PENGARUH PROTEIN TOTAL DARI EKSTRAK BIJI KETAPANG(Terminalia catappa) TERHADAP HEMAGLUTINASI ERITROSIT PADA

MANUSIA

Nurlia Puspita R1, Hery Haryanto2, Aceng Ruyani3

1. Mahasiswa Pendidikan Dokter,Universitas Bengkulu 2. Dosen Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Bengkulu 3. Dosen Jurusan Biologi, Fakultas KIP Universitas Bengkulu

ABSTRAK

Latar Belakang: Biji ketapang (Terminalia catappa) merupakan biji yang memiliki kandungan protein, salah satunya adalah lektin. Adanya ikatan protein lektin dengan karbohidrat pada permukaan eritrosit menyebabkan terjadinya hemaglutinasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian protein total dari ekstrak biji T. catappa terhadap laju hemaglutinasi eritrosit pada manusia. Metode: Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental yang menggunakan ekstrak biji T. catappa dengan pelarut Tris-HCl Buffer dengan pH 7,0. Semua golongan sel darah merah manusia yaitu A, B, AB dan O diuji hemaglutinasi dengan ekstrak biji T. catappa konsentrasi 100% setelah dilakukan sentrifugasi ke-1 (supernatan), setelah sentrifugasi ke-2 (pellet) dan setelah dilakukan dialisis dengan menggunakan kantung dialisis untuk menahan protein dengan berat molekul lebih dari 12000 Da. Hasil uji laju hemaglutinasi dianalisis menggunakan metode deskriptif kualitatif dan kuantitatif. Hasil: Hasil uji laju hemaglutinasi eritrosit dari golongan darah AB terhadap pemberian ekstrak biji T. catappa setelah sentrifugasi ke-2 (pellet) konsentrasi 100% merupakan interaksi terbaik untuk laju hemaglutinasi. Simpulan: Biji Ketapang memiliki kandungan protein lektin yang dapat menimbulkan hemaglutinasi pada eritrosit manusia. Kata Kunci: Ketapang (Terminalia catappa), ekstrak protein, eritrosit, hemaglutinasi.

1

THE EFFECT OF TOTAL PROTEIN EXTRACTED FROM SEED

KETAPANG (Terminalia catappa) ON HEMAGGLUTINATION OF HUMAN ERYTHROCYTES

Nurlia Puspita R1, Hery Haryanto2, Aceng Ruyani3

1. Mahasiswa Pendidikan Dokter,Universitas Bengkulu 2. Dosen Jurusan Biologi, Fakultas MIPA Universitas Bengkulu 3. Dosen Jurusan Biologi, Fakultas KIP Universitas Bengkulu

ABSTRACT

Background: Ketapang Seeds (Terminalia catappa) are seeds that have protein, one of which is lectin. The lectin protein can bind with carbohydrates on the erythrocyte surface causing hemagglutination. This study aims, to determine the effect on the rate of protein lectin hemagglutination of human erythrocytes. Methods: This is a experimental study used protein extracted from seed T. catappa with solvent Tris -HCl buffer at pH 7,0. All classes of human red blood cells (A, B, AB and O) were tested by hemagglutination T. catappa protein extract with 100 % concentration after the first centrifugation (supernatant), after the second centrifugation (pellets) and after dialysis using a dialysis bag for retaining proteins with molecular weight greater than 12000 Da. Rate hemagglutination assay results were analyzed using descriptive method qualitative and quantitative. Results: The results of erythrocyte hemagglutination test rate of blood group AB seeds extract against T. catappa after 2nd centrifugation (pellet) 100% concentration is interaction rate best for hemagglutination. Conclusion: Ketapang seeds contain lectins protein which can cause hemagglutination on human erythrocytes . Keywords: Ketapang (Terminalia catappa), protein extract, erythrocytes, hemagglutination.

2

PENDAHULUAN

Lektin merupakan molekul glikoprotein yang memiliki kemampuan untuk

mengikat gugus karbohidrat secara reversibel pada permukaan eritrosit dan

mengaglutinasi eritrosit tanpa mengubah sifat-sifat karbohidrat. Aktivitas lektin

dalam bidang biomedik antara lain sebagai antitumor, antijamur, anti-serangga,

dan dapat menggumpalkan sel darah merah (Sulasi et al., 2013). Ketapang

(Terminalia catappa) merupakan pohon yang tumbuh didaerah tropis yaitu di

daerah pesisir pantai sehingga pohon ini banyak dijumpai di daerah Kota

Bengkulu. Berdasarkan penelitian, terdapat senyawa lektin yang dapat dimurnikan

dari biji ketapang T. catappa (Vasconcelos dan Oliveira, 2004).

Golongan darah manusia dikelompokkan menjadi empat berdasarkan

antigen yang dimiliki dipermukaan eritrosit, yaitu A, B, AB, O. Golongan darah A

memiliki antigen A pada permukaan sel-sel darah merah. Golongan darah B

memiliki antigen B pada permukaan sel darah merah. Golongan darah AB

memiliki kedua antigen A dan B pada permukaan sel darah merah. Golongan

darah O tidak memiliki antigen A atau B pada permukaan sel darah merah

(Hoffbrand et al., 2005).

Reaksi protein lektin dari berbagai tanaman terhadap berbagai jenis

golongan darah berupa penggumpalan sel darah merah memiliki reaksi yang

serupa yang mungkin terjadi pada permukaan mukosa usus. (Raman et al.,2012).

Hal ini menjadi dasar bagi manusia untuk mengendalikan asupan diet, berdasarkan

jenis golongan darah (Hamid dan Masood, 2009 ).

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui protein dari ekstrak biji T.

catappa yang berpengaruh terhadap proses hemaglutinasi eritrosit pada manusia

serta untuk mengetahui golongan darah yang memiliki interaksi terbaik terhadap

ekstrak protein total biji T. catappa dalam proses hemaglutinasi eritrosit pada

manusia.

3

MATERIAL DAN METODE

Bahan-bahan yang digunakan adalah biji Terminalia catappa, darah

manusia golongan darah A, B, AB, dan O, larutan Tris-HCl buffer pH 7,0 (0,15 M

NaCl dan 1 mM CaCl2 dan 1 mM MgCl2 (TM penyangga), asam asetat 0,3M,

ammonium sulfat, larutan biuret.

Ekstrak yang dilakukan sentrifugasi ke-1 (supernatan)

Biji T. catappa direndam pada larutan Tris-HCl buffer (0,15 M NaCl dan 1

mM CaCl2 dan 1 mM MgCl2 ) pH 7,0 pada suhu 4°C selama semalam. Biji

dihomogenasi dalam blender, dan homogenat disaring menggunakan kain kasa.

Hasil penyaringan (homogenat) dicampur dengan 0,3 M asam asetat, pH 4,0 dan

didiamkan semalam pada suhu 4°C. Homogenat kemudian disentrifugasi dengan

kecepatan 2.500 rpm selama 10 menit dengan menggunakan refrigerated

sentrifuge pada suhu 40C. Pellet (debris sel) dibuang sedangkan supernatannya

diambil untuk diuji laju hemaglutinasi.

Ekstrak yang dilakukan sentrifugasi ke-2 (pellet)

Supernatan yang didapat dari hasil ekstraksi sentrifugasi ke-1 ditambahkan

ammonium sulfat saturasi 50%. Kemudian supernatan yang telah ditambah

ammonium sulfat diinkubasi selama 4-5 jam pada suhu 40C. Supernatan yang

sudah diinkubasi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama

30 menit pada suhu 40C. Supernatan dibuang sedangkan pellet diambil untuk diuji

hemaglutinasi.

Ekstrak yang dilakukan dialisis

Pellet yang didapat dari hasil ekstraksi sentrifugasi ke-2 didialisis

menggunakan kantung dialisis selama semalaman dalam larutan buffer. Hasil dari

4

dialisis sudah menyaring protein lektin dari molekul lain dengan konsentrasi

100% (Naeem et al., 2007).

Penentuan Kadar Protein Biji Ketapang (Terminalia catappa)

Penentuan kadar protein biji T. catappa menggunakan metode biuret

dengan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai protein standar (Robyt dan White,

1997). Data absorbansi sampel diinterpolasikan pada gambar standar BSA untuk

mengetahui konsentrasi protein biji T. catappa.

Sumber Sel Darah Merah Manusia

Pengambilan sel darah merah golongan darah A, B, AB, dan O diambil

dari mahasiswa yang sehat dan tidak merokok yang mempunyai golongan darah

tersebut. Sel darah merah dimasukkan ke dalam tabung EDTA untuk mencegah

terjadinya penggumpalan darah. Darah yang telah ada dalam tabung EDTA dicuci

dalam larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%) untuk memisahkan sel darah dari

plasma (Raman et al., 2012).

Penentuan Aktivitas Lektin

Suspensi sel darah merah A, B, AB, O ditambahkan Tris-HCl buffer pH 7,0. NaCl

0,9 % sebagai kontrol negatif dan reagen golongan darah sebagai kontrol positif.

Pengamatan dilakukan dengan cara mengamati apakah terdapat hemaglutinasi dari

keempat golongan darah tersebut selama 200 detik (Putra, 2013).

Analisis Data

Hasil penelitian mengenai pengaruh protein total dari ekstrak biji ketapang

(Terminalia catappa) terhadap hemaglutinasi eritrosit pada manusia menggunakan

metode deskriptif kualitatif dan kuantitatif dianalisis menggunakan metode Anova

One Way atau Analisis Varian Satu Arah (Kusriningrum, 2010)

5

HASIL PENELITIAN

Kadar Protein Ekstrak Biji Ketapang (Terminalia catappa)

Konsentrasi protein yang terdapat dalam ekstrak, yaitu sebagai berikut. Tabel 2 Kadar Protein Ketiga Jenis Ekstrak

No Ekstrak Biji T. Catappa Konsentrasi Ekstrak (%) Kadar Protein (ppm)

1 Sentrifugasi Ke-1 100 853

2 Sentrifugasi Ke-2 100 876

3 Dialisis 100 892

Pengujian Laju Hemaglutinasi

Waktu yang dibutuhkan oleh protein lektin dari ekstrak biji T. catappa setelah

dilakukan sentrifugasi ke-1 (supernatant) dan ekstrak setelah didialisis terhadap

hemaglutinasi eritrosit manusia dari semua golongan darah membutuhkan waktu

lebih dari 200 detik yang terjadi pada golongan darah A, B, AB, dan O dari semua

probandus. Pada ekstrak setelah sentrifugasi ke 2, didapatkan hemaglutinasi

kurang dari 200 detik.

Gambar 2 Grafik Perbandingan Waktu Hemaglutinasi dari Golongan Darah

A, B, AB dan O Pada Pemberian Ekstrak Biji T. catappa Setelah Sentrifugasi Ke-2 (Pellet)

6

138 45.8393.8372.5

Jenis Golongan Darah

detik)

(

Waktu Hemaglutinasi

O AB B A

150

100

50

0

Analisis Data Pengaruh Protein Lektin Ekstrak Biji Ketapang

Dari data laju hemaglutinasi, ditentukan standar deviasi. Hasil standar deviasi

disajikan dalam tabel sebagai berikut:

Tabel 2 Rata-rata waktu hemaglutinasi dan standar deviasi pengaruh protein lektin ekstrak biji ketapang setelah sentrifugasi ke-2 terhadap hemaglutinasi eritrosit pada manusia

Golongan Darah Probandus n

Rata-Rata Waktu Hemaglutinasi (detik) SD Notasi

AB 3 6 45,83 ± 4,95 A

A 3 6 72,50 ± 7,39 B

B 3 6 93,83 ± 20,88 C

O 3 6 138 ± 10,58 D

PEMBAHASAN

Kadar Protein Ekstrak Biji T. catappa

Terjadinya peningkatan jumlah konsentrasi protein dari ekstrak biji ketapang

(Terminalia catappa) setelah dilakukan sentrifugasi ke-1 hingga konsentrasi

protein dari ekstrak biji T. catappa setelah dilakukan dialisis diduga disebabkan

karena adanya langkah-langkah kerja seperti penambahan amonium sulfat

sebelum dilakukan sentrifugasi ke-2 untuk mengendapkan protein dan

penggunaan kantung dialisis yang berfungsi untuk menyaring protein dan

memisahkannya dari molekul-molekul lain sehingga kandungan protein yang

didapat semakin pekat.

Pengujian Hemaglutinasi

7

Tidak menggumpalnya setiap golongan darah oleh pemberian ekstrak biji T.

catappa yang telah dilakukan sentrifuse ke-1 diduga dikarenakan protein yang

terdapat dalam ekstrak tersebut masih berupa crude ekstrak protein, yakni

campuran dari bermacam-macam jenis protein dan molekul lain yang masih aktif

dari ekstrak biji T. catappa sehingga menggangu proses hemaglutinasi dimana

protein lektin tidak dapat lagi mengikat karbohidrat yang ada pada permukaan sel

darah merah (Lymo B et al., 2012). Adanya penggumpalan setelah lebih dari 200

detik bukan karena disebabkan karena adanya protein lektin yang menyebabkan

penggumpalan, namun diduga disebabkan oleh faktor lain seperti pengaruh suhu

lingkungan yang panas, karena suhu lingkungan yang panas akan menyebabkan

penggumpalan pada darah (Wolberg et al, 2004).

Terjadi penggumpalan pada golongan darah A, B, AB, O dari pemberian

ekstrak biji T. catappa yang telah dilakukan sentrifuse ke-2 dalam waktu kurang

dari 200 detik. Hal ini terkait dengan langkah kerja dari proses ekstraksi, dimana

fungsi penambahan amonium sulfat dan kemudian diinkubasi dan disentrifugasi

dengan kecepatan tinggi dan waktu yang lama yaitu untuk mengendapkan protein

murni yang ada dalam supernatan secara maksimal, sehingga pellet yang didapat

merupakan protein yang mengendap. Protein yang mengendap inilah yang

menyebabkan penggumpalan pada semua golongan darah (Naeem et al, 2007).

Adanya penggumpalan pada pemberian ekstrak setelah sentrifugasi ke-2 (pellet)

diduga bukan disebabkan oleh amonuium sulfat, karena amonium sulfat hanya

berpotensi untuk mengendapkan protein dan tidak mempengaruhi proses

hemaglutinasi eritrosit manusia (Hamid et al, 2013)

Saat pengamatan selama 200 detik tidak ada penggumpalan yang terjadi

pada semua golongan darah yang diberi protein lektin dari ekstrak biji T. catappa

yang telah dilakukan dialisis. Penggunaan kantong dialisis dengan ukuran berat

molekul lebih dari 12.000 Da diduga dapat menyebabkan protein lektin yang ada

akan keluar dan terlarut dalam buffer, sehingga hasil dialisis tidak lagi

mengandung protein lektin yang menyebabkan tidak terjadinya penggumpalan

8

darah pada semua golongan darah, namun masih terdapat protein lain dalam

ekstrak hasil dialisis tersebut.

Interaksi Protein Lektin Ekstrak Biji T. catappa Terhadap Hemaglutinasi

Eritrosit Manusia Terdapat perbedaan lama waktu dari tiap-tiap golongan darah yang diberi

ekstrak biji T. catappa yang telah dilakukan sentrifugasi ke-2 hingga terjadi

hemaglutinasi. Golongan darah AB merupakan golongan darah yang

membutuhkan waktu tercepat sedangkan golongan darah O merupakan golongan

darah yang membutuhkan waktu terlama untuk terjadinya hemaglutinasi setelah

diberi protein lektin dari ekstrak biji T. catappa yang telah dilakukan sentrifugasi

ke-2.

Golongan darah AB memiliki antigen A dan Antigen B pada permukaan

sel Darah merah. Dengan banyaknya karbohidrat permukaan tersebut, akan

memudahkan protein lektin yang diberikan untuk lebih cepat berikatan pada salah

satu antigen atau kedua antigen yang ada di permukaan sel darah merah AB.

Golongan darah O merupakan sel darah merah yang paling lambat

mengalami hemaglutinasi. Pada golongan darah O, tidak memiliki antigen A atau

B pada permukaan sel darah merah. Namun golongan darah O masih memiliki

karbohidrat pada permukaan eritrositnya yang terdiri atas 1 molekul fukosa, 1

molekul N-asetil glukosamin dan 2 molekul galaktosa. Dikarenakan jumlah

karbohidrat permukaan yang dimiliki oleh golongan darah O sangat sedikit maka

protein lektin akan sulit berikatan dengan karbohidrat permukaan yang ada pada

sel darah merah golongan O, sehingga golongan darah O merupakan sel darah

yang paling lambat menunjukkan adanya hemaglutinasi.

Hal ini juga ditunjukkan Dari penelitian yang dilakukan oleh Sulasi, dkk.,

(2013), dimana dalam penelitian tersebut didapatkan bahwa dari 3 jenis tipe darah

yang diteliti, yaitu darah A, B dan O didapatkan bahwa golongan darah O

9

menunjukkan aktivitas yang rendah terhadap hemaglutinasi. Namun hasil ini

berbeda dengan hasil yang didapatkan dalam penelitian yang dilakukan oleh

Astuti, dkk. Dalam penelitian tersebut, dari empat golongan darah yang diteliti,

yaitu A, B, AB dan O, hanya golongan darah A dan O yang mengalami

penggumpalan sedangkan golongan darah AB dan B tidak mengalami

penggumpalan.

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, ekstrak biji T. catappa yang

mengandung protein lektin dapat mempengaruhi laju hemaglutinasi eritrosit

manusia, dimana golongan darah AB merupakan interaksi terbaik untuk laju

hemaglutinasi, diikuti oleh golongan darah A, golongan darah B dan terakhir

golongan darah O.

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, diharapkan adanya penelitian

tentang pengujian hemaglutinasi Ekstrak biji T. catappa yang menggunakan

berbagai macam variasi konsentrasi, menggunakan eritrosit manusia yang

mengandung suatu penyakit tertentu, menggunakan kantung dialisis untuk berat

molekul kurang dari 12000 Da, menggunakan elektroforesis untuk menentukan

profil protein, serta menyamakan volume dan kadar protein ekstrak pada

pengujian hemaglutinasi.

DAFTAR PUSTAKA

Astuti T, Haji S, Ruyani A, Sundaryono A. 2013. Uji Reaksi Penggumpalan eritrosit Penggolongan ABO Oleh Lektin Biji Petai (Parkia speciosa) dan Implementasinya Sebagai Media Macromedia Flash Berbasis Konstruktivis.

Hamid R and Masood A, Ishfak H.W., Shaista R. 2013. Lectins: Proteins with Diverse Applications. Journal of Applied Pharmaceutical Science. 3(4): 93103

Hamid R and Masood A. 2009. Dietary lectins as disease causing toxicants. Pakistan Journal of Nutrition. 8 (3): 293-303

Hoffbrand AV, Pottit JE, Moss PAH (2005). Kapita elekta hematologi. Edisi ke 4. Jakarta:EGC, pp: 289-291

Kusriningrum, R.S. 2010. Perancangan Percobaan. Airlangga University Press. Surabaya. 213 -215.

Lam SK dan Ng TB (2004). Lectins: Production and practical applications. Appl Microbiol Biotechnol. 89:45–55

Lyimo B, Funakuma N, Minami Y, Yagi F (2012). Characterization of a New αgalactosyl-binding Lectin From The Mushroom Calavaria Purpurea. Biosci Biotechnol Biochem. 76(2) : 336-342

10

Naeem A, Ahmad E, Ashraf MT, and Khan RS (2007). Purification and characterization of mannose/glucose-specific lectin from Seeds of Trigonella foenumgraecum. Biochemistry (Moscow). 72(1):44-48.

Putra. SG (2013). Evaluasi ekstrak protein total teripang hitam (Holothuria leucospilota) terhadap hemaglutinasi sel darah merah manusia. Skripsi.

Raman BV, Sravani B, Rekha PP, Lalitha KVN, Rao BN (2012). Effect of plant lectins on human blood group antigens with special focus on plant foods and juices. Ijrap. 3(2):255-263

Robyt, J.F. dan White, B.J. 1997. Biochemical Techniques : Theory and Practice. Sá RA, Santos ND, da Silva CS, Napoleão TH, Gomes FS, Cavada BS, Coelho LC, Navarro DM, Bieber LW, Paiva PM (2009) Larvicidal activity of lectins from Myracrodruon urundeuva on Aedes aegypti. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 149:300–306.

Sulasi F, Mangindaan REP, Losung F (2013). Lektin dari spons Cliona varians asal perairan malalayang Manado. Jurnal Pesisir dan Laut Tropis. 2(1):2834

Vasconcelos IM, Oliveira JT(2004). Antinutritional properties of plant lectins. Toxicon. 44(4): 385-403.

Wolberg AS, Meng ZH, Monroe DM, Hoffman M (2004). Jurnal Trauma.

56(6):1221-1228

11