〔連載講座〕

還 元 糖 の 定 量 法

II

福 井 作 蔵

東京大学応用微生物研究所

II.鉄 試 薬(フ ェ リサ イ ア ナ イ ド,ferricyanide)

に よ る還 元 糖 の 定 量

アル カ リ性 下 でferricyanide(Fe+++)が 糖 の カ ー ボ

ニ ル基 に よ り還 元 されferrocyanide(Fe++)に な る反 応

を基 本 反 応 と した も の で,滴 定 法(Hanes法)お よび

比色 法(Park-Johnson法)が あ る.歴 史 的 に はHage-

dorn-Jensen*(1923～24)が 血糖 定 量 法 と してferri-

cyanideを 用 い る原 法 を 示 し,Hanes**(1929)が 現 在

の 滴 定 法 に 改 良 した.一 方,比 色 法 へ の誘 導 はFolinお

よびMalmros***(1929)やParkお よびJohnson****

(1949)に よ り,ferrocyanideをPrussian blueと し

て比 色 す る こ とに よっ て果 た され た.こ こに 適 用 され て

い る基 本 反 応 は,存 在 す る糖 量 と比 例 性 を示 す け れ ど も

定 量 性 は な い の で,銅 試 薬 を 用 い る場 合 と 同 じ く,定 量

値 は検 量 曲線 か ら算 定 しな くて は な らな い.ま た,こ の

基 本 反 応 は,遊 離 カ ー ボ ニル 基 に対 す る も の で,結 合 型

の糖 ・カ ー ボ ニ ルの 定 量 に は,あ らか じめ 水 解 す る 要 が

あ る.

滴 定 法(Hanes法)

アルカ リ性煮 沸条件下 で行 な う本法の基本反応の進行

は,上記 した ように存在糖量 と比例性 を示すので,反 応後

残存す るferricyanideを 定 量すれば,存 在 した糖量 と

の相関曲線す なわ ち 検量 曲線が 得 られ る.Hanes法 に

おける定量操作中の化学反応は次の ように要約 されるの

で,こ れ らに若干の解説 を加えてみ よう.

〔反 応〕

(1) K3Fe(CN)6+還 元糖Na2CO3

K4Fe(CN)6

(2) 2K3Fe(CN)6+2KIacetic acid

2K4Fe(CN)6+I2

(3) 2K4Fe(CN)6+3ZnSO4K2Zn3[Fe(CN)6]2↓+3K2SO4

(4) I2+2Na2S2O3 Na2S4O6+2NaI

〔試 薬〕

a) アル カリ性ferricyanide液 …ferricyanide(K3Fe

(CN)6)8.25g,無 水炭酸 ソーダ10.6gを1lの 蒸

留水に とかす.着 色瓶保存.

b) ヨウ度 カ リ硫酸亜鉛液 … ヨウ度 カリ12.5g,硫 酸亜

鉛25g,食 塩125gを 蒸留水に とかし500mlと す

る.貯 蔵 中に次第にI2を 遊離す るか ら2枚 の濾 紙を

通 してか ら用い る.

c) 酢酸液 …氷酢酸5mlを 蒸留水で100mlに 希釈す

る.

d) N/100チ オ硫酸 ソーダ液 … 結晶Na2S2O3・5H2O

2.48gを1lと す る.

e) 1%可 溶 性デンプン指示薬.

径の大 きい試験 管(た とえば30×200mm)に 試薬a

5mlと 試料5mlと をと り,キ ャ ップを して液層約10

cmの 沸騰水浴中に15分 保 って後流水 で冷却,次 いで試

薬bお よびcを それぞれ5mlと3mlず つ速やかに加

え,直 ちにN/100チ オ硫酸 ソーダで滴定する.試 薬bお

よびcの 添加は反応(2)を右へ完全かつ速 やかに進行 させ

るためで,ferrocyanideはK2Zn3[Fe(CN)6]2の 沈殿 と

して反 応系外に のぞかれ る.反 応(2)で生 じるI2は 残存

ferricyanide量 に相 当す るか ら,チ オ硫酸 ソー ダの滴定

量の盲検か らの差 が 消費ferricyanide量 に相当 し,試

料中の糖 量に対応す る ものである.

次に本定量法 の長短所(特 徴 とい うべ きか)に ついて

のべ よう.(1)生 成ferrocyanideを 定量す るのに 残

存ferricyanideを 定量 し,差 し引 き しな くてはな らな

い.そ の うえに定量す るまでに4つ の反応 を経なければ

ならない点は,原 則的に面白 くない.し か しHanesの

実験結果は,き わめて再 現性 の高いことを示 してい るの

で,経 験的に納得せざるをえないであろ う.(2)糖 に よ

って,た とえば単糖類 と2糖 類に よって,そ れ ぞれ のカ

ーボニル基 は アルカ リ性ferricyanideに 対 し異な った

responseを 示す ので,定 量 しよ うとす る糖につい てそ

れぞれ検量 曲線 を画か な くてはな らない.0.0129Nfer-

ricyanide 1mlの 消費はグル コース0.42mgに マル ト

ース0.52mgに 相当す るとい う,Hanesの 実験結 果は

このことを明示 している.(3)本 法の基本反 応は反 応

液中の溶存酸 素で影響 を うけに くい ことで,よ い意味の

*Hagedorn-Jensen: Biochem . Z., 135, 46 (1923).

137, 92 (1923), 140, 538 (1924).**C . S. Hanes: Biochem. J. (London), 23, 99 (1929).***O . Folin, H. Malmros: J. Biol. Chem., 83, 115

(1929).****J . T. Park, M. J. Johnson: J. Biol. Chem.,181,

149 (1949).

36 (484) 化 学 と 生 物

特徴 である.銅 試薬 を用い る場合は,反 応液中に酸素を

飽 和 させたときと,ま った くのぞいた ときとで得 られる

還 元値 に約25%の 差が生 じるといわれ,こ れは生成 し

たCu2Oが 溶存酸 素で2CuOに 再酸化 され るためである.

したがって,本 法において径の大 きい試験管を使用する

のは,単 に滴定 を便利にす るためであ り,直 径の大 きさ

の統一 は要 しない.ま た加熱時間(鉄 試薬 との)は 一 応

15分 を基準 とす るが,多 少のずれが あ って も 差 しつか

えないのは,基 本反応の酸素に対す る不感性が もとにな

ってい るのか もしれない.(4)測 定範 囲が200～4,000γ

(グル コース)で,割 合に広い.

比 色 法(Park-Johnson法)

基 本反 応(ferricyanide+還 元 糖 →ferrocyanide)

で生 じたferrocyanideを,ferric-ferrocyanide (Fe4

[Fe(CN)6]3, Prussian blue, Berlin blue)に 導 い て 比

色 す る の がそ の骨 子 で,本 法 に 含 まれ る化 学反 応 は 次 の

と お り.

〔反 応〕

(1) K3Fe(CN)6+還 元糖Na2CO3

CN-K4Fe(CN)6

(2) 3K4Fe(CN)6+4Fe・NH4(SO4)2

Fe4[Fe(CN)6]3+6K2SO4+2(NH4)2SO4

〔試 薬〕

a) ferricyanide液 …ferricyanide 0.59を と り 蒸 留

水 で1lと し,着 色 瓶 に 保 存 す る.

b) carbonate-cyanide液 … 無水 炭 酸 ソ ー ダ5.3gと

KCN 0.659を 蒸 留 水 で1lと す る.

c) alum(鉄 明 バ ン)液 …alum (ferric-ammonium

sulfate 1.5gとSDS(Na-mono-laurylsulfate; Na-

dodecylsulfate)1gを0.05N硫 酸1lに とか す.

普 通 の太 さの 試 験 管(径18mm)に 試 料+水 を3ml

と り,こ れ に 試 薬aお よびbを1mlず つ 加 え て混 じ,

15分 間 沸 騰 水 中 に 保 った 後 流 水 で 冷 し,5mlの 試 薬c

を加 え室 温 に15分 放 置 して 発 色 を 完 全 に し,生 じた 青

色 を比 色 す る(690mμ).本 法 で は 試 薬aお よびbに よ

っ て ア ル カ リ性ferricyanideを 反 応 液 中 で 作 る こ とに

な るが,こ れ にcyanideの 含 ませ て あ るの は 試 薬cの

添 加 で生 ず るferric-ferrocyanideのcolor changeを

防 止 す る た め で あ る.ま た 試 薬c(ferric-ammonium

sulfate液)に 含 ませ て あ るSDSはferric-ferrocya-

nideの 析 出 を阻 止す る のに 役 だつ.

本 法 の 特 徴 は 次 の とお りで あ る.(1)Hanes法 と は異

な り,糖 に よ り還 元 的 に 生 成 したferrocyanide量 を 測

定 す る の で原 理 的 に す ぐれ て い る.し か し,反 応(2)の 定

量 性 に つ い ての 詳 細 な検 討 が な され て い な い の で,多 少

の不 安 が あ る.(2)Hanes法 の 場 合に も 記 した よ うに,

糖 に よ りア ル カ リ性ferricyanideに 対 す る 反 応 性 に 強

弱が あ る.た と えば,グ ル コ ース とキ シロ ー ス で は,グ

ル コ ー スの ほ うが 反 応 性 が 強 く検 量 曲線 の傾 斜 が 大 き い.

(3)測 定 範 囲 は1～9γ/tubeで,検 量 曲線 か ら 定 量 値

を 算 出す る.(4)除 蛋 白剤 と してZn塩 を必 要 と しない

もの を用 い るべ きで,Znの 存 在 はferrocyanideと 不

溶 性 のK2Zn3[Fe(CN)6]2を 生 ず る(Hanes法 参 照 の こ

と)の で,ferrocyanideの 定 量 に は 都 合 が 悪 い.し た

が って,本 法 で は タ ング ス テ ン酸 法 で除 蛋 白す る(5).試

薬 の調 製 が 安 易か つ 安 価 で あ る.

III.ニ トロ試薬に よる還元糖の定量*

3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS)ま た は3,4-dinitro-

benzoic acid(DNBA)が,ア ル カ リ性 に お い て 煮 沸 条

件 下 糖 類 の 還 元 基 と反 応 して 発す る色 を比 色 す る方 法 で,

反 応 に 定 量 性 は な い が 比例 性 は あ る.ま た 糖 に 対 す る選

択 性 は な く,広 く還 元 糖 と反 応 す るの で,一 見 興 味 を も

ちに くい 定 量 法 で あ る.

3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS)法

定量の基本反応は下記の とお りで,還 元糖に よるニ ト

ロ基の ア ミノ基への還元反応を利用す る比色定量法であ

る.

す な わ ち,生 成 した3-amino-5-nitrosalicylic acid

の500mμ に お け る吸 光 度 か ら検 量 曲線 を画 き,こ れ よ

り定 量 値 を算 定 す る.

〔試 薬〕

3,5-Dinitrosalicylic acid(DNS)液:4.5%NaOH溶 液300

mlに,DNSの1%溶 液880mlお よび ロッセル塩255gを

加え る.別 に10%NaOH溶 液22mlに 結晶 フェノール10gを

加え,水 を追加 して溶解100mlと す る.こ の アル カ リ性フェ ノール液69mlにNaHCO3 6.9gを 加え てとかし,上 記DNS

液を注いで ロッセル塩が 充分 に溶解す るまでかきまぜ る.2日 放

置後,濾 過し着 色瓶に保存す る.

25mlに 標 線 の あ る 試験 管 に 試 料1.0ml(グ ル コー

ス0.2～2,0mg)を と り,DNS液3.0mlを 加 え て混 和

し,沸 騰 水 浴 中に5分 間保 った 後,水 冷 して水 で25ml

*3,5-dinitrosalicylic acid法

J. B. Sumner: J. Biol. Chem., 41, 5 (1921); 65, 393 (1925). F. Hostettler, E. Borel, H. Denel: Helv. Chim. Acta, 34,

2132 (1951). E. Borel, F. Hostettler, H. Denel: ibid., 35, 115 (1952).

3,4-dinitrobenzoic acid法

E. Borel, H. Denel: Helv. Chim. Acta, 36, 801 (1953).

竹 本,醍 醐,高 井:薬 誌,75,1024(1955).

Vol. 3, No. 9 (485) 37

に 希 釈 す る.盲 検 試 料 をreferenceと して500mμ に

て比 色 す る.25mlに 希 釈 す る か わ りに10mlに 希 釈

す れ ば100～500γ の グ ル コ ー スが 定 量 され る.

本 法 の 特徴 は次 の とお り.還 元 糖 に よ りDNSか ら還

元 生 成 され る3-amino-5-nitrosalicylic acidをOD500

か ら直 接 比 色 定 量 す るの で,原 理 的 に は す ぐれ て い る.

しか し,DNS試 薬 そ の もの の 吸 収 スペ ク トル が 問題 で,

極 大 は370mμ に あ る け れ ども500mμ に お け る 吸 光

度 も大 き い の で好 ま しくな い.ま たDNSの 還 元 は存 在

す る遊 離 還 元 基 数 と比 例 性 を 示 す が,ペ ン トー ス,ヘ キ

ソー ス,2糖 類 は そ れ ぞ れ グ ル ー プ と して 異 な っ た吸 光

度 を示 す.た とえば,呈 色 度(3-amino-5-nitrosalicylic

acid量)をOD500per μ mole sugarで 示 す と,ペ ン ト

ー ス(キ シロー ス,ア ラ ビ ノー ス)は0.42;ヘ キ ソー ス

(グ ル コー ス,ガ ラ ク トー ス,マ ンノ ー ス)は0.46;

2糖 類(マ ル トー ス,ラ ク トー ス)は0.65と な る.

以上にのべてきた ような観点か らは,本 法に特徴あ る

利点をみいだ しえないが,ミ ロシナーゼ 活性の測定,す

なわち配糖体 と混ず るグルコースの定量に有効なのであ

る.つ ま り,基 質配糖体(シ ニグ リン)は 通常の糖定 量

法 に対 してresponseを 示 し還元値 を与 えるが,本 法 に

対 してはresponseを 示 さない.

3,4-Dinitrobenzoic acid (DNBA)法

E.Borelら(1953)の 原 法 で は,3,4-dinitrobenzoic

acid(DNBA)と 還 元 糖 と を アル カ リ性 下(Na2CO3)で

加 熱 反 応 させ,生 ず る3-nitro-4-hydroxylarnino ben-

zoic acidの 呈 す る紫 色(548mμ)を 測 定 して 検 量 曲 線

を 画 き,そ れ か ら糖 量 を求 め る.基 本 反 応 は 次 の とお り

で あ る.

DNBAか らの還 元 糖 に よ る 還 元 生 成 体 はnitroso-,

hydroxylamino-,お よびamino-誘 導 体 の3種 で あ る

が,本 法 は この 中 のhydroxylamino体 の 示 すOD548を

測 定 して糖 定 量 法 と した もの で あ るか ら,定 量 操 作 中 の

加 熱 条 件 に厳 密 な制 限 を加 え ね ば な らぬ こ と と,色 調 の

不 安 定 な こ とが 本 法 の 欠 点 で あ る.そ こで筆 者 は,む し

ろ3-nitro-4-aminobenzoic acidの 示 す450mμ の 吸

光 度 か ら検 量 曲線 を 求 め た ほ うが,す ぐれ た 方 法 に な る

の ではないか と考える.一 方,竹 本 ら(1955)は,Borel

の原法を改良 して比較 的再現性 の高 い方法 を案出 してい

る.す なわち,Borelの 原法で基本反応を進行 させ て後,

塩酸 酸性 と して反応 を止 め,黄 色 を呈す る反応液中の物

質(395mμ)を,イ ソア ミルアルコールに転溶 してOD395

か ら検量 曲線 を求めてい る.

〔試 薬〕

DNBA液:3,5-dinitrobenzoic acid (DNBA)2gと 無水

Na2CO3 31.8gを 水に とか し1lと す る.

試 料1mlとDNBA液1mlを 径15mmの 共 栓 付 試

験 管 に と り沸 騰 水 浴 中 に10分 保 って 後 水 冷,conc.HCl

0.2ml,次 い で イ ソア ミル ア ル コー ル6mlを 加 え て よ

く混 和 し,イ ソア ミル アル コー ル 層に 移 る呈 色 度 を測 定

す る.す な わ ち,イ ソア ミル ア ル コー ル層 は駒 込 ピペ ッ

トで 別 の 試 験 管 に 移 し,芒 硝0.05gを 加 え て脱 水,濾

過 後,比 色 す る(395mμ).

本法は還 元糖一般 の定量法 であるが,ア スコル ビン酸

に きわめて敏感 である.測 定範 囲は,グ ルコースとして

100～600γ.本 法の特徴は,3,5-dinitrosalicylic acid法

と同様にみ とめがたいが,ニ トロ基の還元を基 本反応と

す ることは本法におけ る特殊性をみいだす手がか りを与

えるであろ う.い ずれに しても本法 をtraceす る研 究

者が少 ないので,あ えて この ような方法 もあることを記

した次第で ある.

IV.ヨ ウ度 試 薬(次 亜 ヨ ウ素 酸)に よ る還 元 糖

の 定量(Willstatter-Schudel法)

本法はグル コースが一定 条件 の下,ア ルカ リ性 ヨウ度

液(NaIO,次 亜 ヨウ素酸)に よって 定量的 に 酸化 され

てグル コン酸になる反応 をアル ドース定量法 と して まと

めた もので,一 応 ケ トースには反応 しない とされている

(実際は多少反応す る).数 多い還元糖の定量法中,本 法

だけがそ の基本反応に定量性のみ とめ られる ことは特記

すべ きであるが,Willstatter-Schudelの 原法では あて

は まらない場合 もあ る.し か し,改 良法に おいては,ほ

とん どすべての アル ドースが化学量論 的にアル ドン酸に

酸化 される.定 量法中の化学 反応は下記 のとお りで,還

元糖の酸化に消費 されたI2量 か ら反応(1)に よ り糖量 を

算出す る.

〔反 応〕

(1) CH2OH(CHOH)nCHO+I2+3NaOH

→CH2OH(CHOH)nCOONa+2NaI+2H2O

(2) I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

〔試 薬〕

a) .N/10ヨ ウ度液 … ヨウ度12.69gとKI40gを 少量

の蒸留水に とか した後1lに す る.

38 (486) 化 学 と生 粉

b) N/10NaOH液.

c) N/10H2SO4液.

d) N/10Na2S2O3液.

改良法における一例a) N/100ヨ ウ度 液.

b) 0.15MNa2CO3液.

c) N/5H2SO4液.

d) N/200Na2S2O3液 …N/10ま た はN/20Na2S2O3液

を そ の都 度 うす め て作 る.

一定量の試 料にN/10ヨ ウ度液10mlを 加え,次 いで

N/10 NaOH 15ml加 えて30分 間室温に 放置 し,反 応

(1)を進行 させる.こ の反応は アル ドースに特異的である

が糖の種類に より反応性 が異 なる.た とえば,マ ル トー

ス(2糖 類),グ ルコース,キ シロ ースに対 しては上記原法

の条件 で定量的 なアル ドン酸への酸化がみ とめ られるが,

マ ンノースに対 しては反応の定量性は とらえ られない.

その原因は反応(1)におけ るアルカ リ度の強す ぎる ことに

ある らしく,NaOHを うす くす るか,ま たは 緩衝能 の

強い炭酸塩 でアルカ リ性 を保つかすれば,マ ンノースを

は じめ,グ ルコース,ガ ラク トース,キ シロース,ア ラ

ビノースなどの定量的酸化が把 握され うる.反 応(1)によ

って消費 された ヨウ度量は,残 存 ヨウ度量 を盲検値か ら

差 し引いて求め る.ヨ ウ度の定量 には,反 応(1)の終了後,

反応液にN/10H2SO4液20mlを 加 えて硫酸酸性 と し,

Na2S2O3で 滴定す る.消 費N/10ヨ ウ度1mlは マル ト

ース17.1mg,グ ル コース9.0mgあ る いは キシロ ー

ス7.5mgに それぞれ相当す る.

本法の特徴は,な ん といって もアル ドースに対す る特

異性の高い ことで,と くに,近 年 注 目を うけた グルコー

スの フラク トースへの異性 化反応 の測定 に,す なわ ち,

グルコースとフラク トースの混 合系 におけるアル ドース

の定量法 と して採用 された ことは周知のとお りである.

しか しなが ら,前 記 した ように,フ ラク トースの混在量

が多 くな るとグル コースの定量値 が高 くなるので,こ の

点 を改良す るために2,3の 改 良法が提 出さ れてお.り,そ

の要点をWillstatter-Schudelの 原法 と比較表示 して

み よ う.な お,マ ンノースが定量的酸化を うけ るように

配慮 した改良法 も付加 してある(第3表).

これ ら諸方法におけ る共通の改良点は,ア ルカ リの種

類 とその濃度 および反応の時間 と温 度に対す る配慮 であ

り,条 件 が次第に厳密にな って きている ことは,糖 の ア

ルカ リに対す る不安定性か らすれば当然であろ う.こ の

ことは,銅 試薬,鉄 試薬,あ るいはニ トロ試 薬に よる定

量法に おいても充分留意 されていたことは,本 稿 をふ り

返 って検討 して くだ されば明 らかである.い ま,改 良法

に おいてみ られ るフラク トース混在下 のグルコース定量

に対す る2,3の 効果を記 してみ よう.小 曽戸 らの実験

では(条 件は第3表 に示す とお り),Na2CO3液 を アル カ

リとした場合,グ ルコースの5倍 量の フラク トースが含

まれ ていても+2%前 後の誤差で グル コースを 定量 し

うるのに対 し,NaOHを 用いる と同 じ糖混合系で約40

%の 誤差 を 生 じる.な おNa2CO3やN/10NaOHを ア

ルカ リと す る とN/100I2液1ml消 費は0.84～0.83

mgの グル コースに相 当 し,反 応の定量性を失 う(理 論

値0.90mg).ま た 貝沼 らの実験では反応温 度に 留意 し

て20℃ と限定 したが,グ ルコースの2倍 の フラク トー

スを含む混 合系で1～2%の 誤差 を生 じるとい っている.

次に本法における欠点は,ケ トン類,た とえば ピル ビン

酸,ア セ トンな どの醸酵生産物に よってinterfereを う

け ることであ る.ま たNH4に よって も同様 であるが,

揮 発性物質であれば前処理でのぞ くことができる.

V.硫 酸処理を基本とする還元糖の定量

還元糖は強い酸 と処理 るす と脱水 され てフルフラール

またはその誘導体 とな り,こ れが各種の試薬 と反応 して

呈色す るので,そ れ らを比色するのが本法 の原理 とされ

第3表 Willstatter-Schudel法 と そ の改 良 法

R. Willstatter, G. Schudel: Ber., 51, 780 (1918).

M. Ludtke: Ann., 456, 201 (1927).

大 槻;日 化,538(1934).

小 曾 戸,数 見,小 鷹,蔀:日 農 化,33,166(1959).

貝 沼,田 所,鈴 木:澱 粉工 業,12,57(1965)

Vol. 3, No. 9 (487) 39

ている.し か し,酸 との反応で生ずる物質がフルフ ラー

ル誘導体のみ であるとは考え られないので,定 量 の基本

反応はここに 明示 しないほ うが誤 りを伝 えない点で良心

的 なのか もしれない.い ずれに しても,糖 の分解生成物

と特殊試薬 との呈色反応を定量 法に応用 した ものである

か ら,糖 分解反応お よび生成物 と試薬 との呈色反応 の2

つ の基本反応が含 まれ ることは,系 の複雑性 を意味 し,

定量法 と しての短所 となる.し か し,応 用 しうる範 囲の

広 さは この欠点を補 って余 りがあ り,と きに は著 しい特

殊性 を示す こともあ るので,以 下にのべ るよ うに,多 く

の定量法が生 まれた.な お,強 酸処 理で多糖類 は一般に

単糖類に加水分解 され るので,本 法 では全還元基 の定量

が なされ ることになる.

強酸 として硫酸を用い る場 合,そ れ の糖 に対す る反応

性について知 ってお くべ きことは,硫 酸濃度 に最適条件

の あることで,高 濃度が必ず しも高い糖分解速度 を与 え

る とは限 らないのであ る.こ の ような反応性 を予備知識

と して,硫 酸処理を基本 とす る各種還元糖 の定量法 をご

らん願いたい.

フェノール硫酸法

本法が案 出された主な理 由は,ペ ーパークロマ トグラ

フ ィーの発達 で糖の混合系か ら各構成糖 の単離が可能 と

な り,そ れぞれ を溶 出定量す る必要が生 じた からである.

と くに糖 の分離に きわめて有効なフ ェノール系溶媒 では,

展開後,乾 燥に よるフェノールの除去が不完 全にな りや

す く,後 述す るアンスロ ン法な どの定量法 の適用 を不可

能 にす る 場合が しば しば 起 こるのである(フ ェノール

とア ンスロンが反応す ると 緑色を生ずる).M.Dubois*

(1951)は,単 糖類,メ チル化糖,オ リゴ糖,多 糖類 な

どの定性試薬 と して フェノール硫酸法を提示 し,あ わせ

て定量 の可能性 を推測 した.さ らにかれ ら(1956)は,

定量法 と しての条件,お よび次の諸溶 媒に対す る反応性

のないことを合わせ明 らかに し,前 処理(加 水分解)す

ることな しに多糖類の構成糖量 を測定 した.定 量に影響

を与えない 展開剤:フ ェノール系,BtOH・EtOH・ 水,

Et-aetate・acetic・ 水,methylethylketone・ 水な ど.

基 本反 応は不 明.

〔試 薬〕

a) 濃硫酸(特 級).

b) 80%フ ェノール液(w/w)ま たは5%フ ェノール液.

試 料2.0ml(10～70γ グ ル コ ース)を 内径16～20

mmの 試 験 管 に と り80%フ ェ ノ ール 液0.05mlを 加

え,濃 硫 酸5.0mlを 速 や か に(10～20秒 間 で)液 面

に 直 接 滴 下 す る よ うに 加 え10分 放 置 後 よ くまぜ,一 定

温 度(20～30℃)の 水 浴 中 に 一 定 時 間(10～20分)保

った 後,呈 す る黄 色 を比 色 す る.色 調 は 数 時 間安 定 で,

ヘ キ ソー ス は490mμ で,ペ ン トー ス お よび ウ ロ ン酸 は

480mμ で そ れ ぞ れ 測定 す る.な お80%フ ェ ノー ル液

0.05mlを 加 え る際 ミク ロ ピペ ヅ トを 用 い る が,そ のか

わ りに5%フ ェ ノ ー ル液1.0mlを 加 え て も よい.定

量 値 は検 量 曲線 か ら求 め る.

なお,筆 者 の経験 では,試 料0.05mlに 対 し80%

フェノール0.05mlと 濃 硫酸5.0mlを 氷水冷 しなが ら

加 えるとき,ア ル ドースはほ とん ど発色 しない(490mμ)

が,ケ トースは前記方法 の場合 とほぼ等 しい吸光度を示

す.

本法の特徴は,(1)フ ェノールで妨害を うけない.

(2)操 作が簡単で,と くに加熱(煮 沸)を 要 しないこと

は多数の試料 を一挙に処理 し うる こ と を 示 し,た と え

ば,カ ラムク ロマ トグラフ ィーに よって単離 される糖類

の溶 出曲線 を画 くために きわめ て好都合であ る.(3)濃

硫酸 の滴加法に多少 の条件が付 されてい るが,と くに面

倒 な技術 を要 しない.(4)試 薬 は安価で しか も安定であ

る.(5)ピ ル ビン酸,ア セ トン その他の ケ トン 化合物

に対 しても強 い反応 を示 し黄色 を呈す る.糖 の うちデオ

キシ糖 とは反応が きわめ て弱い.

アンスロン法

F.Schutz**(1938)は,ア ンス ロ ンが グ リセ ロー ル

と反 応 す る こ と を の べ た が,そ の 後R.Dreywood***

(1946)は,同 試 薬 が セル ロ ース と反 応 して 緑 色 を 与 え

る こ と を知 り,さ らに 同 じ呈 色 反 応 が グ ル コー ス とそ の

多糖類,ペ ン トー ス,ペ クチ ン,ア ル ギ ン酸,フ ル フ ラ

ー ルに 対 して もみ られ る こ とを 示 した .次 い でD.L.

Morris****(1948)は これ を 次 に の べ る よ うに 定 量 法 化 し

た.定 量 の 基 本 反 応 は ア ル ドヘ キ ソー ス で はhydroxy-

methylfurfuralへ の,ま た ア ル ドペ ン トー スで はfur-

furalへ の脱 水反 応 と い わ れ て お り,こ れ ら生 成 物 と ア ン

ス ロ ン との 反 応 に よ り生 ず る緑 色 を比 色 す る.定 量 値 は

*M . Dubois, K. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A.

Rebers, F. Smith: Nature, 168, 107 (1951);

Anal. Chem., 28, 350 (1956).**F . Schutz: Papier-Fabr. (Tech. Tl.), 36, 55

(1938).***R . Dreywood: Anal. Chem., 18, 499 (1946).****D . L. Morris: Science, 107, 254 (1948).

40 (488) 化 学 と 生 物

第4表 アンスロン法 における反応条件 の比較

D. L. Morris: Science, 107, 254 (1948).

L. H. Koehler: Anal. Chem., 24, 1576 (1952). R. R. Bridges: ibid., 24, 2004 (1952).

検量 曲線 から求 める.ア ンスロン試薬の濃度や定量反応

の 条件 な どは定量すべ き糖の種類に よ り異なるので,い

くつ かの例 を第4表 に まとめてみた.な お,わ か りやす

くす るために,堀 越の示 した定量操作を以下に記 して参

考 と しよう.

氷水 中に冷却 した試験管に,あ らか じめ冷 したア ンス

ロ ン試 薬(表 を 参照の こと)5mlを 加 え,そ の層 の上

に試料0.5ml(グ ル コース5～50γ)を 静かに 注 ぐ.た

だ ちに混和,次 いで沸騰水浴中に正確 に10分 保 った後,

第5表 Anthrone factors

L. H. Koehler: Anal. Chem., 24, 1576 (1952); 26, 1914

(1954).

T. A. Scott, Jr., E. H. Melvin: ibid., 25, 1656 (1953).

堀 越:光 電 比 色 法 各 論2(化 学 の 領域,増 刊34),p.36.

J. R. Helbert, K. D. Brown: Anal. Chem., 28, 1098 (1956).

水で急冷す る.620mμ の吸光度を測定す る.

ア ンスロ ン法の特徴 または諸注意:(1)試 薬 は調製

がきわ めて容 易で あるが,不 安定であるので測定前にそ

の都度調製す る.古 い試薬は黒味をおびるとともに発色

能が低下す る.(2)各 糖はそれぞれちがった速 さで,ち

がったintensityで 発色 するが,そ の吸収 スペ ク トル

はほ ぼ同じ波長(620mμ 付近)に 極大を示す.一 方,

2-deoxy sugarや ウロン酸は ピンク 色 を 示 す(520～

550mμ).

現今では,本 法は一般還元糖 の定量法 と して最 も権威

第1図 ア ンス ロ ン法(Koehler)に お け る吸 光 度

の強 さ と変 化(L. H. Koehler: Anal. Chem., 24,

1516 (1952))

F: fructose, G: glucose, Sor: sorbose,

Man: mannose, X: xylose

Vol. 3, No. 9 (489) 41

第2図 ア ンス ロン法(Helbert-Brown)に お け る

フ ラ ク トー ス の発 色(50℃,15分)(J. B. Helbert,

K. D. Brown: Anal. Chem., 27, 1791 (1955)) F: fructose, Ar: arabinose

G: glucose, Man: mannose

あるものの1つ であるが,対 照 とす る糖 の種類に よって

発色の速 さや強さが異 なることのほかに,褪 変色 をも示

すので,一 見,定 量法 と して決定的 な欠点を もつ よ うで

あ る.し か しながら,な ぜ 多 くの研究者に よ り採用 され

ているのであろ うか.こ れに対 し,本 法は多 くの人たち

によって定量法 と しての詳細な検討が なされた結果,そ

の特徴的 な性格 が次第に 明らかに されて きたためであ ろ

うと筆 者は考えている.

い ま,発 色 ・変色の速 さお よび最大 吸 光 度 につい て

Koehler(1952)の 実験 をか りてのべてみ よう.試 薬 お よ

びその加 え方,反 応条件 は,第4表 のとお り,ア ル ドヘ

キ ソースは8分 間の加熱(in boiling bath)で 全発色 し,

呈色度お よび吸収極 大(620mμ)は 加 熱時 間13分 以 内

はほとん ど変わ らないのに対 し,ケ トヘキ ソースは発色

速度が きわめて大で,1～2分 の加熱で最高発色 を示 し,

それ以上の加熱で急激に変色す る.こ のよ うな著 しい吸

光度(620mμ におけ る)の 変化は アル ドペン トースに

お い て もみ られ る.そ こでKoelherは,最 大 吸 光 度 を

示 す に要 す る反 応 時 間 と そ の と き の 吸 光 度(anthrone

factorま た はA.F.)を 表 示 し(第5表),対 照 糖 の 種

類 に よる 適 正 な 加熱 時 間 と,試 薬 のsensitivityお よび

selectivityを 明 らかに した.

A.F.=Klett* scale reading

γ of carbohydrate per 5ml of solution

さらに,定 量反応に おける吸光度(620mμ)の 消長 を追

跡 してい る(第1図).

これ らの結 果か ら,Koehlerの 方法は アル ドヘキ ソー

スに対 し常に安定性ある良好 な数値 を与 えるので,た と

えばグル コースの定量法 と して表に示 された操作が決定

されているわけである.も ちろんペン トースが混存す る

場 合は補正を要す ることはい うまでもないが,比 較的小

さい補正値 です むことであろ う.

また一方,Morrisの 原法に おけ るような 反 応 条 件

(第4表 参照)で は,グ ル コース もフ ラク トース も ほ ぼ

同 じ強 さの吸光度を示す といわれ るので,ヘ キ ソースの

全量がえ られる ことに なる.

次 にHelbert & Brown(1955)の 実 験 結 果 を眺 め て

み る と,グ ル コー ス(ア ル ドヘ キ ソー ス)や ア ラ ピ ノー

ス(ア ル ドペ ン トー ス)の 共 存 下 に お け る フ ラ ク トー ス

(ケ トヘ キ ソー ス)の 定 量 の 可 能 性 が み い だ され る で あ

ろ う.す な わ ち,第4表 に お け るHelbertら の 反 応条

件 中,加 熱 温 度 を50℃ に,加 熱 時 間 を15分 とす れ ば,

第2図 か らア ル ドー ス共 存 下 の フ ラ ク トース 定 量 が 可 能

とな る.

以上,3つ の研究結果 をここに記 して参考 としたが,

筆 者のア ンス ロン法に対す る期待は混合糖系における構

成糖 の 分離定量 であ り,上 記 のHelbertら の方法 はそ

の顕著 な一例 と考 えた い.ま た,Koehlerのanthrone

factorや 反応時 間と 吸収 スペ ク トル との 関係図か ら,

デオキシ糖,メ チ ルペ ン トース,ウ ロン酸な どの定 量の

可能性 を導 き出す ことが できそ うであ る(つ づ く).

*米 国の著名な比色計で,た いへん広 く用 いられている

ので,そ の読み は1つ の標準 となっている.

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