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Speciale diagnostica - giugno 2014N° 3

La diagnostica: dall’ambulatorioal laboratorio

I.R.

2 Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014

Editoriale

Un viaggio nella diagnostica clinica ...........................................................................................................................................................................3Angelo Giorgetti

BVT (Bio Veto Test)

La divisione diagnostica di Virbac...............................................................................................................................................................................4Jérôme Morlet

Esami di laboratorio e diagnosi

Evidence Based Medicine ..............................................................................................................................................................................................5Daniela Proverbio

Diagnostica delle retrovirosi

Speed® Duo FeLV/FIV: possibili casi di impiego................................................................................................................................................7Nicoletta Rizzi

Attendibilità dei test rapidi

Speed® Duo FeLV/FIV raccomandato dagli esperti .......................................................................................................................................8A cura di Virbac

Interazioni antigene - anticorpo

I test sierologici per la diagnosi di malattie infettive .......................................................................................................................................9Emanuele Minetti - Ugo Bonfanti

Leishmaniosi canina

Speed® Leish K: screening pre-vaccinale e iter da adottare ..................................................................................................................12Nicoletta Rizzi

Innovazione nella diagnostica

Il futuro a portata di mano: la spettrometria di massa .............................................................................................................................14Tommaso Furlanello - Graziano Balestra

Sommario

Pubblicazione a carattere non periodicodella Società Virbac e pertantonon soggetta a registrazione ai sensidegli Artt. 2 e 16 Legge n. 47/1948.

Tipografia

Aziende Grafiche Printing srl

Peschiera Borromeo (Mi)virbacnews

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■Test e kit di laboratorioUn viaggio nella diagnostica clinica

Editoriale

Virbacnews n° 3 - Speciale diagnostica - giugno 2014

Angelo Giorgetti, DVMMarketing managerVirbac Italia

C are Lettrici, Cari Lettori. Siamoal terzo numero di Virbac Newsche, dopo argomenti quali la lei-

shmaniosi e le novità in dermatologia, ècompletamente dedicato alla diagnostica.Vorremmo farvi percorre insieme a noiun viaggio attraverso questo aspetto cosìpeculiare della vita quotidiana di un clinico,senza avere la pretesa di fare un trattatoapprofondito, ma con l’obiettivo di svi-luppare momenti di riflessione, di stimolareeventuali approfondimenti, di approcciarela materia in modo pragmatico, semplicee utile. Tratteremo argomenti fondanti econsueti nell’approccio diagnostico, manon mancheranno spunti relativi all’inno-vazione nonché all’esplorazione di nuovefrontiere e di metodiche avveniristiche.Lo spirito di VirbacNews rispetta una vi-sione semplice, quella cioè di dare spazioa voci indipendenti a fianco della più ac-curata comunicazione aziendale, in mododa presentare al lettore una pluralità diconoscenze. Lo scopo ultimo rimanequello di arricchirvi di informazioni utili,nuove e di poter comunicare con voisulla nostra azienda e sulle idee che sonola base dei nostri prodotti.Come vedrete, Virbac ha una storia nelmondo della diagnostica (non solo il rangedei test Speed per l’ambulatorio ma anchekit di laboratorio come quello relativo al-l’individuazione dell’iperplasia prostatica be-nigna canina) contraddistinta da continua

ricerca scientifica e dallo sviluppo di nuovitest, il tutto nel rispetto di standard di altolivello e di buone pratiche di produzione.Inoltre la dimensione internazionale diVirbac ci permette un costante aggiorna-mento, usando le conoscenze e le metodichepiù avanzate e rendendole fruibili a livelloglobale. A riprova di quanto appena dettovorrei portarvi due esempi che rappre-sentano per noi il fiore all’occhiello dellanostra linea diagnostica: Speed Leish K eSpeed Duo Felv/FIV. Entrambi rappresentanolo spirito innovativo della nostra ricercasempre orientata a fornire soluzioni allineatecon le più recenti conoscenze scientifiche,mantenendo elevate le performance qua-litative e di attendibilità.In questo numero troverete prestigiosiautori provenienti dal modo del labora-torio e dal mondo accademico, tutti conuna formazione veterinaria di altissimoprofilo e con un’esperienza di campo digrande valore.La prof.ssa Daniela Proverbio ci aiuterà acapire come sia importante applicare lamedicina basata sulle evidenze (EBM) ecome sia sempre essenziale valutare glielementi di base dell’approccio diagnostico.Una visione quindi più da clinico, costrettoquotidianamente a orientarsi grazie a daticompleti e strutturati, per far fronte allerichieste sempre più competenti e speci-fiche dei propri clienti.Il dott. Emanuele Minetti e il dott. Ugo

Bonfanti, invece, grazie all’accurata de-scrizione di metodiche diagnostiche diuso frequente, ci porteranno a valutarecome i test rapidi e le analisi di laboratorionon siano in antitesi, ma che anzi rappre-sentino due momenti distinti di una com-pleta e accurata raccolta di dati che per-mette al clinico di orientarsi in modo og-gettivo nella individuazione di una pato-logia.Un’ulteriore autorevole voce, quella deldott. Tommaso Furlanello, ci illustreràcome si evolve il mondo del laboratorioe come metodiche una volta riservate aun uso eccezionale, oggi possono diventaredi routine ed essere un valido ausilionella pratica clinica.A loro vorrei porgere i miei più vivi rin-graziamenti per la proattività e il loro al-tissimo indice di professionalità.Infine vorrei ringraziare il marketing teamdi Virbac che ho il piacere di coordinare.Infatti solo grazie a loro e al loro costanteimpegno, alle loro competenze di primoordine, al loro entusiasmo, alla loro moti-vazione si possono realizzare prodottieditoriali di questa levatura. In ultimo, ma non per importanza, ungrazie anche a Le Point Vétérinaire Italieche ci assiste in questa impresa suppor-tando il nostro lavoro con precisione,dandoci sempre una consulenza fattiva.

Buona lettura

Nell’esercizio quotidiano della pro-fessione i metodi di diagnosticarapida sono ormai diventati parte

essenziale del processo diagnostico. Que-ste tecniche rapide, di semplice esecuzionee affidabili sono un valido aiuto per il vete-rinario tanto nella pratica di tutti i giorniquanto nelle situazioni di emergenza, peraffinare la diagnosi e la prognosi in pochiminuti, proprio “in presenza del paziente”.Dal punto di vista economico, questi me-todi sono poco costosi e possono essereutilizzati anche per lo screening a scopoprofilattico di affezioni ancora subcliniche.In questo contesto, Virbac offre un’ampiagamma di test da utilizzare nella praticaveterinaria quotidiana. L’impegno di Virbacnel campo della diagnostica ha avuto inizionel 2003, quando ha acquisito Bio VetoTest (BVT), un’azienda francese di biotec-nologie, fondata dal dott. Gerard-MariePapierok, già direttore del laboratorio dimicologia dell’Istituto Pasteur.Basandosi sullo know how di BVT nel campodella batteriologia e dell’immunoassay, grazieal quale è stato possibile sviluppare prodottidi riferimento come Speed Duo FeLV-FIVe test rapidi per l’identificazione battericae la determinazione dell’antibioticosensibilità,il nuovo dipartimento diagnostico di Virbacha continuato sulla strada dell’innovazione,con il principale scopo di fornire ai veterinaripratici un ampio range di prodotti inno-vativi, usando le migliori tecniche diagno-stiche, tra cui ricordiamo:- 2007: Speed® Duo Leish/Ehrli primotest combinato per l’identificazione dellaleishmaniosi e dell’erlichiosi;- 2009: Odelis® CPSE primo test per indi-viduare l’ipertrofia prostatica benigna nelcane;- 2010: Speed® Leish K primo test perl’individuazione degli anticorpi anti kinesine,

indicative della replicazione attiva di Lei-shmania nel cane;- 2011: Speed® Duo Diro/Leish primotest per l’individuazione simultanea di di-rofilariosi e leishmaniosi- 2012: Speed® V-Diar, con speciali accor-gimenti ergonomici che consentono direalizzare in allevamento l’identificazionedei principali agenti causali della diarreabovina.Oggi, un intero team di Virbac è specifica-tamente dedicato allo sviluppo, produzione,vendita e supporto ai massimi livelli deiprodotti diagnostici Virbac.

Un continuo miglioramento in campomedico, la soddisfazione del cliente e laconformità a tutti i requisiti normativiapplicabili, sono le principali linee guidadell’attività diagnostica di Virbac. La qualitàdei prodotti, così come i processi di sviluppoe produzione sono rigorosamente controllatisecondo le norme ISO 9001.Oggi gli strumenti diagnostici di Virbac ven-gono prodotti in Europa, ma le unità pro-duttive sono approvate anche dall’USDA(US Department of Agriculture) e dal MAAF(Ministero dell’Agricoltura giapponese) perl’esportazione.

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■ BVT (Bio Veto Test)La divisione diagnostica di Virbac

Gli Speed test sono strumenti diagnostici rapidi e semplici da utilizzaresia nella pratica clinica quotidiana che nelle situazioni d’emergenzaA

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Jérôme Morlet, DVMGlobal marketing manager - Diagnostic rangeBVT - Virbac

Diagnostica

Gli strumenti diagnostici di Virbac vengono prodotti in Europa (nella foto, la sede di BVT a La Seyne sur Mer, Francia),ma le unità produttive sono approvate anche dall’USDA (US Department of Agriculture) e dal MAAF (Ministerodell’Agricoltura giapponese) per l’esportazione.

Il corretto approccio alla diagnosi clinicaprevede l’applicazione di uno schema pre-ciso e ripetitivo. Negli anni più recenti,

anche in Medicina veterinaria, è stata propostal’applicazione della medicina basata sulle evi-denze (Evidence Based Medicine EBM).Secondo questo metodo, durante la gestionedel paziente le decisioni devono essere presemediante l’uso coscienzioso delle evidenzefornite dalla ricerca scientifica piuttosto chesulla base delle esperienze personali del clinico. Negli anni l’EBM è stata rivalutata e si è giuntia un approccio bilanciato tra conoscenza edesperienza, in particolare riguardo alcuniprocessi clinici quali la raccolta dell’anamnesie l’esame fisico del paziente, che richiedonoabilità e processi cognitivi che spesso nonpossono essere formalizzati né standardizzati. Tra gli ausili più importanti per il raggiungimentodella diagnosi clinica vi sono gli esami di labo-ratorio. Certamente per la scelta di questiultimi l’Evidence Based Laboratory Medicine(EBLM) rappresenta un ausilio molto valido,in quanto aiuta a conoscere la valutazioneoggettiva dei test, e il loro valore diagnosticoviene valutato in base alla sensibilità, specificitàe al valore predittivo positivo (VPP) o negativo(VPN). L’EBLM permette di eliminare gli esamiinutili che non forniscono adeguato ausilioper il clinico e di introdurre nuovi test, miglio-rando l’accuratezza e l’impatto clinico dell’esame.Una volta effettuata la lista delle possibilidiagnosi differenziali, il clinico mette in atto unpiano diagnostico che ha lo scopo di localizzarela sede dell’alterazione e di ricercarne il mec-canismo fisiopatologico.

Definire l’esame da scegliere esaper interpretare il risultatoGli esami di laboratorio possono essererichiesti per confermare un’ipotesi diagnostica,per monitorare un paziente o per verificare lacorrettezza o la veridicità di esami precedenti.

In qualsiasi caso, occorre considerare i fattoripre analitici che hanno una grande influenzasulla sensibilità e specificità del risultato. Adesempio, occorre tenere presente che permolti test la sensibilità e la specificità varianoin base alla matrice biologica prescelta.Importante è, quindi, non solo definire qualeindagine scegliere, ma occorre anche saperinterpretare il risultato che viene fornito dallaboratorio.Come decidere quale esame di laboratoriorichiedere? In linea generale, occorre:- identificare il biomarker maggiormente cor-relato all’evento clinico che stiamo valutando;- individuare la metodologia più valida perquel determinato esame;- individuare il substrato biologico più idoneo;- conoscere la sensibilità e la specificità delmetodo;- conoscere il valore predittivo positivo o ne-gativo del test, che è influenzato anche daldato epidemiologico della patologia.

Come richiedere gli esami al laboratorio? La richiesta deve avvenire in base a un proto-collo specifico riferito al sintomo o ai sintomiprincipali (ad es. poliuria/polidipsia, ittero, ane-mia….). Gli esami di laboratorio diventano inutili sesono eseguiti superficialmente (ad esempiose chi li richiede non ne sa valutare il risultato),oppure se non viene effettuata una correttavalutazione pre-analitica (ad es. scelta del sub-strato più adatto, corretta conservazione delcampione ecc…).Di regola gli esami di laboratorio vengono ri-chiesti per step successivi da esami più genericie di base, detti di primo livello, fino ad esamiestremamente specialistici.

FIV e FeLV: una presenzamondialeNegli ultimi anni accanto agli esami ematologicied ematochimici tradizionali sono comparsiin commercio test rapidi ad uso ambulatoriale.Generalmente questi test si basano sulla

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■ Esami di laboratorio e diagnosiEvidence Based Medicine

Tra gli ausili più importanti per il raggiungimento della diagnosiclinica vi sono gli esami di laboratorio.

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Prof.ssa Daniela Proverbio DMV, PhDClinica Medica dei Piccoli AnimaliDipartimento di Scienze veterinarieper la salute, la produzione animalee la sicurezza alimentare (VESPA)Università degli Studi di Milano

Diagnostica

Aspetti clinici e di laboratorio di FIV e FeLV

FeLV FIVSEGNI CLINICI Anoressia/disoressia/ Stomatite (spesso cronica dimagramento ulceroproliferativa) Ipertermia Patologie neurologiche Disidratazione centrali e/o periferiche Patologia respiratoria Patologie oculari (riniti, infezioni alte vie) (uveiti, corioretiniti) Patologia gastroenterica (diarrea) Patologia oculare (congiuntiviti) Infezioni cavo orale (stomatiti) Disordini mieloproliferativi ALTERAZIONI Anemia AnemiaDI LABORATORIO Trombocitopenia Leucopenia Neutro e/o linfopenia Linfoadenomegalia/linfoadenopatiaNEOPLASIE ASSOCIATE Linfoma Linfoma/leucemia

ricerca di anticorpi o di antigeni e vengonoutilizzati per la diagnosi di malattie parassitariee infettive (Dirofilaria immitis, Leishmania spp,Ehrlichia spp, Rickettsia spp, leucemia felina, im-munodeficienza felina).Un esempio di test ambulatoriale ampiamentediffuso è rappresentato dai test rapidi per ilvirus dell’immunodeficienza felina (FIV) e ilvirus della leucemia felina (FeLV), che spessovengono commercializzati in un unico kit. Entrambi questi virus sono presenti a livellomondiale con prevalenze variabili di infezione.La prevalenza di FIV varia da 1 a 14% in gattisani mentre arriva fino al 44% in gatti sintomatici.La FeLV ha una prevalenza inferiore all’1% neigatti casalinghi che vivono soli e sale fin oltre il20% in gatti che vivono in nuclei numerosi. Inun recente studio condotto nel Nord Italia èstata valutata la prevalenza di FIV e FeLV in316 gatti di colonia, evidenziando una positivitàdel 6,6% per FIV e del 3,8% per FeLV. Il FIV si ritrova nella saliva, nel sangue e in altrifluidi corporei e la trasmissione avviene pre-valentemente mediante morsi. Il FeLV èpresente nella saliva ed il passaggio tra gattiavviene principalmente per via oronasale me-diante la condivisione di ciotole e comporta-menti sociali in particolar modo in ambientisovraffollati. I gatti affetti da questi patologie virali presentanoalterazioni cliniche (letargia, anoressia, palloredelle mucose, linfoadenomegalia, stomatite,forme respiratoria delle alte e basse vie, con-giuntiviti, alterazioni gastroenterico e neurolo-giche), e/o di laboratorio (anemia, neutropenia,linfopenia, ipergammaglobulinemia, iperazotemia)comuni ad altri processi morbosi virali/infettivie non. Per questo motivo la FIV e la FeLVsono spesso presenti nell’elenco delle possibilidiagnosi differenziali. Risulta di fondamentaleimportanza diagnosticare o escludere la pre-senza dell’infezione in tempi brevi al fine di in-staurare un corretto approccio terapeuticoe/o profilattico (vedere tabella). L’infezione da FeLV è caratterizzata da unaserie di patologie degenerative e proliferativedi origine mieloide, linfoide ed eritroide. Isoggetti si presentano alla visita con perdita dipeso, disidratazione, febbre, stomatite, rinite,congiuntivite, associati ad una più alta incidenzadi forme neoplastiche rispetto ai gatti non

infetti. L’infezione da FIV causa una serie disegni clinici associati che sono altrettantoaspecifici e riflettono la maggiore suscettibilitàalle infezioni oppurtunistiche. Comunementequesti soggetti si presentano alla visita clinicaper perdita di peso, letargia, disoressia/anoressia,linfoadenomegalia, gengivostomatite, scolooculare, ipertermia. Anche in questi gatti èmolto più alta rispetto al resto della popolazionela possibilità di incorrere in forme tumorali (inparticolare i linfomi). Il sospetto diagnostico della presenza di questeinfezioni come causa dei sintomi clinici evi-denziati, deve necessariamente essere con-fermato mediante la ricerca anticorpale o an-tigenica.

Test ambulatorialiIn commercio sono presenti numerosi kitcommerciali ad uso ambulatoriale, che sibasano su metodiche ELISA o di immunomi-grazione rapida. Per quanto riguarda la FeLV i test, che nonhanno alcuna cross reattività con i ceppivaccinali, vanno a ricercare l’antigene p27 delvirus della leucemia felina in sangue o siero,mentre per la FIV vanno a ricercare gli anticorpiprodotti contro il core proteico p24 del FIV(metodo ELISA) o contro la proteina dell’en-velope gp41 (RIM). Questi test rapidi presentano una buonasensibilità (94-96%) e specificità (98-99%),anche se, come ogni test, possono presentarefalsi positivi e falsi negativi (VPP si aggira in-torno all’80-90%, VPN intorno al 96-99%).La corretta esecuzione delle procedure mi-gliora ulteriormente la performance globale.

Ad esempio, i gatti sani devono esseretestati circa 12 settimane dopo l’esposizionea gatti malati (rischio di viremia transitoriaper il test FeLV, e rischio di mancata rispostaanticorpale per il test FIV), mentre l’impiegodel siero al posto del sangue intero può fa-cilitare la lettura del risultato. La facilità diesecuzione e il buon rapporto sensibilità/spe-cificità rende questi test rapidi adatti ancheper esami di screening. Infatti l’ infezione daFIV e da FeLV spesso decorre in modoasintomatico per cui tutti i gatti consideratia rischio di esposizione devono esseretestati. Il test deve essere effettuato attornoal quarto-sesto mese di vita (quando eventualianticorpi materni diretti contro il virus dellaFIV non sono più presenti) a tutti i gattininati in libertà o di cui non si conosce esat-tamente l’anamnesi remota, e a tutti i gatti(qualunque sia l’età) che vengono introdottiin una nuova casa. L’esecuzione “preventiva”del test permette, in caso di positività, dimettere in atto fin da subito gli accorgimentinecessari per la salute del paziente, di pro-grammare al meglio il protocollo vaccinalee di valutare l’eventuale convivenza conaltri gatti. I test di elezione per la diagnosidelle patologie virali del gatto sono l’isola-mento virale e/o l’immunofluorescenza perquanto riguarda la FeLV e il Western Blotper quanto riguarda la FIV. Tali tecnichesono però eseguibili sono presso laboratorispecialistici con personale qualificato. Ge-neralmente si ricorre al loro impiego soloquando i test rapidi forniscono risultatidubbi o non congrui con il sospetto clinicoo l’anamnesi del paziente.

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Diagnostica

• Hosie MJ, Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon Egberink CH, Frymus T, Gruffydd-Jones T, Hartmann K, Lutz H,Marsilio F, Pennisi MG, Radford AD, Thiry E, Truyen U, Horzinek MC and Lloret A - Feline Immunodeficiency: ABCDGuidelines on Prevention and Management. Journal of Feline Medicine and Surgery 2009 11: 575 • Lutz H, Addie D, Belák S, Boucraut-Baralon C, Egberink H, Frymus T, Gruffydd-Jones T, Hartmann K, Hosie MJ,Lloret A, Marsilio F, Pennisi MG, Radford AD, Thiry E, Truyen U and Horzinek MC - Feline Leukaemia: ABCD Guidelineson Prevention and Management. Journal of Feline Medicine and Surgery 2009 11: 565• Spada E, Proverbio D, Della Pepa A, Perego R, Baggiani L, Bagnagatti De Giorgi G, Domenichini G, Ferro E andCremonesi F - Seroprevalence of feline immunodeficiency virus, feline leukaemia virus and Toxoplasma gondii instray cat colonies in northern Italy and correlation with clinical and laboratory data Journal of Feline Medicine andSurgery2012 14: 369• Collaudo VM, Domenech A, Miró G, Martin S, Escolar E, Gomez-Lucia E - Epidemiological Aspects andClinicopathological Findings in Cats Naturally Infected with Feline Leukemia Virus (FeLV) and/or FelineImmunodeficiency Virus (FIV) Open Journal of Veterinary Medicine, 2012, 2, 13-20

Bibliografia

L o screening e la diagnosi della FeLV edella FIV fanno parte dell’attività quo-tidiana del veterinario pratico: per

realizzarli il professionista ha a disposizionedei test rapidi, che si possono realizzare di-rettamente in ambulatorio e che gli permet-tono di sapere - in pochi minuti - lo status delgatto rispetto ai retrovirus; si tratta del testSpeed® Duo FeLV/FIV, che rileva l’antigenecircolante P27 del FeLV e gli anticorpi diretticontro la proteina GP40 del virus FIV.

Retrovirosi: screeninge diagnosiIn un animale sano, l’esecuzione del testSpeed® Duo FeLV/ FIV è opportuno per loscreening prevaccinale, tra gli esami prechi-rurgici, prima di essere messo a contatto conaltri gatti o avviato alla riproduzione, o ancoraper i gatti donatori prima di una trasfusione.In presenza di un quadro clinico polimorfo epoco specifico, Speed® Duo FeLV/ FIV è in-dicato come esame complementare per va-lutare il coinvolgimento di retrovirus e, diconseguenza, per adattare la terapia. Tuttavia,anche alcune situazioni precise possonoessere dovute a una retrovirosi latente, anchein questi casi è utile includere un test nell’iterdiagnostico.Le raccomandazioni sui casi in cui è utile ef-fettuare un test di screening per FeLV e FIVsono pubblicate sia in Europa che negli StatiUniti e sono disponibili gratuitamente online all’indirizzo: www.abcd-vets.org (Gruppodi esperti europei in medicina felina), oppureall’indirizzo: www.catvets.com (Associazioneamericana dei veterinari esperti in medicinafelina).

Retrovirosi e gengivostomatitiIn uno studio condotto negli Stati Uniti*pubblicato in occasione del congresso del-l’American College of Veterinary Internal Medicine

(ACVIM) 2011, relativo a 11.262 gatti colpitida un’affezione della cavità orale, si osservache tra gli animali inclusi nello studio il 6,8% èpositivo per FeLV e il 7,1% per FIV, mentreuna co-infezione FeLV/FIV è presente nell’1%dei casi.Relativamente alle sole stomatiti, la prevalenzaraggiunge il 12,2 % per la FeLV e il 13,9% perla FIV, con il 2,2 % di co-infezioni.Dal momento che in media la prevalenza diqueste malattie nella popolazione felina èdel 2,3% per la FeLV e del 2,5% per la FIV,questo studio evidenzia un aumento signifi-cativo del rischio di retrovirosi in caso diaffezioni della cavità orale nel gatto.

Retrovirosi e ascessisottocutaneiUno studio, pubblicato nel 2008** e relativoa 967 gatti portati in visita per un ascessosottocutaneo o una ferita da morso, mostrache il 19,3% di questi animali era, il giorno

della visita, positivo ad almeno uno dei duevirus. Quindi, uno screening FIV/FeLV do-vrebbe essere previsto per tutti i gattiportati in visita per una ferita dovuta a unalotta con altri gatti o per un ascesso. Per igatti risultati negativi al test, bisognerebbeprevedere di ripetere l’esame dopo 60giorni, per tenere in considerazione il ritardodella sieroconversione caratteristico delle re-trovirosi (30 per FeLV e 60 giorni per FIV).Queste differenti situazioni cliniche devonoindurre il veterinario a proporre uno screeningdelle retrovirosi in modo tale che, se necessario,sia possibile affrontare precocemente e nelmodo migliore queste patologie.

* Belows J. and coll. Seroprevalence of FeLV and FIV in cats withoral disease. In : Proceedings of ACVIM Congress, 15-18 giugno2011, Denver (USA), 707-708** Goldkamp CE et coll. Seroprevalences of feline leukemiavirus and feline immunodeficiency virus in cats with abscessesor bite wounds and rate of veterinarian compliance with currentguidelines for retrovirus testing. J AmVet Med Assoc. 2008 Apr15;232(8):1152-8.

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■ Diagnostica delle retrovirosiSpeed® Duo FeLV/FIV: possibili casi di impiego

“Nonostante la prevalenza della FeLV si sia ridotta, l’identificazionee la diagnosi della FeLV e della FIV restano più che mai di attualità”

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Nicoletta Rizzi, DVMTechnical ServiceVirbac italia

Diagnostica

Impiego del test Speed® Duo FeLV/FIV

Siero, plasma, sangue interocon anticoagulante

Esito positivo

Esito negativo

A cura di Virbac

Uno studio pubblicato nel Journalof Feline Medecine and Surgery(Har tmann et al, dicembre

2007) valuta le performance degli 8 prin-cipali test diagnostici per le infezioni daFeLV e da FIV. Le performance di Speed®

Duo FeLV/FIV quali la sensibilità, la speci-ficità, i valori predittivi positivi e negativi,così come la facilità di lettura sono statevalutate comparandole con i metodi direferenza: il Western Blot per la FIV el’isolamento virale per la FeLV.

Materiali e metodiI sieri utilizzati per lo studio sono statiprelevati da 536 gatti, selezionati randomfra i pazienti del Dipartimento di Medicinadegli animali da compagnia dell’Universitàdella Georgia ad Athens, USA. Tutti i testsono stati realizzati secondo le racco-mandazioni del fabbricante e l’operatorenon conosceva i risultati degli altri testrealizzati sullo stesso siero.- Su tutti i sieri che avevano presentatoun risultato positivo FeLV ad almeno unodei test valutati, è stato realizzato un iso-lamento virale.- Su tutti i sieri che avevano presentatoun risultato positivo FIV ad almeno unodei test valutati, è stato realizzato unWestern Blot.

- Una selezione aleatoria di sieri negativia tutti i test valutati, è stata referenziatagrazie all’isolamento virale (81 campioni)o al Western Blot (100 campioni).I criteri evidenziati per la valutazionedelle performance del test sono stati lasensibilità, la specificità, il valore predittivopositivo (VPP) e il valore predittivo ne-gativo (VPN) (leggere a pag. 11).

Risultati Nella popolazione studiata, la prevalenzadell’infezione da FIV era del 10,3% equella dell’infezione da FeLV del 7,4%. Leperformance del test Speed® DuoFeLV/FIV sono elencate nella tabella (ve-dere).

DiscussioneI risultati ottenuti dimostrano che Speed®

Duo FeLV/FIV è un test le cui performancesono simili a quelle di un test di laboratorio(ELISA su microplacche), mentre lo studiocomparativo dimostra che Speed® DuoFeLV/FIV presenta la maggiore sensibilità ela maggior specificità per la diagnosi di FeLV. Inoltre, Speed® Duo FeLV/FIV:- è citato come il test di scelta per la dia-gnosi e l’individuazione dell’infezione daFeLV;- dimostra eccellenti risultati per la ricercadell’infezione del gatto da virus FIV;

- si interpreta facilmente: la facilità dilettura è stimata al 98,5% dei casi diFeLV e al 99,2% dei casi di FIV.

CommentiA partire dai risultati di questo studio, èstato possibile calcolare l’efficacia dia-gnostica (Diagnostic Efficency od OverallAccuracy) del test Speed® Duo FeLV/FIVcon i metodi di referenza. Questo criteriodefinisce la percentuale dei risultati positivie negativi concordanti con i metodi direferenza.

L’insieme dei risultati ottenuti da Speed®

Duo FeLV/FIV concorda al 98,8%* con irisultati ottenuti dall’isolamento viralee dal Western Blot: Speed® Duo FeLV/FIVpresenta dunque un’efficacia diagnosticaottimale.

* Efficacia diagnostica FeLV: 98,84%; efficacia diagnosticaFIV: 98,68%

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■ Attendibilità dei test rapidiSpeed® Duo FeLV/FIV raccomandato dagli esperti

Le performance di Speed® Duo FeLV/FIV sono state valutate comparandole con i metodidi referenza: il Western Blot per la FIV e l’isolamento virale per la FeLV.A

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Diagnostica

Performance del test Speed® Duo FeLV/FIV

Speed® DuoFeLV/FIV Test FeLV vs isolamento virale Test FIV vs Western Blot

Sensibilità 94,7% 96,3%Specificità 99,2% 98,9%

Valore predittivo positivo 90,0% 91,2%Valore predittivo negativo 99,6% 99,6%

Facilità di lettura 98,5% 99,2%

Efficacia Diagnostica =

(Veri Positivi FeLV + Veri Positivi FIV +Veri Negativi FeLV + Veri Negativi FIV)

Somma dei risultati

1) Hartmann et al. - Comparison of 6 in-house testsfor the rapid diagnosis of Feline Immunodeficiencyand Feline leukemia virus infections. Vet Record, 2001,149 (11); 317-3202) AAFP Guidelines, Current retroviral testingguidelines from AAFP; 2005 -http://www.aafponline.org/3) Hartmann et al. - Quality of different in-clinic testsystems for feline immonudeficiency virus and felineleukemia virus infection. J Feline Med Surg, 2007, 9(6) ; 439-4454) ABCD Guidelines on Feline Leukemia Virus, 2007– http://www.abcd-vets.org/guidelines5) Institute for algorithmic medicine, Houston, TX,USA: The medical algorithm project.-http://www.medal.org – Chapter 39: DecisionalAnalysis

Bibliografia

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■ Interazioni antigene - anticorpoI test sierologici per la diagnosi di malattie infettive

Le metodiche diagnostiche utilizzate per identificare la presenzadi un patogeno si dividono in metodi diagnostici diretti e indiretti.

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Diagnostica

Emanuele Minetti, DMV Specialista in sanitàpubblica veterinaria Direttore Sanitario -Amministratore delegato BiEsseA srl Milano

Ugo Bonfanti, DMV Diplomato ECVCP Consulente scientifico -Responsabile patologia clinica BiEsseA srl Milano

L a sierologia, nella diagnosi dellemalattie infettive, consiste nellamisurazione delle interazioni tra

antigene e anticorpo, per identificare - afini diagnostici - la presenza di un agentepatogeno o l’avvenuto contatto.Tali interazioni possono identificare unanticorpo specifico, fornendo pertantola prova che un animale è stato espostoa un agente patogeno (antigene), oppurepossono essere utilizzati anticorpi specifici,atti a identificare un antigene nel campioneche viene esaminato: tale prova è la di-mostrazione di un’infezione, ma non evi-dentemente di malattia.

Metodi diagnostici direttie indirettiLe metodiche diagnostiche utilizzate peridentificare la presenza di un patogenosi dividono in metodi diagnostici direttie indiretti.I test diretti permettono di identificaredirettamente il patogeno, o suoi fram-menti, mediante ad esempio ricerca delDNA, oppure di un antigene del patogenostesso. Alcuni esempi di test diretti sonorappresentati dalla PCR (Polymerase ChainReaction), dall’isolamento virale, ma ancheda esami batteriologici, micologici, pa-rassitologici, dalla citologia, e infine dalrilievo di antigeni mediante l’utilizzo ditecniche sierologiche. Ad esempio, testdiretti che utilizzano tecniche sierologichesono quelli atti all’identificazione dell’an-tigene della FeLV nel sangue, o di Giardianel materiale fecale.I testi indiretti permettono invece diidentificare una sorta di risposta da partedell’organismo nei confronti dell’agenteeziologico. Tale risposta consiste solita-mente nella produzione di anticorpidiretti contro gli antigeni del patogeno.

Gli anticorpi vengono ricercati nel siero,il quale reagisce con antigeni in sospen-sione (come ad esempio per la aggluti-nazione) o in fase solida (ad es. ELISA).Il legame tra antigene e anticorpo vienevisualizzato mediante “anti-anticorpi”legati a loro volta a sostanze che nepermettono il rilevamento quali ad esem-pio cromogeni (ELISA) fluorocromi (IFA)e particelle di lattice, visibili macroscopi-camente. I principali test indiretti sono rappresentatida ELISA (Enzyme linked immunosorbentassay), immunofluorescenza (IF), aggluti-nazione diretta, immunomigrazione rapida,e immunocromatografia.La matrice comunemente impiegata èrappresentata da siero, sebbene peralcuni test eseguibili anche a livello am-bulatoriale, sia prevista la possibilità diutilizzo anche di sangue intero con anti-coagulante.

ELISACon tale tecnica (test “a legame primario”)vengono ricercati anticorpi eventualmentepresenti nel siero dei pazienti, medianteantigeni coattati sulla parete dei pozzettidi una piastra. In questo modo, mediantel’utilizzo di anti-anticorpi coniugati conun enzima, messi a contatto con il sierodel paziente nel pozzetto, si evidenzial’eventuale presenza di anticorpi presentinel siero del paziente, mediante una mo-dificazione di colore proporzionale allaquantità di anticorpi. Utilizzando tale tecnica si otterranno ri-sultati semiquantitativi, ma oggettivi nelcaso di automatizzazione della metodica.Questa metodica consiste nel classico“ELISA a micropozzetti”, solitamente im-piegati nei laboratori di diagnostica, edeve essere distinta da test ELISA rapidi,

quali lo SNAP test, utilizzabili anche a li-vello ambulatoriale.

Immunofluorescenza (IF)Anche con questa tecnica vengono svelatieventuali anticorpi presenti nel siero deipazienti. In questo caso, però, in qualitàdi antigene vengono impiegate celluleinfettate o direttamente il patogeno, co-attato a un vetrino. In tal caso, pervalutare la positività, vengono usati anti-anticorpi, coniugati con fluoresceina, e lareazione viene letta con un microscopioa fluorescenza. Mediante questa tecnica è possibilefornire un “titolo” applicando diluizioniscalari di siero in cui sono presenti glianticorpi, valutando la presenza o menodi fluorescenza. In tal modo, il “titolo”anticorpale corrisponderà all’ultima di-luizione in cui si identifica fluorescenza.

Agglutinazione diretta (AD)Con questa tecnica si ricercano anticorpidiretti contro antigeni legati a micropar-ticelle (specialmente particelle di lattice).Se sono presenti anticorpi nel campionequesti si legheranno in maniera indisso-lubile alle microparticelle, a cui a lorovolta sono legati gli antigeni.La positività può evidenziarsi mediante: 1) cartine: in tal caso la miscela costituita daanticorpi, antigene e microparticelle vienedepositata su un supporto di colore nero. Incaso di presenza di anticorpi, la miscela, bian-castra, formerà dei piccoli aggregati sottoforma di puntini chiari su fondo scuro; 2) provette: in tal caso, la miscela si forma inpiccole provette o eventualmente nei pozzettidi piastre ELISA. In caso di positività, il materialerimarrà in sospensione e sarà uniformementebiancastro, mentre in caso di negatività il ma-teriale liquido diventerà trasparente e si

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formerà un conglomerato/pellet biancastrosul fondo della provetta/pozzetto.Anche mediante questa tecnica è possibilefornire un “titolo” anticorpale applicandodiluizioni scalari di siero in cui sono pre-senti gli anticorpi.

Immunomigrazione Rapida (IR),Immunocromatografia (IC) In questo caso viene fatto migrare ilsiero – o eventualmente il sangue intero- in cui sono potenzialmente presenti glianticorpi. Questi si legano a un antigene marcatocon sostante par ticolari (rivelatori). Ilcomplesso antigene – anticorpo “migra”fino a incontrare un anticorpo secondario,a cui si lega in un complesso antigene –anticorpo. In caso di positività comparirà una bandaben visibile ad occhio nudo.

Caratteristiche dei test diagnosticiLimitazione importante, che accomunaqualsiasi test diagnostico, è rappresentatadal fatto di poter incorrere in falsi positivie falsi negativi: nessun test può diagno-sticare in modo accurato e sicuro al100% la presenza o l’assenza di una ma-lattia.Occorre quindi accettare il fatto che lasensibilità e la specificità di un test uti-lizzato per diagnosticare una malattia in-fettiva non potranno mai raggiungere il100%, anche se idealmente dovrebberoraggiungere questa percentuale.Ricordiamo che: - la sensibilità diagnostica di un test è lasua capacità di identificare correttamentegli animali malati, ossia la probabilità cheun animale malato risulti positivo al testimpiegato, ossia ancora, la percentuale

di test eseguiti su animali malati che ri-sultano positivi;- la specificità diagnostica di un test è lacapacità di identificare correttamente glianimali sani, ossia la probabilità che unanimale sano risulti negativo al test im-piegato, ossia ancora, la percentuale ditest eseguiti su animali sani che risultanonegativi.Sensibilità e specificità sono caratteristicheproprie del test diagnostico, e sono definitedelle probabilità “pre-test”, risentendo inrealtà della reale prevalenza/incidenza dellamalattia nella popolazione testata.Per il veterinario è comunque importanteche sensibilità e specificità di un testsiano i Valori Predittivi Positivo e Negativodel test stesso.Il Valore Predittivo Positivo (PPV) - de-finito anche in modo più chiaro “Valorepredittivo di un test POSITIVO” - è la

Vantaggi e svantaggi dei test diagnostici sierologici

Test “rapidi”: immunomigrazione rapida, immunocromatografia

Vantaggi• Facile utilizzo, semplice esecuzione, estremamente diffusi anche a livello ambulatoriale• Possibilità di utilizzo di sangue intero, siero o plasma• Risposta rapida

Svantaggi • Meno specifici e meno sensibili di test di laboratorio; falsi positivi o negativi: necessario verificare con test più accurati a sensibilità e specificità maggiori(ELISA – IF). In particolare per alcune malattie la sensibilità è medio - bassa, aumentando il rischio di falsi negativi• Non forniscono titolo anticorpale• Campioni densi o concentrati: difficile migrazione lungo il supporto

Test “da laboratorio”: ELISA, IF, AD

Vantaggi• Possibilità di fornire un titolo anticorpale• IF: test molto sensibile• ELISA e AD: test sensibili, sebbene non come l’IF• ELISA: test specifico, non legato a soggettività operatore• ELISA: possibile automatizzazione lettura quindi maggiore oggettività• Importanti per valutare evoluzione della malattia/risposta alla terapia: concetto di “sieroconversione”

Svantaggi• Laboriosità• Necessità di utilizzo di siero• Necessità di acquisto di grossi confezionamenti• Possibile variabilità legata a metodi - strumenti: stesso campione inviato a laboratori differenti: possibilità di ottenere risultati differenti

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probabilità che un animale che risultapositivo al test sia effettivamente malato. Il Valore Predittivo Negativo (NPV) -definito anche in modo più chiaro “Valorepredittivo di un test NEGATIVO” - è laprobabilità che un animale che risultanegativo al test sia effettivamente sano.PPV e NPV sono legati sia a sensibilità especificità del test, ma specie alla preva-lenza della malattia nella popolazionedegli animali testati. Ossia, l’esito POSITIVO di un test dia-gnostico in una popolazione in cui l’inci-denza della malattia testata è bassa (pocoprevalente) anche in caso di test adelevata sensibilità e specificità, ha probabilitàpiù elevate di essere un falso positivo, ri-spetto ai casi in cui lo stesso identicotest venga eseguito in una popolazionecon un’elevata prevalenza/incidenza dellamalattia. Quindi, una volta eseguito il test, occorrericordare che il risultato risente dellaprevalenza della malattia ricercata nellapopolazione esaminata. A questo proposito, per ridurre al mas-simo le variabili legate ai test diagnostici,è assolutamente consigliabile eseguirequesti accertamenti solo su animali chepresentino segni clinici o esami di labo-ratorio riconducibili alla malattia che sivuole diagnosticare. Questa accortezza- ripetiamo - limita sensibilmente in par-ticolare il rischio di falsi positivi.

Conclusioni Tutti i risultati delle indagini sierologicheper le malattie infettive devono comunquesempre essere interpretati alla luce di:- cinetica anticorpale e relativa fase dilatenza: falsi negativi nelle fasi iniziali di in-fezione;- tipo di infezione: acuta, persistente, ri-corrente, con conseguente differente ci-netica anticorpale;- malattie immunodepressive – malattie daimmunocomplessi: falsi negativi per impos-sibilità a produrre anticorpi rilevabili.Ricordando inoltre che:- la negatività sierologica non semprepermette di escludere una malattia.

Quindi non tutti gli animali NEGATIVIsono in realtà SANI;- la positività sierologica permette di in-dicare l’esposizione a un antigene, manon permette di definire con sicurezzache il soggetto sia infetto, o malato.Sottolineando infine che:- un antigene può venire eliminato dal pa-ziente senza causare malattia, determinandocomunque positività al titolo anticorpale;- l’anticorpo identificato può non esserepatognomonico di una specifica infezione(ad es. anticorpi anti Coronavirusfelino/FIP);- anticorpi possono essere presenti comeconseguenza di trasferimento passivo(allattamento).Per concludere, i test rapidi possonocomunque essere considerati un primo

importante step diagnostico rappresen-tando un buon compromesso tra sem-plicità di utilizzo, rapidità di risposta daun lato, e discreta/buona sensibilità especificità dall’altro.In caso di necessità di ulterioriaccertamenti/approfondimenti, come incaso di risposte dubbie, o che non si alli-neano con i rilievi clinici, risultano eviden-temente imprescindibili test laboratoristicipiù accurati, dotati di maggiore efficienzadiagnostica.Ricordiamo infine come sia sempre neces-sario - prima di acquistare un test - valutareaccuratamente quale test rapido possiedele migliori performance documentandosicon lavori scientifici e schede tecniche.Non tutti i test rapidi posseggono infatti lastessa accuratezza diagnostica.

I testi indiretti permettono di identificare una risposta da parte dell’organismo nei confronti dell’agente patogeno,che consiste solitamente nella produzione di anticorpi diretti contro gli antigeni del patogeno. I principali test indirettisono rappresentati da ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), immunofluorescenza (IF), agglutinazione diretta,immunomigrazione rapida, e immunocromatografia.

L’arrivo sul mercato di CaniLeish®,primo vaccino contro la leishma-niosi canina con Aic europea, ri-

chiede l’esecuzione di uno screeningprevaccinale sistematico, in conformità alleraccomandazioni d’uso del prodotto.

La sierologia prevaccinaleTra i metodi diagnostici, la sierologia è ri-conosciuta come la più adatta per loscreening prevaccinale, soprattutto inzona di endemia dove il numero di animaliportatori asintomatici può essere notevole.L’immunofluorescenza indiretta (IFI) è ilmetodo di riferimento, che consente diquantificare gli anticorpi contro Leishmaniainfantum. Tuttavia, questa tecnica è realizzabilesolo presso un laboratorio e richiede uncerto periodo di tempo tra la consegnadel campione e l’esito, il che la rende pocoadatta a uno screening di routine.L’uso di test rapidi e affidabili, realizzabili inambulatorio in pochi minuti, permette dideterminare lo status sierologico dell’animaledurante la visita per la vaccinazione. Il testSpeed® Leish K è caratterizzato dalla ca-pacità di evidenziare gli anticorpi anti-ki-nesine di Leishmania infantum, il che gli

conferisce eccellenti caratteristiche diagno-stiche. Questo test, infatti, identifica glianimali sieropositivi sin dai primi stadidell’infestazione parassitaria.Un risultato negativo del test Speed® LeishK, dunque, autorizza il veterinario a proce-dere con la somministrazione del vaccinoCaniLeish®; un risultato positivo al test, in-vece, dovrà essere confermato e quantificatomediante IFI (vedere schema).

Procedura daattuare in caso discreeningprevaccinale conSpeed® Leish KpositivoIn presenza di un test rapidopositivo, si raccomanda dieseguire sistematicamente undosaggio degli anticorpi anti-Leishmania. Con l’IFI è quindipossibile precisare lo statussierologico del cane nei con-fronti della leishmaniosi, inbase al titolo anticorpale, edefinire quindi l’iter da se-guire:- se il titolo IFI è fortemente

positivo, superiore a 4 volte la soglia di po-sitività del laboratorio: vi è la forte proba-bilità che il cane abbia in corso una lei-shmaniosi attiva. In questo caso la vacci-nazione non è raccomandata, e vannoprevisti altri esami per effettuare una va-lutazione clinica completa dell’animale;- se il titolo IFI è debolmente positivo, tra1 e 4 volte la soglia di positività del labo-ratorio: in questo caso, l’evoluzione del-

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■ Leishmaniosi caninaSpeed® Leish K: screening pre-vaccinale e iter da adottare

“Inserire lo screening pre-vaccinale della leishmaniosi in un iterdiagnostico è indispensabile per un uso ragionato del vaccino”.A

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Nicoletta Rizzi, DVMTechnical ServiceVirbac italia

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Un risultato negativo al test Speed Leish K® autorizza il veterinario a procedere con la vaccinazione con CaniLeish®; un risultato positivo invece deve essere confermato e quantificatomediante IFI (vedere schema).

Il test Speed Leish K® permette di determinare lo status sierologico delcane durante la visita per la vaccinazione: un risultato negativo del testautorizza il veterinario a procedere con la somministrazione del vaccinoCaniLeish®; un risultato positivo, invece, dovrà essere confermato equantificato mediante IFI.

Fase 1: Deporre una goccia di siero,plasma o sangue intero conanticoagulante mediante la pipetta.

Fase 2: deporre 5 gocce di reagenteSpeed® Leish K e aspettare 20 minuti. Risultato negativo Risultato positivo

l’infestazione non è ancora definita. Ènecessario valutare la cinetica degli anti-corpi, ripetendo l’IFI dopo tre mesi:• se l’IFI torna negativa, significa che ilcane questa volta ha superato l’infezioneed è possibile prevedere una vaccinazio-ne;

• se il titolo è salito oltre 4 volte lasoglia di positività del laboratorio, c’èuna forte probabilità che si stia svilup-pando una leishmaniosi attiva;• se il titolo permane debolmente positivo,è raccomandato un follow up sierologicoe clinico regolare:

• in rari casi può essere il laboratoriostesso a “negativizzare” il titolo IFI (titoloinferiore al valore soglia di riferimentodel laboratorio). In questi casi è possibileprocedere con la vaccinazione, tenendoconto dell’anamnesi, dell’esame clinico edel contesto epidemiologico.

Status sierologicodell’animale vaccinatoGli studi di validazione del vaccino Cani-Leish® hanno mostrato, dopo la vaccina-zione, una produzione transitoria di an-ticorpi anti Leishmania infantum diretticontro le proteine del vaccino. Dal mo-mento che l’IFI rileva la presenza dell’in-sieme degli anticorpi anti Leishmania, glianticorpi post vaccinali saranno eviden-ziabili tramite IFI e lo resteranno per 4mesi circa.In presenza di segni clinici indicativi dileishmaniosi in un animale vaccinato, ènecessaria l’effettuazione di un esamediagnostico per confermare o escludereuna leishmaniosi attiva.Le kinesine di Leishmania sono proteinenon presenti nel vaccino CaniLeish®,quindi Speed® Leish K, che rileva speci-ficatamente gli anticorpi anti kinesine,resta negativo dopo la vaccinazione.Quindi, se i segni clinici sono dovuti aun’infezione in corso, Speed® Leish Ksarà positivo; se invece Speed® Leish Kresta negativo, bisognerà prendere inconsiderazione altre ipotesi diagnosti-che.

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Speed® Leish K: iter diagnostico dello screening prevaccinale

• CaniLeish : EPAR - Public assessment report -http://www.ema.europa.eu• Miró G, Cardoso L, Pennisi MG. and al. -Canine leishmaniosis - new concepts and insightson an expanding zoonosis : part two. TrendsParasitol., 2008 ; 24 (8) : 371 - 7.• Chêne J, Chabanne ., Morlet J. and BourdoiseauG. - Comparison of a rapidimmunochromatographic test (Speed Leish KTM,BVT) with immunofluorescence assay for thedetection of anti-Leishmania infantum antibodiesin dogs. In Proceedings of the 2nd InternationalCongress on Canine Leishmaniasis. Pisa, Italy, 17- 18 April 2010.

Bibliografia

Graziano Balestra Biotecnologo farmaceuticoLaboratorio d’AnalisiVeterinarie San Marco,Padova

Tommaso Furlanello, DMVPhD, Diplomato ECVCPLaboratorio d’AnalisiVeterinarie San Marco,[email protected]

Nell’ultimo decennio la spettrometriadi massa ha conosciuto uno svi-luppo tecnologico eccezionale e il

suo uso si è esteso, dai centri di ricerca, ai la-boratori clinici. Il notevole interesse è legatoall’elevata specificità e sensibilità analitica checollocano questa metodica in una posizionedi vantaggio rispetto ad altre tecniche dia-gnostiche. A conferma di ciò bisogna consi-derare che tutte le attuali metodicheimmunologiche, di uso routinario, vengonovalidate con metodi cromatografici/spettro-metrici di massa. Un vantaggio importante diqueste tecniche è rappresentato dalla capa-cità di determinare numerosi biomarker, pre-senti in miscele complesse come il siero, inuna sola analisi (ad esempio, ormoni steroideinella loro totalità). Tale tecnica consente lostudio di malattie metaboliche, endocrinopa-tie, monitoraggi terapeutici e indagini tossi-cologiche.Il concetto fondante della spettrometria di

massa è la ricerca diretta di molecole, inbase al rapporto di massa/carica (m/z). L’eli-minazione dell’uso di anticorpi per la deter-minazione di queste sostanze ha consentitoun forte aumento della specificità e l’elimi-nazione della maggior parte degli interferenti(emolisi, lipemia, ittero, ormoni similari/me-taboliti) e del cosiddetto effetto matrice, ge-nerato dal fluido indagato. Un esempioclassico può essere rappresentato dalla mi-surazione del cortisolo mediante chemilu-minescenza (immunodosaggio), ove, come èstato dimostrato da numerosi studi interna-zionali, esistono forti limitazioni relative alvalore di questa metodica. Infatti, uno deiprincipali limiti è la reattività dell’anticorponei confronti di molecole con strutturasimilare al cortisolo stesso (ad es. 11-deossi-cortisolo).La maggior parte delle metodiche immuno-logiche, inoltre, è finalizzata alla determinazionedelle molecole non libere, ovvero legate a

proteine di trasporto. Tali molecole rappre-sentano una semplice stima dell’attività bio-logica della molecola stessa, in quanto l’effettometabolico è correlato alla forma attiva o li-bera. La spettrometria di massa, in questosenso, è più adatta a misurare le formelibere, metabolicamente attive, indipenden-temente dai veicoli proteici.

Principi della spettrometria di massaLa spettrometria di massa, oggi, viene utilizzatanon solo per determinazioni quantitative equalitative di composti noti, ma anche peridentificare prodotti incogniti e per chiarireanche le proprietà strutturali e chimichedella molecola. Questa tecnica inoltre è am-piamente utilizzata anche perché richiedeminime quantità di campione e soprattuttoriesce a determinare in miscele complesseconcentrazioni molto basse di analiti (pg/ml).La caratteristica principale, che rende unospettrometro così selettivo, è quella di de-terminare la massa di una molecola in manieraprecisa dopo che questa è stata ionizzata(conferimento di carica elettrica). Tre sono icomponenti chiave di tale strumento: unasorgente che converte le molecole introdottein ioni in fase gassosa, l’analizzatore chesepara gli ioni in base al rapporto m/z (rap-porto massa/carica) e un rilevatore che am-plifica il segnale, generando uno spettro cherappresenta l’immagine della molecola (vederefigura 1).Brevemente si elencano i passaggi per eseguireuna determinazione quantitativa di una mo-lecola in spettrometria di massa partendoda una matrice complessa come il siero:preparazione del campione con ultracentri-fugazione, precipitazione, diluizione e filtrazione,separazione con tecniche cromatograficheultraperformanti, trasferimento del compostoin uno spettrometro di massa per essere io-

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■ Innovazione nella diagnosticaIl futuro a portata di mano: la spettrometria di massa

“La spettrometria di massa viene utilizzata ancheper identificare prodotti incogniti”.A

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Applicazioni della spettrometriadi massa con cromatografia liquida (esempi)Ormoni- cortisolo libero (sierico e urinario)- aldosterone (sierico e urinario)- catecolamine sieriche e urinarie (adrenalina, noradrenalina, dopamine e metanefrine)- Free T4, Free T3, Reverse T3- insulina- progesterone, testosterone

Monitoraggio FarmaceuticoCiclosporina, digossina, acido micofenolico (micofenolato), levetiracetam, zonisamide

Pannello TossiciOrganofosforici (carbaril, chlorpyrifos, coumafos, diazinon et al.)Rodenticidi (brodifacaum, bromadiolone, cumaclor, cumatetril et al.)Piretroidi (allethrin, cyfluthrin, cypermethrin, deltamethrin et al.)Lattoni macrociclici (ivermectina, abamectina, doramectina et al.)Metaldeide ecc.

nizzato, separazione degli ioni in base al rap-porto m/z, infine misurazione degli ioni e ge-nerazione di uno spettro.

Applicazioni di spettrometria di massa nel laboratorio clinicoLa gamma di analiti che un laboratorio dotatodi questa tecnologia può offrire, dopo avereseguito gli opportuni processi di ideazionee validazione dei test, è immenso. Grazie aqueste strumentazioni si possono eseguireindagini singole (ad es. cortisolo urinario),oppure pannelli diagnostici (cortisolo, aldo-sterone e DHEA), in modo da esplorare inmodo completo la corteccia surrenalica. Unaltro esempio è la valutazione della funzionegonadica tramite la misurazione contempo-ranea di estradiolo, progesterone, estriolo,estrone e testosterone.Una testimonianza dell’innovatività della me-todica, che non richiede tecniche immuno-logiche, è data dalla misurazione dell’insulinanel gatto, che non era realizzabile con meto-diche che comprendessero l’uso di anticorpianti-insulina per la peculiare presenza nellaspecie felina di anticorpi naturali anti-insulina,che si associano a gravi interferenze diagno-stiche con le metodiche classiche.Infine, di grande interesse per il veterinariopuò essere la possibilità di risolvere casi

complessi di sospette intossicazioni neglianimali domestici eseguendo una ricerca disostanze tossiche anche a concentrazionimolto basse partendo da una piccola quantitàdi campione di sangue intero in K3EDTA, odi urine. Inoltre tutto ciò permette di effettuaresuccessivi monitoraggi terapeutici per moni-torare l’eventuale eliminazione della sostanzatossica presente nell’organismo e pertantodecidere se continuare o sospendere il trat-tamento farmacologico.

ConclusioniLe metodiche di cromatografia abbinate aspettrometria di massa tandem rappresentanouna vera e propria rivoluzione per il laboratorioclinico, sia in Medicina umana che veterinaria.

Queste tecnologie, se impiegate dopo rigoroseindagini e messe appunto dei test, con op-portune validazioni (Recovery, LOD, LOQ,ripetibilità, esattezza e robustezza del metodo)permettono l’esecuzione di un numero sem-pre crescente di indagini, sia singole che as-sociate a formare pannelli diagnostici inmodo estremamente sensibile, selettivo epreciso. In ambito endocrinologico, la possibilitàdi evitare reazioni immunologiche per otteneredei dosaggi ormonali ha reso estremamentepopolare questa tecnologia in Medicinaumana e rappresenta ormai il gold-standard.Nel prossimo futuro questa tecnologia cioffrirà ancora nuovi ed entusiasmanti obiettivie traguardi, a partire dal mondo della meta-bolomica e proteomica.

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• Denoroy L et al. - Ultra high performance liquid chromatography as a tool for the discovery and the analysis ofbiomarkers of diseases: a review. J. Chromatogr. B 2013;927: 37–53• Grebe SKG & Singh RJ, - LC-MS/MS in the Clinical Laboratory – Where to From Here? - Clin Biochem Rev2011; 32: 5-31• Kushnir MM et al. - Liquid chromatography tandem mass spectrometry for analysis of steroids in clinicallaboratories - Clinical Biochemistry 2011;44: 77–88• Leung KSY & Fong BMW. - LC–MS/MS in the routine clinical laboratory: has its time come? Anal. Bioanal.Chem. 2014; 406: 2289-301 • Soldin OP & Soldin SJ. - Thyroid hormone testing by tandem mass spectrometry. Clinical Biochemistry 2011;44: 89–94

Per approfondire

1 - Cromatogramma di una molecola di L-tiroxina (linea rossa e blu) abbinato a uno spettro di massa tandem(finestra nel quadrante a destra).

2a-2b - Due diversi spettrometri di massa tandem (MS-MS), abbinati a un sistema cromatograficoultraperformante ad alta capacità di carico.

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n° 3 speciale diagnostica - giugno 2014 - virbac italia · virbacnews n° 3 - speciale diagnostica...

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