Bol. San. Ueg. Plagas, 32: 545-562, 2006

Necrosis del tomate: "torrao "o "cribado"

A. ALFARO FERNÁNDEZ, M. C. CÓRDOBA SELLÉS, M. C. CEBRIÁN MICÓ, I. FONT, M. .IUÁREZ,

V. MEDINA, A. LACASA, ,I. A. SÁNCHEZ NAVARRO, V. PALLÁS, C. .IORDÁ GUTIÉRREZ

Desde la primavera de 2001, viene presentándose en Espana una nueva enfermedadconocida con el nombre de "torrad' o"cribado". Los síntomas que habitualmente pre-sentan las plantas afectadas son una necrosis en la parte basal del foliolo que evolucio-na a cribado, en los peciolos aparecen manchas longitudinales en ocasiones endurecidasque Ilegan a curvar los foliolos, y los frutos manifiestan manchas necróticas, deforma-ciones que finalmente lo rajan, quedando comerciahnente inviables. Muestreos realira-dos desde su aparición han determinado la mayor incidencia de la enfermedad en la ronade Murcia, seguido de Canarias y en menor proporción Almería, y Alicunte. Los resul-tados de los análisis realizados a las 369 muestras recogidas determinan que el 67^7o delas muestras analizadas eran positivas a Pepino masuic rirus (PepMV). En los ensayosde transmisión, únicamente mediante el injerto, se consiguió reproducir los síntomas dela enfermedad en dos casos, en el resto las plantas inoculadas e injertadas únicamentemostraban síntomas típicos de PepMV y los análisis realizados contirmaron este aspec-to. A la vista de los resultados obtenidos, se diseñó un nuevo método de diagnóstico queha permitido la caracterización del 89% de las muestras analizadas como aisludo Chile-no 2 de PepMV, recientemente publicado en el Gen Bank (Accesión number:DQ000985). De acuerdo con lo expuesto podría traturse de uno de los agentes implica-dos en el desarrollo del síndrome junto con otros factores aún por determinar.

A. ALFARO FF.RNÁNDEZ, M. C. CtSRDORA $F,LLÉS, M. C. CEBRIÁN MI('^, I. FONT, C. JURDÁ

GuT1ÉRREZ. Instituto Agroforestal Mediterráneo- Virología Vegetal. Universidad Politéc-nica de Valencia. Camino de Vera s/n. 46022 Valencia. (_mjordajC eaf.upv.es)M. JUÁRez. Universidad Miguel Hernández. Orihuela. Alicante.V. MeDiNA. Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agraria. Lleidu.A. LACnsA. Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario. LaAlberca, Murcia.J. A. SÁNCHFZ NAVARRO, V. PALLÁS. Instituto de Biología Molecular y Celular de Plan-tas. Universidad Politécnica de Valencia-CS[C.

Palabras clave: Pepino mosaic virus, microscopía electrónica, diagncístico, virosis,serología, RT-PCR.

INTRODUCCIÓN

En la primavera del año 2001 se detectaen invernaderos de tomate de Murcia unanueva sintomatología no observada anterior-mente en la zona. Esta sintomatología sedenominó "cribado" o "torrao" del tomate,nombre que hace referencia al aspecto que-mado que adquieren las plantas afectadas.Las prospecciones realizadas desde su apari-

ción en la Región de Murcia han determina-do la naturaleza estacional de la enfermedad,ya que sólo se presenta en primavera yotoño, mostrando su mayor agresividad amitad de dichas estaciones, aunque estopuede variar en función de la campaña(JORDÁ et al., 2003). Desde su primera detec-ción, el "torrao" ha ido apareciendo en dife-rentes zonas productoras de tomate de nues-tro país.

A. ALFARO FERNÁNDEZ, e^ al.

d

Figura I. Síntomas de °torrao" observados en plantas afectadas. a. Amarilleo y necrosis en la zona basal de losfoliolos. b. Cribado de las lesiones necróticas de la base del foliolo. c. Manchas internerviales de color negro quewanzan hacia la zona apical deI foliolo. d. Arabescos necróticos. e. Aspecto general de una planta afectada por

"torra^i'. f. Manchas longitudinales endurecidas en los peciolos que se asemejan a"costuras". g. Manchas negraslongitudinales no endurecidas en los peciolos que forman "chorreras".

BOL. SAN. VEG. PLAGAS, 32, 2006 547

Los primeros síntomas de la enfermedadaparecen en las nuevas brotaciones. En lashojas, puede observarse un amarilleo en lazona basal de los foliolos y junto al nerviocentral que posteriormente se necrosa (Figu-ra 1 a). Estas lesiones necróticas presentanuna típica coloración marrón que evolucionaa"cribado" (Figura 1 b). Otro de los síntomasobservados en las hojas es la aparición demanchas necróticas internerviales de colornegro en la base del foliolo, que van avan-zando hacia la zona apical (Figura lc),pudiendo formar arabescos (Figura ld). Eneste caso las manchas necróticas negras noevolucionan, y los foliolos no presentan eltípico "cribado", aunque la apariencia gene-ral de ]a planta enferma es similar al casoanterior, tiene un aspecto "quemado" o"torrao" (Figura 1 e).

En los peciolos, pedúnculos y tallos tam-bién se observa una manifestación variablede los síntomas, presentándose unas man-chas longitudinales de color pardo, endureci-das que se asemejan a"costuras" (Figura I f).Estas "costuras" ejercen una tensión tal enlos tejidos que desemboca en el retorcimien-to en espiral de la hoja. En algunos casos,los pecíolos presentan manchas longitudina-les no endurecidas de color negro que for-man "chorreras" (Figura lg). Los síntomasdescritos, tanto en hojas como en tallos ypeciolos, pueden aparecerjuntos,presentán-dose en la misma planta, o separados, detec-tándose plantas aisladas con una u otra mani-festación.

Las flores de plantas afectadas por"torrao" pueden presentar también necrosisy caer (Joa^á et al., 2003). No obstante, esmás habitual observar la afección en los fru-tos recién cuajados o frutos verdes de menosde 5 cm de diámetro, mostrando manchasmarrones o negras, pudiendo ser lineales ocirculares (Figura 2a), que presentan aspectode "costura". A medida que el fruto engordalas lesiones se hacen más evidentes, y la ten-sión ejercida en el fruto termina por rajarlo(Figura 2b). Generalmente son los frutosverdes los que suelen verse en los invernade-ros con la citada sintomatología, pero si las

plantas afectadas no son eliminadas, apare-cen frutos maduros totalmente rajados,deformados y con necrosis (Figura 2c). Encualquier caso, estos frutos son comercial-mente inviables.

Cuando el "torrao" o "cribado" apareceen los primeros estados de desarrollo, lasplantas presentan porte reducido, frutospequeños y cosecha escasa. En ocasiones,cuando se producen ataques poco severos o

Figura 2. Síntomas observados en frutos de plantasafectadas por "torraci'. a. "Costuras" en fruto verde.b. Frutos verdes rajados. c. Frutos maduros rajados,

detbrmados y con necrosis.

A. ALFARO FERNÁNDEZ, et c^l.

las condiciones no son las adecuadas para eldesarrollo del "torrao" la planta continúa sudesarrollo, emitiendo nuevas hojas y mante-niendo como único síntoma patente el criba-do en hojas más viejas (JoRDÁ et al., 2003).

El "torrao" en campo puede aparecer eninfecciones mixtas con otros virus que afec-tan habitualmente al cultivo del tomate comoson Tomato vellow lenf c«rl virus (TYLCV),Tornato mos^ic t'irus (ToMV), Tomato spot-ted wilt virus (TSWV), Tomato chlorosisvirus (ToCV) y el Potato virus Y (PVY). Enestos casos los síntomas se acentúan. Lossíntomas típicos del "torrao" siempre se venasociados con la sintomatología típica delPepino mosaic virus (PepMV), virosis muyextendida por las zonas productoras detomate de nuestro país desde 1998 (JoRDÁ etci/., 2001). Las plantas afectadas manitiestanlos síntomas anteriormente descritos juntocon abullonado, filiformismo, rizado ymosaicos típicos del PepMV.

Los primeros estudios realizados en ladetección del agente causal de la enfermedaddescrita apuntaron a la posible implicaciónde Parietaria mottle virus (ARAtwBUxu yARlfvo, 2003), Ilarvirus de partículas isomé-tricas que produce una sintomatología similara la típica de "torrao". Este virus provoca, enlas plantas de tomate afectadas, la apariciónde manchas necróticas internerviales y ani-Ilos en las hojas del brote. Los tallos mues-tran un mosaico que progresa a necrosis,observándose en la superficie de los frutosmanchas marrones y anillos acorchados. Pos-[eriormente, una comunicación presentada enel Tomato Working Group Meeting XV(Bari, Septiembre 2005) señaló que el agentecausal de esta enfermedad es un nuevo virus,proponiéndose para éste la denominación"Tomato torrado virus" (ToTV), compuestopor partículas esféricas de aproximadamente28 nm de diámetro similar a las de los miem-bros de la familia Comoviridae y Sequiviri-dae (VERBEEK et nl., 2005).

La disparidad de criterios junto con otrasobservaciones realizadas, han determinadoel planteamiento de este trabajo, donde serecogen los estudios preliminares realizados

para establecer el posible agente causal de lasintomatología descrita como "torrao" o"cribado".

MATERIAL Y MÉTODOS

Muestreos realizadosDesde su primera aparición en el año

2001, se han venido realizando muestreos enlos invernaderos y campos afectados de dife-rentes zonas productoras de tomate de Espa-ña, recogiendo también otras muestras quepresentaban diferentes tipos de necrosis ysintomatologías similares al "torrao". Elnúmero de muestras recogidas, el año demuestreo y su procedencia se recogen en elCuadro l.

Evaluación de la incidencia viralAnálisis serológicosLas muestras recogidas fueron analizadas

por técnica serológica DAS-ELISA utilizán-dose extractos de hojas y/o frutos de dichas

Cuadro I. Año de muestreo, número y procedenciadel total de muestras recogidas con síntomas de"torrao" y otras muesiru^^ con sintomatología

similar.

Año Procedencia N° muestras TotaVaño

Murcia 28

21101 Alicante I 32

Msllorca 3

Murcia 19

211112 Alicante 3 24

Vizcaya 2

2003Murcia 27 34

Canarias 7

Murcia 6

2004Almería 2

19Canarias 9

Tarragona 2

Murcia 98

2005 Canarias 10 110

Valencia 2

2^ú Canarias U150

Murcia 133

N" total de muestras 369

BOL. SAN. VEG. PLAGAS. 3?, ?U06 ?J9

Cuadro 2. Antisueros específicos empleados para todos los virus considerados en los análisis y casas comercialesa las que pertenecen.

Casa comercial del antisueru F.ntidad viral analizada

Tontulo s'pntted Hilt (TSWV1

Polrtto t^irns Y (PVY)

7nmr^tu lwsh^ snott tirus (TBSV)

Loewe Biochemica.Sauerlach, Germanv

Potrtto virus X (PVX)

Tirmrno ntnsaic rirus (TuMVI

Toharcu ner rusis t•irns (TNV )

TNV+ satélite

Ti^nurto chlorutic spot rirns (TCSV)

Groundnur ring.rpot tdrus (GRSV 1

Bmud fiecut trilt rirtcr- l (BBWV-I I

Bio-rad Phyto-Diagnostics.Marnes- La Coquette. France

Tobucco strerrk rirus (TSV)

Potyvirus-General

Cncurnbr^r rnoscric rirns (CMV)

AI/iilfct ntosaic• riru.r (AMV)

Tomnto f^lnrkrirtg t^irus (TBRV)

Tobnccn tnusuir tirus (TMV)

DSMZ Deutsche Sammlung vonmikroorganismen und Zellkulturen.

Braunschweig, Germany

Adgen Phytodiagnostics.

Auchincruive, United Kingdom

Tomuta rinK spat t•irus (ToRSV)

Pepino mastrir rirus (PepMV)

Pelnrgnniunt ^nnute spat rirus (PZSV)

Pepper muttle t^irus (PepMoV)

Potruo rirus Y- raza N(PVYn)

Pototo t^inr.c Y- raza 0(PVYo)

plantas frente a los antisueros específicospara los virus que están recogidos en el Cua-dro 2, con el fin de descartar la implicaciónde las virosis conocidas que atacan al toma-te. En todos los casos, se siguieron los pro-tocolos indicados por las propias casascomerciales, utilizando como testigo negati-vo tejido de tomate sano y como positivoextractos foliares de plantas infectadas porlos diferentes virus analizados.

Análisis molecularesLas muestras recogidas se analizaron

mediante distintas técnicas moleculares(PCR, Nested-PCR, RT-PCR e hibridaciónmolecular), tras realizar la pertinente extrac-ción de ácidos nucléicos. Los extractos deRNA se obtuvieron empleando el kit deextracción RNAwiz (Ambion catalog. n°9736). En los casos en los que se analizaron

virus cuyo material genético está compuestopor DNA, la extracción de éste se realizó conel kit EZNA Plant DNA Miniprep kit(Omega Bio-tek).

El análisis por PCR de Begomovirus yTYLCV se llevó a cabo según el método

descrito por MARTíNez-CuLEBRAS c t rtl.

(2001). Para descartar la presencia de fito-

plasmas las muestras se analizaron mediante

Nested-PCR con cebadores universales de la

forma descrita por LEE et aL (1993). Se apli-

có la técnica RT-PCR para la detección en un

paso de PepMV, Tumato c^hlurrtsis t^irt+s,

Tomato infectious chloro.eis virt^.r (TICV),

Alfalfu mosuic viru.r (AMV), Purieturla mot-

tle virus (PMoV) y Bean ^^ellow disorder

virus (BnYDV) usando cebadores especíti-

cos para cada uno de ellos: PepMV (PAGAN

et ul., 2006), TICV (VAiRA ct ul., 2002),

ToCV (Lou Ŝto et nl., ?000), AMV (MARTí-

550 A. ALFARO FERNÁNDEZ, et al.

NEZ-PRIEGO et al., 2004), PMOV (7ANSSEN et

al., 2005) y BnYDV (SECUNDO et al., 2004).

Se buscó descartar la presencia de cualquier

virosis de los géneros Potexvirus, Potyvirus,

Ilarvirus y Luteovirus mediante el análisis de

las muestras por RT-PCR en dos pasos con

cebadores degenerados para Potexvirus

(MARTÍNEZ-CULEBRAS Ct a^., 2002), POtyvl-

rUS (MARTÍNEZ-PRIEGO et aL, 2002), IlarvlI'uS

(análisis realizados en el laboratorio del Dr.

Pallás) y Luteovirus, Tospovirus y TSWV

(análisis diseñados en el Laboratorio de

Referencia de Virus y todavía en fase de

experimentación, no publicados). Todos los

productos amplificados fueron separados por

electroforesis en gel de agarosa al 1,5% enTAE 1 X y teñidos con bromuro de etidio. El

tamaño del fragmento obtenido se estableció

por comparación con un marcador de pesos

moleculares conocidos GeneRulerTM 100 bp

DNA Ladder Plus (Invitrogen Life Techno-

logies. Barcelona, España). Las muestras se

analizaron posteriormente mediante hibrida-

ción molecular no radioactiva con digoxige-

nina con sonda específica de PMoV suminis-

trada por el Dc Pallás (GALIPtENSO et al.,

2005).

Microscopía electrónica de transmisión(M.E.T)

Se seleccionaron 23 muestras que presen-taban distinto grado de agresividad en la sin-tomatología, para su observación al micros-copio electrónico de transmisión. Para ello,se hicieron preparaciones del extracto frescode las muestras mediante su tinción con lasal sódica del ácido fosfotúngstico al 2°Io pH:7,2 y 6,5, realizándose asimismo preparacio-nes con extractos pre-purificados de materialinfectado. Se procedió a la inclusión en resi-nas de 35 muestras que presentaban sínto-mas típicos de torrao procedentes de las dife-rentes zonas afectadas, cortándose con ultra-microtomo y observándose mediante M.E.T.con el fin de identificar posibles inclusionesvirales típicas de alguno de los virus ante-riormente citados, detectar la presencia departículas virales y los cambios citológicosen el tejido infectado.

Ensayos de transmisiónInoculación mecánica artificialA1 comienzo de la primavera del 2001, se

llevó a cabo la inoculación mecánica de plan-tas de tomate sanas con material vegetal pro-cedente de las primeras plantas que mostraronlos síntomas de la enfermedad objeto de esteestudio recogidas en Murcia. Previamente, seefectuó el análisis serológico de las muestrasa inocular, eliminándose aquel material vege-tal que presentaba infección con alguna de lasvirosis descritas hasta ese momento en loscampos de producción de tomate.

Ante los resultados obtenidos en estatransmisión previa, se realizaron distintosensayos de inoculación mecánica. Para ello,se seleccionaron muestras que presentabanlos síntomas típicos de "torrao" descritosanteriormente, analizándose asimismo elmaterial a utilizar en la transmisión para des-cartar la presencia de cualquier otra entidadyue interfiriera con el objetivo marcado dedemostrar la transmisibilidad del posibleagente causal de este síndrome.

Las muestras seleccionadas para realizarla transmisión mecánica a partir del homoge-neizado de hoja fresca y sus característicasquedan recogidas en el Cuadro 3. Asimismose realizó una purificación parcial de los ais-lados 7826, 7827, 8493, 9023 (Cuadro 4) y seprocedió a su inoculación mecánica artificial.

En los distintos ensayos de transmisión sevariaron las condiciones de la inoculación(momento del ciclo vegetativo, estado dedesarrollo de la planta, técnica de inocula-ción, tampón de inoculación, pH, etc...) paradeterminar cuáles eran las que permitían lareproducción del síndrome. Las plantas ino-culadas se mantuvieron bajo condicionesambientales controladas en invernadero o enfitotrón.

La variedad de tomate seleccionada parala realización de la transmisión mecánicaartificial fue Marmande, excepto en el últi-mo ensayo, en el que se utilizó la variedadBoludo por observar en campo una mayorsensibilidad a la manifestación del síntomade "torrao". La inoculación mecánica se rea-lizó por frotación con el abrasivo Carborun-

BOL. SAN. VEG. PLAGAS. 32. ?006 551

Cuadro 3. Características de los aislados originales empleados en los ensayos de transmisión medianteinoculación mecánica del extracto fresco de hoja, número de plantas inoculadas con cada aislado, síntomas

observados en las plantas inoculadas y resultados obtenidos en el análisis a PepMV.

N°

Muestras originales

ResultadosN° plantas Plantas inoculadas

inoculadas Síntomas en las Resultadosplantasinoculadas a PepIViV

síntomas originalesa Pepb9Vaislado

8413 "Torrao", amarilleo y abullonado

8414 "Torra^'. Abullonado

8597* Mosaico verde claro-verde oscuro

xsy9

8941

fiy42

8965*

K975

"Torrad', costuras, abullonadoy mosaico

Abullonado. "Torrao". Inicio deapuntamiento

Mosaico dorado, mosaico en cálizy tallo. Fruto verde con manchas

verde oscuro. Amarilleo en la basedel foliolo y clorótico en el ápice.

Mancha amarilla aisladay mosaico

"Torrao" con cribado, amarilleointernervial y abullonado

8980 Abullonado y "torraó'

Abullonado, apun[amiento.9003 "torraó', arabesco, cribado,

amarilleo internervial

90S 2 "Torraci '

9053 "Torrao"

9054 "Torrao"

9055 "Torrao"

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

3 Asintomótira

3 Asintomótira

Mosaico verdc claro-8 oscuro. Evolución +

a mancha aislada.

Fuerte abullonado yfirronnismo

3 Fuerte abullonudo +y rizado

2 Fuerte shullonado +

Asintomáticas (2)3 Apuntamiento de +t

foliolos ( I )

Fuerte abullonado ynervios marcados

3

Abullonado y3 apuntamiento de los +^

foliolos

Ligero abullonudo einicio de apuntamiento

Amarilleo internervial,abullunudo y

deformxci6n. Manchaamarilla aislada ( I )

Abullonado e iniciode rizado

+

+

+

+

Abullonado v3 apuntamiento dc los +

foliolo^

4

Abullonado yapuntamiento de los

tiiliulos. Manchaaislada.

+

*^ Aislado que presentaba en campo síntomas exclusivamente de PepMV.^: Análisis negativo mediante serología. Análisis positivo a RT-PCR con los cebadores especíticos de PepMV.( I), (2): N° plantas afectadas con el síndrome descrito.

dum (tamaño de partícula 0,013 mm) e ino-culación eon el homogeneizado de hoja fres-ca de material infectado o del purificado. Seobservó la evolución de los síntomas duran-te 60 días, testándose a los 15 días de la ino-culación serológicamente y por RT-PCRsegún se creyó conveniente al observar lasintomatología obtenida.

^ansmisión por injertoAl comienzo de la aparición de la enfer-

medad se realizaron dos ensayos previos detransmisión mediante injerto con el tin demantener el material para proseguir el estu-dio y para comprobar la posible existenciade un agente titopatógeno. En dichos ensa-yos se injertaron dieciséis y veinte plantas

552 A. ALFARO FERNÁNDEZ, et a!.

Cuadro 4. Características de los aislados originales purificados, número de plantas inoculadas con lospurificados virales obtenidos, sintomatología observada en las plantas inoculadas y resultados de los

análisis a PepMV.

Muestras originales N" plantas Plantas inoculadas

N"aislado

Síntomas originales Resultadosa PepMV

inoculadas Síntomas en las Resultadosplantas inoculadas a PepMV

7826Abullonado, amarilleo"torrad', cicatrices en

foliolos y cribado

Amarilleo, abullonado, apuntamiento12 y curvamiento de los foliolos. +

Asintomáticas (2)

7827Abullonado, amarilleo,"torrao", cicatrices en

foliolos y cribado+^

Mosaico verde claro-verde oscuro,amarilleo basal y apuntamiento de

12 foliolos. Abullonado. Inicio de +curvamiento de foliolos.

Asintomáticas (2)

8943

"Torrao con cribado,Abullonado. Mosaicoamarillo internervial.Curvamiento foliolos.

Costuras en tallo.

+Apuntamiento de foliolos y

5 +abullonado. Asintom^tica ( I )

9023 "Torraci' 5 Rizado, abullonado y apuntamiento +de tbliolos. Enanismo ( I ).

^: Análisis negativo mediante serología. Análisis positivo a RT-PCR con los cebadores de Potexvirus, secuencia obteni-da de PepMV, 97%r homología con aislado Ch2.

( I), (2): N° plantas afectadas con el síndrome descrito.

respectivamente. Se seleccionaron plantascon síntomas típicos de "torrao" y se anali-zaron las muestras seleccionadas para des-cartar la presencia de cualquier otro agente.EI injerto del material afectado se realizópor escudete.

Posteriormente, debido a la baja eficien-cia obtenida en los ensayos anteriores, serealizaron otros dos ensayos partiendo dematerial afectado procedente de campocomo en el caso anterior pero introduciendocambios en el procedimiento. Se selecciona-ron 14 muestras de tomate con síntomas típi-cos de "torrao", Il procedentes de Cañadadel Gallego-Mazarrón (Murcia) recogidas enmayo de 2005 (ensayo 1) y 3 recogidas enCalnegre-Mazarrón (Murcia) recogidas enjunio de 2006 (ensayo 2), analizándolas pre-viatnente a realizar el injerto. El modo deinjerto empleado fue el mismo que en el casoanterior. Las plantas injertadas en el ensayo1 se mantuvieron en el Fitotrón en condicio-nes controladas de humedad y temperatura(20°C/24°C, noche/día) y las del ensayo 2 semantuvieron en invernadero. Las caracterís-

ticas de las muestras originales se recogen enel Cuadro 5. Se observó la evolución de lasplantas injertadas y se procedió a realizar losanálisis pertinentes.

RESULTADOS

Evaluación de la incidencia viral, varie-dades afectadas y distribución geográficadel síndrome

Desde que apareció la enfermedad haceya seis años, se han recogido 369 muestrasque presentaban la sintomatología descritaen este trabajo. De las muestras recogidas el84%, procedían de Murcia, mientras que el12% aproximadamente correspondían amuestreos en las Islas Canarias, zonas dondela incidencia ha sido más notable. Las mues-tras recogidas en la mitad norte del país (Viz-caya, Tarragona y Valencia) presentaban unanecrosis en los foliolos, que se podría con-fundir con los típicos síntomas de "torrao"como puede observarse en la (Figura 3a y3b), sin embargo los resultados de su diag-nóstico diferían de las muestras recogidas en

BOL. SAN. VEG. PLAGAS, Ŝ '_, 20U6 553

Figura 3. Síntomas observados en plantas infectadas por PMoV. a. Áreas necrótices en los foliolos típicas de PMoV.b. Círculos necróticos en fruto verde causados por PMoV.

las otras zonas muestreadas. Hay que pun-tualizar que las 3 muestras de "torrao" reco-gidas en Mallorca, procedían de un semille-ro de Murcia. Según nuestros datos, la sinto-matología típica del síndrome conocidocomo "torrao" o"cribado" ha sido detectadaen Murcia, Almería, Alicante, Tenerife, GranCanaria y Mallorca.

En general se puede atirmar yue todas lasvariedades de tomate cultivadas en la actua-lidad se ven afectadas en mayor o menorgrado por el "torrao". Se observaron diferen-cias en el comportamiento de las diferentesvariedades en cuanto a la agresividad ymomento de aparición de los síntomas de"torrao", sin embargo parece apreciarse unamenor sensibilidad en algunas variedadesresistentes a otras virosis, aunque esta apre-ciación requiere un mayor estudio al respec-to. Las variedades más sensibles presentantempranamente síntomas tanto en hoja comoen frutos todavía verdes.

La distribución de las plantas afectadas enel interior de los invernaderos suele presen-tarse en focos localizados generalmente enlas líneas cercanas a las puertas, así como enlas zonas cercanas al pasillo central, aunyueen las filas centrales del invernadero y en laparte intermedia de las filas, también se pre-sentan plantas afectadas. EI número de plan-tas afectadas va incrementándose con el pasodel tiempo. Según testimonios de los propiosproductores y estudios Ilevados a cabo poruno de los autores de este artículo, se obser-

va una clara relación entre la incidencia de laenfermedad y presencia de Triuleurndesvaporariorum Westwood en campo.

Resultados de los análisis realizados alas muestras recogidas

Análisis serológicosLos resultados serológicos de todas las

muestras recogidas de campo a lo largo delos diferentes años se sintetizan en la Figura4. De todas las virosis analizadas, la que pre-sentó un mayor número de resultados positi-vos fue el Pepino ntosuic virus, donde un60% de las muestras analizadas fueron posi-tivas (Figura 4). EI 11% de los casos anali-zados a TSWV resultaron positivos, asícomo el 6% de los análisis realizados a PVY.Debemos indicar que los resultados positivosobtenidos en los análisis de TSV y el TNV +satélite dieron una señal muy débil, por loque no fueron considerados como resultadosfiables, pudiendo tratarse de falsos positivospor una escasa sensibilidad del suero utiliza-do o ruido de fondo del experimento.

Hay que indicar que los análisis serológi-cos iban dirigidos por la sintomatología pre-sentada; se recogieron diferentes tipos denecrosis, pero alguna de ellas entraba en elestudio sospechosa de ser portadora de otrosagentes virales yue desarrollan también sín-tomas de necrosis, como es el caso de PVY,AMV, PVX o el propio TSWV. En otroscasos, se analizaron virosis yue han sido des-critas en otros países como productoras de

SSd A. ALFARO FERNÁNDEZ, e^ al.

Análisis mediante serología

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n Muestras positivas

O Muestras nega[ivas

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Virus analizado

Figura 4. Número de positivos y negativos del total de muestras analizadas para cada una de las virosis estudiadasmediante análisis por serología.

Análisis medi.uve tecnicas moleculares

350 ^

3n0

2SU

'_00

43°6

n Mucstras positivas

^ O Mucstru negahvas

SO37°%

28 %

> > ^>^¢

ó 2' > ^ • ^ y

^ ^É ~ Fá m ó _

aó0m ^

En[idad analizada

Figura 5. Número de positivos y negativos del total de muestras analizadas para cada una de las entidades estudiadasmediante análisís por técnicas moleculares.

BOL. SAN. VEG. PLAGAS, 32, 2006 555

necrosis en tomate como es el caso de PZSV,descrito en Italia (GALLtTELL Ŝ , 1982).

Análisis molecularesLos resultados de los distintos análisis

moleculares se resumen en la Figura 5. Losanálisis realizados mediante RT-PCR con loscebadores específicos de PepMV resultaronpositivos en el 43% de los 322 casos anali-zados, estando presente también el ToCV enel 37% de las 68 muestras analizadas a estevirus (Figura 5).

El Penino mosuic virus se analizó en algu-nas muestras, como se ha explicado anterior-mente, mediante distintas técnicas de análi-sis: serología, RT-PCR con cebadores espe-

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cíficos y mediante RT-PCR en dos pasos concebadores degenerados de Potexvirus. Enaquellas muestras a las que se realizó más deun análisis para la detección de esta entidad,normalmente los resultados fueron coinci-dentes, pero en algunos casos por ejemplo,en muestras que por serología habían resul-tado negativas, el análisis mediante RT-PCRcon cebadores específicos de PepMV resultópositivo, debido lógicamente a la mayor sen-sibilidad de la técnica molecular. En deter-minados casos, hubo que recurrir a la RT-PCR con cebadores degenerados del géneroPotexvirus y posterior secuenciación paradeterminar la presencia de este virus.Haciendo un recuento total del número de

., , ^

^^. 4

Figura 6: Observaciones del extracto directo de hoja y de cortes de inclusiones en resina mediante M.E.T.a. Vazillas agregadas y degradadas observadas en la preparación del extracto fresco de muestras afectadas por "torraó'.

b. Partículas virales típicas de PepMV y ToCV en la preparación del extracto fresco de muestras afectadaspor estos virus. c. Cloroplasto totalmente hinchado y deformado perteneciente al tejido de una planta afectada por

"torrao". d. [nclusiones de patículas flexuosas típicas de los Potexvirus.

556 A. ALFARO FERNÁNDEZ. et nl.

muestras positivas al PepMV, independiente-mente del análisis realizado, se obtuvieron228 muestras positivas de un total de 339muestras analizadas, es decir, más de un67% de las muestras analizadas a este virusresultó positivo al análisis.

Los análisis de PMoV sólo resultaronpositivos en cuatro muestras que procedíande Vizcaya, Valencia y Tarragona, y quecomo hemos señalado anteriormente mostra-ban una sintomatología similar, pero noidéntica a la del resto de muestras de otrasprocedencias.

Microscopía electrónica de transmisión(M.E.T)

Los extractos de hoja fresca con síntomastípicos de "torrao" o"cribado" con diferen-tes grados de agresividad observadosmediante M.E.T., mostraron la presencia departículas en forma de varillas alargadas yrígidas que se agregaban entre ellas, apare-ciendo en grupos en toda la preparación. Enla Figura 6a pueden observarse dichasestructuras en comparación con las partícu-las que presentan extractos de hoja infecta-das con PepMV y ToCV de otra preparación(Figura 6b). La observación del purificadoviral mediante M.E.T, puso de manitiesto lapresencia de las mismas estructuras agrega-das que aparecían en el extracto de tejidofresco, pero en mayor cantidad y agregación.

En las inclusiones realizadas con las mues-tras infectadas no se observaron dichas estruc-turas agregadas, y uno de los cambios ultraes-tructurales más evidentes fue la deformacióntotal de los cloroplastos que se hinchabantotalmente (Figura bc), llegando a estallar. Enalgunos casos se observaron los vasos llenosde partículas flexuosas y en el citoplasmainclusiones de partículas flexuosas típicas delos Potexvirus (Figura 6d). En ninguno de loscasos, se observaron partículas esféricas oinclusiones que hicieran sospechar la presen-cia de otro tipo de agentes. Hay que recordarque el material con el que se realizaron losestudios de microscopia electrónica previa-mente había sido analizado para asegurar queno era portador de otras virosis.

Ensayos de transmisiónInoculación mecánica artificialEn los ensayos previos únicamente se

consiguió obtener síntomas típicos dePepMV en las plantas inoculadas, por lo quese pensó que procedía de la planta original,aunque en el análisis previo había resultadonegativo.

En los ensayos posteriores las plantas ino-culadas con extractos crudos de los aisladosn° 8413 y 8414 no mostraron ninguna sinto-matología y al ser analizadas por ELISA aPepMV resultaron negativas (Cuadro 3). Sinembargo, el resto de aislados inoculados símostraron sintomatologías concretas queestán descritas en el Cuadro 3, así como losresultados de los análisis realizados median-te serología. Las plantas inoculadas presen-tan típicos síntomas de PepMV como filifor-mismo en distintos grados, abullonado yrizado. Algunas plantas inoculadas con losaislados n° 8942 y 9055, mostraron manchaamarilla aislada. No se consiguió reproducirlos síntomas de "torrao" en ninguna plantainoculada, pero sí aparecieron síntomas nopresentes en las plantas originales como elcaso de mancha aislada en las plantas inocu-ladas con la muestra n° 9055. En ]as plantasinoculadas con un aislado original con sínto-mas exclusivamente de PepMV (n° 8965) elaspecto general de las plantas inoculadas erasimilar al de otras inoculadas con aisladoscon los síntomas típicos de "torrao" (n°8975).

Las plantas que habían sido inoculadascon el aislado n° 8599, que presentaba sínto-mas de "torrao" originariamente (Cuadro 3),manifestaron un abullonado y filiformismomuy marcado, ya visible a los 15 días des-pués de la inoculación (ddi). Las plantas ino-culadas con el aislado n° 8597, que mostrabaoriginalmente síntomas exclusivamente dePepMV (Cuadro 3), a los 15 ddi mostraronun mosaico muy fuerte verde claro-oscuro,similar al de la planta original. Las plantasinoculadas con estos dos aislados se reubica-ron en el invernadero para que recibieranmayor iluminación. Días más tarde (45 ddi)se observó en las plantas inoculadas con el

BOL. SAN. VEG. PLAGAS. 3?. 2006

aislado n° 8597 la aparición de mancha ama-rilla aislada además del mosaico que ya pre-sentaba. Las plantas inoculadas con el aisla-do 8599, mantuvieron los síntomas descritosanteriormente.

Las plantas inoculadas con los purificadosvirales de los aislados n° 7826 y 7827 comen-zaron a manifestar algunos síntomas (Cuadro4) al mes de ser inoculadas. Las plantas mos-traban amarilleos, en algunos casos, otrasabullonados, e incluso en algunas se observa-ba un curvamiento del foliolo hacia el envés.Los síntomas evolucionaron haciéndose másintensos y, en determinadas plantas, generan-do un mosaico internervial de distinta intensi-dad en las diferentes plantas, y clareado devenas que recordaban a los síntomas dePepMV. En ningún caso se consiguió repro-ducir los síntomas de "torrao". En cambio, lasplantas inoculadas con los puriticados viralesde los aislados n° 8943 y n° 9023 ya a los I Sddi mostraban síntomas característicos, reco-gidos en el Cuadro 4. EI aislado n° 9023, pre-sentaba síntomas más agresivos de apunta-miento y abullonado que el n° 8943.

En todos los casos, los análisis medianteserología a PepMV resultaron positivos aexcepción de los aislados n° 8413 y n° 8414indicad^>s anteriormente.

Figura 7: Necrosis del foliolo observada en la plantainjertada con el aislado n° 8976 (Flecha).

557

Ensayos de transmisión por injertoEn los ensayos previos de transmisión por

injerto, se obtuvo una sola transmisión en ellote de las dieciséis plantas injertadas, mani-festándose el síntoma típico de "torrao",pero fue tan agresivo que la planta murió alos pocos días. En el lote de las veinte plan-tas injertadas no se obtuvo la necrosis busca-da, apareciendo únicamente síntomas típicosde PepMV a pesar de que se partió de mate-rial vegetal cuyo análisis por técnicas mole-culares resultó negativo a dicho virus.

En las plantas injertadas con materialinfectado con "torrao" procedente de Cañadadel Gallego (Murcia) únicamente se observóen tres de las plantas injertadas un curva-miento en espiral del foliolo (Cuadro 5). Serealizaron análisis para descartar la implica-ción del PepMV y sólo tres de las muestrasresultaron positivas. Los resultados de losanálisis se recogen en el Cuadro 5. Las plan-tas injertadas con material procedente deCalnegre (Murcia) manifestaron un ligerofiliformismo, mostrando en un solo caso unligero amarilleo basal de los foliolos. Una delas plantas injertadas con el aislado n° 8976presentó una ligera necrosis en los foliolosque podría tratarse de la transmisión de laenfermedad (Figura 7). Los resultados de losanálisis a PepMV del segundo ensayo detransmisión por injerto resultaron positivosen todos los casos a excepción de 2 de lascuatro plantas injertadas con el aislado n°9010, probablemente debido a un fallo en elinjerto (Cuadro 5).

Repetición de análisis en base a los dife-rentes resultados obtenidos

Debido a la continua asociación del"torrao" con PepMV, se plantea la posibleimplicación de este último en el síndromedescrito. Además, en base a los resultadosobtenidos, se observó la continua apariciónde síntomas típicos de PepMV al inocularplantas con muestras originalmente afecta-das por "torrao". Los resultados positivos aPepMV en estas muestras inoculadas nosllevó a volver a analizar algunas muestrasoriginales, que en un principio habían resul-

558 A. ALFARO FERNÁNDEZ, et al.

Cuadro 5. Características de las muestras originales empleadas en los ensayos de injerto, numero de plantasiqjertadas y resultados del obtenidos del injerto: sintomatología y análisis a PepMV.

N°aislado

Muestras originales N" plantas Plantasinoculadas

Resultados inoculadas Sín[omas en las Resultadosa PepMV plantas inoculadas a PepMV

Síntomas originales

Mosaico verde claro-oscuro, necrosis con7522 cribado y abullonado en foliolos. Necrosis en - 2 Asintomática -

peciolo.

7528Abullonado y cribado fase intermedia, ^+ 1 Asintomática -

mosaico. Necrosis incipiente en los peciolos

7529Necrosis tipo "torrao" en los foliolos. _ 2 Asintomática -Abullonado. Curvamiento de foliolos

7531 Cribado incipiente. Abullonado y mosaico + 2Curvamiento del

foliolo+

7533Mosaico, abullonado y cribado incipiente en +' 2 Asintomática -foliolos. Comienzo de necrosis en el peciolo.

o7534

Mosaico. Abullonado. Cribado incipiente. ^+ 1 Asintomática +^,^ Apuntamiento. Retorcimiento de los foliolos.

e 7537Abullonado. Cribado muy avanzado. + 1 Asintomática -

W Necrosis. Peciolos necrosados

7544"Torraci' típico. Cicatrices en el peciolo. +-' 2 Asintomática +

Mosaico, abullonado. Arabesco.

Mosaico, retorcimiento, abullonado Curvamiento del7547 y necrosis en foliolos con cribado. costras en - ^ foliolo

_

peciolo.

7548Necrosis que avanza desde la base del foliolo. + 1 Asintomática +

Abullonado en foliolos

Curvamiento de foliolos. Necrosis y cribado.7558 Peciolos con costras que provocan su + 1 Asintomática -

curvatura.

"Torrao", amarilleo, abullonado yAmarilleo basal de

N 8966 curvamiento del foliolo en forma de espiral+ 2 los foliolos. +

Filiformismo

o Abul lonado,

R^,a

8976 "Chorrera", "torrao", cribado avanzado + Zfiliformismo.

Necrosis en foliolos(I)

+

w^10

„Costras y"torrao en foliolos. Fruto reventado + 4 Ligero filiformismo +^

con anillos, abullonado

^: Análisis negativo mediante serología. Análisis positivo mediante RT-PCR con los cebadores de Potexvirus.^: Análisis negativo mediante serología. Análisis positivo mediante RT-PCR con los cebadores específicos de PepMV.^: Únicamente 2 de las 4 plantas injertadas resultó positiva.(1): N° plantas afectadas por el síntoma observado.

tado negativas. Se pretendía asimismo con-firmar si se trataba de una posible contami-nación de las plantas inoculadas. Se realizóla RT-PCR con los cebadores degeneradosde Potexvirus y se consiguió amplificar labanda esperada de 760 pb, que se purificócon el High Pure PCR Product PurificationKit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

Germany) y se secuenció. La secuenciaobtenida, al compararla con las secuenciasde Gen Bank presentó un 97% de homolo-gía con el aislado Ch2 de PepMV (Acces-sion number: DQ000985) recientementepublicado.

Este nuevo resultado determinaba que losnegativos a PepMV obtenidos hasta el

BOL. SAN. VEG. PLACAS, 3^, 3006 559

momento con las técnicas tradicionales podí-an tratarse de falsos negativos, ya que estenuevo aislado no siempre resultaba positivopor serología o mediante RT-PCR con loscebadores específicos de PepMV. Por todoello, se ha diseñado un nuevo método dedetección que permite la diferenciación detres tipos de aislados de PepMV que actual-mente se encuentra en fase de publicación.Con este método, se han vuelto a analizar122 muestras, hasta el momento, con sínto-mas típicos de "torrao" recogidas de campoa lo largo de los distintos años de estudio yde distintas zonas geográficas. Los resulta-dos del análisis han determinado que 104muestras son positivas, caracterizándoseéstas como el aislado Chileno 2 de PepMV.

DISCUSIÓN

El cultivo del tomate presenta una com-plejidad fitosanitaria propiciada por su granintensificación, complejidad que se ve refle-jada en la aparición de nuevas enfermedadesde etiología diversa. El caso del "torrao" o"cribado", enfermedad de etiología viral pre-sente en nuestro país más de seis años (Joa^Áet al., 2003), produce infecciones muy gravestanto por sí solo, como en infecciones mixtascon otras entidades virales presentes en elcampo, las cuales agravan sus síntomas eincluso a veces llevan a confundirlos, debidoa su capacidad de producir necrosis en plan-tas de tomate afectadas. Estas causas incre-mentan la dificultad del diagnóstico de estaenfermedad. Asimismo, se aprecia la influen-cia de diversos factores que confluyen paradeterminar la manifestación de la misma, loque obliga a tener en cuenta la pluralidad delos distintos componentes implicados queinteraccionan en la determinación del síndro-me e intentar determinar no sólo el agentecausal sino también dichos componentes.

Según los muestreos realizados a lo largode los años, queda patente que esta enferme-dad presenta una mayor incidencia en Mur-cia, habiéndose recogido también un impor-tante número de muestras en Canarias y enmenor medida en otras zonas productoras.

Los síntomas causados por el "torrao" o"cribado", se diferencian de la infección porParietarim m^ttle ^^irus (PMoV), [larvirusdetectado en tomate en España en 2001(ARnwisurtu, 2001). Únicamente las muestrasrecogidas de la mitad norte del país (Vizcaya,Tarragona y Valencia), además de presentaruna necrosis algo diferente a la típica del"torraó', resultaron positivas a este Ilarvirus.

En campo pueden observarse diversidadde síntomas necróticos en plantas de tomate,que pueden confundirse en ocasiones, comose ha reiterado a lo del trabajo, con la sinto-matología típica de "torrao". Entre ellas,además de la necrosis causada por PMoVindicada anteriormente, otros virus como elTSWV, PVY, PVX o AMV también puedenproducir necrosis. Algunas de las muestrasrecogidas, presentaban necrosis causadaspor los virus anteriormente citados, y sudiagnóstico permitió establecer una compa-ración entre las necrosis producidas porestos agentes y la necrosis típica de "torrao"para su diferenciación en futuros muestreos.Por otra parte, en plantas con síntomas de"torrao" se han encontrado, al margen dePepMV presente en la mayoría de las mues-tras, otros virus que habitualmente seencuentran en el campo en infección mixtacon "torrao" como es el caso del ToCV. Portodos estos motivos, no es de extrañar que sepresenten resultados positivos a estos virusen los análisis realizados. También cabeindicar la presencia de otras necrosis en elcultivo del tomate, diferentes en su expresiónal síndrome que nos ocupa, de las cuales sedesconoce su etiología.

La aparición, incidencia y agresividad delos síntomas de "torrao" se ven influenciadaspor la conflueneia de factores anteriormenteindicada. Entre ellos, la variedad de tomate ala que infecta y las condiciones ambientalesde humedad, temperatura e iluminación sonfactores determinantes en la aparición del sín-drome. Por tanto, las dificultades observadasen los intentos de transmisión realizados sedeben a esta última causa, no se han conse-guido alcanzar las condiciones idóneas para lareproducción del síndrome en las instalacio-

560 A. ALFARO FF.RNÁNDEZ, et al.

nes donde se llevaron a cabo los ensayos detransmisión. Únicamente en el caso del injer-to se consiguió reproducir los síntomas.

A lo largo de los años se ha consideradosiempre que el agente causal, tras descartarotras entidades, debía ser un virus descono-cido, ya que ninguna virosis conocida habíaresultado positiva. La reciente comunicacióna un congreso de un grupo de trabajo holan-dés, ha señalado como el agente causal deesta enfermedad un nuevo virus, similar enmorfología y tamaño de partícula a losmiembros de la familia Comoviridae ySequiviridae, pero con una organizacióngenómica distinta y sus secuencias no homó-logas a virus de estas familias (VERSEEK etal., 2005). Las observaciones realizadasmediante microscopía electrónica, en el pre-sente estudio, tanto de extracto crudo demuestras infectadas por "torrao" o "cribado"como de purificados virales, no presentan enningún caso partículas de las característicasseñaladas por estos autores. Únicamente sehan encontrado en todos los casos partículasen forma de varillas alargadas que aparecenagregadas, aunque bastante degradadas,morfología totalmente distinta a la que pre-sentan los miembros de las familias indica-das. Si bien, la sintomatología descrita porestos autores para el Tomato torrudo viruscursa con necrosis internervial que se iniciadesde la base del foliolo, en ningún caso des-criben el típico "cribado" en hoja ni la defor-mación y rajado en fruto.

Debido a los resultados de los distintosensayos de transmisión realizados que siem-pre reproducían el PepMV y a la constanteasociación en campo del PepMV y e]"torrao", se planteó estudiar la posible impli-cación del PepMV en esta enfermedad,reconsiderando así la hipótesis de partida.Para estudiar la asociación PepMV- "torrao",como se ha indicado anteriormente, algunasde las muestras positivas a PepMV afectadaspor "torrao", se secuenciaron, y la secuenciaobtenida se alineó con las publicadas en elGen Bank obteniéndose una homología del97-98% con el aislado Chileno 2 del Pepinomosaic virus.

Este resultado ha conducido al diseño delnuevo sistema de detección que permite ladiferenciación de tres tipos de aislados delPepMV, anteriormente descrito. Este métodoha permitido la obtención de 104 positivoscaracterizados como aislado Chileno 2 dePepMV de las 122 muestras ensayadas hastael momento. Actualmente, el estudio seencuentra en fase de volver a analizar y com-probar los negativos obtenidos, ya que debi-do a la antigiiedad de algunas de las mues-tras empleadas y del estado del materialvegetal de partida que suele estar bastanteoxidado, han podido presentarse falsos nega-tivos al análisis. Aún así, el porcentaje depositivos obtenido con e] nuevo método, quealcanza el 89^10, es lo suficientemente eleva-do como para poder afirmar que el aisladoChileno 2 del Pepitzo mosaic virus está pre-sente en las muestras de "torrao". Se han rea-lizado también análisis a algunas plantas delos distintos ensayos de transmisión y por elmomento el agente transmitido en las inocu-laciones e injertos ha resultado ser elPepMV- Aislado Ch2. El hecho de que unaislado de PepMV esté implicado en estaenfermedad y pueda producir síntomas denecrosis no se aparta del comportamientohabitual de este virus, ampliamente extendi-do en el cultivo de tomate en España, ya queel PepMV presenta una gran variabilidadsintomatológica y una clara dependencia delas condiciones ambientales (JoRDÁ et al.,2000; PACÁN et al., 2006).

En España estudios sobre la variabilidadgenética y la estructura poblacional delPepMV en cultivos de tomate afectadosdeterminaron que el genotipo prevalecienteen España era los aislados tipo Europeo(80% de la población pertenecía a dichoaislado). Con una menor frecuencia relati-va, se encontraban también los aisladostipo Peruano, aunque estos siempre apare-cían en infecciones mixtas con el aisladoEuropeo (PAC.áN et al., 2006). La publica-ción del nuevo aislado Ch 2 de PepMV y laidentificación de éste en muestras afecta-das por "torrao" amplía esta estructurapoblacional, aunque se necesitan un estu-

BOL. SAN. VF,G. PLAGAS. 3'_. ?o(I(,

dio más exhaustivo al respecto. La secuen-cia completa de este nuevo aislado dePepMV (Ch2) se caracteriza por presentaruna homología del 91% con el aislado US2de este virus. Ambos aislados forman ungrupo que se diferencia del resto de aisla-dos en un 80%, porcentaje que lleva a pen-sar en una gran diferencia a nivel molecu-lar entre estos aislados y los comúnmenteencontrados en nuestro país, hecho quepodría determinar asimismo una gran dife-rencia en el comportamiento biológico delaislado, tanto en manifestación de síntomascomo en condiciones propicias para sumanifestación.

Por otra parte, los resultados obtenidosmediante serología nos indican que aproxi-madamente 40% de las muestras analizadasa PepMV resultaron negativas al análisis,hecho que se explica con la menor sensibili-dad que presenta esta técnica frente a losanálisis moleculares. El diseño del nuevométodo nos ha permitido comprobar quealgunas muestras negativas por serologíaeran realmente positivas.

De este trabajo se concluye que la enfer-medad denominada "torrao" está presente enEspaña desde su aparición, manifestándoseen mayor o menor medida según la campaña,muy dependiente de condiciones ambienta-

ABSTRACT

561

les y de la variedad a la que infecta. Tambiénse pone de manitiesto la presencia del aisla-do Chileno 2 del Pepi^lo rnnsaic L^ii•us en estesíndrome. Queda pendiente determinar exac-tamente las condiciones ambientales bajo lascuales este agente, sólo o en combinacióncon otro, es capaz de alterar su sintomatolo-gía típica de PepMV y causar necrosis, cri-bado y costuras en plantas de tomate infecta-das. Por otra parte, hay que destacar yue úni-camente ha sido determinada una pequeñaparte del total de su genoma en la que seestablece la relación de homología con elaislado Chileno 2. Se requiere, por tanto, larealización de estudios más amplios de otraspartes del genoma para determinar sí es real-mente este nuevo aislado de PepMV o pudie-ra tratarse de una nueva entidad muy próxi-ma a este virus, lo que implicaría para suestablecimiento, entre otros, estudios sobresu comportamiento biológico en plantas hos-pedantes.

AGRADECIMIF,NTOS

Este trabajo está siendo tinanciado porel Ministerio Español de Ciencia y Tecno-logía a través de los proyectos: AGL2004-07752-C02. (1 año) y AGL2005-06682-C03.(3 años).

ALEARO FERNÁNDEZ A. , M. C. CÚRDOBA SELLÉS, M. C. CEBRIÁN MICO, ^. FONT', M.

.IUÁREZ.. V. MEDINA, A. LACASA, .I. A. $ÁNCHEl NAVARRO, V. PALLÁS, C. IORUÁ GUTI^:-

RREZ. 2006. Tomato necrosis disease: "Torrao" or "Cribado''. Bol. Sun. Veg. Plugc)s, 32:545-562.

A new disease. known with the local name of "torrao", is reported in Spanish tomu-to crops since springtime of 2001. Affected plants show necroric spots starting at thebase of the leatlets. La[er these spots fall down producing litde holes ("cribad^i'). Lon-gitudinal stains appear on the stems and the fruits are distorted with necrotic lines andfinally crack, becoming unmarketable. Affected plants present a burn-like appearance.Sampling carried out since the apparition of the disease, has determined more inciden-ce in Murcia (84°Ir.) and Canary Islands (12%^), following a lower freyuency in Alme-ría and Alicante. The results of the analysis performed determined that 679^ of the sam-ples were positive to Pepino mns^ic rirus (PepMV) from a[otal of 369 samples analy-sed. Transmission assays have only reproduced the symptoms of the disease in twoplants grafted with infected p]ants. The rest of the plants inoculated or grafted showedrypical PepMV symptoms. Posterior analysis confinned this fact. All the results poin-Led out the design of a new diagnosis method that allowed the characterization of 89^7^of the tested samples as Chilean 2 isolate of PepMV, recendy published in the GenBank database IAccesión number: DQ000985). To our knowledge, this isolate could be

562 A. ALFARO FERNÁNDE"L, et al.

one of the implicated agents on the syndrome development together with other unde-termined factors.

Key words: Pepino moscúc rirus, shot-hole, electron microsope, diagnosis, virosis,serology, RT-PCR.

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(Recepción: I septiembre 2006)IAceptación: 6 septie^mbre 2006)