre el FSII y el FSI trae aparejado un aumento

en la emisión de la fluorescencia proveniente desde el FSII. Esta tendencia se observa

en forma más nítida en los espectros corregidos por reabsorción que en los espectros no

corregidos. Hay que remarcar que las diferencias observadas son estadísticamente

significativas con un P < 0.05 (Test de Student) y por lo tanto no pueden atribuirse a

error experimental. La tabla 5.A.1 muestra los valores de la relación de máximos de

fluorescencia para ambas especies vegetales tratadas con atrazina.

Tabla 5.A.1. Relación de máximos de fluorescencia para las hojas control y las hojas

tratadas con atrazina

Especie vegetal

Tratamiento

Fred/Ffar-red sin

corregir

Fred/Ffar-red

corregida

Ficus benjamina Control 0.66 ± 0.06 1.91 ± 0.18

Atrazina 0.84 ± 0.07 2.45 ± 0.24

Hedera helix Control 0.68 ± 0.06 1.89 ± 0.17

Atrazina 0.73 ± 0.07 2.06 ± 0.21

Por otro lado, las relaciones Fred/Ffar-red para las hojas tratadas con metil-

viológeno siempre fueron menores que los respectivos controles. Esto se debe a la

destrucción preferencial del FSII por las especies reactivas generadas por el metil-

viológeno. Nuevamente, esta tendencia fue mayor para los espectros corregidos por

procesos de reabsorción. En este caso las diferencias observadas también fueron

estadísticamente significativas con un P < 0.05 y por lo tanto no pueden atribuirse a

error experimental. La tabla 5.A.2 muestra los valores de la relación de máximos para

ambas especies vegetales tratadas con metil-viológeno (MV).

157

Tabla 5.A.2. Relación de máximos de fluorescencia para las hojas control y las hojas

tratadas con metil-viológeno

Especie vegetal

Tratamiento

Fred/Ffar-red sin corregir

Fred/Ffar-red corregida

Ficus benjamina Control 0.58 ± 0.06 1.68 ± 0.17

MV 0.54 ± 0.04 1.57 ± 0.14

Hedera helix Control 0.75 ± 0.07 2.10 ± 0.19

MV 0.64 ± 0.06 1.78 ± 0.17

Ya sea que las relaciones de máximos de fluorescencia (Fred/Ffar-red) aumenten

como en las hojas tratadas con atrazina o que disminuyan respecto de los controles

como en el caso de las hojas tratadas con metil-viológeno, la única explicación posible

para estas variaciones es la existencia de dos especies emisoras en los espectros de

fluorescencia de hojas a temperatura ambiente. Por lo tanto, mediante el uso de los

herbicidas elegidos fue posible confirmar la emisión de ambos fotosistemas en las

condiciones de los experimentos.

5.A.4. Conclusiones

Gracias a la evidencia experimental reunida en este trabajo pudimos dilucidar

que a temperatura ambiente ambos fotosistemas se encuentran emitiendo fluorescencia.

Es necesario recalcar la necesidad de realizar correcciones por reabsorción de luz en los

espectros de emisión de fluorescencia para lograr una correcta interpretación de los

resultados.

Por último, es importante destacar que la alta sensibilidad del método basado en

la fluorescencia de clorofila-a permitió la detección del daño causado por atrazina de

manera anticipada a la aparición de síntomas visuales.

5.A.5. Bibliografía



158





Franck F., Juneau P. y Popovic R. 2002. Resolution of the Photosystem I and

Photosystem II contributions to chlorophyll fluorescence of intact leaves at room

temperature. Biochim. et Biophys. Acta. 1556: 239-246

Gitelson A., Buschmann C. y Lichtenthaler H. 1998. Leaf Chlorophyll Fluorescence

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http://www.ab.ipw.agrl.ethz.ch/~yfracheb/flex.htm

160

Capítulo 5. VARIACIÓN DE LAS PROPIEDADES ÓPTICAS DE HOJAS

FRENTE A SITUACIONES DE TENSIÓN AMBIENTAL

Sección B

5.B. Efecto de la deficiencia de fósforo en la reflectancia y fluorescencia de clorofila

de cotiledones de colza (Brassica napus L.)

Las experiencias presentadas en la sección B del capítulo 5 han sido publicadas

recientemente en un trabajo realizado en colaboración con el grupo dirigido por el Dr.

Augusto García, Instituto de Investigaciones Bioquímicas y Fisiológicas (IBYF),

Facultad de Agronomía, UBA. El trabajo fue publicado en el Journal of Agronomy and

Crop Science y fue titulado: Effect of phosphorus deficiency on reflectance and

chlorophyll fluorescence of cotyledons of oilseed rape (Brassica napus L.) (Yaryura et

al., 2009).

5.B.1. Introducción

Las semillas de colza son importantes para la producción de aceite comestible de

alta calidad, alimentación animal y para la fabricación de biodiesel. Comparadas con

otros cultivos para la fabricación de aceites, las plantas de colza presentan una gran

demanda de nutrientes, incluido el fósforo (Grant y Bailey, 1993). Si bien, el fósforo es

uno de los macronutrientes menos disponibles e inaccesible de los requeridos por las

plantas, juega un rol clave en un gran número de procesos vegetales (Vance et al.,

2003). El fósforo es el sustrato primario de la fotosíntesis y presenta funciones

estructurales en membranas celulares (Iglesias et al., 1993). También regula

enteramente el metabolismo energético de las plantas debido a su presencia en las

moléculas de ATP, ADP, AMP y en moléculas de pirofosfato (Xu et al., 2007), además

participa en procesos de señalización, activación y desactivación de enzimas y procesos

de respiración (Vance et al., 2003). La deficiencia de fósforo produce cambios

morfológicos, fisiológicos y en procesos bioquímicos, tales como el descenso en la

relación raíz/tallo, modificaciones en la arquitectura de la raíz, acumulación de

antocianinas y retrasos en la maduración de las plantas (Rodriguez et al., 1994; Rubio et

al., 2003; Vance et al., 2003; Rubio y Lynch 2007).

161

El estrés de las plantas también puede manifestarse con cambios en sus

propiedades ópticas y propiedades espectroscópicas (Neuner y Larcher, 1990; Ratinam

et al., 1994; Koscielniak y Biesaga-Koscielniak 1999; Rapacz et al., 2008). Esas

variaciones pueden ser utilizadas como herramientas indicativas de estrés, relevantes en

aplicaciones de campo debido a su potencial uso en teledetección. En ese contexto, las

espectroscopias de reflectancia y fluorescencia son métodos de diagnósticos rápidos y

no-destructivos que permiten detectar y cuantificar situaciones de tensión ambiental y

daños al aparato fotosintético de las hojas (Mino et al., 1998; Merzlyak et al., 2003;

Papageorgiou, 2004).

En las zonas del rojo y del rojo lejano del espectro electromagnético, la emisión

de fluorescencia en plantas es causada principalmente por la clorofila-a. Esta

fluorescencia como ya mencionamos anteriormente está caracterizada por dos bandas

(una banda en el rojo, alrededor de 687 nm y una banda en el rojo lejano, alrededor de

737 nm). La relación de máximos de fluorescencia Fred/Ffar-red obtenida de dichos

espectros es un parámetro que ha sido correlacionado con diferentes factores de tensión

anteriormente (Lichtenthaler y Rinderle, 1988; Agati et al., 1993 y 2000; Subhas et al.,

1999).

Las hojas de las plantas también emiten en la porción azul y verde del espectro

electromagnético. La fluorescencia del azul esta caracterizada por un máximo alrededor

de 530 nm. Como fuera reportado previamente (Lang et al., 1991), esta emisión tiene

su origen en las paredes celulares. Las sustancias fenólicas tales como el ácido

clorogénico, ácido caféico, cumarinas y estilbenos pueden ser los responsables por la

emisión de fluorescencia azul. Mientras que las sustancias como la berberina y la

quercetina son responsables por la fluorescencia en el verde (Lang et al., 1991).

La principal propuesta de este trabajo fue evaluar los efectos producidos por la

falta de fósforo en las propiedades espectroscópicas de hojas y cotiledones y evaluar la

emisión de fluorescencia y la reflectancia como posibles indicadores prematuros de

estrés en plantas de colza.

Si bien, el análisis espectroscópico de cotiledones ha sido estudiado escasamente

(Vertucci et al., 1985; Lebkuecher et al., 1999), este parece ser adecuado para detectar

estrés inducido por falta de fósforo en estadíos tempranos del desarrollo de plantas.

Por otro lado, es sabido que la carencia de fósforo produce la destrucción del

fotosistema II en diferentes plantas (Jacob y Lawlor, 1993). En este contexto, el

segundo objetivo de este trabajo fue evaluar la posibilidad de detectar daños en el

162

fotosistema II a través de la interpretación de los espectros de fluorescencia de clorofila.

Para lograr interpretaciones correctas de los resultados se efectuaron las correcciones

correspondientes para tener en cuenta los procesos de reabsorción de luz en los

espectros de emisión de fluorescencia (Lagorio, 1998), algo que se realiza por primera

vez en cultivos de interés para la industria alimenticia.

5.B.2. Materiales y métodos

5.B.2.1. Condiciones de crecimiento de las plantas

Las superficies de las semillas de colza (Brassica napus L.) se desinfectaron por lavado

con solución de NaOCl al 3% de durante 10 minutos, luego se enjuagaron tres veces

con agua destilada estéril. Las semillas desinfectadas y pre-germinadas (dos días a 25

°C en la oscuridad) se transfirieron a tubos de vidrio conteniendo 20 ml de solución

mineral estéril descripta por Murashige y Skoog (Murashige y Skoog, 1962). Se

prepararon dos tipos de soluciones minerales: una con fosfato de potasio (+P) y otra sin

fosfato de potasio (-P). La concentración de potasio se mantuvo en un nivel constante

por la adición de KCl. Previamente se insertaron dentro de los tubos de vidrio filtros de

papel con la forma de una U invertida como soporte mecánico para las semillas. Las

plantas crecieron en una agitador orbital (Vicking Shaker pro; Vicking S.A., Buenos

Aires, Argentina) a 140 rpm, colocado en una cámara de crecimiento donde se

mantuvieron ciclos de 16 hora de luz y 8 horas de oscuridad. La luz utilizada (densidad

de flujo fotónico fotosintético de 200 µmol m-2 s-1) provino de tubos fluorescentes

marca Phillips TLD 865 (Phillips B.V., Amsterdam, Países Bajos). La temperatura se

mantuvo en 22 ± 2 °C. Las plantas se dejaron crecer hasta que las primeras hojas

estuvieron completamente expandidas (alrededor de 30-35 días luego de ser

transplantadas).

5.B.2.2. Determinación del contenido de pigmentos

Se determinaron los contenidos de clorofila-a, clorofila-b, carotenoides y

antocianinas en hojas y cotiledones. Para ello, alrededor de 0.1-0.2 g de tejido vegetal

(un cotiledón entero o una hoja) se colocaron en un mortero el cual contenía la mitad de

su volumen lleno con nitrógeno líquido, luego el tejido vegetal se molió. Los pigmentos

se extrajeron de la muestra molida añadiendo 2.0 ml de solvente de extracción (acetona

85% y buffer Tris 15%, la concentración final del buffer fue 1% m/v, pH = 8 ajustado

163

con HCl) previamente enfriado en hielo. El extracto se centrifugó a 12000 g durante 3

minutos. Se removió luego una cantidad definida del sobrenadante (1 ml) y se diluyó

hasta 3.0 ml. Se determinaron las absorbancias a 537, 663, 647 y 470 nm en una celda

de 1 cm de paso óptico. Los contenidos de pigmentos se calcularon de acuerdo con las

ecuaciones 2.23 a 2.26 propuestas por Sims y Gamon en 2002, ver 2.3. Materiales y

métodos del Capítulo 2 de esta tesis.

5.B.2.3. Mediciones de reflectancia

Se registró la reflectancia difusa como una función de la longitud de onda desde

300 hasta 800 nm para grupos de cotiledones apilados (reflectancia infinita,

transmitancia cero). Estas mediciones fueron realizadas según la descripción previa del

Capítulo 2 de esta tesis (sección 2.3. Materiales y métodos). A partir de estas

mediciones se calcularon las funciones de remisión en función de la longitud de onda de

acuerdo con la ecuación 2.10. de la sección 2.2.1. Teoría de Kubelka-Munk).

5.B.2.4. Mediciones de fluorescencia

Las mediciones de fluorescencia se realizaron según la descripción del Capítulo

3 (ver 3.3. Materiales y métodos). Las medidas de fluorescencia se llevaron a cabo

sobre hojas y cotiledones intactos. La longitud de onda de excitación para los espectros

de la región del rojo-rojo lejano fue 460 nm, mientras que para los espectros en la

región del azul-verde la longitud de onda de excitación fue 340 nm. Los espectros se

registraron entre 600 nm y 800 nm para los espectros excitados a 460 nm y desde 400

nm y 600 nm para los espectros excitados a 340 nm. Todos los espectros se corrigieron

por la respuesta de sensibilidad del detector y por procesos de reabsorción de luz de

acuerdo con las ecuaciones 3.4 y 3.5 de la sección 3.2. Base teórica de los modelos

para corrección por procesos de reabsorción de luz del Capítulo 3 de esta tesis.

5.B.3. Resultados y discusión

5.B.3.1. Determinación del contenido de pigmentos

El contenido de los pigmentos de hojas y de cotiledones de plantas estresadas y

de plantas controles de colza son presentados en la tabla 5.B.1.

164

Tabla 5.B.1. Contenido de pigmentos en hojas y cotiledones estresados (-P) y control

(+P)

El análisis estadístico fue realizado usando el método ANOVA. Todos los datos

representan el promedio ± la desviación estándar de al menos tres series independientes

de experimentos. Los superíndices *, **, *** denotan el grado de significancia

estadística < 0.05, 0.01, y 0.001, respectivamente, DNS para las diferencias no

significativas (Test de Tukey). Plantas control: +P y Plantas sin fósforo: –P.

El estrés por falta de fósforo produjo un aumento en el contenido total de

clorofila, carotenoides y antocianinas en hojas y en cotiledones. La relación clorofila-

a/clorofila-b no se alteró significativamente.

El incremento de las antocianinas es un síntoma en varios procesos de estrés con

fósforo (Close y Beadle 2003; Jiang et al., 2007). Sin embargo, la biosíntesis de estos

pigmentos es inducida por muchos otros factores de tensión tales como radiación visible

y UV, drogas, bajas temperaturas, deficiencia de nitrógeno, bajo pH e infección por

patógenos (Bergmann 1992; Trull et al., 1997; Chalker-Scott, 1999). Como

consecuencia, su acumulación no debería ser considerada como una respuesta específica

a la falta de fósforo, pero es un indicador indirecto o respuesta secundaria (Trull et al.,

1997). Como regla general, las antocianinas son consideradas atenuadores de la luz y

antioxidantes. En este contexto su principal función es eliminar a las especies reactivas

del oxígeno generadas por el estrés (Neill y Gould, 2003).

Cotiledones Hojas

Contenido de pigmentos

(µµµµmol/g peso fresco) -P +P -P +P

Clorofila-a 0.36 ± 0.06** 0.15 ± 0.02** 0.62 ± 0.07 * 0.31 ± 0.04 *

Clorofila-b 0.17 ± 0.02** 0.08 ± 0.01** 0.25 ± 0.03 * 0.14 ± 0.02 *

Clorofila total 0.53 ± 0.08 ** 0.23 ± 0.02** 0.87 ± 0.09 * 0.46 ± 0.06 *

Clorofila-a/clorofila-b 2.03 ± 0.11 DNS 1.97 ± 0.05 DNS 2.45 ± 0.18 DNS 2.19 ± 0.07 DNS

Carotenoides 0.30 ± 0.02*** 0.15 ± 0.02*** 0.41 ± 0.04 * 0.24 ± 0.03 *

Antocianinas 0.24 ± 0.05* 0.08 ± 0.03* 0.29 ± 0.09 * 0.07 ± 0.0013*

165

La tabla 5.B.2 muestra los pesos de las raíces y de los tallos de las plantas

tratadas y de los controles.

Tabla 5.B.2. Valores de peso seco de tallos y raíces en plantas estresadas (-P) y no

estresadas (+P)

+P (mg)

–P (mg)

Tallo 59.63 ± 2.20** 21.83 ± 1.30**

Raíz 5.12 ± 0.40** 10.21 ± 0.30**

Raíz/Tallo 0.09 ± 0.01** 0.45 ± 0.03**

Nuevamente, el análisis estadístico fue realizado usando el método ANOVA.

Todos los datos representan el promedio ± la desviación estándar de al menos tres series

independientes de experimentos. El superíndice ** denota el grado de significancia

estadística (< 0.01 según Test de Tukey). Plantas control: +P y Plantas sin fósforo: –P.

De acuerdo con los datos de la tabla 5.B.2, la carencia de fósforo decrece el tallo

y aumenta el peso de las raíces produciendo un aumento en la relación Raíz/Tallo.

Los resultados obtenidos para la relación Raíz/Tallo en Brassica napus L.

resultaron similares a aquellos obtenidos con otros cultivos tales como Helianthus

annus L. (girasol) (Plesnicaronar et al., 1994) y Arabidopsis thaliana donde se mostró

que las bajas concentraciones de fosfato en el medio inhiben la tasa de crecimiento e

incrementan la proliferación de las raíces (Jiang et al., 2007). Los cambios observados

en los patrones de los órganos superiores e inferiores al ser afectados por el nivel de

fósforo son muy conocidos. Cuando los elementos minerales, tales como el fósforo, son

escasos, las plantas a menudo derivan una mayor proporción de su biomasa hacia el

sistema de raíces. Esta respuesta es una consecuencia a los cambios metabólicos en los

tallos y un ajuste en el transporte de carbohidratos hacia las raíces (Herman et al.,

2006).

5.B.3.2. Mediciones de reflectancia

Las figuras 5.B.1 y 5.B.2 presentan los espectros de reflectancia de hojas y de

cotiledones, respectivamente. Adicionalmente, ambos gráficos muestran las derivadas

166

primeras de los espectros de reflectancia correspondientes. Los espectros de reflectancia

mostrados resultan del promedio de cinco determinaciones.

300 400 500 600 700 800

Ref

lect

anci

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


300 400 500 600 700 800

Der

ivad

a de

la r

efle

ctan

cia

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

A

B

167

Figura 5.B.1. (A) Espectros de reflectancia promedios de hojas estresadas ( ) y de

hojas control ( ). (B) Primera derivada de los espectros de reflectancia de hojas

estresadas ( ) y hojas control ( )

300 400 500 600 700 800

Ref

lect

anci

a

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


300 400 500 600 700 800

Der

ivad

a de

la r

efle

ctan

cia

-0.005

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

A

B

168

Figura 5.B.2. (A) Espectros de reflectancia promedios de cotiledones estresados ( ) y

de cotiledones control ( ). (B) Primera derivada de los espectros de reflectancia de

cotiledones estresados ( ) y cotiledones control ( )

El efecto más pronunciado de la falta de fósforo tanto en los espectros de

reflectancia de hojas como en los espectros de cotiledones fue el descenso en los valores

de reflectancia entre 500-650 nm (P < 0.0005, test de Tukey para hojas y cotiledones).

El nivel de fósforo no afectó significativamente la reflectancia en la zona del

rojo del espectro electromagnético. En el intervalo del rojo lejano, la reflectancia de las

hojas resultó menor para las plantas estresadas y mayor para los cotiledones

provenientes de las mismas plantas.

Los espectros de reflectancia de hojas (figura 5.B.1 (A)) y de cotiledones (figura

5.B.2 (A)) no muestran diferencias significativas entre las plantas tratadas y las plantas

control para las longitudes de onda que van desde los 300 nm y hasta 500 nm. De

hecho, en esta región, la clorofila-a, clorofila-b y los carotenoides presentan una

absorción tan alta que la señal de reflectancia probablemente se vea saturada y las

diferencias en las concentraciones de pigmentos no pueden verse reflejadas en dichos

espectros. El análisis de la primera derivada (Gitelson y Merzlyak, 1994) en esta región

tampoco muestra diferencias importantes entre las plantas control y las plantas

estresadas (ver figuras 5.B.1 (B) y 5.B.2 (B)).

Sin embargo, se encontraron importantes diferencias entre las plantas control y

las plantas estresadas, para tanto hojas como cotiledones en la región entre 500 y 600

nm. Dado que las antocianinas típicamente absorben alrededor de 530 nm, el mayor

contenido de estos pigmentos en las plantas estresadas (ver Tabla 5.B.1) producen

mayor absorción y menor reflectancia en la región del verde (Figuras 5.B.1 (A) y 5.B.2

(A)). El efecto fue más pronunciado para cotiledones que para hojas. Las antocianinas

son las responsables por el color rojizo que se observó en las hojas y cotiledones

estudiados en este trabajo. Como previamente observaran Neill y Gould en 1999, el

color rojo no se debe a una mayor reflectancia en la región del rojo sino a la sustracción

de las longitudes de onda del verde de la luz reflejada. La primera derivada de la

reflectancia en esta región también presenta un comportamiento diferente entre las

especies estresadas y los controles. En este caso, incluso cuando la posición de los

máximos y los mínimos son los mismos, la amplitud de la derivada resultó menor para

169

las plantas estresadas. Las señales derivadas muestran un cambio importante (desde

positivo a negativo) cerca de 553 nm.

Desde los 600 nm hasta los 700 nm, las propiedades de la reflectancia están

determinadas por el contenido de clorofila. El mayor contenido de clorofila en las

plantas estresadas se manifestó como un descenso en la reflectancia entre los 600 y 650

nm, principalmente para cotiledones. Desde 650 hasta 700 nm, ni hojas ni cotiledones

mostraron diferencias significativas. Los mayores valores de absorbancia alrededor de

680 nm inducidos por altas concentraciones de clorofila produjeron la saturación de la

señal de reflectancia y por lo tanto no permitieron la detección de diferencias en la

concentración de pigmentos.

Las pendientes de las derivadas fueron muy elevadas desde 680 nm hasta los 700

nm, pero no pueden ser consideradas como diferencias características entre las plantas

estresadas y no-estresadas.

En la región del rojo lejano, a longitudes de onda superiores a 700 nm, la

reflectancia usualmente está determinada por la estructura del material (Slaton et al.,

2001) y las diferencias en esta región no pueden ser relacionadas con la concentración

de pigmentos. En el caso de los cotiledones, donde las diferencias resultaron más

importantes, los valores mayores de reflectancia en las plantas crecidas con carencia de

fósforo pueden deberse al mayor espesor de los cotiledones que adicionalmente se veían

más esponjosos que los cotiledones provenientes de plantas control.

En conclusión, en los espectros de reflectancia, los valores en la región entre 530

nm y 555 nm para los espectros de cotiledones mostraron la respuesta más sensible a la

deficiencia de fósforo. Para caracterizar los datos de reflectancia, se calcularon las

profundidades de absorción a 680 nm de acuerdo con el trabajo de Run-he-Shi et al. del

año 2006. En hojas, los valores de las profundidades de absorción fueron de 0.087 y

0.114 para plantas control y estresadas, respectivamente. En cotiledones, los valores

fueron similares: 0.150 para el control y 0.166 para plantas carentes de fósforo. La

similitud entre los valores de las profundidades de absorción a 680 nm no es sorpresiva

dado que pequeñas diferencias en las bandas de absorción a esta longitud de onda

pueden ser observadas en los espectros de reflectancia. De este análisis surge la

conclusión de que el uso de la profundidad de absorción a 680 nm no es un buen

parámetro para evaluar deficiencias de fósforo.

5.B.3.3. Mediciones de fluorescencia

170

El fósforo no mostró efectos significativos en los espectros de emisión de

fluorescencia de las hojas de colza (resultados no mostrados aquí). En contraste, se

detectaron cambios significativos en cotiledones. Los resultados de la emisión

fluorescente en la región del rojo-rojo lejano se muestran en la figura 5.B.3. Los

espectros experimentales son el promedio de cinco muestras corregidas por la respuesta

del detector. Los espectros se muestran normalizados en 737 nm para permitir una

mejor comparación entre las distribuciones espectrales.


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Fred

/Ffar-red

= 1.35

Fred

/Ffar-red

= 0.87

Figura 5.B.3. Espectros de emisión de fluorescencia experimentales de cotiledones

estresados ( ) y cotiledones control ( ). Los espectros han sido corregidos por la

respuesta del detector y normalizados a 737 nm

La relación experimental de máximos, Fred/Ffar-red, resultó mayor para los

controles que para las plantas estresadas. Las desviaciones estándar de los valores

experimentales promedios fueron menores que el 20% en todos los casos. Por lo tanto,

las diferencias observadas inducidas por el estrés fueron significativas de acuerdo con el

test-t (P < 0.05).

171

La figura 5.B.4 presenta los espectros de emisión de fluorescencia

experimentales de cotiledones en la zona del azul-verde del espectro electromagnético.

Los espectros son el promedio de cinco determinaciones y han sido normalizados en

470 nm para una mejor comparación.


400 450 500 550 600

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

Fblue/Fgreen = 0.64

Fblue/Fgreen = 1.69

Figura 5.B.4. Espectros de emisión de fluorescencia experimentales promedios de

cotiledones estresados ( ) y cotiledones control ( ). Los espectros han sido

corregidos por la respuesta del detector y normalizados en 470 nm

Las medidas de fluorescencia en la región del azul-verde fueron

significativamente menores a 570 nm en los cotiledones de plantas estresadas. La

dispersión de los datos experimentales fue muy amplia, especialmente para las plantas

sometidas a la carencia de fósforo. La relación F470/F560 muestra una desviación de los

promedios desde un 14% para los cotiledones controles hasta un 45% para los

cotiledones estresados. En hojas no se encontraron diferencias significativas en los

espectros de fluorescencia en esta zona del espectro (datos no mostrados).

172

La corrección de los espectros experimentales de fluorescencia por reabsorción

de luz fue realizada calculando la función de corrección, Gamma, y luego dividiendo los

espectros experimentales por esta función (Lagorio et al., 1998).

Un análisis detallado de la función de corrección para la región del rojo muestra

valores bajos (correspondientes a procesos de reabsorción importantes) entre 600 y 700

nm y altos valores a longitudes de onda mayores, ver figura 5.B.5.


600 650 700 750 800

Func

ión

γ

0.0

0.4

0.8

Figura 5.B.5. Función Gamma para cotiledones estresados ( ) y cotiledones control

( ) en función de la longitud de onda. Calculada para una longitud de onda de

excitación de 460 nm. Las áreas sombreadas muestran la desviación estándar de las

mediciones

La función gamma utilizada para corregir los espectros de fluorescencia en la

región azul-verde muestra valores bajos (alta reabsorción) en todo el intervalo, esto

puede verse en la figura 5.B.6. Las diferencias entre los cotiledones control y los

estresados para longitudes de onda menores a 500 nm se encuentran dentro del error

experimental.

173


400 450 500 550 600

Func

ión

γ

0.0

0.4

0.8

Figura 5.B.6. Función Gamma para cotiledones estresados ( ) y cotiledones control

( ) en función de la longitud de onda. Calculada para una longitud de onda de

excitación de 340 nm. Las áreas sombreadas muestran la desviación estándar de las

mediciones

Cuando se aplican las funciones de corrección mencionadas a los datos

experimentales, se obtienen los espectros verdaderos para las regiones del rojo-rojo

lejano (figura 5.B.7) y para las regiones del azul-verde (figura 5.B.8).

174


600 650 700 750 800

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0

1

2

3

4

Fred

/Ffar-red

= 2.89

Fred

/Ffar-red

= 1.91

Figura 5.B.7. Espectros de emisión de fluorescencia en la zona del rojo-rojo lejano

corregidos por reabsorción de luz (promedios de cinco determinaciones), para

cotiledones estresados ( ) y cotiledones control ( ). Los espectros han sido

normalizados a 737 nm. Las áreas sombreadas muestran las desviaciones estándar de los

resultados

Los espectros de emisión corregidos en la figura 5.B.7 muestran que la relación

de máximos de fluorescencia Fred/Ffar-red permanece menor para los cotiledones

estresados que para los controles, la diferencia es estadísticamente significativa (P <

0.05) y no puede atribuirse a error experimental. Se encontraron las mismas diferencias

en los espectros corregidos de la región azul-verde (figura 5.B.8), donde la intensidad de

fluorescencia a 550 nm es relativamente menos importante para los cotiledones

estresados.

175


400 450 500 550 600

Inte

nsid

ad d

e fl

uore

scen

cia

(u.a

.)

0.0

0.5

1.0

1.5

Fblue/Fgreen = 1.16

Fblue/Fgreen = 2.30

Figura 5.B.8. Espectros de emisión de fluorescencia en la región azul-verde corregidos

por reabsorción de luz (promedios de cinco determinaciones), para cotiledones

estresados ( ) y cotiledones control ( ). Los espectros han sido normalizados a

737 nm. Las áreas sombreadas muestran las desviaciones estándar de los resultados

La relación de fluorescencia en el rojo (F680/F737) (figura 5.B.3) y la relación de

fluorescencia en la región azul-verde (Fblue/Fgreen) (figura 5.B.4) de los espectros de

emisión de fluorescencia experimentales de los cotiledones también resultaron

herramientas sensibles. La relación en el rojo cambia desde 1.35 en cotiledones control

a 0.87 en cotiledones estresados y la relación en el azul-verde cambia desde 0.64 a 1.69

para cotiledones control y estresados, respectivamente. Sin embargo, estas relaciones de

fluorescencia no mostraron diferencias significativas en hojas. Los cotiledones son una

de las partes de las plantas más rápidamente afectadas por la carencia de fósforo, dado

que ellos contienen los mayores reservorios de este mineral como ácido fítico, el cual es

convertido subsecuentemente en fósforo inorgánico por las fitasas para luego trasladarse

hacia el resto de la planta (Mitchell y Allsopp, 1984). Se ha mostrado previamente en

literatura que diferentes órganos de la misma planta pueden diferir en su sensibilidad a

176

un estrés particular (Yusufov y Alieva, 2002). Estos hechos experimentales soportan la

decisión de incluir los cotiledones como puntos clave para detectar estrés tan pronto

como sea posible.

Las variaciones en los espectros de fluorescencia causadas por estrés son muy

claras y significativas, aunque la interpretación de los factores que llevan a estos

cambios no es tan directa.

Para analizar la emisión en el rojo, hay que tener cuenta los siguientes puntos: (i)

bajo las condiciones experimentales (flujo fotónico de excitación bajo y temperatura

ambiente), ambos fotosistemas contribuyen al espectro de absorción, (ii) FSII es

responsable de la emisión a 680 nm, mientras que FSI es responsable de la emisión a

737 nm y (ii) la contribución de FSI puede ser mayor que el 50% (Agati, 1998; Pfündel,

1998). Adicionalmente, la distribución espectral de la emisión de fluorescencia sufre

distorsiones por procesos de reabsorción (Ramos y Lagorio, 2004). Entonces, los

cambios en la relación experimental Fred/Ffar-red pueden deberse a diferencias en la

reabsorción de luz o a variaciones en la emisión de un fotosistema respecto al otro.

Dado que la banda de emisión a 687 nm se superpone con el espectro de absorción de la

clorofila, el descenso en la relación de fluorescencia Fred/Ffar-red (figura 5.B.3.) es

consistente con un mayor contenido de clorofila en los cotiledones de plantas

estresadas. Sin embargo, otra alternativa para el descenso observado en esta relación

puede ser debido al daño causado al FSII el cual ha sido bien documentado en

bibliografía cuando se induce estrés por falta de fósforo (Jacob y Lawlor, 1993). Para

separar ambos factores, los espectros experimentales de fluorescencia deben ser

corregidos por los procesos de reabsorción de luz y de esta manera cualquier diferencia

remanente puede ser atribuida a diferencias en la contribución relativa de cada

fotosistema a la emisión.

Debido a razones experimentales (pequeño tamaño de los cotiledones frente al

área de muestreo necesario por el espectrofotómetro utilizado en estas experiencias) se

decidió utilizar el modelo de corrección por reabsorción de fluorescencia desarrollado

por Lagorio et al. (1998) en vez otros dos modelos existentes en literatura (Cordon y

Lagorio, 2006). El modelo de Lagorio fue validado en hojas por Ramos y Lagorio en

2004 (para ver una comparación exhaustiva de los tres modelos de corrección ver el

Capítulo 3 de esta tesis).

La función Gamma calculada para la corrección de la emisión en el rojo y rojo

lejano muestra que los valores a 680 nm fueron menores a 0.28 (ver figura 5.B.5). Este

177

resultado muestra la importancia de los procesos de reabsorción a 680 nm, donde la

intensidad de emisión debió ser multiplicada por un factor de alrededor de 3.6 (1/0.28)

para producir el valor correcto. La banda de emisión a 737 nm, por el otro lado, fue

afectada por un factor mucho menor (alrededor de 1.4). Esto es coherente con el hecho

de que la superposición entre la absorción de los pigmentos y la emisión de la clorofila

es mucho mayor en la banda ubicada a 680 nm que en la banda centrada a 737 nm.

Cuando se compararon los cotiledones estresados con los cotiledones control, la

primera característica relevante fueron los valores bajos en la función Gamma de los

cotiledones estresados en la región entre 600 y 650 nm. Este resultado puede ser

explicado por la mayor proporción de antocianinas y clorofilas halladas en los

cotiledones estresados. Sin embargo, los valores de Gamma dentro del error

experimental fueron similares para longitudes de onda mayores que 650 nm. Este

resultado puede ser explicado por la alta absorción de la muestra a la longitud de onda

de excitación, y la subsecuente baja penetración de la luz. Luego de aplicar el modelo

de corrección a los datos de la figura 5.B.3., aun subsisten diferencias en la relación de

fluorescencia. Este resultado es consistente con un posible daño al FSII durante el

estrés. Se han reportado daños al FSII para plantas de girasol y de maíz crecidas bajo

deficiencias de fosfato (Jacob y Lawlor, 1993) y también fue identificado en muchos

otros procesos. El FSII es muy sensible a las condiciones medioambiente de las plantas

incluyendo su estatus nutricional. De hecho, el FSII ha sido identificado como el blanco

principal del daño fotoinhibitorio cuando las plantas son sometidas a condiciones

extremas de tensión (Chow et al., 1989). Más específicamente, ha sido probado que la

carencia de fósforo produce fotoinhibición del FSII (Jacob y Lawlor, 1993). Deo y

Biswal (2001) encontraron que la falta de agua también induce daño al FSII en

cotiledones.

La relación clorofila-a/clorofila-b fue la misma para cotiledones estresados y

controles. Este hecho no entra en controversia con la reducción observada en FSII luego

del estrés ya que ha sido mostrado que la actividad del FSII puede disminuir para

cotiledones estresados manteniéndose la relación clorofila-a/clorofila-b constante

(Ghosh et al., 2001).

El análisis de los espectros de emisión experimentales en la región azul-verde

mostró una reducción relativa a 560 nm que puede ser explicada por la presencia de

grandes cantidades de antocianinas en los cotiledones estresados. El espectro de

178

absorción de antocianinas presenta un máximo entre 500 y 600 nm (Moreira et al.,

2003), por lo tanto se superpone con la emisión de fluorescencia en esta región.

La corrección utilizando la función Gamma también se calculó para la emisión

en la región del azul-verde (figura 5.B.6). Para longitudes de onda mayor que 500 nm,

la función de corrección fue menor (mayor reabsorción) para las plantas estresadas de

acuerdo con su mayor contenido de pigmentos (particularmente antocianinas). Para

longitudes de onda menores que 600 nm, las diferencias en la función Gamma fue

menor.

La relación de fluorescencia corregida F470/F560 llego a ser incluso más alta para

cotiledones estresados que la relación no corregida (diferencias significativas, P < 0.005

de acuerdo con el test-t). Este hecho parece indicar que las diferencias en el contenido

de antocianinas no pueden explicar enteramente las diferencias en los espectros

experimentales.

5.B.4. Conclusiones

El presente estudio revela que la carencia de fósforo puede ser detectada

tempranamente por un importante descenso en los valores entre 500 y 600 nm de los

espectros de reflectancia para hojas y para cotiledones. El efecto es más pronunciado

para cotiledones que para hojas.

Si bien la separación de los cotiledones de las hojas en imágenes obtenidas por

teledetección a través de monitoreo satelital es imposible, la sensibilidad extra de los

cotiledones puede ser aprovechada a distancias pequeñas en experiencias a campo.

La fluorescencia tampoco es adecuada para monitoreo remoto en hojas donde no

se hallaron diferencias. Sin embargo, en estudios realizados a campo, la fluorescencia

puede ser una herramienta sensible cuando se utilizan cotiledones y presenta ventajas

frente a la reflectancia ya que no sólo provee información del estrés si no que también

permiten obtener información de los daños sufridos por los fotosistemas de las plantas

cuando se analizan las regiones del rojo y rojo lejano del espectro electromagnético.

Es necesario destacar que para aplicaciones prácticas, el uso del modelo de

corrección para tener en cuenta los procesos de reabsorción no es necesario dado que los

datos experimentales también mostraron cambios. Sin embargo, el uso de los modelos

de corrección que permiten la sustracción de los procesos de reabsorción tiene

179

consecuencia interesantes ya que proveen información adicional de los aspectos

fisiológicos causados por el estrés (Cordon y Lagorio, 2006).

5.B.5. Bibliografía


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185

Capítulo 6.

IMÁGENES DE HOJAS

186

Capítulo 6. IMÁGENES DE HOJAS

6.1. Introducción

En el trabajo cotidiano en agronomía es usual predecir la deficiencia de

nutrientes a partir de la observación de síntomas visuales. Por ejemplo, el

amarillamiento de las hojas más antiguas de una planta (las hojas cercanas a las raíces)

podría estar indicando carencia de nitrógeno. Es sabido que este macronutriente se

comporta dentro de las plantas como un elemento muy móvil. Por lo tanto, cuando

existe déficit de nitrógeno en el suelo éste es rápidamente transportado desde las hojas

más antiguas hacia las hojas más jóvenes como recurso de aclimatación para no afectar

el normal desarrollo de las plantas. Esto es lo que provoca el fenómeno de clorosis

(amarillamiento de las hojas producido por insuficiencia de clorofila) en las hojas

antiguas empobrecidas de nitrógeno. Algunas especies pueden presentar coloración

purpúrea causada por la acumulación de pigmentos antociánicos en respuesta a la

carencia de nitrógeno (Bonilla, 2000).

Otro ejemplo muy conocido es el enrojecimiento de las hojas adultas de las

plantas sometidas a la carencia de fósforo. La acumulación de antocianinas en las hojas

es la responsable de este fenómeno visual tan conocido. En algunas especies se observa

un color verde intenso debido a la carencia de fósforo en contraste a lo observado con la

deficiencia de nitrógeno (Bonilla, 2000). Estos son sólo dos ejemplos pero en

agronomía abunda este tipo de observaciones prácticas para evaluar y posiblemente

corregir el aporte de nutrientes en el suelo de los cultivos mediante la fertilización.

Resulta intuitivo pensar entonces que el color de las hojas es un indicador del

contenido de clorofila y otros pigmentos tales como antocianinas. El contenido de

pigmentos a su vez es indicador del metabolismo de las plantas (Kawashima y

Nakatani, 1998). Por lo tanto, resulta lógico pensar en la posible aplicación de imágenes

de color de hojas a la evaluación no-destructiva de la salud vegetal. De hecho, existe

bibliografía donde utilizan imágenes digitales y análisis de color en la evaluación de la

influencia de factores de tensión ambiental sobre la salud foliar. Estos ejemplos

incluyen tensión por falta de agua y nitrógeno (Ahmed y Reid, 1996), baja temperatura

(Bacci et al., 1998), senescencia (Adamsen et al., 1999; Schaberg et al., 2008) y

enfermedades como moho de la hoja de café (Price et al., 1993). La metodología

187

utilizada para la captura de las imágenes varía en los diferentes trabajos. Por ejemplo, en

el trabajo de Kawashima y Nakatani se utilizó una video cámara (Kawashima y

Nakatani, 1998) mientras que tanto en el trabajo de Murakami y colaboradores como en

el trabajo de Schaberg y colaboradores se utilizaron imágenes escaneadas de hojas

(Murakami, 2005; Schaberg, 2008). En un trabajo publicado recientemente Richardson

y colaboradores implementaron la captura de imágenes con un cámara Web comercial

(Richardson, 2007).

El desarrollo de la metodología que se presenta en este trabajo de tesis evidencia

un gran potencial debido al bajo costo de implementación, ya que simplemente requiere

un escáner comercial y un programa de procesamiento de datos adecuado.

Adicionalmente, este método posee ventajas prácticas como procedimiento alternativo

al análisis de pigmentos por métodos químicos tradicionales. Mientras los métodos

químicos son destructivos y consumen mucho tiempo y trabajo de laboratorio, los

métodos de adquisición de imágenes se realizan rápidamente sobre material vegetal

intacto y permitiendo resolución espacial. Por último, es necesario destacar la relevancia

de este método diagnóstico aplicado a la agricultura y al manejo de recursos forestales.

Dentro de este trabajo de tesis la aplicación de imágenes de color de hojas sienta

las bases para el estudio de la distribución espacial del contenido de pigmentos en tejido

foliar. El objetivo principal de este trabajo fue encontrar una correspondencia entre el

contenido de pigmentos de las hojas con los valores digitales de color de cada imagen

para así poder desarrollar un algoritmo que permitiera estimar el contenido de clorofila

y de antocianinas de las hojas utilizando simplemente imágenes obtenidas con un

escáner comercial.

6.1.1. Conceptos básicos sobre color y visión de color

Es ampliamente conocido que el color no es una propiedad intrínseca de las

cosas. La percepción del color es un proceso cerebral el cual comienza en los receptores

ubicados en los ojos (Pascale, 2002).

En la parte trasera de la esfera ocular se encuentran las células fotosensibles

llamadas conos y bastones. Tanto los bastones como los conos contienen pigmentos los

cuales luego de absorber un fotón de luz cambian su estructura molecular y liberan

energía. Los cambios que sufren las moléculas de pigmento producen una señal

eléctrica que es recibida por el cerebro donde se forma la imagen.

188

Los bastones son sensibles a niveles muy bajos de iluminación y son los

responsables de la capacidad de visión cuando hay poca luz (visión escotópica). El

máximo de sensibilidad de los bastones se halla a 510 nm. La visión escotópica carece

de color y por lo tanto es monocromática. Son los conos los que proporcionan la visión

de color (Smith y Pokorny, 2003).

Los conos exhiben sensibilidad a distintas longitudes de onda. Existen tres clases

de conos los que presentan su máxima capacidad de absorción hacia los 445 (violeta),

540 (azul verdoso) y 560 nm (amarillo verdoso) se suelen denominar conos cortos,

conos medios y conos largos por el tipo de longitud de onda al que son sensibles (Smith

y Pokorny, 2003), ver figura 6.1.

nm vs VsBird


300 400 500 600 700

Sen

sibi

lida

d

0.0

0.3

0.6

0.9

S M L

Figura 6.1. Ubicación en el espectro electromagnético de los máximos de absorción de

los bastones y los conos (extraído del trabajo de Smith y Pokorny, 2003)

La teoría tricrómica postulada por Young en 1802, y posteriormente por

Helmholtz, postulaba que la mayoría de los colores se podían igualar superponiendo tres

fuentes de luz separadas conocidas como colores primarios. Este proceso se conoce

como mezcla aditiva (González Sotero, 2008). Ésta es la teoría más extendida para

explicar la forma en que el cerebro recibe las señales visuales. Según esta teoría, las

estructuras neuronales de la retina codifican la información del color en sólo tres

canales.

Un espacio de color define un modelo de composición del color y por lo general

está definido por una base de N vectores. El espacio de color RGB utiliza el sistema

aditivo de colores y está formado por tres vectores: rojo, verde y azul (Red, Green y

189

Blue, de donde surge la sigla RGB), cuya combinación lineal genera todo el espacio de

color (Smith y Pokorny, 2003). Un color se especifica utilizando tres coordenadas o

atributos, las cuales representan su posición dentro del espacio de color.

6.1.2. El programa de procesamiento de imágenes utilizado: ERDAS IMAGINE 8.4

En este trabajo, el procesamiento de imágenes se realizó con el programa

ERDAS IMAGINE 8.4. Cabe destacar que otros softwares como PhotoShop, Matlab o

NIH Image se han utilizado en el procesamiento digital de imágenes de hojas

(Kawashima y Nakatani, 1998; Murakami et al., 2005; Richardson, 2007; Schaberg et

al., 2008). Sin embargo, se decidió utilizar el programa ERDAS IMAGINE 8.4 para

manipular las imágenes de hojas a fin de obtener información sobre la salud vegetal de

las plantas, ya que es un programa ampliamente difundido para el procesamiento de

imágenes satelitales.


En primer lugar se registraron los espectros de refletancia difusa de un grupo

muy variado de hojas. Las medidas de reflectancia se realizaron con un

espectrofotómetro Shimadzu UV3101PC equipado con una esfera integradora de luz

Shimadzu ISR-3100 (el esquema de la esfera integradora se muestra en la figura 2.7 del

Capítulo 2 de esta tesis). Para mayor información sobre las determinaciones de

reflectancia recurrir a la sección 2.3 Materiales y métodos del Capítulo 2 de esta tesis.

Se seleccionaron hojas de diversas especies no emparentadas y con diferentes

contenidos de pigmentos. Se eligieron hojas rojas, verdes y amarillas, las cuales se

lavaron con agua destilada y se secaron con papel absorbente teniendo cuidado de no

dañarlas. Las especies utilizadas fueron: Hedera helix, Liquidambar styraciflua,

Populus alba, Rosa sp., Gardenia jasminoides, Schefflera arborícola, Aloysia triphylla

y Ficus benjamina.

Luego de registrar los espectros de reflectancia difusa de las hojas se realizó la

extracción por vía húmeda de los pigmentos presentes en las hojas y la posterior

cuantificación de los mismos de acuerdo con las ecuaciones 2.23 a 2.26 ya presentadas

en el Capítulo 2 de esta tesis en la sección 2.3. Materiales y métodos. Dichas

ecuaciones fueron desarrolladas por Sims y Gamon (Sims y Gamon, 2002).

190

Con los valores de reflectancia de las hojas se calcularon los valores de las

componentes R, G y B utilizando un programa obtenido de la página de Internet de

Bruce Lindbloom denominado Spectral Calculador (http://www.brucelindbloom.com).

Una explicación detallada de las ecuaciones utilizadas en esta conversión se realiza en

el Apéndice A, denominado: Del espectro de reflectancia a los valores de RGB.

Los valores de R, G y B se calcularon en el rango de 0 a 255 en unidades

arbitrarias de valores digitales o digital numbers (DN). Se eligió trabajar con el espacio

de color denominado NTSC RGB cuyo iluminante de referencia es el iluminante C, el

cual representa potencialmente a la luz del sol. La elección del espacio NTSC se efectuó

para mantener compatibilidad tanto para las imágenes en blanco y negro como para las

imágenes de color con los sistemas actuales de monitores. Con los valores de R, G y B

obtenidos a partir de los espectros de reflectancia se buscaron correlaciones con los

diversos contenidos de pigmentos de las hojas a fin de aplicar dichas correlaciones en el

procesamiento de las imágenes digitales, ver figura 6.2 para mayor claridad.


500 600 700 800

Ref

lect

anci

a (%

)

0

20

40

60

80

Se obtienen losvalores R, G y B

UtilizandoSpectral Calculator

creado por Bruce Lindbloom

A partir de los espectrosde reflectancia de hojas

Se determina el contenidode pigmentos por un método

de extracción químico

Clorofila-a, Clorofila-b,

Clorofila total (a + b),Antocianinas,Carotenoides

Mediante las ecuacionesde Sims y Gamon(Sims y Gamon, 2002)

Se buscaron correlaciones entre los valores de R, G y B con los contenidos de pigmentos

Se eligieron lascorrelaciones con mejor R2

Estas correlaciones fueron utilizadas finalmenteen el procesamiento digital de las imágenes

Se encontraron CORRELACIONES Clorofila-a = f ( R, G, B)Clorofila-b = f ( R, G, B)

Clorofila total = f ( R, G, B)Antocianinas = f ( R, G, B)


500 600 700 800

Ref

lect

anci

a (%

)

0

20

40

60

80

Se obtienen losvalores R, G y B

UtilizandoSpectral Calculator

creado por Bruce Lindbloom

A partir de los espectrosde reflectancia de hojas

Se determina el contenidode pigmentos por un método

de extracción químico

Clorofila-a, Clorofila-b,

Clorofila total (a + b),Antocianinas,Carotenoides

Mediante las ecuacionesde Sims y Gamon(Sims y Gamon, 2002)

Se buscaron correlaciones entre los valores de R, G y B con los contenidos de pigmentos

Se eligieron lascorrelaciones con mejor R2

Estas correlaciones fueron utilizadas finalmenteen el procesamiento digital de las imágenes

Se encontraron CORRELACIONES Clorofila-a = f ( R, G, B)Clorofila-b = f ( R, G, B)

Clorofila total = f ( R, G, B)Antocianinas = f ( R, G, B)

191

Figura 6.2. Esquema de los pasos realizados para obtener las correlaciones aplicadas en

el procesamiento de imágenes a partir de los datos de reflectancia y de los contenidos de

pigmentos

Finalmente, con las correlaciones halladas se procesaron las imágenes de hojas

de diferentes especies obtenidas utilizando un escáner comercial (HP-Deskjet F380 de

Hewlett-Packard). Se obtuvieron las imágenes de hojas de: Liquidambar styraciflua,

Ligustrum vulgare y Schefflera arboricola para obtener como resultado final imágenes

del contenido de clorofila-a, clorofila-b, clorofila total (clorofila-a + clorofila-b) y

antocianinas a partir de ellas.

Las imágenes escaneadas se procesaron digitalmente utilizando el programa

ERDAS IMAGINE 8.4. Si bien, este software fue creado para el procesamiento de

imágenes satelitales permite trabajar imágenes obtenidas a partir de un escáner las

cuales deben ser soportadas en formato TIFF (Tagged Image File Format) no

comprimido para no perder resolución. En este caso se utilizaron imágenes con una

resolución de 300 ppp (puntos por pulgada) y con una profundidad de 24 bits. La

profundidad de bits o profundidad de color se utiliza para medir la cantidad de color de

la imagen, es decir, son los bits de información por píxel. A mayor profundidad de bits

es posible disponer de mayor número de colores y más exacta será la representación del

color de la imagen digital (Sanchez Maza, 2001).

ERDAS permite importar las imágenes desde formato TIFF al formato IMG

(imagen) que utiliza normalmente. Una vez que las imágenes se convierten a este

formato es posible trabajar con ellas de una manera muy versátil. ERDAS permite

desplegar y procesar cada una de las tres bandas que conforman una imagen, es decir,

las bandas o canales R, G y B (rojo, verde y azul). Adicionalmente, ERDAS permite

una amplia variedad de posibilidades para lograr una atractiva visualización de las

imágenes. Para esclarecer el procesamiento digital aplicado a los imágenes ver la figura

6.3.

192

Figura 6.3. Modelo del procesamiento digital de imágenes realizado para obtener

imágenes del contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total de las hojas


Para comenzar el estudio de las imágenes de color de las hojas se graficaron los

contenidos de los distintos pigmentos presentes en las hojas en función de los valores

digitales o digital numbers de cada componente por separado (R, G y B). La

concentración de los pigmentos vegetales fue cuantificada mediante una técnica de

extracción por vía húmeda. Es importante destacar la variedad de las especies vegetales

utilizadas, las cuales no se hallan emparentadas en lo absoluto, lo que garantiza que las

Imagen escaneadaen formato TIFF

Imagen escaneadaimportada por ERDAS

formato IMG

Es posible trabajarcada banda que forma una

imagen por separadoR, G y B

R G B

RG

B

Clorofila-a Clorofila-b Clorofila total

Utilizando la correlación entre R, G y B

con el contenido de pigmentos

Se utilizó pseudo-colorpara facilitar la interpretación

visualClorofila-a Clorofila-b Clorofila total

Antocianinas

Antocianinas

Imagen escaneadaen formato TIFF

Imagen escaneadaimportada por ERDAS

formato IMG

Es posible trabajarcada banda que forma una

imagen por separadoR, G y B

RR GG BB

RG

B

RG

B

Clorofila-a Clorofila-b Clorofila total

Utilizando la correlación entre R, G y B

con el contenido de pigmentos

Se utilizó pseudo-colorpara facilitar la interpretación

visualClorofila-a Clorofila-b Clorofila total

Antocianinas

Antocianinas

193

correlaciones que surjan a partir de estos datos puedan ser generalizadas a otros tipos de

especies. Para incrementar la variabilidad de cada especie se eligieron hojas verdes,

amarillas y rojas a fin de evitar márgenes demasiado acotados de concentraciones de

pigmentos. En todas las figuras de este capítulo se ha utilizado un mismo símbolo para

representar los pares [valor de la componente, contenido de pigmentos], (�), sin

embargo es importante recordar que cada punto corresponde a especies vegetales

diferentes y con grandes diferencias de color entre las hojas seleccionadas.

Las figuras 6.4, 6.5 y 6.6 muestran las correlaciones existentes entre los valores

de la componente R con las concentraciones de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total,

respectivamente:

Valores de la componente R

60 80 100 120 140 160 180 200

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

-2e-5

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5

Figura 6.4. Relación entre el contenido de clorofila-a cuantificado por un método de

extracción químico con los valores de la componente R de las mismas hojas

194


60 80 100 120 140 160 180 200

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

-2e-5

0

2e-5

4e-5

Figura 6.5. Relación entre el contenido de clorofila-b cuantificado por un método de

extracción químico con los valores de la componente R de las mismas hojas


60 80 100 120 140 160 180 200

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

-2.0e-5

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

195

Figura 6.6. Relación entre el contenido de clorofila total (clorofila-a + clorofila-b)

cuantificado por un método de extracción químico con los valores de la componente R

de las mismas hojas

Como puede observarse en las tres figuras anteriores, la dependencia de los

valores de la componente R con el contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total

es potencial (figuras 6.4, 6.5 y 6.6, respectivamente). La tabla 6.1 resume los valores de

los coeficientes producidos por los ajustes a las funciones potenciales correspondientes.

También fueron incluidos los errores y los valores del coeficiente de correlación, R2, en

la misma tabla.

Tabla 6.1. Valores de los coeficientes producidos tras el ajuste de funciones potenciales

a las relaciones existentes entre los valores de la componente R con las concentraciones

de clorofilas de las hojas.

f = y0+(a/x) Valor de

a

Desviación

estándar

de a

Valor de

y0

Desviación

estándar

de y0

R2

Clor-a = y0 + a/(Valor de R) 6,8E-3 7E-4 -4,4E-5 7E-6 0,942

Clor-b = y0 + a/(Valor de R) 2,9E-3 3E-4 -1,8E-5 4E-6 0,925

Clor total = y0 + a/(Valor de R) 9,7E-3 1E-3 -6,2E-5 1E-5 0,943

Las figuras 6.7, 6.8 y 6.9 muestran las correlaciones existentes entre los valores

de la componente G con las concentraciones de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total,

respectivamente:

196

Valores de la componente G

60 80 100 120 140 160

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5

6e-5

8e-5


extracción químico con los valores de la componente G de las mismas hojas


60 80 100 120 140 160

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-5

4e-5


extracción químico con los valores de la componente G de las mismas hojas

197


60 80 100 120 140 160

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4


cuantificado por un método de extracción químico con los valores de la componente G

de las mismas hojas

Para la componente G se observa una dependencia lineal con el contenido de

clorofila-a, clorofila-b y clorofila total (figura 6.7, 6.8 y 6.9, respectivamente). La tabla

6.2 resume los valores de los coeficientes obtenidos a partir de los ajustes lineales.

Tabla 6.2. Valores de los coeficientes obtenidos tras el ajuste de funciones lineales a las

relaciones existentes entre los valores de la componente R con las concentraciones de

clorofilas de las hojas.

f = y0 + a*x Valor de

a

Desviación

estándar

de a

Valor de

y0

Desviación

estándar

de y0

R2

Clor-a = y0 + a * (Valor de G) -7,6E-7 7E-8 1,0E-4 8E-6 0,960

Clor-b = y0 + a * (Valor de G) -3,3E-7 4E-8 5,0E-5 5E-6 0,930

Clor total = y0 + a * (Valor de G) -1,1E-6 1E-7 2,0E-4 1E-5 0,955

198

En un primer análisis podría resultar sorprendente que tanto los valores de la

componente G como los de la componente R aumenten a medida que la concentración

de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total disminuyen. Intuitivamente, podría pensarse

que más color verde, es decir, mayores valores de la componente G deberían

corresponder a las concentraciones de clorofila más altas. Sin embargo, las hojas que

poseen mayores concentraciones de clorofila pueden absorber más luz solar y por lo

tanto la proporción de luz que es reflejada por ellas es menor y esto es lo que causa

valores menores de las componentes G y R.

Las figuras 6.10, 6.11 y 6.12 presentan las correlaciones existentes entre los

valores de la componente B con las concentraciones de clorofila-a, clorofila-b y

clorofila total, respectivamente:

Valores de la componente B

55 60 65 70 75 80

Clo

rofi

la-a

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-4

4e-4


extracción químico con los valores de la componente B de las mismas hojas

199


55 60 65 70 75 80

Clo

rofi

la-b

(m

mol

/cm

2 )

0

2e-4

4e-4


extracción químico con los valores de la componente B de las mismas hojas


55 60 65 70 75 80

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0

2e-4

4e-4

200


cuantificado por un método de extracción químico con los valores de la componente B

de las mismas hojas

Como puede observarse en las figuras 6.10, 6.11 y 6.12, los diferentes valores de

la componente B para las distintas hojas presentan aproximadamente el mismo valor de

clorofila-a, clorofila-b y clorofila-total, respectivamente. Si se observa detenidamente la

figura 3.4 del Capítulo 3 de esta tesis, la cual muestra el espectro de absorción de las

hojas resulta claro que la componente B (azul), cuyo máximo se ubica alrededor de 430

nm se encuentra saturada y por lo tanto no responde a variaciones en el contenido de

clorofila de las hojas.

Finalmente, se encontró una correlación lineal entre el cociente

antocianinas/clorofila total con los valores de la relación R/G (figura 6.13):

R/G

0.8 0.9 1.0 1.1 1.2

Ant

ocia

nina

/Clo

rofi

la to

tal

0

1

2

3

4

5

Figura 6.13. Relación entre la proporción de antocianinas a clorofila total (cuantificado

por un método de extracción químico) con la proporción de la componente R y de la

componente G del mismo conjunto de hojas estudiados

201

La tabla 6.3 muestra los valores de los coeficientes obtenidos a partir del ajuste

correspondiente a la figura 6.13. En la misma tabla fueron incluidos los respectivos

errores y el valor del coeficiente de correlación (R2).

Tabla 6.3. Valores de los coeficientes producidos tras el ajuste de una función lineal a la

relación existente entre los valores de la relación R/G con la relación de

antocianinas/clorofila total.

f = y0 + a*x Valor de

a

Desviación

estándar

de a

Valor de

y0

Desviación

estándar

de y0

R2

Anto/Clor total = y0 + a * (R/G) 13,69 1,4 -11,63 1,3 0,914

Los valores de los coeficientes de correlación (R2) de las relaciones halladas

entre los contenidos de clorofilas con las componentes R y G por separado son altos

(siempre mayores a 0,90), y son satisfactorios teniendo en cuenta la dispersión que

existe en muestras biológicas, en este trabajo: hojas. Sin embargo, se decidió buscar

nuevas correlaciones combinando las bandas R y G de las imágenes foliares y analizar

si mejoraba el R2. La banda B (azul) fue descartada de este análisis debido a que es

insensible a la variación en el contenido de pigmentos.

Se encontró que la suma de las componentes R y G mostraba una correlación

muy buena con los contenidos de clorofilas. Los gráficos de R + G en función del

contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total (a+b) se muestran en las figuras

6.14, 6.15 y 6.16, respectivamente.

202

R + G

150 200 250 300

Clo

rofi

la a

(m

mol

/cm

2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Figura 6.14. Relación entre la concentración de clorofila-a (cuantificado por un método

de extracción químico) con la suma de las componentes R y G del mismo conjunto de

hojas estudiados

R + G

150 200 250 300

Clo

rofi

la b

(m

mol

/cm

2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

203

Figura 6.15. Relación entre la concentración de clorofila-b (cuantificado por un método

de extracción químico) con la suma de las componentes R y G del mismo conjunto de

hojas estudiados

R + G

150 200 250 300

Clo

rofi

la to

tal (

mm

ol/c

m2 )

0.0

2.0e-5

4.0e-5

6.0e-5

8.0e-5

1.0e-4

1.2e-4

Figura 6.16. Relación entre la concentración de clorofila total (cuantificado por un

método de extracción químico) con la suma de las componentes R y G del mismo

conjunto de hojas estudiados

La tabla 6.4 resume los valores de los coeficientes obtenidos a partir de los

ajustes correspondientes a las figuras 6.14, 6.15 y 6.16, respectivamente. También

fueron incluidos los errores y los valores del coeficiente de determinación, R2.

204

Tabla 6.4. Valores de los coeficientes obtenidos tras el ajuste de funciones lineales a las

relaciones existentes entre R + G con las concentraciones de clorofilas de las hojas.

f = y0+(a/x) Valor de

a

Desviación

estándar

de a

Valor de

y0

Desviación

estándar

de y0

R2

Clor-a = y0 + a/(R + G) 1,6E-2 1E-3 -5,1E-5 6E-6 0,974

Clor-b = y0 + a/(R + G) 7,1E-3 7E-4 -2,2E-5 4E-6 0,956

Clor total = y0 + a/(R + G) 2,3E-2 2E-3 -7,3E-5 9E-6 0,973

Los valores altos de R2 obtenidos en este caso indican una excelente correlación

entre los valores de R + G y las concentraciones de pigmentos. Como consecuencia se

eligió la suma R + G como algoritmo para analizar las imágenes digitales de las hojas

obtenidas con un escáner.

Aplicando las correlaciones mostradas en la tabla 6.4 sobre imágenes de hojas

obtenidas con un escáner comercial fue posible lograr imágenes del contenido de

clorofila-a, clorofila-b y clorofila total. También fue posible obtener imágenes del

contenido de antocianinas a partir del algoritmo encontrado en la figura 6.13, cuyos

parámetros se muestran en la tabla 6.3.

Las imágenes de hojas tal cual fueron obtenidas con el escáner se muestran a

continuación. La imagen 6.1 corresponde a una hoja de Ligustrum vulgare, la imagen

6.2 corresponde a una hoja de Schefflera arboricola, la imagen 6.3 muestra hojas de

Liquidambar styraciflua.

Imagen 6.1. Ligustum vulgare Imagen 6.2. Schefflera arborícola

205

Imagen 6.3. Liquidambar styraciflua. a: hoja 1, b: hoja 2

Antes de aplicar las correlaciones halladas para obtener los contenidos de

clorofila se sumaron las bandas R y G de cada imagen. Las imágenes de R + G para

cada hoja se muestran a continuación. La imagen 6.4 corresponde a la hoja de

Ligustrum vulgare, la imagen 6.5 pertenece a la hoja de Schefflera arboricola, la

imagen 6.6 pertenece a las hojas de Liquidambar styraciflua.

Imagen 6.4. Ligustum vulgare (R + G) Imagen 6.5. Schefflera arborícola (R + G)

a b

206

Imagen 6.6. Liquidambar styraciflua a: hoja 1, b: hoja 2 (R + G)

Una vez obtenidas las imágenes R + G se aplicaron las relaciones

correspondientes ya mostradas en la tabla 6.4. De esta manera fue posible obtener

imágenes del contenido de clorofila para cada hoja escaneada. A fin de poder comparar

se agregaron las imágenes no procesadas en las imágenes 6.7, 6.8, 6.9 y 6.10:

Imagen 6.7. (a) Imagen sin procesar de Ligustrum vulgare, (b) imagen de clorofila-a,

(c) imagen de clorofila-b y (d) imagen de clorofila total de la hoja

a b

a b dc

207

Imagen 6.8. (a) Imagen sin procesar de Schefflera arboricola, (b) imagen de clorofila-a,

(c) imagen de clorofila-b y (d) imagen de clorofila total de la hoja

Imagen 6.9. (a) Imagen sin procesar de Liquidambar styraciflua, (b) imagen de

clorofila-a, (c) imagen de clorofila-b y (d) imagen de clorofila total de la hoja

ba c d

a b

c d

208



Para resaltar visualmente las imágenes se efectuó una clasificación de pixeles

con el mismo valor de clorofila, la clasificación realizada fue una clasificación no

supervisada en cinco clases. Luego de efectuar esta clasificación, los pixeles con valores

similares de clorofila se colorearon con un mismo tono de verde. De esta manera fue

posible obtener imágenes del contenido de clorofila en pseudo-color para facilitar la

interpretación visual. De lo contrario, se vería como una imagen monocromática en

tonos de grises como las imágenes (b), (c) y (d) mostradas en las imágenes 6.7, 6.8, 6.9

y 6.10. Las imágenes en pseudo-color, con su escala correspondiente se muestran a

continuación:

a b

c d

209

Imagen 6.11. (a) Imagen sin procesar de Ligustrum vulgare, (b) imagen de


0.77 0.03 0

µmol/cm2

2.31 0.05 0

µmol/cm2

0.71 0.02 0

µmol/cm2

1.61 0.04 0

µmol/cm2

a b

c d

a b

210

Imagen 6.12. (a) Imagen sin procesar de Schefflera arboricola, (b) imagen de


0.29 0.05 0

µmol/cm2

0.09 0.01 0

µmol/cm2

0.20 0.03 0

µmol/cm2

1.10 0.04 0

µmol/cm2

0.34 0.01 0

µmol/cm2

c d

a b

c d

211





Utilizando la correlación obtenida en la figura 6.13, cuyos datos figuran en la

tabla 6.3 fue posible obtener las imágenes del contenido de Antocianinas respecto del

contenido de clorofila total (Antocianinas/Clorofila total) para las hojas 1 y 2 de

Liquidambar styraciflua.

Para adquirir una imagen del contenido de antocianinas la imagen de la relación

de ambos pigmentos se multiplicó por la imagen de clorofila total de la misma hoja, la

imagen (d) de las imágenes 6.13 y 6.14 para la hoja 1 y hoja 2, respectivamente. De

0.24 0.04 0

µmol/cm2

0.08 0.01 0

µmol/cm2

0.17 0.03 0

µmol/cm2

a b

c d

212

esta manera fue posible obtener imágenes del contenido de antocianinas de las hojas de

Liquidambar styraciflua. Nuevamente se efectuó una clasificación de los pixeles con

valores similares de concentración de antocianinas, logrando de esta manera una imagen

en pseudo-color del contenido de antocianinas de la hoja 1 y de la hoja 2 de

Liquidambar styraciflua. Las imágenes del contenido de antocianina de ambas hojas se

muestran en las imágenes 6.15 y 6.16, respectivamente.

Imagen 6.15. (a) Imagen sin procesar de Liquidambar styraciflua, (b) imagen del

contenido de antocianina y (c) imagen en pseudo-color del contenido de antocianinas

1.89 0.08 0

µmol/cm2

a

b c

213

Imagen 6.16. (a) Imagen sin procesar de Liquidambar styraciflua, (b) imagen del

contenido de antocianina y (c) imagen en pseudo-color del contenido de antocianinas

6.4. Conclusiones

El objetivo principal de este trabajo fue cumplido, es decir, fue posible

desarrollar exitosamente un método para monitoreo óptico no destructivo de hojas. Este

procedimiento permite conocer el contenido de clorofila-a, clorofila-b y por ende de

clorofila total (clorofila-a + clorofila-b) además del contenido de antocianinas de las

hojas mediante la utilización de imágenes de color obtenidas con un escáner comercial.

La aplicación de este metodología al diagnóstico de la salud vegetal inferido a

partir del contenido de pigmentos foliares es altamente efectivo y de fácil

implementación debido al bajo costo de operación. Sólo es necesario contar con un

escáner y con un programa de procesamiento digital de imágenes para conocer

rápidamente el contenido de clorofila o antocianinas de las hojas. Esta técnica permite

3.66 0.08 0

µmol/cm2

a

b c

214

ahorrar mucho tiempo y trabajo de laboratorio al evitar el tratamiento químico por vía

húmeda (método destructivo) del tejido vegetal estudiado.

Cabe destacar que esta metodología de procesamiento de imágenes permite

acceder no sólo a las imágenes mostradas en esta tesis sino a las mátrices de valores

numéricos correspondientes a los valores de concentración de pigmentos sobre la

superficie de la hoja.

Finalmente, el desarrollo del método óptico no destructivo presentado aquí

sienta las bases para el estudio de la distribución espacial de los pigmentos foliares

dentro de las hojas.

6.5. Bibliografía

Adamsen F., Pinter P. y Barnes E., LaMorte R., Wall G., Leavitt S. y Kimball B. 1999.

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http://www.brucelindbloom.com

216

Capítulo 7.

CONCLUSIONES GENERALES

217

Capítulo 7. CONCLUSIONES GENERALES

El desarrollo del trabajo de tesis permitió cumplir con el objetivo general

propuesto de estudiar y desarrollar diversos métodos analíticos ópticos para obtener

información de hojas de manera no destructiva.

La teoría de Kubelka-Munk predice que los valores de la función de remisión a

distintas longitudes de onda, para un colchón de hojas, deben coincidir con los del

cociente de los parámetros ópticos k/s obtenidos para hojas individuales (Stokes, 1862;

Wendlandt, 1966). En el Capítulo 2 de esta tesis se pudo verificar el cumplimiento de

esta igualdad en hojas intactas. La importancia de este resultado surge de la posibilidad

de determinar experimentalmente los coeficientes de absorción (k) y de dispersión (s)

de hojas mediante la utilización del modelo de Pila de Placas (Allen y Richardson,

1968; Gausman y Allen, 1973).

Por otro lado, en el Capítulo 2 se hallaron correlaciones lineales entre las

propiedades ópticas de las hojas con su contenido de pigmentos vegetales y con su

contenido de agua. Estas correlaciones son muy importantes ya que permiten ahorrar

mucho tiempo y trabajo de laboratorio al evitar la cuantificación de pigmentos por los

métodos químicos tradicionales.

En el Capítulo 3 de este trabajo de tesis se compararon tres modelos existentes

en literatura para corregir distorsiones por procesos de reabsorción de luz, los cuales son

motivo de controversia (Agati et al., 1993; Gitelson et al., 1998; Lagorio et al., 1998).

Se efectuó un análisis exhaustivo de los fundamentos físico-matemáticos que soportan a

cada uno de ellos y se compararon las condiciones experimentales utilizadas en los

respectivos manuscritos originales.

Las conclusiones que surgen de este análisis son, que el modelo propuesto por

Gitelson y colaboradores (Gitelson et al., 1998) desarrollado en forma empírica, no

cuenta con fundamentos físicos aceptables, mientras que los modelos desarrollados por

Agati y colaboradores (Agati et al., 1993) y por Lagorio (Lagorio et al., 1998) y

colaboradores presentan una base teórica buena y adecuadas metodologías de

validación.

218

En este capítulo también se evaluaron los efectos de la anisotropía sobre las

distribuciones de fluorescencia de distintos sistemas. De acuerdo con los resultados

obtenidos se concluye que la distribución espectral de fluorescencia de las hojas intactas

se encuentra despolarizada.

La anisotropía de fluorescencia de una suspensión de hoja diluida se encuentra

despolarizada. Sin embargo, la misma suspensión de hoja depositada sobre una placa de

cuarzo presenta anisotropía de fluorescencia. Una evaluación cuantitativa de la

influencia de la anisotropía hallada sobre la emisión de fluorescencia permite afirmar

que esta anisotropía no es responsable por las diferencias encontradas en las relaciones

de máximos de fluorescencia (Fred/Ffar-red) de estos dos últimos sistemas. En

consecuencia, se puede concluir que no se registran distorsiones significativas en los

espectros de emisión fluorescente estudiados, por polarización de la fluorescencia.

Los resultados obtenidos en la Sección A del Capítulo 4 muestran que en hojas

dicotiledóneas (Ficus benjamina, Ficus elástica, Gardenia jasminoides y Hedera helix)

la cara abaxial de las mismas presenta una relación de máximos de fluorescencia

(Fred/Ffar-red) mayor que la adaxial, aún después de corregir por reabsorción de luz. Esto

indica que contrariamente a lo publicado en bibliografía (Lichtenthaler y Rinderle,

1988; Lang et al., 1991), las diferencias no se deben solamente a cambios en el

contenido de clorofila en ambas caras sino a diferentes características de los

cloroplastos en ellas. En hojas monocotiledóneas (Gladiolus spp y Dracaena cincta

bicolor), las caras de la hoja no se diferencian y los espectros de emisión de

fluorescencia corregidos por reabsorción muestran en forma congruente la misma

relación de picos.

Adicionalmente, en esta sección de la tesis se demuestra la aplicabilidad de la

teoría de Kubelka-Munk y del modelo de Pila de Placas en las caras abaxiales de las

hojas, en forma similar a lo que se observa para las caras adaxiales (Capítulo 2 de esta

tesis).

En la Sección B del Capítulo 4 demuestra por primera vez en hojas variegadas

la aplicabilidad de la teoría de Kubelka-Munk y el modelo de Pila de Placas.

Por otro lado, se concluye que los espectros de emisión fluorescente de hojas

albinas no pueden analizarse utilizando los mismos patrones de emisión que para hojas

verdes.

219

Las técnicas ópticas utilizadas permitieron determinar características fisiológicas

de las hojas variegadas, algo que no se había realizado hasta el momento a través de

determinaciones no destructivas.

En la Sección A del Capítulo 5, la evidencia experimental producida mediante

el uso de herbicidas como herramientas para eliminar la emisión de uno u otro

fotosistema, de manera específica, revela la contribución de ambos fotosistemas en el

espectro de emisión de fluorescencia de hojas a temperatura ambiente.

En la sección B de este capítulo se determina de manera temprana la carencia de

fósforo en el medio de cultivo de plantas de Colza (Brassica napus L.) mediante la

evaluación de los espectros de reflectancia de hojas y cotiledones. Los espectros de

fluorescencia de hojas y de cotiledones de plantas sometidas a la falta de fósforo se

comparan con los resultados obtenidos para plantas control (crecidas en medio

suplementado con cantidades apropiadas de este mineral). En todos los parámetros

ópticos estudiados siempre se observa un efecto más pronunciado de la carencia de

fósforo en cotiledones que en hojas. Por lo tanto, se sugiere la evaluación no destructiva

y temprana de cotiledones para subsanar rápidamente posibles efectos por carencia de

nutrientes en el suelo de cultivo.

Para finalizar, se logró desarrollar un método para monitoreo óptico no

destructivo mediante la obtención y procesamiento de imágenes de color de hojas. En el

Capítulo 6 en especial se utilizan imágenes de hojas obtenidas con un escáner

comercial sin embargo la misma metodología podría aplicarse a imágenes obtenidas con

una cámara digital bajo condiciones estandarizadas de iluminación. Esta metodología

permite obtener imágenes del contenido de clorofila-a, clorofila-b y clorofila total

además de antocianinas presentes en el tejido foliar. La gran ventaja de esta técnica

radica en la rapidez del análisis, el cual puede realizarse de manera no destructiva y a

muy bajo costo de implementación ya que sólo requiere de un escáner y un programa de

procesamiento digital de imágenes.

Bibliografía

220

Agati G., Fusi F. y Mazzinghi P. 1993. A simple approach to evaluation of the

reabsorption of chlorophyll fluorescence spectra in intact leaves. J. Photochem.

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New York

221

Apéndice. DEL ESPECTRO DE REFLECTANCIA

A LOS VALORES DE RGB

222

Apéndice. DEL ESPECTRO DE REFLECTANCIA A LOS VALORES DE RGB

A.1. Del espectro de reflectancia a los valores de XYZ

En 1931, la CIE (Commission Internationale de l'Eclairage, es decir,

Comisión Internacional de la Luz) desarrolló un sistema para especificar los estímulos

cromáticos que recibe un observador estándar a partir de la mezcla aditiva de tres

colores primarios. Este sistema fue llamado “observador estándar CIE 1931”. Este

observador estándar es representado por una tabla de valores en la que se indica cuánto

color de cada primario se necesita para igualar una unidad de luz en cada longitud de

onda (Smith y Pokorny, 2003). Las funciones de igualación de color para los primarios

CIE XYZ se muestran en la figura A.1.

Figura A.1. Funciones de igualación de color para los primarios CIE XYZ.

(Imagen tomada del sitio http://www.gusgsm.com/observador_estandar_cie)

Partiendo del espectro de reflectancia definido como S (�) es posible calcular los

valores triestímulos XYZ. Para ello, se utilizan las funciones definidas por la CIE para

un observador estándar: x , y y z y la distribución espectral de un iluminante de

referencia denominado I (�). Para obtener valores de XYZ precisos es necesario utilizar

un iluminante de referencia ya que para obtener la reflectancia de una muestra primero

es necesario iluminarla. Por lo tanto, el color producido obviamente depende del tipo de

iluminación que recibe (http://www.brucelindbloom.com). En el espacio de color

utilizado en el Capítulo 6, NTSC RGB, el iluminante de referencia es C. Como ya se

explicara en ese capítulo, un iluminante C representa potencialmente a la luz del sol.

223

Las coordenadas de color X, Y y Z se calculan de acuerdo con las ecuaciones

A.1, A.2 y A.3, respectivamente. La ecuación A.4 corresponde al factor de

normalización utilizado.

λλλλλ

dISxN

X )()()(1�= (A.1)

λλλλλ

dISyN

Y )()()(1�= (A.2)

λλλλλ

dISzN

Z )()()(1�= (A.3)

λλλλ

dIyN )()(�= (A.4)

Las integrales se deberían calcular sobre todo el espectro visible sin embargo,

como los espectros de reflectancia se obtienen experimentalmente, los valores de S (�)

se obtienen como muestras discretas y por lo tanto se sustituyen las integrales por

sumas. Las coordenadas X, Y y Z se calculan entonces de acuerdo con las ecuaciones

A.5, A.6 y A.7, respectivamente. El factor de normalización queda definido por la

ecuación A.8 (http://www.brucelindbloom.com).

ii

i

i ISxN

X �=1

(A.5)

ii

i

i ISyN

Y �=1

(A.6)

ii

i

i ISzN

Z �=1

(A.7)

i

i

i IyN �= (A.8)

224

A.2. De los valores de XYZ a los valores de RGB Dado un color XYZ cuyos componentes están en el rango nominal (0; 1) es

posible pasar las componentes XYZ a los valores RGB con las ecuaciones A.9 a A.11.

γ/1rR = (A.9)

γ/1gG = (A.10)

γ/1bB = (A.11)

donde � corresponde a los valores Gamma del sistema de color RGB utilizado, en este

caso NTSC RGB, por lo tanto � = 2.2.

Teniendo en cuenta las coordenadas de cromaticidad del sistema RGB (xr, yr),

(xg, yg) y (xb, yb) y los valores de referencia se utiliza una matriz de 3 x 3 para pasar de

los valores XYZ a los valores de RGB, ecuación A.12.

[ ]��

�

�

��

�

�

=

��

�

�

��

�

�−

Z

Y

X

M

b

g

r1 (A.12)

Los valores de la inversa de la matriz de transformación para obtener los valores

RGB se muestran a continuación:

[ ]��

�

�

��

�

�

=−

0.8975535 0.1183781- 0.0583056

0.0283082- 1.9991710 0.9846663-

0.2882091- 0.5324542- 1.9099961 1

M

Finalmente, para obtener los valores de R, G y B en el rango entre (0; 255) hay

que multiplicar cada componente por 255.

Todos los pasos descriptos aquí fueron tomados de la página de Internet de

Bruce Lindbloom (http://www.brucelindbloom.com).

A.3. Bibliografía

Smith V. y Pokorny J. 2003. The science of color. Elsevier, 2nd Ed. Oxford. pp. 117-120

http://www.brucelindbloom.com

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