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臨 床

Nested polymerase chain reaction法 に よ る

結 核 性 髄 膜 炎 の経 時 的 検 討

名古屋市立東市民病院小児科1),北 海道大学 医学部小児科2)

早 河 秀 治1)成 田 光 生2)加 藤 敏 行1)

中 村 千 衣1)今 枝 正 行1)木 戸 内 清1)

(平成4年6月3日 受付)

(平成4年6月23日 受理)

Key words: nested polymerase chain reaction,

tuberculous meningitis

序 文

Nested polymerase chain reaction (nested

PCR) 法 はpolymerase chain reaction (PCR)

法 に使 用 した プ ラ イ マ ー の 内 側 に さ らに も う1組

の プ ライ マ ー を設 け て 増 幅 させ る こ とに よ り感 度

を 高 め たDNA検 出法 で1),我 々 は結 核 性 髄 膜 炎 の

迅 速 診 断 に お け るnested PCR法 の有 用 性 につ い

て 報 告 して き た2)3).し か し,実 際 に早 期 診 断 へ 応

用 し得 た 臨 床 報 告 例 は今 まで に少 な い.今 回,結

核 性 髄 膜 炎 の初 期 にnested PCR法 に よ っ て初 め

て結 核 菌 が 検 出 され,早 期 治 療 が 可 能 で あ った1

例 を 経 験 し,髄 液 を経 時 的 にnested PCR法 で 検

討 す る こ とが で きた の で,臨 床 経 過 を 報 告 す る.

症 例

症 例:5ヵ 月,女 児.

既 応 歴:1991年10月17日 にBCG接 種.

臨 床 経 過(Fig.1):1991年10月30日(1病 日)

か ら38.0℃ の 発 熱 と1日 に1～2回 の 嘔 吐,3病

日 か ら1日 に2～3回 の 下 痢 お よ び 傾 眠 を 認 め

た.4病 日 に は傾 眠 は 消 失 す る も,不 機 嫌 と食 欲

低 下 が 出 現 した た め 当 院 に 入 院 と な っ た.入 院 時

大 泉 門 は 平 坦 で 髄 膜 刺 激 症 状 を 認 め な か った.入

院 時 検 査 所 見 は,白 血 球 数19,700/μl(リ ン パ 球

37%,粁 状 好 中 球11%,分 葉 好 中 球48%,単 球

4%),CRP 11.64mg/dl, 血 沈120mm/hr,血 液

培 養 と便 培 養 に て有 意 菌 は検 出 され な か った.胸

部X線 写 真 上 異 常 を 認 め な か った.入 院 後fos-

fomycin (FOM) の 静 注 に て 一 時 的 に症 状 の 改 善

とCRPの 低 下 を 認 め た が,8病 日か ら再 び 発 熱

し,10病 日か ら大 泉 門 の膨 隆 と不 機 嫌 を 呈 した.

項 部 硬 直 やKernig徴 候 は 認 めず,意 識 は 清 明 で

あ った.10病 日の 検 査 所 見(Table 1)で は,著 し

い 白血 球 数 の増 加,CRPの 上 昇,血 沈 の 充 進 を認

め た 髄 液 は細 胞 数886/3/μl(リ ンパ 球80%),蛋 白

20mg/dl, 糖27mg/dl, Cl 122mEq/l,

adenosinedeaminase活 性5.7IU/lで あ った.以

上 の 検 査 所 見 よ り化 膿 性 髄 膜 炎 を疑 いampicillin

(ABPC)とcefotaxime (CTX) お よび γ-グ ロ ブ

リンを 投 与 した.13病 日の 髄 液 所 見 で は 細 胞 数 が

4320/3/μlと 増 加 を 示 し た た め 結 核 性 髄 膜 炎 擬

い,ツ ベ ル ク リン検 査 とnestedPCR法 を 施 行 し,

isoniazidとrifampicinで 抗 結 核 療 法 を 開 始 し

た.ツ ベ ル ク リン反 応 は10mm×10mm/12mm×12mmであ っ た.

27病 日に はnestedPCR法 に て13,16病 日の 髄 液

中 の結 核 菌 陽 性 との 結 果 を得 た た め 結 核 性 髄 膜 炎

と診 断 し,isoniazid とrifampicin にethambutol

とstreptomycinを 追 加 し4者 で 抗 結 核 療 法 を 継

続 した.経 過 中 に 繰 り返 し施 行 した 髄 液 培 養 で は

結 核 菌 は 検 出 で き な か っ た.抗 結 核 療 法 開 始 後 は

別刷 請求先:(〒464)名 古屋市千種区若水1-2-23

名古屋市立東市民病院小児科

早河 秀治

平成4年10月20日

1480 早河 秀治 他

Fig. 1 Clinical course

Table 1 Laboratory data on the 13th day of the

illness

16病 日に解熱,17病 日に大泉門の膨隆の消失,34

病 日にCRPの 陰性化,55病 日に髄液所見の正常

化を認め,89病 日に神経学的後遺症な ぐ退院 と

なった.な お,経 過中に家族および患児 と接触の

既往のある者について検診を施行 したが,感 染源

は不明であった.

Nested PCR法 による結核菌の検出(Fig.2)

方法は,髄 液150～200μlか ら遠心沈殿によ り得

たペレットに リゾチーム処理,プ ロテイナーゼK

処 理,熱 処 理 を 加 え,得 た 粗 抽 出 液 を 直 接

polymerase chain reaction (PCR) 用 の検 体 と し

て 用 いた4).PCRはShankarら の 発 表 した プ ラ イ

マ ー5)を用 い,標 準 的 条 件 下 で,denaturation 94℃

1分 間,annealing 55℃2分 間,extension 72℃2

分 間 を1サ イ ク ル と し て,35サ イ ク ル の 増 幅 を

行 った.Nested PCR法 は,上 記 プ ラ イ マ ー の 内

側 に も う1組 の プ ラ イ マ ーを 作 製 し,さ らに15サ

イ ク ル の 増 幅 を 行 っ た2).Fig.2の レー ン1～4

は 最 初 の35サ イ ク ル,レ ー ン6～9はnested

PCR法 に よ る50サ イ ク ル の 結 果 で あ る.レ ー ン

1, 6はpositive control,レ ー ン2, 7はbuffer

control, レー ン3, 8は13病 日,レ ー ン4,9は

16病 日の髄 液 で あ る.単 独 の35サ イ ク ル で は結 核

菌DNAを 検 出 で き な か った が,nested PCR法

に て 予 測 され た200塩 基 対 の 位 置 に レ ー ン8,9で

パ ン ドを認 め ,結 核 菌DNAを 検 出 した.ま た,

retrospectiveに 検 討 した26, 34, 55, 83病 日の 髄

液 は い ず れ も陰 性 で あ った(未 発 表 デ ー タ).

考 察

Nested PCR法 はPCR法 に 使 用 し た プ ラ イ

マ ーの 内 側 に さ ら に も う1組 の プ ラ イ マ ー を 設 け

て増 幅 させ る方 法 で,こ の 方 法 に よ る と91%と 単

独 のPCR法 と比 べ て 高 い 特 異 性 レベ ル を維 持 し

つ つ,感 度 はPCR法 の39%に 比 べ て63%と 有 意

感染症学雑誌 第66巻 第10号

結 核 性髄 膜 炎 に お け るnested PCR法 の 有用 性 に つ い て1481

Fig. 2 PCR results

Lane 1-4; 35 cycles of amplification, Lane 6-9; 60 cycles of amplification, Lane 1

& 6; a positive control, Lane 2 & 7; a buffer control, Lane 3 & 8; CSF sample of

14th day, Lane 4 & 9; CSF sample of 16th day, Lane 5 & 10; a gastric aspirate

sample of another patient suspected of having tuberculosis

に 改 善 され た1).こ のた め,nested PCR法 は髄 液

中 の結 核 菌 数 が 少 な い結 核 性 髄 膜 炎 の 診 断 に有 用

で あ る と考 え られ るが,今 まで にnested PCR法

の早 期 診 断 へ の 臨 床 的 な 具 体 的 応 用 例 は報 告 され

て い な い.こ の理 由 と し て,特 に 小 児 で は,1)初

期 症 状 が 不 活 発,食 欲 不 振 な どの 不 定 愁 訴 が 多 く,

髄 膜 刺 激 症 状 を 呈 す る症 例 が少 な いた め6)7),入 院

が 平 均22病 日と遅 れ る傾 向 に あ る こ と7),2)髄 液

のZiehl-Neelsen染 色 法 に よ る 塗 抹 陽 性 率 は

3%,ツ ベ ル ク リン反 応 の陽 性 率 は50%,肺 病 変

の 合 併 は40%,家 族 歴 あ りが43%と 低 いた め7),と

りあ え ず 抗 結 核 療 法 を開 始 し,そ の後 の 臨 床 経 過

か らretrospectiveに 診 断 が な され る こ とが 多 い

こ と8),な どが あ げ られ る.

本 例 はBCG接 種4週 間 後 に 施 行 した ツベ ル ク

リン反 応 は陽 性 で あ った が,家 族 歴 や 肺 病 変 の 合

併 もな く,ま た髄 液 中 のadenosine deaminase活

性 も結 核 性 髄 膜 炎 を 強 く疑 う9IU/l以 上9)で な

か った た め 参 考 に は な ら な か った.以 前 我 々 は,

nested PCR法 に て 初 め て結 核 菌 を 検 出 す る こ と

が 可 能 で あ った が診 断 の 遅 れ の た め 重 篤 な 後 遺 症

を 残 し た 典 型 的 な 結 核 性 髄 膜 炎 の8ヵ 月 の 男 児 例

を 経 験 した3).こ の 経 験 を も とに 本 例 で は13病 日

に結 核 性 髄 膜 炎 を 疑 いnested PCR法 を 施 行 し,

同 時 に 抗 結 核 療 法 を 開 始 した こ とが後 遺 症 な く治

癒 した 大 き な要 因 と考 え られ た.

また,本 例 で は経 過 中 に 繰 り返 し施 行 した 髄 液

の結核菌培養は陰性であったが,抗 結核療法開始

後13日 目以降の髄液からはnested PCR法 でも結

核菌DNAは 検出されず,抗 結核療法開始後42日

目の髄液所見 も正常化 し,そ の他の検査所見や臨

床症状の改善 とよく相関 した.こ のことは抗結核

療法が有効なら2週 間で結核菌は陰性化 し10),2

ヵ月以内に髄液所見が正常化する11)との従来の報

告 と一致 していた.以 上のことより,nested PCR

法は結核性髄膜炎における抗結核療法の効果判定

にも有用 と考えられた.

文 献

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3) 早 河秀 治, 成 田 光生, 加藤 敏 行, 今枝 正 行, 中村

千 衣, 木 戸 内 清: Nested PCR (polymerase chain

reaction) 法 が診 断 に有 用 で あ った結 核 性 髄 膜 炎

の1例. 日児 誌, 96: 1274-1278, 1992.

4) Narita, M., Shibata, M., Togashi, T. &

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平成4年10月20日

1482 早河 秀治 他

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Nested Polymerase Chain Reaction for the Diagnosis and Follow-Up of

Tuberculous Meningitis: A Case Report

Hideji HAYAKAWA 1), Mitsuo NARITA 2), Toshiyuki KATOH 1), Chie NAKAMURA 1),Masayuki IMAEDA 1) & Kiyoshi KIDOUCHI 1)

1) Department of Pediatrics, Nagoya City Higashi General Hospital2) Department of Pediatrics, Hokkaido University School of Medicine

We presented a case of tuberculous meningitis in which a nested polymerase chain reaction was

useful for its rapid diagnosis and follow-up .

A 5-month-old girl was hospitalized for gastrointestinal complaints of 4 days' duration. She

initially had no meningeal signs, but showed a bulging of the anterior fontanel on the 10th day of her

illness. Cerebrospinal fluid examination revealed a cell count of 886/3ƒÊl (80% lymphocytes), protein of20

mg/dl, and glucose of 27mg/dl. Tuberculous meningitis was suspected clinically and an anti -

tuberculous therapy was commenced on the 13th day . Although repeated attempts to culture

Mycobacterium tuberculosis were negative, the DNA of the organism was detected sequentially from

the cerebrospinal fluid of the 13th and 16th day by the method of a nested polymerase chain reaction.Th

e final diagnosis of tuberculous meningitis was established on the basis of the positive results of the

nested polymerase chain reaction , a positive tuberculin test, and typical cerebrospinal fluid findings .She recovered rapidly in response to the therapy and was discharged from the hospital without any

neurological sequelae on the 89th day . The follow-up samples of the nested polymerase chain reaction

resulted as negative after the 26th day of the illness .

感染症学雑誌 第66巻 第10号