11法科学技術，19(1)，1―8(2014)

―原著―

ABO 式血液型に注目した混合血痕からの個体成分の分離と DNA 型鑑定

常盤尚子1,3，中村眞二2，佐藤耕一3，吉井富夫3

1順天堂大学医学部腎臓内科学講座2順天堂大学大学院研究基盤センター細胞病理イメージング研究室

〒1138421 東京都文京区本郷 2113警視庁科学捜査研究所

〒1008929 東京都千代田区霞が関 211

Isolation method from mixture of blood stain by ABO blood typingand DNA testing

Naoko Tokiwa1,3, Shinji Nakamura2, Koichi Satoh3 and Tomio Yoshii3

1Division of Nephrology, Department of Internal Medicine,Juntendo University Faculty of Medicine

2Laboratory of Biomedical Imaging Research, Biomedical Research Center,Graduate School of Medicine, Juntendo University211 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 1138421, Japan

3Medico-Legal Section, Criminal Investigation Laboratory, Metropolitan Police Department211 Kasumigaseki, Chiyoda-ku, Tokyo 1008929, Japan

(Received 15 October 2012; accepted 2 September 2013)

In a series of random murders and gang rapes, biological material left at thecrime scene was often a mixture from two or more individuals. In such cases, it isdi‹cult to identify the DNA proˆle of each individual. Therefore, using the MCARmethod, we aimed to detect the individual components of such a mixture for DNAtyping, thereby establishing a method of examination that facilitates personal iden-tiˆcation from a mixture of biological samples.

In this study, we attempted to establish a method for the preparative separationof cells using laser microdissection (LMD), and determined the number of cells re-quired for DNA typing. In addition, we investigated whether it is possible to deter-mine the DNA proˆle of the cells separated from an experimental mixture of blood.

As a result, we found that at least 16 cells were required for DNA typing by cellsmearLMD method. On the other hand, 150 cells were need for DNA typing by celltransferLMD method. In the case of a mixture of blood group A and B cells, it waspossible to determine the DNA proˆle of each individual by the preparative separa-tion of cells in positive regions with antiA or antiB antibody using MCAR andLMD.

Biological material at the crime scene is almost always collected on a piece of

22 常盤尚子ほか

gauze or adhesive tape, and for these cases, it is necessary to use the cell transfermethod. In this study, it was suggested that the cell transferLMD method was ex-pected in forensic application.

However the mixtures are variously mixed with a great variety of cases for everysample, and are on various carriers. So we need to identify the exact location of theindividual component and to take notice of biological contamination on carriers.

Key words: Mixture of biological sample, Laser microdissection, PCR, Celltransfer method, ABO blood typing

緒 言

今日の DNA 型鑑定の識別能力は高く，犯罪現場

に残された血痕や体液斑，垢等付着物が一個人由来

のものであれば，その個人を特定できるまでに至っ

ており，犯罪捜査において重要な役割を果たしてい

る．

しかしながら，無差別・連続殺傷事件や輪姦事件

においては，その現場に遺留された血痕や精液斑等

が複数人による混合状態となってしまっていること

がある．この場合，検出される DNA 型は混合所見

となり，個人を特定することが困難である．しかし

その一方で，微量の混合血痕からでも，それが誰と

誰に由来するものなのかを明確にしなければならな

い場合がある．

これまでに報告されている混合試料からの個体成

分の分離は，異種細胞の混合の場合に成功してお

り，例えば，膣内容物に混在する精子の分離があげ

られ，この場合，2 段階細胞融解法1)やレーザーマ

イクロダイセクション（LMD）法26)が用いられて

いる．2 段階細胞融解法では，精子頭部が強靱なタ

ンパク質で覆われていることに着目した生化学的前

処理により膣扁平上皮細胞を分解除去し，残存する

精子のみを分離している．また，LMD 法では細胞

の形の違いに着目し，顕微鏡下で物理的に精子を採

取している．

これに対して，生化学的性質や形状が同じ，いわ

ゆる同種混合試料（血液と血液，精液と精液，垢と

垢等）からの個体成分の分離とその DNA 型検査に

ついては全く検討が行われていない．そこで，同種

の混合試料から，それぞれの個体成分を分離する方

法として，ABO 式血液型に注目した抗原抗体反応

をマーカーとする LMD 法による細胞採取について

検討を行った．

ここでは，抗 A・抗 B 抗体を用いた混合凝集反

応（MCAR）を用い，また LMD 法による細胞採

取のために細胞転写法及び細胞塗沫法（直接法）を

検討したところ，細胞転写法でも良好な成績を得た

ので報告する．

なお，抗 H レクチンは全血液型血痕に陽性反応

を示すため，本法では利用しなかった．

さらに，細胞転写・LMD 法による細胞採取の効

率・有効性を調べるために，口腔内細胞を用いて，

その数と DNA 型の検出率についても検討を加え

た．

材料および方法

試料

血液試料は A 型および B 型既知の成人から採取

したものを，細胞試料は綿棒で口腔内より採取した

ものを使用した．なお，本研究は順天堂大学医学部

研究等倫理審査委員会の承認を得て行った．

混合血痕試料の作製

A 型および B 型の採血直後の血液各10 mL を隣接

するようにスライドグラス上に滴下し，ピンセット

の先端で 1 回転，2 回転，5 回転，20回転の 4 通り

で攪拌した後，その混合血をガーゼ片に転写し，作

製した．Fig. 1 には，1 例として 2 回転攪拌の混合

血液から作製した血痕ガーゼ片を示した．

混合凝集反応（MCAR)7,8)

作製した混合血痕に，セルタック（セロハン両面

テープ・透明タイプ，ニチバン）の粘着面を貼り付

けて試料を採取した後，反対側の粘着面でスライド

グラスに固定し，MCAR プレートを作製した．こ

3

Fig. 1 Type A/B mixed blood stain on gauze

Fig. 2 A/B-antigen-positive regions on the MCAR plates from the blood stain of blood A and B mixture with 2times stirring softly. (e), detection of A-antigenp-positive regions, (f), detection of B-antigen-positiveregions

3血液型に注目した混合血痕からの個体成分の分離と DNA 型鑑定

の方法で同一血痕部からもう 1 枚の MCAR プレー

トを作製した．感作用の抗 A 抗体液の組成は，抗

A 抗体，10ブロックエース，0.5Tween，生理

食塩水＝1, 1, 1, 1 とし，抗 B 抗体液の組成は，抗

B 抗体，10ブロックエース，0.5Tween，生理

食塩水＝2, 3, 2, 1 とした．なお，抗 A，抗 B 抗体

は，イムコア社製（東京）のマウスモノクローナル

抗体を，ブロックエースは，雪印乳業株式会社製の

免疫研究用ブロッキング剤，ブロックエース粉末を

使用した．

2 枚の MCAR プレートの試料面にそれぞれ抗 A

抗体あるいは抗 B 抗体液を重層し，37°C 30分間，

続いて室温で 1 時間感作した．次いで，4°Cの生理

食塩水で過剰の抗体を洗い流し，余分な水分を除去

した．続いて試料面に指示赤血球 3浮遊液（オー

ソ・クリニカル・ダイアグノスティックス株式会

社，東京）を重層し，室温で10分間反応させた後，

シャーレに満たした生理食塩水に反転静置し，未反

応の血球を沈下させた．この MCAR プレートを取

り出し，肉眼的ないし顕微鏡下で陽性反応を観察し

た（Fig. 2）．

LMD 用プレートの作製

(1) 細胞塗沫法（直接法）

綿棒により採取した口腔内細胞を，LMD 用ホイ

ル付きスライドグラスに直接塗布し，ドライヤーで

冷風乾燥，エタノール固定後，ヘマトキシリン染色

し，水洗，エタノール脱水，乾燥させた．

(2) 細胞転写法9,10)

ABO 式血液型検査後の MCAR プレートの試料

面に，マウントクイック（MQ，大道産業，東京）

封入剤を全体に載せた．80°C，30分間で MQ 封入

剤を硬化させ，2時間以上かけて室温に戻した．次

いで，50°C温浴中で 5～10分間軟化させ，MQ 封入

剤（フィルム状）のみを剥離し，LMD 用ホイル付

きスライドグラス（LMD スライドグラス，ライカ

マイクロシステムズ，東京）に細胞を含んだ面が接

するように貼り付けた．その後，50°Cで一晩かけて

十分伸展させ，ホイル面に細胞を転写させた．続い

て，キシレンに 4～5 時間浸し，MQ 封入剤を溶解

除去し，エタノールで洗浄後，乾燥させた（Fig.

3）．また，スライドグラス上に作製した細胞塗沫標

本についても上記 MQ マウント法で LMD プレー

トを作製した．

4

Fig. 3 Preparation of LMD sample from MCAR plate using cell transfer methods

4 常盤尚子ほか

細胞転写法を用いた LMD 法による細胞採取と

DNA 型判定

MCAR 検査プレートを乾燥後，MQ 封入剤を用

いた細胞転写法で LMD 用試料スライドグラスを作

製した．続いて，LMD 細胞採取用のチューブの蓋

内側に，あらかじめ細胞溶解液（TE 9 mL，1

Tween20 0.8 mL ， 10 mg / ml ProteinaseK 0.2

mL）を置き，MCAR 陽性部位を Leica AS LMD

system（ライカ マイクロシステムズ，東京）を用

いた LMD 法により採取した（Fig. 4）．次いで細胞

溶解液と混合し，72°C15分間の酵素処理後に98°C10

分間で酵素を失活させた11)．DNA 型判定は，

AmpFLSTRIdentiˆler Kit（ライフ・テクノロジー

ズジャパン株式会社，東京）を用いた PCR 増幅，

ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer によるフラグメ

ント解析で行った（Fig. 5, 6, 7）．なお，血液型判

5

Fig. 4 Isolation of A/B-antigen-positive regions onthe MCAR plate with foil for LMD. (A, B) Be-fore microdissection and (C, D) after microdis-section.

Fig. 5 Results of Identiˆler analysis of a mixedblood stain

Fig. 6 Results of Identiˆler analysis of A-antigen-positive regions

5血液型に注目した混合血痕からの個体成分の分離と DNA 型鑑定

定に用いた指示赤血球浮遊液について直接 DNA 型

検査を行ったところ，DNA 型は検出されなかっ

た．

結果と考察

混合血痕における個体成分の局在性と LMD 法

による分取

A 型と B 型の血液で作製した混合血痕の不均一

性については，1 回転攪拌ではその不均一性を肉眼

で確認できたが，2 回転さらに 5 回転と攪拌回数を

増やすと不均一性を確認することは困難となり，20

回転攪拌の場合は肉眼的にはもはや均一と見なせる

状態であった．しかしながら，いずれの場合も

MCAR プレートを顕微鏡下で観察すると明らかに

局在ないし偏りが認められた．Fig. 2 は 2 回転攪拌

で作製した血痕の MCAR 顕微鏡像であり，A 型反

応を呈する部位と B 型反応を呈する部位が認めら

れた．その A 型反応部位及び B 型反応部位を

LMD 法で採取し，DNA 型検査を行った結果は

Fig. 6, 7 のとおりであり，明らかに個体成分の分離

が行われていた．

Table 1 は 4 通りの攪拌で作成した血痕の MCAR

6

Fig. 7 Results of Identiˆler analysis of B-antigen-positive regions

Table 1 Locus-detection rate of A-antigen-positiveregions on the MCAR plate.

Number of stir softlywith blood A and B

Number of identiˆable loci

Singleproˆle

Mixedproˆle

Notavailable

1 16 0 01 16 0 01 16 0 02 15 0 12 11 5 02 16 0 02 15 1 05 16 0 05 16 0 05 16 0 05 16 0 0

20 16 0 020 15 0 120 15 1 020 16 0 0

6 常盤尚子ほか

プレートから，A 型反応部位を LMD 法で採取し，

DNA 型検査を行った結果であり，15例中12例につ

いては16ローカス全てにおいて明らかに個体成分の

分離が行われていた．このことから，MCAR プ

レート上に偏った血液型反応が肉眼的に確認できる

場合はもちろんのこと，顕微鏡下で，その局在が観

察される場合は，LMD 法の適用により個体成分の

分取が可能であることが示された．

混合血痕が実際の犯罪現場で形成される過程を考

察してみると，多くの場合は，1 番目の流動血が担

体に付着した後に，時間差と位置のずれをもって，

2 番目の流動血が付着するという過程をたどると考

えられる．位置のずれは必然的に個体成分に局在性

を与え，時間差は血液の流動性低下により，やはり

局在性を高めると思われる．また，1 番目の付着血

痕の上を 2 番目の流動血が完全に覆ったような血痕

の場合，検査のためにかき取った砕片状血痕の一部

には，個体成分の局在が期待されるし，湿潤ガーゼ

等による拭き取り法でも，乾燥血痕同士の完全な溶

解混合はあり得ず，一部に局在が認められるものと

思われる．しかしながら，MCAR 法の原理からし

て，例えば抗 A 感作反応では，A 型成分が存在す

れば陽性となるため，他の型成分が混在している部

分も陽性を示し，局在部分との区別は困難である．

したがって実務にあたっては，陽性部辺縁を避け，

中心部の数箇所を独立に採取し，そのそれぞれにつ

いて DNA 型検査を行う等の工夫が必要であると思

われる．

また，MCAR 陽性所見と DNA 型結果との間に

整合性がないということも起こりうる．例えば，O

型血痕が A 型のだ液で汚染された担体上に形成さ

れている場合，抗 A 抗体陽性という所見により，

その部の検出 DNA 型は A 型人物由来と判断して

しまう危険性がある．したがって，現場試料の多様

性を考えると，試料のおかれていた環境等を十分考

慮した上で，各種予備検査（だ液，精液，尿等）の

併用も必要であると思われる．

細胞転写・LMD 法の評価

血液型局在部位を LMD 法で採取するためには，

細胞転写法による前処理が必要となる．そこで，細

胞転写・LMD 法の有効性および効率を評価するた

7

Fig. 8 Results of Identiˆler analysis of 16 cells fromcell smear method

Fig. 9 Results of Identiˆler analysis of 150 cellsfrom cell transfer method

Table 2 Accuracy of DNA typing by the number ofLMD-sampling cells.

Identiˆable loci using Identiˆler Kit/test loci

Numberof cells

Cell smearmethod

Cell transfermethod

4 0/16 NTa)

4 0/16 NTa)

16 16/16 0/1616 16/16 0/1664 16/16 7/1664 16/16 6/16

150 NTa) 16/16150 NTa) 16/16

a) NT, Not tested

7血液型に注目した混合血痕からの個体成分の分離と DNA 型鑑定

め，細胞塗沫・LMD 法を対照に，採取口腔内細胞

数と DNA 型検出率について 2 セットで検討し，そ

の結果を Table 2 に示した．

Fig. 8 は細胞塗沫・LMD 法で16個の口腔内細胞

を採取したときの DNA 型結果像であり，本 DNA

型検査法での信頼下限域（DNA0.1 ng，細胞数にし

て約15個）を満足する結果であった．一方，細胞転

写・LMD 法では，16個の細胞採取では不検出，64

個の細胞採取で一部の DNA 型の検出，150個の細

胞採取でほぼ完全な DNA 型を検出した（Fig. 9）．

すなわち，このことは，細胞転写・LMD 法におけ

る有効細胞採取率は，細胞塗沫・LMD 法の 1/10程

度と低く，完全な DNA 型を検出するためには，少

なくとも150個以上の細胞採取が必要であることを

示している．この細胞転写法の効率の低さは，細胞

の MQ 封入と引き剥がしという過程を経るため，

細胞は原試料面に残存したままで，転写後に LMD

で採取されているものの多くがゴースト細胞である

とも考えられる．

血液 1 mL 中には約4000～8000個の白血球がある

と言われている．つまり，150個の細胞（有核）を

血液量に換算すると，血液0.02 mL 程度と極少量で

88 常盤尚子ほか

あるため，Fig. 2 に見られるように，MCAR 法で

異なる血液型の局在が顕微鏡下で観察できれば，各

種担体上に付着する混合血痕の個別 DNA 型検査に

おいて，この細胞転写・LMD 法が法医採証学的に

利用できると期待される．

ABO 式血液型マーカーによる分別とその限界

日本人における ABO 式血液型は，A 型が38.2

，O 型が30.5，B 型が21.9，AB 型が9.4の

割合で存在している12)．したがって，血液型の異な

る二つの組合せとその組合せ確率は，A 型と O 型

の組合せで23.3，A 型と B 型で16.7，B 型と O

型で13.4，A 型と AB 型で7.2，O 型と AB 型

で5.7，そして B 型と AB 型で4.2であり，血液

型を異にする組合せ確率の総和は70.5となる．つ

まり，2 名の混合血痕の場合，血液型の検査によ

り，その約70が分別の対象となりうる．残る約30

の混合血痕は，同じ血液型の組合せであることか

ら，これを分別するためには他の血液型検査法の併

用が必要となってくる．そこで，MCAR 法の適用

が可能と思われる Lewis 式血液型についても検討す

る予定である．また他の免疫染色法の適用により混

合血痕等の個体成分の識別がより広がるものと思わ

れる．

謝 辞

本研究を行うにあたり，ご指導，ご助言を賜った

順天堂大学医学部法医学教室故伊藤幸夫准教授並び

に對馬秀子先生に深く感謝いたします．

文 献

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