mutation and allelic loss of the pten/mmac1 gene in primary and metastatic melanoma biopsies

4
Mutation and Allelic Loss of the PTEN/MMAC1 gene in Primary and Metastatic Melanoma Biopsies Anette Birck,Vibeke Ahrenkiel,* Jesper Zeuthen,* Klaus Hou-Jensen,² and Per Guldberg* *Department of Tumor Cell Biology, Institute of Cancer Biology, Danish Cancer Society, Copenhagen, Denmark; ²Department of Pathology, University Hospital, Copenhagen, Denmark The PTEN/MMAC1 gene on chromosome 10q23 encodes a lipid phosphatase with tumor-suppressive properties. Germline PTEN/MMAC1 mutations have been implicated as the predisposing factor in Cowden disease and other hamartoma syndromes, and somatic mutations and deletions have been iden- ti®ed in a wide range of human cancers, including 30±40% of metastatic melanoma cell lines. To study further the possible role of PTEN/MMAC1 in the pathogenesis and progression of malignant mela- noma, we examined uncultured specimens from 16 primary and 61 metastatic tumors from 67 patients. Denaturing gradient gel electrophoresis was used to analyze systematically the coding region of PTEN/ MMAC1 and revealed mutations in four of the meta- static samples (7%). Sequence analysis of the mutants identi®ed a 1 bp frameshift insertion, a 2 bp frame- shift deletion, an 11 bp frameshift deletion, and a sin- gle base substitution resulting in the generation of a premature stop codon. Analysis of two intragenic polymorphisms showed allelic loss in three of eight informative primary tumors (38%) and in 18 of 31 metastatic tumors (58%). One of the mutant cases showed allelic loss, suggesting that both PTEN/ MMAC1 alleles were inactivated in this tumor. Altogether, these results suggest that mutation and deletion of PTEN/MMAC1 may contribute to the development and progression of malignant mela- noma. Key words: loss of heterozygosity/tumor suppressor. J Invest Dermatol 114:277±280, 2000 T he putative tumor suppressor gene PTEN, also known as MMAC1, was recently cloned and mapped to chromosome 10q23.3 (Li et al, 1997; Steck et al, 1997). The product of this gene is a phosphatase that shares structural homology with the protein tyrosine phosphatase family, yet exhibits strong activity toward phosphati- dylinositol 3,4,5-triphosphate (PtdIns(3,4,5)P 3 ) (Maehama and Dixon, 1998; Furnari et al, 1998; Myers et al, 1998). One of the direct targets of PtdIns(3,4,5)P 3 , protein kinase B (PKB/Akt), is constitutively activated by phosphorylation in cells lacking functional PTEN/MMAC1, and the elevated levels of activation can be reduced to normal levels by expression of wild-type PTEN/ MMAC1 (Stambolic et al, 1998; Haas-Kogan et al, 1998). These data suggest that the tumor-suppressive properties of PTEN/ MMAC1 relate at least in part to its ability to regulate negatively the PtdIns(3,4,5)P 3 /PKB/Akt signaling pathway. Overexpression of wild-type PTEN/MMAC1 suppresses growth in PTEN/MMAC1-mutated glioblastoma cells (Furnari et al, 1997; Cheney et al, 1998), probably by rendering cells susceptible to induction of apoptosis (Suzuki et al, 1998; Davies et al, 1998). Moreover, PTEN/MMAC1 can physically interact with focal adhesion kinase (FAK) in focal adhesion complexes (Tamura et al, 1998). Thus, PTEN/MMAC1 may be an important regulator of interactions between extracellular matrix and cytoskeleton, and be involved in integrin-mediated cell spreading and metastasis of malignant cells. Germline PTEN/MMAC1 mutations have been established as the predisposing factor in Cowden disease and, albeit less clear-cut, another autosomal-dominant cancer susceptibility syndrome of the hamartomatous type, Bannayan±Zonana syndrome or Ruvalcaba± Riley±Smith syndrome (Liaw et al, 1997; Nelen et al, 1997; Marsh et al, 1997). The notion that PTEN/MMAC1 haploinsuf®ciency may be suf®cient for the pathogenesis of these syndromes was strongly supported by the demonstration that Pten +/± mice show hyperplastic±dysplastic and preneoplastic lesions similar to Cowden disease and spontaneously develop malignant tumors (Di Cristofano et al, 1998; Suzuki et al, 1998). Further evidence suggesting that PTEN/MMAC1 acts as a tumor suppressor comes from the demonstration of a high frequency of deletions and mutations in some sporadic cancers, in particular glioblastomas, prostate cancers, and endometrial cancers (Li et al, 1997; Wang et al, 1997; Steck et al, 1997; Cairns et al, 1997; Kong et al, 1997; Risinger et al, 1997; Vlietstra et al, 1998). Recently, our group and others have found that deletion or mutation of PTEN/MMAC1 occurs in 30±40% of metastatic melanoma cell lines (Guldberg et al, 1997; Teng et al, 1997; Tsao et al, 1998; Robertson et al, 1998). Limited and con¯icting evidence, however, exists with regard to the occurrence of PTEN/ MMAC1 alterations in uncultured melanoma specimens (Tsao et al, 1998; Bo Èni et al, 1998). To study this issue and to examine further the possible role of PTEN/MMAC1 in the progression of melanoma, we set out to study mutations and allelic loss of PTEN/MMAC1 in a panel of uncultured primary and metastatic melanomas. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 277 Manuscript received February 4, 1999; revised August 13, 1999; accepted for publication October 27, 1999. Reprint requests to: Dr. Per Guldberg, Department of Tumor Cell Biology, Institute of Cancer Biology, Danish Cancer Society, Strand- boulevarden 49 DK-2100 Copenhagen, Denmark. Email: [email protected] Abbreviations: DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis; PtdIns(3,4,5)P 3 , phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate; PKB, protein kinase B.

Upload: per

Post on 06-Jul-2016

213 views

Category:

Documents


1 download

TRANSCRIPT

�������� ��� ��� ��� �� ��� ���������� ���� ��������� ��� ���������� ������� ��������

������ ������ ����� � ������� ������ ���� ��� ����� ����������� ��� ��� �������������������� �� ���� !��� ������" #�������� �� !����� ������" ����� !����� $�����" !���� ���� ������% ����������� �� ��� ����"&��'�����" �������� !���� ���� ������

��� ���������� ���� �� ���������� ������������ � ���� ����������� ���� ����� ���������!�����������" #������ ���������� ��������� ��!�$��� ��������� �� ��� ������������ ������ ��%����� ������� ��� ����� ��������� ���������&��� ������� ��������� ��� �������� ��!� $��� ���� ��'�� �� � ���� ����� �� ����� �������& ����������()�* �� ���������� ������� �� ����" �� ������������ ��� �����$� ��� �� ���������� �� ��������������� ��� ����������� �� �������� ��� ����& �� �+������ ��������� ��������� ���� �,������� ��� ,� ���������� ������ ���� ,- ��������".��������� �������� �� �������������� ��� ���� ������/� ������������ ��� ������ ������ �� ���������� ��� ��!���� ��������� �� ���� �� ��� ����

������ ������ 0-*1" 2������� ������� �� ��� �������������'�� � � $� ���������� ���������& � � $� ����� ����� �������& �� �� $� ���������� �������& ��� � ��� �� $��� ��$��������� �������� �� ��� ���������� �� ���������� ���� �����" ������ �� ��� ���������������������� ������ ���� ��� �� ����� �� ��������������!� ������� ������ 0�3*1 ��� �� �3 �� ������������ ������ 043*1" 5�� �� ��� ������ ����������� ���� ���& ���������� ���� $��� ���������� ���� ���� ������!���� �� ���� �����"��������& ����� ������ ������� ���� �������� ���������� �� ���������� ��� ������$��� �� �����!������� ��� ����������� �� �������� ��� ����" � � ���� � �� � ��� ��� �������� � ������� ��� � !�� "��#� � ��$�%&&'%()* %)))

� ������'� ����� ���������� ���� ���� ������(� ������� (�� �������" ������ ��� �������� � �������� )*+,-.- /0� �� )112% $��� ��)1123. � ������� �� � �� ���� �� � � ��� ����� � ��� ���� ���������� ������" (�� � � ������� �"������

� ��� ����� �����" "�� �4 ����� ������ ����'��" ��(��� � ��� �����"��������� -56����� ��� ��� /���#��/-563�-3 /7�� ��� �����4�� )118% 9������ �� )118% 7"��� �� )1183. :�� �� � ������� ������� �� ���#��/-563�- ������� ����� � /���;��3 ������������'��" ����'���� �" � ��� ��"������ �� ����� ���������������� ����;����� ��� � � ���'���� ��'��� �� ����'�������� �� ������� �� ������ ��'��� �" �4�������� �� (�����"�� ����;����� /$�������� �� )118% ���������� �� )1183. ������� ������� � �� � � ���������������'� ���������� �� ����;����� ������ �� ����� �� ���� �� ��� ������" �� �������� ������'��" � ����#��/-563�-;���;�� ��������� ��� (�".:'���4�������� �� (�����"�� ����;����� ���������� ���(�

�� ����;������������� ������������ ����� /9������ �� )112%! ���" �� )1183 �������" �" ��������� ����� ����������� ����������� �� ��������� /$�<�� �� )118% ��'��� �� )1183.7����'�� ����;����� ��� � "������" �������� (�� ������� ����� ����� /9��3 �� ����� �� ����� ������4�� / ����� ��

)1183. �� ����;����� ��" �� �� ��������� ��������� �������������� ���(��� �4����������� �����4 ��� �"��������� ��� ����'��'�� �� ����������������� ���� ��������� ��� ���������� ����������� �����.�������� ����;����� ��������� �'� ���� �������� �� ��

� � ������������ ������ �� !�(��� ������� ��� ������ ���� ������������� �� ������������������ ������ �������������" �"������ �� � � ������������ �"�� �����"��=������ �"������ �� >�'������=>���"=$��� �"������ /0��( �� )112% ?���� �� )112% 7��� �� )1123. � ������ � �� ����;����� ���������@�����"��" �� ���@����� ��� � � ��� �������� �� � ��� �"������� (���������" ��������� �" � � ������������� � �� � A;= ���� � �( "����������=�"�������� ��� ������������� ������� ������� �� !�(���������� ��� ������������" ��'���� ��������� ������ /�� !��������� �� )118% $�<�� �� )1183.9��� �� �'������ ���������� � �� ����;����� ���� �� �

����� ���������� ����� ���� � � ������������� �� � �� ���+����" �� ��������� ��� ��������� �� ���� �������� ������� ������������ ������������� �������� ������� ��� ����������� �������/0� �� )112% B��� �� )112% $��� �� )112% !����� ��)112% ���� �� )112% >������� �� )112% ��������� �� )1183.>������" ��� ����� ��� �� ��� �'� ����� � �� �������� ���������� �� ����;����� ������ �� -*=5*C �� ������������������ ���� ����� /�������� �� )112% ��� �� )112% ��� �� )118% >�������� �� )1183. 0������ ��� ���D�������'������ �(�'�� �4���� (�� ������ �� � � ���������� �� ����;����� ����������� �� ���������� �������� ��������� / ��� ��)118% ��E�� �� )1183. � ����" � �� ����� ��� �� �4����� ���� ��� � �������� ���� �� ����;����� �� � � ����������� ���������� (� ��� ��� �� ����" ��������� ��� ������� ���� ������;����� �� � ����� �� ���������� ������" ��� �������������������.

**,,�,*,F;**;G)6.** H !��"��� � � ,*** �" � $�����" ��� #�'��������'� ����������" #��.

�--

7��������� �����'�� 9������" 5 )111% ��'���� ������ )- )111%�������� ��� ����������� :������ ,2 )111.>������ ��+����� ��I ��. ��� �������� ���������� �� ���� !���

������" #�������� �� !����� ������" ����� !����� $�����" $�����������'����� 51 ���,)** !���� ���� ������.J����I ����K������.������'�������I ���J ���������� �������� ��� �������� ������%

���#��/-563�- � ��� ����"��������� -56����� ��� ���% ��� ������������ �.

7� J>#�0$ �?� 7J �:�$

������� ������ ������ � �������� ������� �4������ �� � ������" ���� ���� L2 �������� ��� �������� )L ������" ��� L) ����������������. � ������" ������ �������� � ��� ������� ��������� ),�����@���� ��������� ��������� ��� ��� ����� ����������� ��������. ���������� �� ���� ���� ���<�� �� ��+��� �������� ����������" ����� ������"��� ������ �� =8*�! ����� ���. ��� �����" �������� (��� ��������� �� �������8*=1*C ����� �����. 9�� ���� �������� ������ ������" ��� ���������������� (��� �'������� ��� ��� @'� ���������� �������� �(� �� � ��� ������������������� (��� �������� �'�� � ������ �� , ". (� �������� �� ���'�����"� ���������� ����'�� ���� ( �� � ���� ���� (�� �������� �� /97L, ���971- ��������'��"3 /�������� �� )1123.

.6 �+�������� ��� ��������� �� ���������� ����������?� (�� �������� ���� ���<�� ������ /)*=,* �������� �� 5 �� � ������������������� �� 6=)*�� �� ������3 ����� � � �������� �?� #�������� ���/������ $"����� 7���������� 7?3 ��������� �� � � ������������M������������. ���"������ � ��� �������� /�!>3 �����@������ �� ��� �����4��� �� � �����;����� ���� ��� �����+���� ��������� ����������� �"���������� �������� ��� �������� ������ /���J3 (�� ��������� ����������" ����������� ���'�����" /�������� �� )1123. #� ����� �!>��4����� ���������,*�7 ���=�!� /�� 8.53 6*�7 �!� ,.*�7 7�!�, *.**6C /(;'3��'��� ����� ������� *.,�7 !����� >�� ),C ������� L* �7 ��� ���4"���������� ���� ��� ��� *.L �7 ��� ������ )** �� �� �?� ���*.6 ����� �� ����� �+ ���"������ /������J���� !���� J���"'���� !�3 ������� '������ �� ,6 ��. �����@������ ���������� ��� ��� �4��� (��� �� �����(�I�� ������� ������������ ���� �� 15�! ��� 6��� �����(�� �" -5 �"���� �� 15�!��� ,* � 65�! ��� ,* � ��� 2,�! ��� ,* � �4���� � �� � � �������������������� (�� 68�! ��� �4�� ) ��� 6L�! ��� �4�� 2. ������������� �� � ��!�������� �!> �������� (��� ������ �� �� � )*C ����������;LC���"���"������=2*C ����������;),C ���"���"������ ��������������� ���/!�������� �� )1123. � ��� (�� ��� �� )L*� ��� 6 �� )� �J ������ ��65�! ������� (�� �� ����� ������� ��� � ������� �� ����� �����'����������������������. � �������" � � ��+����� ����������� ������� ����� ���������� ����� (��� �4����� ���� � � ���������� �������� ��� �������@�� ����������" ��+������ (�� � --��������� ������ ����� � � ��������� !"���$�+������� ��� /����� �� 0��� $������ !��'����� :�3 ��������� �� � �������������M� ������������. 9�� ����"��� �� ������� � �� (��� ��'��"������������ (�� ����4������� ������� ,*�� �� ��'��� ����� �������(�� ����� ��� ,6�� �������� ��4���� �� �'������ � � �� ������" ������ ��������� �� �!> /������������ �� )1183.

.�������� �� ���� ��� �� ���������� � ������ ������� ���� ������;����� (� �������� ������� �� ������" ������� �������������(� ��(� ���������� ���"���� ���� #�$8A -, /�; 3 �� ������ 8 /�� �� �� )1123 ��� #�$5A )*8 /=� ! ;A� ! 3 �� ������ 5 /���� ��)112% ��� �� )1183. � )*L �� ������ ������������ #�$8A -, (�������@�� ����� ������� 6��N�!!!!�!�!!!� !!!�!!�!!!!!��!!!�O�!����!��� �����!�����-� /���(��� ������3 ��� 6���!�!�!� !�!� �!� �!����-� /��'���� ������3 ����� � � �!>���������� ��������� ���'�. ?���������� �� ������� ��������� � �!������/$ ��@��� �� )1813. � ����'����� ������� �� � � ���"���� ��� (��������'�� �" ���J �� ��������� ���'�. � #99������� ����� �� � � ���(�� ��������� ����� �� ����� ������� �������� ��� �����'���������������������� ��� � � ����������� �� ��� ���� ��������4 ��� ����������4 ����� �� ��� ������ (��� ���������� �" ����� � � )���� ����"��� � �����4 $���(��� /� �����4 ?�(������ &.�.3. � ������'������������� �� �� ����'����� ������ �� � ������ (�� ���������� ��I /#����A /#����) A #����,3;,3; ���#% ( ��� #���� �� � � ��������" �� � �����'��� ��������4 ���� #����) ��� #����, ��� � � ����������� �� � ��(� ����������4 ����� ��� ���# �� � � ��� �� � � ����������� �� ��� ���������. � ������ ���(��� � � �(� ������� �� �?� �������� ���� ����� ��������� �"�� ��"��� �� )6 ���� " '��������� (��� *.1)=).*2. � ����������� (�� ���������� ������'� ��� �� ������� ����;����� �������� ��� � ����� (�� ����( *.8 �� ���'� ).,.9�� ����"��� �� � � #�$5A )*8 ���"���� ��� � )*, �� ������ �� ������

5 (�� �����@�� ��� -* ������ �� �!> ����� � � ������� 6��� !!��� � !������ �!�-� /���(��� ������3 ��� 6�� � �!�� �! !! ��-� /��'���� ������3 �� )*�� '���������������� ,*�7 ���=�!� /�� 8.53 6*�7 �!� ,.*�7 7�!�, *.**6C/(;'3 ��'��� ����� ������� ,*�7 �� ��� �? � *.6�7 ��� ������L.,6�!� N��--�O�� � )** �� �?� ��� *.- ����� �� ����� �+ �?����"������ /������J���� !����3. � �!> �������� (��� ��������� ������������ �" �������� ������ �� � LC ���"���"������;2 7 ���� ��� ( �� (�� �����+�����" ����� �4����� �� � $������ � ��� �� $����� /7���������"������ $���"'��� !�3 ��� ,5 ��� ��������� ����� � � #����P��������(��� /7�������� �"������3.

>J$&0 $

.�������� �� ���� ���������� ��� � ��������� � �������� ������ �� � � ����;����� ���� �� ���������� ���������������� (� �������� �� �!>������ ����"� �� �4����� �(� �������������"���� ���� ������� �� ������ 5 ��� ������ 8 �� � � ������������'��". ����"��� �� �?� ���� ��� ������ ������ ����������� ��������� ��'����� ������ ����+��������� ���(��� � ��(� ���"���� �� ������% � � A� ! ������ �� � � #�$5A )*8���"���� ��� �����������" ������������� (�� � � � ������ �� � �#�$8A -, ���"���� ��� ��� � � =� ! ������ �� #�$5A )*8������������� (�� � � ������ �� #�$8A -, /7�� �3.:'����� -1 �� � � 22 �������� /6)C3 (��� ���������'� /��$� 83.

(���"���� �� � ��� �������� /65C3 � �(�� ���� �� ��� ����;����� ������ ��������� � ��� �� ��� � ������" ������ /-8C3 ���)8 �� -) ���������� /68C3 N)2 �� ,1 ����������� ���������� /61C3O.����� � � ������" ������ ������� ���� (�� �����'�� �� ��� �� ������������'� ������� �������� ��� �� �(� �� ��'�� ���������'������@���� ��������� ���������. #� ,* �� � � �������� ������� ����(�� ������������ �� ��� ���"���� �� �������. #� � � ��������������" � ������������ �������� ���������� (� �����'�� ����������� �� ������ 8 ��� �������� ��������� �� �����<"�����" �� ������5 ���������� � �� � � ����� ����� ������� ���<"���� �������� ��� � 6� ��� �� ����;����� /7�� � �� �3. ���������'��" ���������� ����" � �� ����� ��" �'� ������� � ����� ���<"������������ ��������� �4�� 8.

2�������� ��� ���������� ��������� &���� �!> ������������� (�� ���J �� ���� �"�����������" ��� �4���� ��������� � � ����;����� ���� ��� ��+����� ����������� (� ������@����������� �� ���� �� � � L) ���������� �������� �������� /2C3 N������ 66 ����������� ���������� /2C3O ��� �� ���� �� � � )L ������"������ /��$�� 8 ��� 883. � ��������� �������� � �����

7����� �" .�������� �� ���� �������� �� ���������� ����������� ������� ��������� $� �+��������� �� ��� ����������$� ���� ������������" � ����'����� ������� �� � � ���"���� ����(��� �����'�� �" ���J ��� #�$8A -, /�; 3 /���� �� �3 �� �������������"���"������ ��� �������� ������ ��� #�$5A )*8 /=� ! ;A� ! 3/���� �� �3. ������� ��������� (�� �����'�� �� ���� �� � � @'� ���������'���������� /�� � � � � ��� �3. :�� �� � � ��������� /�� �3 � �(� ���� �� �����<"�����" �� ������ 8 /���� �� �3 ��� ��������� �� �����<"�����" �������� 5 /���� �� �3 ���������� � � �������� �� ����� �������� � ������� ���<"���� ����;����� ��������.

��$� 8" ��������� �� ��� ���������� ���� �� ���������� ���������� ��������

������� ���� 7�������

������" �������� -8C /-;83 *C /*;)L37������� ���������� 68C /)8;-)3� 2C /5;L)3�

�)2 �� ,1 ����������� ������ /61C3.�5 �� 66 ����������� ������ /2C3.

�-3 �#>!� �� �� �J �:&>?�0 :9 #?�J$ #�� #�J �J>7� :0:�Q

�����'������ �� ����� )-1 �� �4�� 6 ������� �� � � ��������� �� ���������� ���� ����� /7�� �3% � ) �� ��������� �� ����� )L5 ���4�� 6 ������� �� � ������ ��� ��� �������� � ��'�� ���� ����� ��)21% � , �� �������� �� ����� L �� �4�� ) ������� �� � ������ ������ �������� � ��'�� ���� ����� �� 1% ��� �� )) ��/ �!� ! !�3 ������ ��� �������� �� ����� ,2L �� �4�� 8�������� � ��'�� ���� ����� �� ,12 /��$� 883. :� � � ���� ��������(�� ����;����� ��������� ���" ��� (�� ���������'� ��� � ���+����� ���"���� ���� �� ������� 5 ��� 8. �� �����" � �(���'������ �� �����<"���� �������� ���������� � �� ��� ����;����� ������� (��� ������'���� �� � � ����� �����.:�� �� � � ����;������������� ������ � �"�� ����

���������� ���� ���� � ������� ( � ������� �� � ��������������'�� � �� (�� �������� �� �� � ���� ���� /97L,3. �� ���� ���� ������ ���'�����" ����"<�� ��� ����;����� ������ /�������� ��)1123 ��� (�� � �(� �� ����" �� ��������� ���<"���� ����;����� �������� � �� �4������� � � ����������" �� � ���� �����������������. 9��� ���� �� ������� (�� � ����;��������������"�� ���� ���������� (� ���� ����"<�� � � ������" ����� �������� �� �'������ �� ��������� �� � � ����;����� ����. 9��� � ��������� ����;������������� ����� (� �� �� ������������� �� �������� �� ���� ����� �� ���<�� ������" ����� ��������.

�#$!&$$#:?

�� ����" (�� �������� �" �(� ������ ������� ���'����� ���������� ���D������ �'������ �� �� � � �������� ���� �� ����;������� � � ��'�������� �� ��������� �������� / ��� �� )118% ��E�� �� )1183. ��E�� �� /)1183 �4������ ,- ������" ��� )2���������� ������ ���� $(��� �������� ��� ���� �� �����<"�����" �"����� �(� ���"���� �� ������ D����� ����;����� ��� ������������ �" ������ ������ ������������ ���"���� ��� ����"��� ���4��� 6=8. ?��� �� � � ��������� � �(�� ������� �������� ���������� �� ����;�����. ��� �� /)1183 ������� )2���������� �������� ���� &.$. �������� ��� ��������� �" ������������ ������������ ���"���� ��� ����"��� �� ��� �4��� �� ����;����� ��� ��� ���� �� �����<"�����" �" ����� �� �������������"���� ���. J'������ (�� ����� ��� ������� ���� �� 55C /���� ������3 �� � � ������� ��� � ���<"���� �������� �� ��� ������ ������ � �������� �� ���� �� ������.���� (� �"�����������" �4������ � ������ ����� �� ����������

�������� ��������� ��������� )L ������" ������ ��� L)

���������� ���� ����� �������� ��� ������� ���� ��� ��������� ������;�����. :�� ����" ��'����� � � �����(���I /�3 �����������;����� ��������� ����� �� ������������ �� �����4������" ��� �� � � �������� ��������% /��3 ��������� (��� ����� �� ������'��" �� ����� �� ��� ������" ��� ���������� ������ /-8C ��� 68C��������'��"3% /���3 ���������������� ��������� (��� ����� �� � ������������� �� ���������� ������� /2C3 ��� �� ���� �� � � ������"������% ��� /�'3 ��� �� � � ������@�� ��������� (�� �������������� � ���'���� ���������� ���� � � ���� ������� ���������� ������� ������ ������. ���� �� � ��� ���� �������" ������� ���������� ���������� /�������� �� )1123 � �� ����;���������������� ��������� �� ��������� ����������� �� � � ��'�����������;�� ����������� �� ��������� ��������. #� ������� �����'�( �� �� � � �������� ��� �� � �������� )*+ ��� ����;����� ����������� �� ��������� ���� �������� �� $(��� ������/��E�� �� )1183 ��D���� ������������������ ����������� �� � ���������� ����� �� �������� �����������. � ����� �� ��������� ��� ���<"���� ��������� �� ����;

����� �����'�� �� � � �������� �������� �4������ �� � �� ����"(��� ��(�� � �� �4������ ����������� �4������ ���� ����'�� ����� � ����" �� �������� ���� ����� /�������� �� )112% ��� ��)1183. ��� ��� ���'���� ������� �� �� �� ����� ����������� ���������� �'� � �(� � �� ���+������� �� �������� ��� �������� ������ ����� ��" ����� �� �����@�����" �� �� ( �� �������� (�� ���������� ������ ��� ��" ��������� � ���� ��������� ���������/!����� �� )1153 ���� �� ����" ����� ��� � � �����'��������������� �� ��� ����� �����������. 9���� ��� ��� ����� �� � �����"��� �� ���������� ���"���� ���� ��� (��� ������ ��� � � ����������� ���<"���� ������� ��������� ��� ��� ��������" ���������'� �� ����� ���<"���� ���������. $����� ��� ����"��� (�� ���������� �� ������� ������������ �� ��� ����� �����" ����"��� � �� ������������� ��� ��������� ������� �� � � �������� ������ ��" ��� �'� ���� ����������� �� � � ������������� ����"����� ��������� ��� ������ �� ���������� �����������". � ������� �� � �� ����" ������� ��� �4���� �4������ ������ ���

� � ��'��'����� �� � �������� )*+ �� � � ����������� �� � �������� ���������. ���'���� �"��������� ���� �� �����<"�����" ������������� ������� �'� ������������ ������� ������� �� � ��������� )* �� -*=L*C �� ����" ��� ��'����������� �������� /#�� �� �� )11-% ����" �� )116 )11L% ������ �� )116% ������� �� )1183. � �� ����� �� ����;����� ������'����� ������������ ���� ����� /�������� �� )112% ��� �� )1183 ����� ��(�� � � �������� �� ����;����� ��������� �� ���� ���������������� ��� ��� �� ��������� �� � � ���� �� ������" ������/�������� �� )112% � �� ����"3 ������� � �� �������� ���� ������;����� �������� ��" �� ���������� (�� ��+�������� ������������ ������". �� ������ ��" �� ���������� (�� ���'�����'������ � �� ����� �������� �"����������� �� � � ��� (�"��'��'��� � ��� ����"��������� -������ ���#��/-563�- ������;�� ��� ���� ����������� �� ������ �.�. � � ���� �� ���������� �� �� ������� ( �� � ���� ������� ����� �� ���� ��� �4����������������4 /9���� ��� >����� �� )112% ��'��� �� )1183. 7������������ ������ ����;����� �������� ��" � �� �� ������ ��������� ���'�'��� �� � � ������� �� ����� ���� ��� ��������� �� ������������ �� � � ���". #� �(���� ���� �� ����" ( �� �� ������� ������������ ������ ��� �� ����������� �� ����;����� �� �������" �� ������������ �� � � ���� ��� (�" �� � ������� ������� �� ������������������.

��$� 88" ���������� ��������� �� ��������� ��������

�����" ��. 7������� J4�� !���� ��������� ������ ������" �����

5L ������������ ���������� �� ��� ) 2 9����� ��� ���� �� 1 ?��

) �"�� ���� ���������� � �� �� 6 )-1 0�� �� ���� ?� ��������)- �"�� ���� ���������� #�������� �� � 6 )L5 9����� ��� ���� �� )21 ?� ��������5 ������������ ���������� )) �� �������� 8 ,2L 9����� ��� ���� �� ,12 ?��

�?� ��� �'�������.

7����� �" .�������� �� ��� ��9: �������� �� � �����������������" $�+����� ����"��� �� �4�� 6 �� � � ����;����� ������'���� � ����� �����'������ ������� � � ������������ �� � �������������������� �����.

�:0. ))5 ?:. , 9J�>&�>Q ,*** ����;����� #? &?!&0 &>J� 7J0�?:7� �-9

� �� � �� �� !�"# #�� �������� �# ���� ��$���� ���� ���� ��� ������%

�& '�� � #��$ � �� ��� �� (� )�(�&* � �� ��� �%�(�� +���(� ��� (��*

� �� ��� �� (� +���(� ,�� %��� * � ���� ���%��� ,�� %��� * � ����%

���&� ,�� %��� * � % � -���� ,�� %��� �

>J9J>J?!J$

������� �! 0����� �J ���� � ���E��� J� ����� �I ! ��������� ����� ��������� �� ������" ��������� ��������� �������� �" ���������'� ������� "�����<�����. �� (� +� 68I,)2*=,)26 )118

��E�� > ������"�� �: ���� � �������� � � ���� �I � � J? ���������������� ���� ��� ��������� ��������. ��� �$� +� 8I-**=-*, )118

!����� � 7�� 0 7���� � ��I >���� �� �)L /7 $)3 ��������� �� ������" ������(�� 1� ����. )(� ( ,L6I5)6=5)2 )115

!����� � :��� � ����� �� $ ��I 9��+���� ������'����� �� � J?;77�!) ��������" �������� ������. �� (� +� 62I5112=6*** )112

! ���" #B �� ���� �J ������������ 7 ��I $���������� �� �������������" �������������� ����� �" �����'������������� 77�!);� J? ���� ��������.�� (� +� 68I,--)=,--5 )118

!�������� 0 9���� $ 9������ 7 >�� ���� �� ���@ !I ��������������� ���J ���������<�� ��������� �� �?� ����� ���������. .��(� �/�� ,,I-,L=--* )112

�� �� �0 7��� �� � ��� � ��I $������ ��������� ��� ��������� �� � � !�(���������� ���� � J? �� �������� � "���� ������. �� (� +� 62I52)*=52)-)112

��'��� 7� 0� Q $��� ��I �����'���� ��������� �4�������� �� 77�!;� J?�� ���� ������ ����� �� ����� �� ����'����� ��� ������� ������. �� (� +�68I6,86=6,1* )118

�� !��������� � ����� � !������!���� ! ������@ ��I ���� �� ��������� �������"���� ��'�������� ��� ������ �����������. �� 0 )1I-58=-66 )118

9���� $7 >����� �� JI #�������� ��� ������. ���� 1�� ��� .��� 1I2*)=2*L )1129������ 9� 0�� � ����� �$ !�'���� B�I ���(� ����������� �� ������ ����� �"

� J? ��+����� � ���������� � ��� ����� �����"��� ������. ���( ��� �(�% )(�2)� 15I),521=),585 )112

9������ 9� ����� �� !�'���� B�I � � ��� ��������� � ��� ����� ����'��" ��� J? �������� � �������������'� �) ���(� ������ �� ������ �����. �� (� +�68I6**,=6**8 )118

������������ � >���� & ����� >�I ��'��� ����� ������� ��'����� �� ��������� > ��!> �" �������. .��(� �/�� ,6I6L5=6LL )118

�������� � �� $������ � ���� � � ������ � ����� �9 ���� �� �I ������������ � � �����;���� ���� �" �������� �� �������� �� � ���+���� �'��� ����������� ��������. �� (� +� 62I-LL*=-LL- )112

���������� � $ ���' ? B��� 7 7���� � Q���� � $���� �I ������� ����� �/���;��3 ����'��" �� ���'���� �� ������������ ����� ��� �� �������� �� � ������ ���������� � J?;77�!. ���� .��� 8I))16=))18 )118

����" J >� ��� # ����� � >��� �0I 0��� �� �����<"�����" �� �������� ������"��������� ��������. 0 � ����$���$� �� (� ),I)6,=)6L )116

����" J ������� !J ���� 7 �� �+���� � >� ��� # >���" � >��� �0I�������"��� �� ������" ��������� �������� ��� ������ �������"��� ��'�.�� (� +� 6LI681=61- )11L

#�� �� � J���� �J �����" � 0�������� ��I ! �������� )* ������� ���� ����������� ��������. 0 � ����$���$� �� (� 8I)28=)85 )11-

���� � $�<�� � ��� ��I � J?) �� ���+�����" ������� �� ������"����������� ����������. �� 0 )2I)5-=)55 )112

0� � Q�� ! 0��( � ��I � J? � ������'� ������� �"������ � ��� ����� ����������� �� ���� ����� ������ ��� �������� ������. )(� ( ,26I)15-=)152)112

0��( � 7��� �� 0� � ��I �������� ��������� �� � � � J? ���� �� !�(���������� �� �� ������ ������ ��� � "���� ������ �"������. �� 0 )LIL5=L2)112

7�� ��� ��4�� �JI � ����� ���������� � J?;77�!) ��� ��� ��"������ � ����� ������ ��������� � ��� ����"��������� -56������ ��� ���. 3 .�����$ ,2-I)--26=)--28 )118

7��� �� �� �� �07 � ��� � 0��( � ������� > ������ >� J�� !I ����������������� �� ���� ��� ������� �� �����"��������� �"������. �� 0 )LI---=--5 )112

7"��� 7� ���� # ����" #� ��I � ����� � ��� ����� ����'��" �� � J? �� ����������� ��� ����� ���������� ��������. ���( ��� �(�% )(� 2)� 16I)-6)-=)-6)8)118

?���� 7> '�� $��'���� B!� ������� J�� ��I �������� ��������� �� � �����;����� ���� �� �������� (�� !�(��� �������. 4�$ ��� 0 LI)-8-=)-82 )112

>������� �# ��"�� �� ���� �� � ������� �!I � J?;77�!) ��������� ������������� �������. �� (� +� 62I52-L=52-8 )112

>�������� �� 9������ 9� 7���� 7J ��I #� '���� ���� �� �����<"�����" ������� � �� J?;77�!) ���� �� ��������. ���( ��� �(�% )(� 2)� 16I15)8=15,-)118

$ ��@��� �! !�4 �> 0����� 0$ 7"��� >7I ����� ���� �� � 5*���������� �A!��� ��+����� /�!������3 �� ������� �?� ��������� �" � � ���"������� ��� �������� �� �����'�� ��������� �� ����������� � �����. ���( ��� �(�% )(�2)� 8LI,-,=,-L )181

$�������� � $�<�� � �� �� ����� �0 ��I ?�����'� ���������� �� ���;������������ ���� ���'�'�� �" � � ����� ���������� � J?. ��� 16I,1=-1 )118

$��� �� ���� ���� 7� ������ $� ��I #�����@������ �� � ��������� ���������������� ���� 77�!) �� � �������� )*+,-.- � �� �� ������� �� ����������'����� �������. �� 0 )6I-6L=-L, )112

$�<�� � �� �� ����� �0 $�������� � ��I ��� ������ �������������" �������"���� ��� ����" ���������� (�� �������� �� � � � J? ����� �������������� �� ����. ���� .��� 8I))L1=))28 )118

����� 7 �� � 7�������� � ���� $ ������� > Q����� �7I #� ������� �� ������������� ��������� ��� ����� �� ������ �" ����� ���������� � J?. )(� (,8*I)L)5=)L)2 )118

��� �� �� > 0�� � ��I 77�!);� J? ��������� �� ������" �������������� ��� ����� ���� �����. �� (� +� 62I6,,)=6,,6 )112

������ 9� J������ � :���� $ ��I !"���������� �� )68 �������� (�� ���������� ������������ ��������. $����� ����"��� �� ������������ ��� ��������"��"���. �� (� 0 �&�' 8-I1-=)*5 )116

��� � � ��� F ������ J ������ 9�I #�����@������ �� � J?;77�!)����������� �� ���������� ��������� ��� �������� ���� �����. 1 (�' )LI--12=-5*, )118

��������� >� '�� ���(�R �! ������� �� '�� $���������� �� ������ �I9��+���� ������'����� �� � J? �� �������� ������ ���� ����� ��� 4���������.�� (� +� 68I,2,*=,2,- )118

B��� $# ��� � 0� � ����� �? !����� � $������" � ������� >I $������ ����������� � J? �� ������������ ����������. �� (� +� 62I5)8-=5)8L )112

�3� �#>!� �� �� �J �:&>?�0 :9 #?�J$ #�� #�J �J>7� :0:�Q